Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод точечной ДНК-РНК гибридизации для диагностики трансмассивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Метод точечной ДНК-РНК гибридизации для диагностики трансмассивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней"

129 08 9?

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССУВДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ . ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

Ковачев Димитьр Лалев

МЕТОЛ ТОЧЕЧНОЙ ДНК-РНК ГИБРИДИЗАЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА И РОТАВИРУСНО^БОЛЕЗНИ СВИЙЕЙ.

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мссглп - 1392

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологин в биохимии Всеросийского научно-исследовательского института вкспери-ментальаой ветеринарии имени Я. Р.Коваленко.

Научный руководитель

Заведущий лабораторией молекулярной биологии в бволпдв ВИЭВ, доктор биолог, наук, академик РАСХН, профессор Г.в.Коромшж».

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Д.Г.Малахов ( МВА ).

Кандидат ветеринарных наук М.М.Гогалев ( ВИЭВ ).

Ведущее учреждение - ВШСИ ветеринарных препаратов.

Защита диссертации состоится " 1902 г.

в " //" чаоов на заседании сшциализированьшч) соьвтв К.020.28.01 по защите диссертации не соискание ученой степени кандидата наук при Всесроссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко ш адресу:109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан ¿C^tZAc^f 1992 г.

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат ветеринарных наук. ш ».Г.Тереиков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность_про0дамы:. Желудочно-кишечные болезни молодняка сельскохозяйственных животных широко распространены на всех континентах и являются одной из причин гибели животных в первые недели постнатального периода ( Притулин П.И., 1975; Vanier R. et al.,1983 ).

Главными этиологическими агентами острых гастроэнтеритов новорожденных поросят являются энтеропатогенные вирусы ( Bohl E.H., 1981; Pensaert м.в.,1984), которые сами приводят к развитию диа-реИного синдрома или служат "пусковым механизмом", обуславливающим последующ® развитие бактериальной инфекции.

Неонатальная диарея у поросят ассоциирована прежде всего с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита, типичным представителем семейства коронавирусов ( Ястребов А.С.,1989; Bohl E.H.,1989 ). В настоящее время болезнь зарегистрирована во многих странах мира с интенсивно развитым свиноводством. Заболеванию подвержены свиньи всех возрастов, однако, наиболее высокая летальность ( до 100% ) отмочена у поросят до 2-неделыюго возраста ( Bohl E.H., 1 gai; Pensaert M.B., 1989 )•

Наряду с ТГС важное место в структуре желудочно-кишечных болезней поросят отводится ротавирусной инфекции, заболеваемость среди поросят при которой составляет 50-80%, а летальность варьирует от 0 до 50% С Борисович Б.В.,1988; Eebouck Р.,1989 ). Рота-вирусная болезнь свиней регистрируется на всех континентах. У взрослых свиней ротавирусные антитела обнаруживаются у 90-100% ЖИВОТНЫХ ( Aehaa J. et al.,1983; Bohl E.H. et.al., 1984 )

Сложная структура вирусных гастроэнтеритов остро поставила вопрос диагностика этих болеззней с целью дифференцирования этиологического агента. От быстрой и точной диагностики зависит правильное и своевременное осуществление лечебных и профилактических мероприятия. Окончательный диагноз может Сыть установлен при лабораторном обследовании болышх, основанном на обнаружении специфического возбудителя ( вирусных частиц или вирусных антигенов ) в фекалиях или в тканях кишечника ( Букринская А.Г. п др.,1939 ). Спектр используемых для этих целей диагностических методов достаточно широк: прямая и тамуноэлектронная микроскопия (ПЭМ и ИЭМ),. встречный гдмуноэлектрофорез (ВИЭФ), реакция диффузионной преця-

питации в геле (РДП), реакция пассивной гемагглютинации ( РПГА ), а также электрофорез РНК в полиакриламидном геле ( Горбачев Е.Н. и др., 1988; Букринская А.Г. и др.,1989; Santoe H.о. et al.,1989; Гирин В.H. и др.,1990; Malicki К.et al.,1990 ). Указанные методы, из-за своей сложности или низкой чувствительности, не позволяют осуществлять диагностику во всех случаях.

В последние годы в качества диагностического теста широкое распространение получил иммуноферментный анализ ( ИФА ), отличающийся высокой чувствительностью и специфичностью,возможностью автоматизации и массового исследования образцов. Однако этот метод, особенно при работе с образцами фекалий, часто дает локнополоки-тельные результаты ( Рrey M.U. et al., 1987; Paoini D.L. et al., 1988; Но1ineaux P.J. et al.,1989 Forrer C.B. et al.,1989 ).

В связи с этим целесообразно развитие альтернативного подхода, который, обладая столь ле высокой чувствительностью,специфичностью и оперативностью, был бы основан на других теоретических принципах.

Одним из наиболее чувствительных современных методов быстрой диагностики вирусных инфекций является метод гибридизации нуклеиновых кислот. Наиболее простым вариантом молекулярной гибридизации является метод точечной гибридизации, котбрый позволяет одновременно исследовать много проб ( Plores J. et al'. ,1989; Eiden J. J. et al.,1989 )•

Шль_и_задачи_исслвдов8Шял Целью настоящей работы явилось йолучение гибридизационных зондов для идентификации ротавируса свиней группы А "и вируса ТГС реакцией ДНК-РНК гибридизации и изучение диагностической ценности этого метода в сравнении с ИФА. В соответствии с огт.м решали следуицие задачи:

- отработать ycj.ot,' i пор1 о гогаш &н аизируемого образца и постановки реакции ДНК-ГНК гибридизации с U'-лью диагностики ТГС;

- получить гибридизационные зонда для идентификации ротавируса свиней Группы А и вируса ТГС, провести их сравнительную оценку с целью выявления наиболее чувствительного;

- провести скрининг фокальных проб от евшей из различных хозяйств на наличие специфической РНК вирусов ТГС и- РВБС методом ДНК-РНК гибридизации;

- провести скрининг фекальных проб от ' свиней из различных хозяйств на выявление антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней методом ишуноферментного анализа (ИФА)

и проанализировать распространение ТГС и РВБС в Болгарии; - изучить эффективность метода ДНК-РНК гибридизации для диагностики рота- и коронавируяшх инфекций у свиней в сравнении с имму-поферментным'анализом на основе положительных результатов, полученных при скрининге фекальных проб.

_Научная_новизнал Впервые проведено изучение распространения трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусноЯ инфекции свиней на территории Болгарии с применением методов ДНК-РНК гибридизации и иммуноферментного анализа. Установлено широкое распространение ( 100% ) ротавирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах.

Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности методов иммуноферментного и гибридизационного анализов, обнаруживающих разные компоненты вирусной частицы - белки и РНК.

Разработаны простые методы подготовки анализируемого матери-

• ала, которые могут 0Ы1Ь использованы в гибридизациошгом анализе,

• цепной полимеразной реакции и других диагностических целях.

Практическая_знатамдсть_ра0отыл В результате проведешшх исследований отработаны условия постановки реакции ДНК-РНК точечной гибридизации при анализе фекальных образцов на наличие РНК вирусов ТГС и РВБС, включая подготовку образцов, получение зонда и проведение реакции гибридизации.

Получешше данные о распространении трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусноЯ инфекции свиней на территории Болгарии использованы при организации лечебных и профилактических мероприятий. (

Публикации. Результаты диссертации отражены в двух научных работах.

_Обьем_и_с^уктура_диссертациил Диссертационная работа изложена на I?/ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследования, обсуящэння результатов исследований, выводов, практических предлотапШ и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 18 'фотографиями и 10 таблицам!. Список литературы включает ¿^"источников отечественных и зарубежных ).

з

СОБСТВЩЫЕ_ислеловашя

Материалы_и_метд£и

Исследования по теме диссертации выполнены в I989-I99I гг. в лаборатории молекулярной биологии и биохимии ВИЭВ.

Культурэльную вирусную суспензию штамма "ТЫК" вируса TTC, получали из лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней свиней ВИЭВ. В опытах использовали векторные плазмида pBR 322,pUC 19,а также рекомоинантныь плазмиды рТО 2.21, pTG 2.27 и pBRV-б, любезно предоставленные Х.Лодом ( Лаборатория вирусологии ИНРА, Франция ).

Клетки E.ooli выращивали на среде LB. При выделении небольших и препаративных количеств плазмидной ДНК использовали метод щелочного лизиса, предложенный Birnboim H.С. и Doli J.A. ( 1979 ) с последующей очисткой в градиенте плотности хлористого цезия ( Маниатис и др., 1984 ) и хроматографией на колонке SR-6 ( FPLK, Pharmacia )

Рестрикщюнный анализ рекомбинантных плвзмад осуществляли в соответствии с руководством Маниатиса и др.,1984, с использованием эндонуклеаз рестрикции фирмы "Amereham"( Великобритания ) и НПО "Фермент"( г. Вильнюс ). ЭлектрофоретичесКое разделение молекул ДНК проводили в 0,8% агарозном геле ( Л.А.0Стерман,1981 ) с использованием оборудования фирмы "Pharmaoia", Швеция.

Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы ( Sigma,США ) проводили по методике,'разработанной BeiBlender L.,1979.

В качестве'исходного опытного материала использовали копро-логический материал, полученный от поросят с клинически выраженным синдромом гастроэнтерита невыясненной этиологии.

Экстракцию РНК вирусов из культурального и копрологического материала проводили следующими методами :

1) Исходный культуралышй вирусный материал использовала без предварительной обработки.

2) К впрусн:му материалу добавляли ДЦС-Na до конечной концентраций 1% и прогревали 5 мин при 50 °С.

3) К вирусной суспензии добавляли равный объем охлажденного во льду 2 I лизирущего буфера ( 0,14 Ы NaCl, 1,5 мМ lfgCl0,' 10 Ш трис-HCl, pH 8,6, 0,5Ж NP-40, 1000 ед/мл РНКазин ). Смесь перемешивали в течение 10 с, инкубировали на льду в течение 5 мин.

4) К исходному вирусному материалу добавляли равный обьем буфера РК ( 2х ) имеющий состав : 0,2 М трис-НИ, рН 7,5, 25 мМ ЭДТА, 0,3 М NaGl и 2%-ный ( вес/объем ) SDS. Добавляли протеиназу К до конечной концентрации 200 мкг/мл. Перемешивали и инкубировали смесь при 37°С в течение 30 мин.

5) К вирусной суспензии добавляли ДЦС-Na до конечной концентрации IX и протеиназу 1С до конечной концентрации 200 мкг/мл. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем, после экстракции фенолом и хлороформом, преципитировали РНК этанолом, осаждали центрифугированием, высушивали и растворяли в IOx ssc.

6) К вирусной суспензии добавляли ДДС-Na до конечной концентрации 1%, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и РНК экстрагировали фенол-хлороформным методом как указано в пункте 5.

7) К вирусной суспензии добавляли равный объем смеси фонол-■ хлороформ. Дальше как описано в пункте 5.

Включение в ДНК радиоактивной метки проводили методом "ник"-трансляции ( Rigby P.V. et al.,1977 ).

Предгибридизацию и гибридизацию проводили при 42°С в присутствии 50% формамида.

Раствор для предгибридизации содержал:. 50% формомид, 2х раствор ssc, 5х раствор Денхэрдта, 0,1% SDS, 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося. Раствор для гибридизации имел тот же состав к которому добавляли декстрансульфзт до 10%, фрагменти-рованную ДНК pBR 322 '- 20 мкг на I мл раствора и 0,2 мкг денатурированной ДНК меченного зонда.

Для постановки реакции иммуноферментного анализа использовали "Диагностический набор для выявления специфических антигенов вируса ТГС и РВС для постановки ИФА" ( опытная серия, изготовленная в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней свиней В11ЭВ и лаборатории экспериментального производства института вирусологии АМН СССР ).

РЩУМШ-ИСЁЩОВАШЙ

Выявлйже_гендгшой_РИС_вир^са_тр8 и_Еотавир2са_сЕиней_методдм_мдлекулщндй_га

Начальным этапом нашей работы явилась отработка условий для постановки реакции молекулярной гибридизации с целью выявления

геномной РНК вирусов ТГС и РВБС, содержащихся в биологических жидкостях ( культуральной и фекальной ).

51Е§Оотка_услдвШ_для_П°с1§новки ^еакцш_шлекхлярной_гиб]2И; дизауии.

При проведении ДНК-РНК гибридизационного анализа образцов материала наиболее существенное значение имеют:

- подготовка анализируемого образца;

- отработка условий постановки реакции гибридизации с целью предотвращения неспецифических сигналов.

Для определения оптимальных условий подготовки анализируемого образца с максимальным выходом РНК Г при минимальной степени ее деградации ) в качестве исходного материала использовали куль-туральную вирусную суспензию штамма "ТЫК" вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней с ТЩЦ0/МД.

При подготовке вирусного материала использовали три-подхода:

- для нанесения на нитроцеллюлозный фильтр использовали исходный культуралышй вирусный материал без предварительной обработки ( метод I );

- для нанесения на нитроцеллюлозный фильтр использовали лизат вирусного материала ( методы 2, 3 и 4 );

- дня нанесения на нитроцеллюлозный фильтр использовали очищенный препарат РНК вируса ( методы 5, 6 и 7 ).

Результаты молекулярной гибридизации с культуральным вирусным материалом, обработанным разными методами, представлены на рис. I. •

Наилучший результат получен при обработке исходного вирусного материала по 5 методу с использованием ДЦС-Иа и БКЗ до конечной концентрации и.Ь.г с пс следующей экстракцией фенол-хлороформом и осаждением этанолом. Мощные гибридизационные сигалы получены также при подготовке вирусного материала методами I, 2 и 6. Результаты других методов обработки анализируемого вирусного материала оказались неудовлетворительными. .

Основываясь на данные результаты исследования, в дальнейшем проводили подготовку анализируемых клинических образцов ( фекалии ) методом 5, который показал наибольший выход интактной вирусной РНК.

Рис. I. Результаты денситометрии гибридизационных сигналов, полученных при молекулярной гибридизации специфического зонда * 7 с вирусным материалом, обработанным разными методами.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

84*

¡¡?',/з; ¡Гя-"1

Щ

fLi'VÎ

щ

m

Г...... ts

5055

щ

l-'-J

Ш

ts

9%

ymt

m

16«

ТТЛ

100»

pi i

г 1

i-

№

ys.-.-'i

I4i

fti ■ .......

ш

».I 4 >|

'■Ц

и

58$

TF7Ï

m

tf. 'Л

ÎN

V, ¡-1

1858

m

il uL

10« pf^,:"™"

A - S - вирусный лктериал.ойраОотаюмй яетодаш 1-7. 3 - реко.гбижотюя гиазшда pTG 2.27.

Что касается РНК ротавирусов свиней, то она являясь двуцепо-чечной, обладает большой молекулярной устойчивостью. Поэтому для подготовки исходного испытуемого Фокального материала, основываясь на литературных данных, использовали вишеизлокеннцй 5 метод с использованием ДДС-Na и SES и последующей экстракцией смесью, фенол-хлороформа ( 1:1 ).

В нашей работе в качестве зондов использовали вируссгтецифи-

ческие нуклеотидные последовательности, находящиеся в рекомби-нантных плазмидах рто 2.21, pTG 2.27 и pBRV 6, сконструированные на основе плазмидного вектора pBR 322. Целью нашей дальнейшей работы явилось получение их в достаточно чистом виде, чтобы избежать ложноположительных сигналов при постановке реакции гибридизации.

" Клетки E.ooli выращивали на среде lb. При выделении небольших и препаративных количеств плазмидной ДНК использовали метод щелочного лизиса, предложенный Birnboim Н.С. и Doli J.А. ( 1979 ) с последующей очисткой в градиенте плотности хлористого цезия ( Маниатис и др., 1984 ) и хроматографией на колонке sr-6 ( FPLK, Pharmacia )

Рестрикцию рекомбинантных плазмид проводили с использованием эндонуклеазы Pst-1. Электрофоретическое разделение молекул ДНК проводили в 0,8% агарозном геле. Размеры полученных фрагментов определяли по электрофоретической подвижности в агарозном геле в сопоставлении с маркерными молекулами ДНК фага Л,порезанной Pet-i И Super marker.

Для получения гибридизационного зонда в дальнейшем мы использовали фрагменты вирусного генома с размерами 1,75 кБ (й 7), 0,9 кБ (* I), 0,6 кБ (Jt 2) и 0,3 кБ (* 3). Извлечение ДНК из легкоплавкой агарозы проводили по методике Вейслендера'Л. и др.(1977).

Для проверки чистоты полученных фрагментов проводили молекулярную гибридизацию с нанесенными на нитроцеллюлозный фильтр денатурированными препаратами ДНК рекомбинантных. и векторной плазмид, а также ДНК' E.ooli.

Результаты этих исследований показали, что полученные таким образом рестриктозныо фрагменты рекомбинантных плазмид, содержат в себе остаточные количества ДНК E.ooli и плазмидного вектора pBR 322,которые могут способствовать получению ложноположитёлышх результатов.

При использовании в качестве зонда фрагмента £ 3 (=0,3 кБ), интенсивность носпецифического сигнала с ДНК векторной плазмиды оказалась меньше величины специфического сигнала с рекомбинантной плазмидой более чем в 80 раз. При использовании в качестве зонда фрагмента JS 2, величиной 0,6 кБ, сигнал с векторной плазмидой составил меньше 80 раз. При использований Фрагмента Л I (=0,9 кБ) в качестве зонда, неспецифический сигнал с плазмидой pBR 322 меньше специфического сигнала примерно в 40 раз, а при использо-

вании в качестве зонда фрагмента J6 7 (1,75 кБ), эта разница составляет около 20 раз. То же относится и для неспецифического сигнала с ДНК E.coli. При использовании самого маленького фрагмента (J< 3) в качестве зонда, этот сигнал оказался меньше специфического сигнала с рекомбинантной плэзмидой Солее чем в 1500 раз, а при использовании самого большого зонда ( А 7 ), этот сигнал меньше специфического сигнала примерно в 700 раз.

На основе полученных результатов в дальнейшем получали нужные нуклеотидные последовательности по отработанной методике. На следующем этапе оптимизировали услоеия для предотвращения нэспецифических сигналов при постановке реакции ДКК-FHK гибридизации.

В этом направлении мы проводили очистку уже меченного зонда с целью удаления неспецифических нуклеиновых последовательностей, представляющих собой ДНК векторной плззмиды pBR 322 и ДНК E.coli, находящихся в зонде в остаточных количествах.

Для этого в гибридиззционную жидкость со стандартно помеченным зондом добавляли 3 нитроцеллюлозные кружочка с иммобилизованной на них 50 мкг ДНК векторной плазмиды pBR 322 с примесями ДНК E.coli и инкубировали в течение ночи. Очищенный тагам образом зонд использовали в реакции гибридизации с контрольными образцами ДНК рекомбинантной и-векторной плззмид, а также ДНК E.coli.

Результаты этого эксперимента показали возможность выявления 6 пкг нанесенной на фильтр ДНК рекомбинантной плазмиды. Гибридизация с 8000 пкг ДНК E.ooli не дала никакого сигнала. Это же количество ДНК векторной Плазмиды давало сигнал слабой интенсивности, а 400и пкг не давало никакого сигнала. По наиим расчотам, неспецифический сигнал с ДНК векторной плазмщШ в 1000 раз меньше, . чем специфический сигнал с рекомбинантной плазмидой.

Однако, имея ввиду трудоемкость указагаюго метода очистки зонда, дальнейшей целью пашей роботы стали поиски технологически простых методов нейтрализации неспецифического сигнала. При этом усилия енли налрзвдеш на нейтрализацию иммобилизованной на пи-троцеллюлозннх фильтрах ДНК векторной плагмидн и E.coli.

• Для этого ггровогн эксперимент по молекулярной гибридизации с меченным зондом по стандартному методу. Ключевым моментом эксперимента явилось добавление денатурированной ДНК E.ooii и векторной плазмидн pBR 322 в предгибридизлционную жидкость в разной концентрации 10 гжгАхл ( вариант I ),30 мкг/мл ( вариант 2 ) и 50

ЮТ/МЛ ( В0СЙЭН7 3 ).

Результаты этого эксперимента показали, что при добавлении в предгибридизационную хидкость 10 мкг/мл денатурированной ДНК векторной плазмиды и ДНК E.ooli, интенсивность неспецифических сигналов к этим же контрольным препаратам в сравнении с сигналом к рекомбинантной плазмиде ( специфический сигнал ) меньше примерно на 80-160 и 1280 раз соответственно. При добавлении в предгибридизационную хидкость 30 мкг/мл денатурированной ДНК плазмиды pBR 322 и E.ooli, разница в интенсивности меаду неспецифическим сигналом с векторной плазмидой и специфическим сигналом с рекомбинантной плазмидой составляет более чем 160 раз. Сигнал с 8 ООО пкг ДНК Е. ooli не регистрируется. При добавлении в предгибридизационную жидкость 50 мкг/мл денатурированной ДНК E.ooli и плазмиды pBR 322 наблюдали следующее: гибридизационный сигнал с 8000 пкг ДНК бактерии хозяина не зарегистрирован, а неспецифический сигнал с векторной плазмидой меньше специфического сигнала с рекомбинантной плазмидой более чем в 160 раз.

Отмечено прямо пропорциональное возрастание интенсивности фонового сигнала с увеличением концентрации добавленной в предгибридизационную жидкость денатурированной смеси ДНК в.ooli и pBR 322.

С целью поиска технологически простых методов нейтрализации неспецифического сигнала добавили в предгибридизационную жидкость фрагментированную ( 0,2-0,8 кБ ) ДНК плазмидного вектора и. Е. ooli. Результаты опыта показали, что добавление их в гибридизаци-онную жидкость вместе с меченным зондом в соотношении 100:1 и более приводит к значительному подавлению неспецифических сигналов, что убедительно демонстрируется при постановке опыта молекулярной гибридизации с РНК вируса TTC из клинического ( фекального ) материала.

При постановке реакции точечной гибридизации зонда J6 7 с клиническими фекальными образцами от свиней без добавления в гиб-ридазационную жижу фрагментированной ДНК pBR 322 и E.ooli видно, что молекулярная гибридизация с I ыкг ДНК E.ooli дает мощный сигнал, а с 10 нг - еле заметный. Гибридизация даже со 100 пкг ДНК плазмиды pBR 322 дает хорошо заметный сигнал. При постановке реакции были получены 94 положительных сигнала разной интенсивности. При добавлении в гибридизационную жидкость 20 мкг/мл фрагментированной ДНК плазмидного вектора и ДНК бактерии-хозяина, даже I мкг ДНК E.ooli не дал гибридизационного сигнала. Контрольный об-

л >в

разец с I мкг pBR 322 дал четко заметный сигнал, а со ЮОнг - еле заметный. При постановке реакции было выявлено 52 положительных сиЁналов. Надо отметить, что ряд мощных гибридизационных сигналов образцов клинического материала был полностью подавлен при добавлении в гибридизационную жидкость фрагментированной смеси, а некоторые образцы дали гибридизационные сигналы меньшей интенсивности.

В результате проведенных исследований по оптимизации условий проведения молекулярной гибридизации для индикации РНК вирусов TTC и РВБС придерживались следу щей схемы:

- подготовку анализируемого образца проводить с использованием ДДС-Na ( 200 мкг/мл ) и SDS до конечной концентрации 0,5% при 37°С в течение 30 мин с последующей экстракцией смесью фенол-хлороформа ( 1:1 ) и осаждением 2.5-ой объемами этанола;

- получать нужные нуклеотидные последовательности путем амплификации рекомбинантных цлазмид с последующим удалением рестрик-тазных вирусспецифгееских фрагментов;

- вводить в зонд радиоактивную метку с использованием меченных нуклеозидтрифосфатов в реакции ник-трансляции;

- проводить молекулярную гибридизацию по стандартному методу с добавлением в гибридизационную жидкость денатурированной фрагментированной ДНК B.ooli и pBR 322 в концентрации 20 мкг/мл при максимальной концентрации меченного зонда - 200 нг/мл.

Скринига^фека^нга_проб^вгаей^азлита

специфической РНК вирусов TTC и РВБС.

Для выяснения практического применения реакции ДНК-РНК гибридизации ( с определенным набором вирусспэцифических зондов ) с целью выявления генетического материала вирусов ТГС и РВБС в клиническом материале, была проведена серия экспериментов с фекальными пробами свиней, полученными как пз крупных свиноводческих хозяйств пропиленного типа ( M I, Б, 6, II ), так и из мел- ' ких свиноводческих хозяйств Болгарии. Исследовано 166 образцов от поросят из II свиноводческих хозяйств пз 3 районов Болгарии ( Сливенски район - *» 1,2,3,4;Новозагорски район - JR* 6,7,8,9,10 и Врачанскн район - » II ). Фекальные пробы брага у поросят с клинически выраженной диареей в Возрасте Б дней-1,5 мес. в период апреля по май месяцы 1991 г.

Скришшг_на_нажчие_РЩ_вщ>¥са_трансшссж

свиней^

Для диагностики ТГС в качестве гибридизационного зонда использовали 32Р меченные вирусспецифические рэстриктазные фрагменты, полученные от двух рекомбинантных плазмид рТО 2.21 и рТО 2.27 с воличиной 1,75 ( зонд * 7 ), 0,9 ( зонд * I ), 0,6 ( зонд * 2 ) и 0,3 ( зонд Л 3 ).

Результаты анализа фекальных проб свиней на наличие специфической РНК вируса ТГС при использовании различных зондов в реакции молекулярной гибридизации представлены в таблице I.

Таблица I. Сравнительные результаты анализа фекальных проб свиней на наличие специфической РНК вируса трансмиссивного гастроэнтерита при использовании различных зондов в реакции молекулярной гибридизации.

1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А 1 а 3 7 1 г 3 7 1 2 3 -7

к 1 2 Б 3 7 1 г 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 1 7 1 2 3 7 1 2 3 7

В 1 2 37 1 2 ? 7 7 7 1 2 3 7

Г | 1 2 3 7

Д 7 1 2 3 7 1 2 3 7 ■ 7 1 г 3 7 1 2 7 1 2 3 7 1 2 3 7

Е | 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7

„12 а з ? 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7 • 1 2 3 7 1 2 3 7

3 1 1 2 Т -Г

И I 1 2 3 7 1 2 3 7

к \ 2 3 7 1 2 3 7 1 £ 3 7 1 г 3 7

л 1 2 3 7 1 2 3 7 1 2 3 7

м ~г 1 2 3 7

1 2 3 7

о 1 2 7 1 г ? 7

I - позитивней результат при скриютзе с зонвол М I

?, - чс-&яч*ниа рбяулмпт при афининге с зондом » 2

Ч - n:\iwv ¡ух'Уиьътп при скрининге с зондоя .4 3

" 7?г ..м•,1"\а>и>й /--.о;/.ил/ст щи сщгич'тге с зсндол № 7

При проведении гибридизации с зондом * I было выявлено 48 положительных сигналов разной интенсивности, что составило 28,9$ от-всех испытуемых проб.С зондом * 2 было выявлено 47 положительных сигналов ( 28,3® ). Гибридизация с зондом * 3 выявила 45 положительных сигналов (27,1% ), а с зондом * 7 было выявлено 52 положительных сигнала разной интенсивности, что составило 31,3* от всех анализируемых образцов.

Сравнение позитивных результатов, выявленных при проведении реакции молекулярной гибридизации разными зондами, представленное в табл. I показывает, что 45 образцов являются положительными при гибридизации со всеми 4-мя зондами.При рассмотрении остальных положительных результатов отмечаем, что два образца ( Д 10 и О I ) положительные при использовании зондов *№ I, 2 и 7, являются отрицательными при использовании зонда * 3. Эти гибридизациошше сигналы имеют 'слабую интенсивность. Положительные сигналы образца Б 10 получены только с использованием зондов Л* I и 7 и надо отметить, что они тоже имеют слабую интенсивность. Результаты 4 образцов ( В 3, ВЦ, Д 3 и Д 8 ) являются позитивными только при использовании зонда Я 7, при этом отмечена низкая интенсивность сигнала.

Для изучения воспроизводимости метода провели повторную реакция гибридизации с использованием зонда Я 7 в тех жэ условиях, что и в предыдущем опыте. Сравнение полученных результатов указывает на полную воспроизводимость всех 52'положительных результатов, однако надо отметить появление нового, хотя и слабого сигнала образца К 5 (г = 0,97.).

Для изучения воспроизводимости молекулярной гибридизация на другом уроснэ, поставили решению гибридизации с тем ге зопдем п тем та испытуемым материалом, по обработанным другим ( I ) спосо-боч. Полученный коэффициент корреляции г = 0,75 указывает на тес-нув связь результатов реакция пйрляизпцпи с неходки пепитуога! "атеряалом, полученным разными cnoco6ar.ii, а тпкгэ л па писокув, но не абсолютную воспроизводимость результатов.

С;д)шинг^а_нал1тае_Щ

Для выявления ротавпрусов свиной использовалз в качество га-брвдязациенного зонда '2Р печенный ЕпрусгаещгфпческиЗ рестриктаз-йШ! фрагмент рекомбинантпой плазмндц рЗПУ-б, с еостшной 1,1 кБ. Результаты скрининга фекальных проб свиней на палячио спецкфпчес-

кой РНК ротавируса свиней показали 45 положительных сигналов разной интенсивности, что составляет 27,1$ к общему количеству исследованных проб,

Выявлеше_антигенов_вщуса_тратс

С целью выявления антигенов ВТГС и РВС были проведены исследования образцов фекальных проб свиней 11 свиноводческих хозяйств Болгарии. Исследовано 166 образцов от поросят из II свиноводческих хозяйств 3 районов Болгарии. Фекальные пробы брали у поросят с клинически выраженной диареей в возрасте 5 даей-1,5 мес. в период с апреля по май месяцы 1991 г.

При проведении ИФА антигены вируса ТГС выявлены в 58 препаратах; для которых величина оптической плотности превышала величину оптической плотности в лунках с отрицательными контролями на 0,250 о. ед. и более. Количество животных, выделявших антиген вируса трансмиссивного гастроэнтерита с фекалиями, выраженное в % к общему количеству исследованных проб, равняется 34.9Ж.

Количество поросят, выделявших антиген' ротавируса свиней с фекалиями - 41, что составляет 24, 7% от исследуемых животных.

В некоторых фекальных образцах одновременно выявляли антигены как вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, так и ротавируса свиней. В наших исследованиях смешанная рота-коронавирус-ная инфекция выявлена у 21 поросенка, что составляет 12,65% от обследованного поголовья.

Распределение положительных результатов по хозяйствам представлено в таблице 2.

Из таблицы 2 видно что трансмиссивный гастроэнтерит свиней зарогестрирован в 9 из II исследуемых хозяйств, а ротавирусная инфекция - во всех исследуемых хозяйствах. Надо отметить, что в хозяйствах ДО 3 и 5 зарегестрирован высокий процент как ТГС, так и ГВВС. В хозяйствах jfJi I, 6, 8 и 9 превалирует в основном трансмиссивной гастроэнтерит, а в хозяйствах Л» 8 и II - ротавирусная инфекция свиней. В хозяйствах 4 и 7 не выявлен ТГС, а в хозяйства/. ЛЛ 10 и II заболевание незначительно распространено. Хотя РЬБС Естречз'.'тея во всех исследуемых хозяйствах, в некоторых из mix ( XX I, 4, d и 10 ) инфекция весьма ограничена.

Таблица 2. Обобщенные результаты, полученные при иммунофер-ментном анализе на наличие' специфических антигенов вирусов TTC и РВБС в фекальных пробах от свиней различных хозяйств Болгарии

Я: ХОЗЯЙСТВО. РАЙОН Ч ВЫЯВЛЕН АНТИГЕН

TTC X I РВС * 1 тгс * J РВС X

I Хозяйство I Сливенски р-он 12 4 33,3 I 8,3 I 0 0

2 Хозяйство 2 Сливенски р-он 4 2 50,0 I 25,0 I 25,0

3 Хозяйство 3 Сливе иски, р-он 22 II 50,0 12 54,6 8 36,4

4 Хозяйство 4 СлиЕенски р-он 7. 0 0 I 14,3 0 0

5 Хозяйство I Новозагор.р-он 20 8 ■40,0 6 30,0 3 15,0

6 Хозяйство 2 Новозагор.р-он 23 15 65,2 5 21,7 4 17,4

7 Хозяйство 3 Новозагор.р-он 8 0 0 2 25,0 0 0

8 Хозяйство 4 Новозагор.р-он 15 4 26,7 I 6,7 I 6,7

9 Хозяйство 5 Новозагор.р-он 17 8 47,1 4 23,5 2 11,8

10 Хозяйство 6 Новозагор.р-он 18 3 16,7 S 3 16,7 I 5,6

II| Хозяйство I i ¡Врачански р-он 20 3 15,0 S 5 25,0 1 I 5,0 I

«ТОГО 166 58 34,9 | 41 24,7 21 12,7.

МасосШ®_ТЕ9нсшссиетдго_гаотроэдтврит __болезни

■ свиней.

Особый, интерес представляет сравнение диагностической ценно- '

сти реакции иммуноферментного анализа и молекулярной гибридизации по их результатам, полученным при скрининге клинических фекальных образцов.

При сравнении этих двух методов диагностики для индикации вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней использовали результаты иммуноферментного анализа и результаты молекулярной гибридизации, полученные зондами * 7 и * I.Сравнительный анализ этих двух методов показан в табл. 3.

Таблица 3. Сравнительный анализ полохительных результатов реакции иммуноферментного анализа и молекулярной гибридизации при скрининге клинических фекальных проб на вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней

1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А ш Х# X # Е X * 3 X

Б X !* Е X X # з X # 3 X # Е X # Е X # .н X # 5

В X 1# = X # £ X = X # Е

Г X # Е

Д = X # г X # 2 X # Е # 3 X # Е X % Е

Е X # в X # Е X # з X X X # Е X # Е X # Е

Я X # Е X # а X # 5 X # Е X # Е # Е X X X X # Е # Е

3 X # Е

и X # 3 X # 3 X

к X X X # з *х III X # Э X # Е

л X # г X # 3 X # в X

м X X # 3

н X * г

0 * » п X # =

у. - пологлгельный результат при КО А.

г- - п-л'штии-сый гж^ул^ап при ги/ЗриВипацш с зондол й I. н •■ чсч!,.гл1?.1ьн\й ¡¡сиулти при гибридизации с зондол № 7.

Из табл.3 видно,что с помощью иммуноферментного метода антигены вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней обнаруживаются в 58 образцах, т.е. 34,9S к общему количеству исследованных проб, а с помощью молекулярной гибридизации с зондами Jf I и Л 7 вирус-специфическую РНК обнаруживали соответственно в 48 ( 28,9 % ) и 52 ( 31,3 г ) образцах. Причем в 44 образцах вирус ТГС выявляется одновременно и иммуноферментным и гибридизационным методами. Коэффициенты корреляции г, = 0,643 ( р < 0,005 )( выражающий взаимосвязь между ИФА и гибридизационным анализом с зондом Л I ) и г2 = 0,672 ( р < 0,005 )( выражающий взаимосвязь между ИФА и гибридизационным анализом с зондом А 7 ) указывают, в целом о высокой достоверности совпадения результатов полученных тем и другим методами.

Нами проведен анализ тех результатов, когда данные ИФА и гибридизации на совпадают. При этом наблюдается ряд вариантов.

В 4 отрицательных до ИФА пробах был выявлен генетический материал обоими зондами, а в 14 пробах положительных по ИФА генетический материал не обнаружен ни одним из зондов. Эти несовпадения могут быть объяснены с различных сторон: потерей РНК в процессе транспортировки и хранения клинического материала или в процессе обработки анализируемых образцов. Вероятна возможность локнополо-¡пителыых иди ложноотрицательных результатов по одному из двух ;,:этодов диагностики. В этих случаях необходимо проведение дополнительных исследований этих образцов с помощью электронной микроскопии.

Сравнение результатов иммуноферментного анализа и молекулярной гибридизации для индикации ротавирусов свиней отражено в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что с помощью ишуноферментного спалгаа антигены ротавируса свиней обнаруживаются в 41 образце фекалий, что составляет 24,7 3 от всех анализируемых проб. С помощью молекулярной гибридизации РНК ротавируса 'обнаружено в 45 образцах, что составляет 27,1" к общему количеству исследуемых проб. Поло-гятеяышй результат получен одновременно с помощью обоих методов диагностики в образцах от 36 поросят. Это свидетельствует. о присутствии в этих пробах ротавируса. Следует отметить, что в большинстве случаев наблюдалась прямая лппеДная зависимость мэдду интенсивностью сигналов в обеих реакциях.

При статистической обработке полученных результатов получила

коэффициент корреляции г = 0,659 ( р < 0,005 ), который по нашему мнению, указывает на высокий уровень совпадения результатов, полученных обоими методами диагностики.

Таблица 10. Сравнительный анализ положительных результатов реакции иммуноферментного анализа и молекулярной гибридизации при скрининге клинических фекальных проб на ротавирус свиней

1 1 г 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121

А | X

Б * . X X X X X X Е X |

■ В | X X X Е X

Г | X X X X

д X X X

Е | X В X

Ж X £ X

3 х и X X X

И | X г

к | X

л | X X г X

м X X X 1

н £ X о = X

0 г - X 5 X

х - положительный результат при ИФА.

е - полошпелъный реэуаьтюя при молекулярной гибридизации.

В 5 образцах полоямтельный результат получили только в ИФА, о в 9 образцах - только с помощью ДНК-РНК гибридизации. При этом «нтенсигность сигналов в большинстве этих образцов как в ИФА, так и при ДНК-Л!К гибридизации довольно высокая. Интерпретация этих результатов е-.о многом сходна с шшеописанной. Для разрешения еггрпм случпоь необходимо проведение дополнительных исследова-

кий этих образцов с помощью электронной микроскопии и ( или ) электрофореза РНК в полиакриламидном или агарозном гелях.

выводы

1. Разработан метод получения гибридизационных зондов и постановки реакции ДНК-РНК гибридизации, позволяющий идентифицировать РНК вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней в присутствии эукариотических и микробннх ДНК и FHK с чувствительностью менее 10 пкг.

2. Показано, что плазмиды рта г.21 и рта 2.27, содержащие фрагменты 0,9 кБ, 0,6 кБ, 0,3 кБ и 1,75 кВ кДНК вируса трансмиссивного гастроэнтерита, могут быть использованы в качестве источников гибридизационных зондов для идентификации вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в материале от кивотных.

3. Показано, что плазмида pBHV 6, содержащая фрагмент 1,2 кБ кДНК ротавируса свиней, иожвт быть использована в качестве источ-пика гибридизацио!шого зонда для идентификации ротавирусов в материале от тавотных,

4. Разработан простой метод подготовки виру с содержащих препаратов для птбрндизационного анализа, включающий обработку материала протеиназой К ( 200 мкг/мл ) и ДДС-Na ( до 13 ) и депро-топплзают.

5. Установлено, что вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиной обнаруживается с помоцью 32Р меченного зонда без продварп-тельной обработки вяруссодеркащего материала.

6. Метод ДНК-гибрлдпзащгоншх зондов позволяет выявлять вирус тропсгягсспЕпого гастроэнтерита и ротав!грус сппюй в образцах Фекалий с чувствительностью и спэци£тпгостыо пэ уступашей к.му-по:1«р"ппгло:;у методу ( г » 0,643-0,672, р < 0,005 ).

7. С псмоаьв ДНК-РНК'гибридизации и пммунофэртаптного анализа установлено широкое распространенна трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируспоЯ болэзшт свилей на территории Болгария. Епруо трансгстссявного гастроэнтерита обнаружен в 823 неблагополучных по гастроэнтеритам хЪзкЯств, а ротавирус свпгеЯ - в 1003.

3. У значительного процента глвотшхх гэтодом ДНК-ИИ п:брл-лпзпцтн ( 20" ) п п.мулофортштпзм анализом ( 273 } установлено наличие сделанной рота-коронаваруспой шх$окцяя.

Полученные данные позволяют рекомендовать применение метода ДНК-РНК гибридизации с использованием в качестве зондов вирусспе-цифических ДНК-фрагментов рекомбинантных плазмид рта г.21, рто 2.27 и рвет 6 для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней и при проведении эпизоотологического обследования хозяйств.

Полученные результаты могут использоваться при планировании профилактических мероприятий по борьбе с трансмиссивным гастроэнтеритом и ротавирусной болезни свиней в хозяйствах Болгарии.

Сгшсдк^абдт_по_теме_йиссертации

1. Ковачев Д.Л., Артюшин С.К., Коромыслов Г.Ф.'Выявление ро-тавируса свиней ( РВС ) в фекальных пробах методами ДНК-РНК гибридизации и иммуноферментного анализа.// Труды ин-та / Всесоюз. н.-и. ин-т эксперимент, вет. им. Я.Р.Коваленко. Еип.71, 1991.

2. Коромыслов Г.Ф., Ковачев Д.Л., Артшин С.К. Выявление вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней ( ВТГС ) в фекальных пробах методами ДНК-РНК гибридизации и иммуноферментного анализа.// Труда ин-та / Всесоюз. н.-и. ин-т эксперимент, вет. им. Я.Р.Козчленко. Вып.71, 1991.

Подписано в печать 17,06.92. Заказ 614 Формат 60x84/16 Тирах НО

wocitea. Типография РАСХН