Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске у детей раннего возраста

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске у детей раннего возраста"

На правах рукописи

Жираковская Елена Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РОТАВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В НОВОСИБИРСКЕ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

д г оГ-3 т.

Кольцово - 2009

003461228

Работа выполнена в ФГУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель

доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Хлебодарова Тамара Михайловна доктор медицинских наук Малкова Елена Михайловна

Ведущая организация

ФГУН Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Роспотребнадзора, Москва

Защита состоится «05» марта 2009 года в ' часов на заседании

диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора.

1Я-

Автореферат разослан « ' » января 2009 года

■ J

Ученый секретарь ^ /

диссертационного совета /. д.б.н. Л.И. Карпенко

«/< 'с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время острые кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, уступая по частоте лишь гриппу и острым респираторным заболеваниям. Ротавирусы группы А (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются наиболее распространенной причиной тяжелого гастроэнтерита у детей младшего возраста во всем мире. Ежегодно регистрируется более 100 млн. случаев ротавирусного гастроэнтерита, являющегося причиной 2 млн. госпитализаций и около 600 тыс. смертей детей в возрасте до 5-ти лет, при этом до 80% летальных случаев приходится на развивающиеся страны. Однако эпидемиологические исследования показывают, что и в экономически развитых странах данная проблема стоит достаточно остро. Ротавирусная инфекция относится к числу заболеваний, этиологически верный диагноз которых возможен только после лабораторного подтверждения. К сожалению, не во всех специализированных лечебных учреждениях РФ проводят диагностику этого заболевания. Поэтому в России показатели заболеваемости ротавирусной инфекцией ниже, чем в развитых странах. По данным Федерального Центра Госсанэпиднадзора, в 2004-2005 гг. в РФ было официально зарегистрировано свыше 33-38 тыс. случаев ротавирусной инфекции в год, из которых 90,3-91,7 % приходились на детей до 14 лет, при этом дети до 2-х лет составили 76,4 - 75,7 % от всех заболевших детей.

Ротавирусная инфекция является высококонтагиозным заболеванием с множественными путями распространения. Источником инфекции служит человек с манифестной или бессимптомной формой заболевания, а также вирусоноситель. Проблема профилактики ротавирусной инфекции привлекает внимание специалистов во всем мире. В настоящее врем накоплена обширная информация о генетическом разнообразии ротавирусов. Современная классификация ротавирусов группы А разработана на основе вирусных антигенов VP7 и VP4, на которые вырабатываются вируснейтрализующие антитела. Среди ротавирусов человека различают 14 Р- и 10 G-генотипов. Существуют географические различия в распространенное™ ротавирусов различных генотипов даже в рамках одной страны, и частота их встречаемости изменяется со временем. Опубликованы данные о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавирусов и большом числе нетипируемых штаммов. В связи с этим для оценки эффективности уже созданных вакцин и разработки новых необходимо -знание генетического спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории. Всемирный альянс вакцинации и иммунизации (GAVI) при сотрудничестве ВОЗ, Программы оптимальных технологий в здравоохранении (PATH, США) и Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США) в 2003 году активировал Ротавирусную программу вакцинации (http://www-rotavirusvaccine.org'>. В рамках этой программы созданы пять региональных сетей мониторинга ротавирусного гастроэнтерита, которые охватывают более 40 стран мира. Пока Россия не входит ни в одну из этих

сетей мониторинга. Ранее было проведено изучение генетических вариантов ротавирусов на европейской территории России. В то же время исследований ротавирусной инфекции и молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов, циркулирующих в Западной Сибири, не проводилось.

Цель исследования: изучить особенности эпидемического процесса ротавирусной инфекции у детей до 3-х лет, госпитализированных в специализированную клинику, и определить молекулярно-генетическое разнообразие выявленных изолятов ротавируса.

Задачи исследования:

1. Оценить этиологическую значимость ротавирусов в структуре острых кишечных инфекций у детей до 3-х лет и проанализировать сезонные особенности ротавирусной инфекции в Новосибирске.

2. Изучить генетическое разнообразие ротавирусов, циркулирующих на территории Новосибирска, выявить динамику встречаемости генотипов в течение пятилетнего периода исследования, сравнить с генотипами ротавирусов, циркулирующими в Омске и Омской области.

3. Определить нуклеотидные последовательности кДНК четвертого и девятого фрагментов генома ротавирусов, кодирующих белки УР4 и УР7.

4. Провести сравнительный филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей двух изучаемых фрагментов генома ротавирусов различных генотипов с ранее опубликованными в ОепВапк нуклеотидными последовательностями кДНК аналогичных генотипов.

Научная новизна. Впервые проведено пятилетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование ротавирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске. Установлена высокая этиологическая значимость ротавирусов группы А в структуре спорадической заболеваемости детей острыми кишечными инфекциями. Представлены новые данные, свидетельствующие о широком распространении микст-инфекций: ротавирусно-вирусной и ротавирусно-бакгериальной сочетанной этиологии.

Впервые проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов группы А, циркулирующих в Новосибирске. Выявлено изменение генетического спектра популяции ротавирусов в течение пяти лет. Проведено сравнение выявленных генотипов ротавирусов с генотипами, циркулирующими в Омске и Омской области. Показано, что генетические спектры ротавирусов, циркулировавших в Новосибирске, Омске й Омской области в один эпидемический сезон, существенно различались.

Показано, что ротавирусы группы С являются достаточно редкой этиологической причиной острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в Новосибирске.

Впервые определены и зарегистрированы в базе данных вепВапк (ЫСВ1, США) нуклеотидные последовательности кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен \Ф8* белка УР4, и девятого фрагмента генома, кодирующего белок УР7, изолятов ротавируса группы А, выявленных в Новосибирске и Омске.

Практическая значимость. Сравнительный анализ имеющихся в РФ диагностических тестов для выявления ротавируса группы А показал, что комплект реагентов для ПЦР-диагностики "АмплиСенс Rotavirus-290" (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) по диагностической эффективности превосходит существующие ИФА-тесты и может быть рекомендован дня детекции ротавирусов в клинических образцах и проведения молекулярно-генетических исследований.

Оперативное выявление и установление этиологически точного диагноза позволило врачам специализированной детской клиники проводить более рациональное лечение детей раннего возраста и исключить развитие лекарственных осложнений. Такая своевременная диагностика сокращает время пребывания пациента в стационаре и снижает стоимость проводимого лечения.

Полученные данные о выявлении ротавирусной инфекции включены в статистические отчеты .городской специализированной клиники и вошли в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области в 2006 и 2007 годах.

Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики.

Результаты мониторинга генетического спектра циркулирующих ротавирусов могут быть использованы при решении вопроса о проведении вакцинации детей раннего возраста с учетом соответствия антигенного состава существующих ротавирусных вакцин доминирующим в Западной Сибири генотипам вируса.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 9 статей. Результаты работы были представлены на 5-ти российских и 4-х международных конференциях: V Российская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных болезней", Новосибирск, 2005; III Российская научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2006; VII Межрегиональная научно-практической конференция с международным участием "Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения", Омск, 2007; Межрегиональная научно-практическая конференция "85-летие образования Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации", Тюмень, 2007; VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Молекулярная диагностика - 2007", Москва, 2007; 7th International Rotavirus Symposium, Lisbon, Portugal, 2006; 4th International Conference on Vaccines for Enteric Diseases - VED 2007, Lisbon, Portugal, 2007; 3rd International Conference "Basic Science for Medicine", Novosibirsk, Russia, 2007; 26a Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

главы "Материалы и методы", главы "Результаты и обсуждение", заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 41 рисунком, включает 22 таблицы и одно приложение. Библиография включает 445 работ: 55 -отечественных авторов и 390 - зарубежных.

Диссертационная работа выполнена в 2003-08 гг. в лаборатории разработки средств экстренной профилактики ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках выполнения проекта МНТЦ № 2935р (рук. -академик РАМН В.В. Малеев).

На разных этапах в работе приняли участие С.А. Боднев, А.Ю. Тикунов, Т.Э. Юн, A.B. Качко, И.В. Бабкин, Н. Сафонова, Н.Т. Денисова, Т.Г. Корсакова, В.В. Клемешева, М.Г. Горбунова - автор приносит им искреннюю благодарность. Особую признательность автор выражает д.б.н. Н.В. Тикуновой за полезные советы и поддержку на всех этапах исследования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика обследованных больных и схема исследования

Проведено обследование 4288 больных, находившихся на лечении в Детской городской клинической больнице №3 Новосибирска. В эту специализированную клинику поступают дети из всех районов города и части Новосибирского сельского района. Среди обследованных были выделены две группы пациентов. Основную группу составили дети до 3-х лет с острой кишечной инфекцией, госпитализированные с июля 2003 по июнь 2004 г. (660 человек) и с марта 2005 по июнь 2008 г. (3486 детей). В группу сопоставления были включены дети до 3-х месяцев, госпитализированные в отделение респираторных инфекций с марта 2005 по июнь 2008 г. (142 ребенка). Они не имели клинических проявлений кишечной инфекции.

Образцы фекалий собирали в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры при поступлении пациентов в стационар, чтобы исключить внутрибольничное инфицирование. До транспортировки образцы хранили при минус 20°С. Собранные образцы еженедельно отправляли в ГНЦ ВБ "Вектор".

Проведено также исследование 167 копрофильтратов от детей до 3-х лет с клиническими проявлениями ротавирусной инфекции, переданных из Центра гигиены и эпидемиологии в Омской области. Они были собраны в специализированных отделениях с января по март 2007 года в Омской области и с сентября 2007 по январь 2008 г. в Омске (91 и 66 образцов, соответственно). Транспортирование материала в ГНЦ ВБ "Вектор" проводили с соблюдением условий холодовой цепи.

На проведение данного исследования было получено одобрение Этического комитета ГНЦ ВБ "Вектор" (регистрационный номер IRB0001360).

Схема проведения исследований представлена на рисунке 1. В микробиологической лаборатории больницы проводился стандартный бактериологический посев (МУ №04-23/3 от 17.12.84). В лаборатории ГНЦ ВБ "Вектор" проводилась комплексная ПЦР-диагностика всех поступивших проб на наличие вирусных и бактериальных энтеропатогенов с использованием

МУЗ ДГКБЛ"|3

госпитализированные дети до 3-х лет, поступившие из Новосибирска и части Новосибирского сельского района

-^-frj Salmonella spp~

Микробиологическая лаборатория: сбор образцов фекалий и бактериологический посев

Информированное согласие, идентификационный лист, медицинская карта

> Shigella spp.

ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" . —База данных

ycjiOBHo-rraroreHHfcie MHKpo opraioo m w. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. E. coli 3HTcponaToreHinje Enterobacter spp, Citrobacter spp. Klebsiella spp. Proteus spp. Acinetobacter spp. Candida spp. Pseudomonas aeruginosa Bacillus cereus Serratia marcescens Hafnia

генотипнровааие ротавару со* группы А

норовирусы 1 я 2 генотипа

секв енкрование астровирусы

ротавирусы группы С КИНЭ

Campylobacter термофильной группы

Рис. 1. Организации-участники и схема проведения молекулярно-генетического исследования ротавирусов, циркулировавших в Новосибирске.

наборов "AMrumCzHG-Roiavirus-290", п АыхитСспс-Norovirus 1, 2 genotypes-306/322"AmumCeaoAstrovirus- 165й, "AmumCcnc-Salmonellaspp", "АмплнСенс-ShigelIa spp. "AuxumCsnc-Campylobacter spp. " (ЦНИИ

Эпидемиологии, Москва). Пробы также тестировались методом ИФА на присутствие ротавирусного антигена с использованием тест-систем "Premier™ Rotaclone" (Meridian Bioscience, США) и "IDEIA™ Rotavirus" (DakoCytomation, Великобритания). Методом мультиплексной ОТ-ПЦР определялись [PJG-генотипы выявленных ротавирусов группы А и проводилось секвенирование кДНК соответствующих фрагментов генома. Методом ОТ-ПЦР клинические образцы с неуточненной этиологией дополнительно исследовались на наличие ротавирусов группы С. Информация об анамнезе заболевания и результатах всех лабораторных исследований вносилась в единую базу данных, структура которой была разработана на основе Microsoft Office Access.

Особенности эпидемического процесса ротавирусной инфекции у детей до 3-х лет. За все время исследования с июля 2003 по июнь 2004 г. и с марта 2005 по июнь 2008 г. ротавирусы группы А были выявлены в 34,5 % (228/660) и 33,8 % (1177/3486) проб, соответственно.

Для проведения адекватного сравнительного анализа использовались данные, полученные в течение четырех полных лет (табл. 1). Анализ возрастной структуры обследованной группы пациентов показал, что среди больных ротавирусной инфекцией, дети младше 3-х месяцев жизни составляли всего около 6 %. Большинство детей с ротавирусным гастроэнтеритом были в возрасте от 3-х месяцев до полутора лет. Доля пациентов в возрасте от полутора до 3-х лет составила всего 7 %. При этом у детей от года до 3-х лет в 50 % случаев именно ротавирусы являлись причиной госпитализации.

Таблица 1

Выявление ротавирусной инфекции (РВ) в разных возрастных группах детей до 3-х лет, госпитализированных с ОКИ, и в группе сопоставления

Возраст, месяцы жизни Периоды исследования Итого

06.03-07.04 06.05-07.06 06.06-07.07 06.07-07.08

ОКИ, п РВ п(%) ОКИ, п РВ п(%) ОКИ, п РВ п(%) ОКИ, п РВ п(%) ОКИ п РВ п(%)

0-2 149 13 (8,7) 134 11 (8,2) 187 18 (9,6) 253 34 (13,4) 723 76 (10,5)

3-5 111 29 (26,1) 145 49 (33,8) 161 34 (21,1) 198 47 (23,7) 615 159 (25,9)

6-8 159 50 (31,4) 222 88 (39,6) 245 73 (29,8) 307 115 (37,5) 942 326 (34,6)

9-11 126 69 (54,8) 225 103 (45,8) 281 83 (29,5) 305 155 (50,8) 937 410 (43,7)

12-17 78 43 (55,2) 138 81 (58,7) 110 40 (36,4) 115 51 (44,3) 441 215 (48,7)

18-23 29 19 (65,5) 46 27 (58,7) 41 20 (48,8) 24 11 (45,8) 140 77 (55,0)

24-36 8 5 (62,5) 22 7 (31,8) 14 2 (14,3) 5 3 (60,0) 49 17 (34,7)

итого 660 228 (34,5) 932 367 (39,4) 1039 270 (26,0) 1207 415 (34,4) 3838 1280 (33,4)

Г] эуппа сопоставления

0-2 - " 58 3' 1 42 (5,2)1 42 4 (9,5) 42 1 (2,4) 142 8 (5,6)

В группе сопоставления в фекальных пробах от детей без клинических проявлений кишечной инфекции ротавирусы были выявлены в 8 (5,6 %) образцах.

Анализ помесячной динамики выявления ротавирусов показал, что случаи заболевания регистрировались на протяжении всего года (рис.2). Наблюдалась выраженная активизация эпидемического процесса ротавирусной инфекции в холодное время года. В Новосибирске пик ротавирусной инфекции приходился на зимне-весенние месяцы. В феврале-марте ротавирусы являлись этиологической причиной почти 60-80 % , кишечных инфекций. ,В эпидемический сезон 2006-07 гг. значительного увеличения частоты

Рис. 2. Динамика госпитализации детей до 3-х лет с ОКИ (столбцы) и ротавирусной инфекцией (ломаная линия). Пунктирные линии — соеднее число выявлений оотавиоусов в год.

выявления ротавирусов не наблюдалось. Возможно, подобные колебания заболеваемости в различные годы объясняются колебаниями погодных условий. В сезон 2006-2007 гг. не было такого большого понижения температуры в осенне-зимний период, как, например, в сезон 2005-06 гг. (ниже минус 40°С).

В результате лабораторной бактериологической и комплексной ПЦР-диагностики была установлена этиологическая структура ОКИ в 68 % случаев. У 60,3 % пациентов с выявленными ротавирусами группы А диагностировалась моноинфекция, микст-инфекция наблюдалась в 39,7 % случаев. У 16,2% пациентов в фекальных пробах вместе с ротавирусами группы А были определены другие вирусы, вызывающие диарею - норовирусы в 9,7 %, астровирусы в 5,1 %, норовирусы и астровирусы одновременно в 1,3 % проб. У 4,0 % пациентов вместе с ротавирусами были обнаружены Salmonella spp. и у 1,3 % - Shigella spp. и энтероинвазивные Е. coli.

Считают, что у детей до года жизни удельный вес кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, может составлять до 20 %. В нашем исследовании в 19,8 % проб вместе с ротавирусами диагностировалась условно-патогенная микрофлора, чаще всего Staphylococcus spp. (8,5%), Enterobacter spp. (6,8%), Campylobacter термофильной группы (2,9 %) и Streptococcus spp. (1,4 %). В 4,0 % проб вместе с ротавирусами были определены более одного вида бактерий, а в 1,9 % проб -три и более патогена вирусной и бактериальной природы. Возможно в большинстве случаев кишечных инфекций, когда при проведении бактериологического анализа выявляются условно-патогенные микроорганизмы, истиной причиной заболевания являются ротавирусы. Ротавирусы поражают и вызывают гибель зрелых эпителиоцитов двенадцатиперстной кишки и верхнего отдела тонкого кишечника. Зрелые эпителиальные клетки замещаются незрелыми клетками, не способными

адекватно абсорбировать углеводы или другие питательные вещества. Эти процессы могут влиять на флору кишечника ребенка и изменять ее состав.

Очень сложно оценить вклад каждого выявленного патогена в развитие болезни, но наличие нескольких возбудителей может менять клиническую картину, свойственную моноинфекции, приводить к более тяжелому течению заболевания, затруднять выбор лекарственных препаратов для лечения и увеличивать срок госпитализации.

Ротавирусы группы С являются вторыми по встречаемости среди патогенных для человека ротавирусов. Они могут вызывать как вспышки, так и спорадические случаи гастроэнтерита с такими же клиническими проявлениями, что и ротавирусы группы А. Более чем за двухлетний период (с марта 2006 по июнь 2008 года) ротавирусы группы С были выявлены в 6 (0,4 %) пробах. Полученные результаты свидетельствуют, что ротавирусы группы С могут вызывать кишечную инфекцию у детей раннего возраста, но являются достаточно редкой этиологической причиной.

Генетическое разнообразие ротавирусов, циркулировавших на территории Новосибирска с 2003 по 2008 г. Современная классификация ротавирусов базируется на различиях антигенных детерминант белков внешней оболочки VP4 и VP7. Четвертый фрагмент РНК-генома ротавирусов кодирует поверхностный протеазочувсгвительный белок VP4, домен VP8* которого определяет Р-генотип. Девятый фрагмент генома кодирует гликопротеин наружного капсида VP7, определяющий G-генотип. В нашем исследовании для определения Р- и G-генотипа мы использовали модифицированные методики мультиплексной ОТ-ПЦР, разработанные в ЦНИИ эпидемиологии на основе методов, детально описанных в ряде работ (Gouvea V. et al., 1990; Gentsch J R. et al„ 1992; Das В. K. et al., 1994).

Всего за время исследования было проведено генотипирование 738 изолятов ротавирусов, выделенных из фекальных проб от детей с кишечной инфекцией и детей из группы сопоставления. Р- и G-геноггипы ротавирусов были определены в 656 (88,9 %) и 696 (94,3 %) случаях, соответственно (табл. 2). У 6,4 % изолятов не был определен Р-генотип, у 1,2 % - G-генотип и у 4,3 % не определялись оба генотипа.

Таблица 2

[PJG-генотипы изолятов ротавируса группы А, выделенных в Новосибирске

Генотипы G1 G2 G3 G4 G9 G1+G2 G1+G3 G1+G9 G3+G4 NT*

РГ41 1 84 0 0 0 4 0 0 0 0

Р[6] 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1

Р[8] 373 0 71 45 50 0 9 5 2 8

РГ91 0 0 3 1 0 0 0 0 0 0

РГ81+РГ9] 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

NT* 28 5 3 7 4 0 0 0 0 32

* - нетипируемые изоляты

Анализ данных генотипирования показал, что в Новосибирске в каждый эпидемический сезон доминировал широко распространенный во всем мире генотип Р[8]в1 - от 40 до 70 % всех генотипированных изолятов. В тоже время наблюдался дрейф следующих по встречаемости генотипов (рис. 3).

Генотип Р[8]С9 впервые выявили в Новосибирске в феврале 2004 г., и до июля 2005 года он был вторым по встречаемости (20 %). Затем он стал встречаться все реже, в течение почти года не выявлялся ни разу, а потом снова появился в единичных случаях.

С сентября 2005 по июль 2007 года вторым по встречаемости был генотип Р[8]03 (15 %), который в 2003-04 гг. не был определен ни разу, а в 2007-08 гг. стал четвертым по встречаемости (10 %).

В сезон 2007-08 гг. вторым стал генотип Р[4]в2 (19 %), который до этого обычно был третьим по встречаемости (6-12 %). В этот же сезон увеличилась встречаемость генотипа Р[8]С4 (12 %), хотя до этого его доля была невелика (3-5 %).

Кроме этого в двух пробах были определены ротавирусы генотипа Р[6]в4 и в единичных случаях - ротавирусы генотипов Р[9]С54 и Р|9]03. В 19 (4,9 %) клинических пробах было вьивлено несколько генотипов одновременно: Р[8]С1+03 (8), Р[8]С1+С9 (4), Р[4]СН+02 (4), Р[8]СЗ+С4 (2) и Р[8]+Р[9]С1 (1).

В группе сопоставления были выявлены ротавирусы генотипов Р[8]в1 (2), Р[9]03 (2), Р[8]03 (1) и Р[8]01+С3 (1). В тех случаях, когда генотипы ротавирусов, обнаруженных в фекальных пробах от детей из группы сопоставления, совпадали с преобладающими в данный эпидемический сезон генотипами ротавирусов, выявленными при кишечных инфекциях, можно предполагать вирусоносительство. Весной 2006 г. в двух клинических образцах от детей первого месяца жизни из группы сопоставления были выявлены

Р[8]С1 оР[8]СЗ аредвд ВРИЙЭ И Р{41<32 адругие аыт

Рис. 3. Динамика выявления ротавирусов разных генотипов в клинических пробах от детей до 3-х лет в Новосибирске.

ротавирусы генотипа P[9]G3, которые не выявлялись до этого в фекалиях больных кишечной инфекцией. В данных случаях, скорее всего, наблюдались асимптоматические формы ротавирусной инфекции, характерные для детей неонатального периода. В таких случаях, чаще всего, выявляются ротавирусы необычных генотипов. Ротавирус генотипа P[9]G3 нами был впервые определен в пробе ребенка с кишечной инфекцией через год, в июне 2007 г.

Таким образом, спектр генотипов ротавирусов, циркулировавших на территории Новосибирска в течение пяти лет, постоянно изменялся. Предсказать, ротавирусы какого генотипа будут превалировать в следующем эпидемическом сезоне, очень сложно.

Сравнение генотипов ротавирусов, циркулировавших в Новосибирске и Омской области. Поскольку существует региональная вариабельность преобладающих генотипов, было интересно провести сравнительный анализ генотипов ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске и соседней Омской области, расположенной в том же климатическом поясе. В Новосибирске в январе-марте 2007 г. доминировал генотип P[8]G1 (80%) и другие генотипы встречались редко (по 2-3 %). В это же время в Омской области распределение генотипов было следующим: P[8]G1 (55 %), P[4]G2 (11 %), P[8]G4 (6,6 %). В следующий эпидемический сезон с сентября 2007 по январь 2008 г. в Новосибирске преобладающим генотипом остался P[8]G1 (36 %), затем следовали P[4]G2 (14,9 %), P[8]G3 (10,6 %) и P[8]G4 (9,6 %). В этот же период в Омске преобладающим генотипом стал P[8]G4 (54,5%), следующими по встречаемости были P[4]G2 (9,1 %) и P[8]G3 (6,1 %).

Таким образом, на двух географически близко расположенных территориях в течение двух эпидемических сезонов спектр генотипов, циркулировавших там ротавирусов, отличался. Причем в эпидемический сезон 2007-08 гг. в Новосибирске преобладающим был генотип P[8]G1, который в Омске почти не встречался. А в Омске самым распространенным был генотип P[8]G4, который в данный период в Новосибирске был лишь четвертым по встречаемости.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК фрагментов генома ротавирусов группы А. Определение нуклеотидных последовательностей кДНК фрагментов генома, кодирующих домен VP8* белка VP4 и белок VP7, проводили на автоматическом анализаторе CEQ™2000XL DNA Analysis System (Beckman, США). Полученные последовательности редактировали и анализировали с помощью программ SeqMan II DNASTAR 7.0., BioEdit 7.0. На основании данных секвенирования был проведен сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями кДНК соответствующих фрагментов генома ротавирусов доступными на сервере Национального центра биотехнологической информации BLAST (NCBI, США), использующего базы данных GenBank (NCBI, США), EMBL (The European Molecular Biology Laboratory) и DDBJ (DNA DataBank of Japan). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК исследуемых фрагментов генома ротавирусов проводили методом

минимальной эволюции по двухпараметрической модели Кимуры с перестановочным анализом по 1000 реплик средствами программы Mega 4.1. Пятьдесят шесть полученных последовательностей кДНК зарегистрированы в базе данных GenBank: FJ435203-FJ435212, FJ440329-FJ440334, FJ447564-FJ447579, FJ529382-FJ529404 (http://www.ncbi.nlm.nih.еоуЛ.

Исследования генетического разнообразия ротавирусов во многих странах показали, что благодаря существующей вариабельности многие генотипы разделяются на группы и подгруппы. В Новосибирске в течение всего периода исследования доминировали ротавирусы, имеющие широко распространенный генотип Р[8]. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4, показал, что двенадцать изолятов, выделенные в нашем исследовании, входят в многочисленную подгруппу P8-IIB, которую формируют современные штаммы из разных стран мира (рис. 4).

Рис. 4. Филограмма, построенная методом минимальной эволюции по двухпараметрической модели Кимуры на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома ротавируса (880 п.н.), кодирующего домен VP8* капсидного белка VP4. Цифры покатывают индексы статистической надежности узлов дерева (перестановочный анализ с 1000 реплик). Внизу - шкала дивергенции (замен на сайт). Кружком обозначены изоляты, выделенные в нашем исследовании.

Один изолят RUS-Nov06-1486 генотипа P[8]G1 входит в достаточно редкую группу P8-III. Оказалось, что двухлетний ребенок, из копрофильтрата которого был выделен этот изолят ротавируса, был госпитализирован с диареей сразу же после возвращения из поездки с родителями в Адлер. Анализ конденсированного выравнивания аминокислотных последовательностей домена VP8* показал, что изолят RUS-Nov06-1486 имеет высокую степень гомологии (97,3 %) с другими изолятами, входящими в группу P8-III, и 89,1 % с ротавирусами, выявленными в нашем исследовании и относящимися к подгруппе P8-IIB. В его последовательности вьивлено 26 замен аминокислотных остатков по сравнению с подгруппой P8-IIB.

В Новосибирске в течение всего периода исследования преобладали ротавирусы, имеющие широко распространенный генотип P[8]G1. При филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7 ротавирусов генотипа Gl, видно, что восемь изолятов (включая моно- и микст-инфекции), выделенные в нашем исследовании, входят в группу G1-II, которую формируют штаммы, циркулирующие в последние годы в разных частях света (рис. 5).

ТЕ56 Thai-1604 Dhakal6-03 Dhaka 14-04 111251

VN-35S

- KUM502-11

- CAU 164

- 7108'JP

Py03SR124 Г- PA2-04

П-RUS-NOVOÓ-1486 Ql

—Ii-PA9-03

4 A RUS-NOV06-988 G1+C3 Ц— ▲ RUS-NQV08-3427 Gl

- A RUS-NOV06-76! Gl «39 k RUS-NOV05-640 G1+G3 k RUS-NOV05-701 G1+G3 k RUS-NOVO5-688 G1+G9 ▲ RUS-NOV05-168 G1+G9

Or-wa "1-D

- larael-56 - Fin-107

Gl-I Gl-VI

Gt-ll

G1-V Gt-IV

С <-111

0.01

Рис. 5. Филограмма, построенная методом минимальной эволюции на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома (860 п.н.), кодирующего белок УР7 ротавирусов генотипа 01. См. пояснения к рис. 4. Треугольником обозначены изоляты, выделенные в нашем исследовании.

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белка VP7 изолята RUS-Nov06-1486 с изолятом RUS-Nov08-3427 выявил замены Leu19—>H¡s19, Gly28—>Arg28, Ile^Leu55, Ser90-*Ile90.

Таким образом, мы выявили случай завозной инфекции ротавирусом генотипа P[8]G1, который отличался от вирусов этого же генотипа, циркулировавших в Новосибирске, и имел множественные точечные замены аминокислотных остатков в последовательностях домена VP8* и белка VP7.

Ротавирусы генотипа P[8]G9 в Новосибирске были вторыми по частоте встречаемости в 2004-05 гг. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7 ротавирусов генотипа G9, показал, что все 19 изолятов (включая моно- и микст-инфекции), выделенные в нашем исследовании, имеют высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей белка VP7, как между собой (97,1%), так и между другими штаммами данной группы (96,7 %), циркулирующими в разных странах в последние годы.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7 ротавирусов генотипа G4, показал, что пять изолятов, выделенные в нашем исследовании, входят в многочисленную группу G4-I, которую формируют штаммы из разных стран мира (рис. 6). Сравнительный анализ выведенных аминокислотных последовательностей белка VP7 изолятов, выделенных в Новосибирске, показал, что они имеют высокую степень гомологии (95,6 %) между собой и

И[24ЛЗ «Ь—Руоз I-в

íi-ARUS-Ko>fl«-136! G4 »J— A RUS-NovOS-1235 G4 * I1>RUS-Noí07-1S05G4

ARUS-Omsl<18-254 G4 ARUS-Nov0«-3260 G4 - J-4624 ,24ЛЗ

-Py02SR7 -Ba2il 04

87]-STJ

!lJl-Odelia

1-NB187/86

-Bakergmjl0-06 CIT-176RV

-Arg987 •Arg990

-Arg92S

- Gottfiied^jor ГГА -'VA75

-VN-59W002 -VN-Í46/2003

1С

|АчВ I»

С4-И

C'H

0.02

Рис. 6. Филограмма, построенная лметодом минимальной эволюции на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома (899 п.н.), кодирующего белок УР7 ротавирусов генотипа 04. См. пояснения рис. 4; рог - ротавирус свиньи. Треугольником обозначены изоляты, выделенные в нашем исследовании.

штаммами подгруппы G4-IC, но все содержат замену Leu18—»Phe18. В полученных нами последовательностях, также как и у других штаммов подгруппы G4-IC существует вставка Asp76, которая увеличивает гидрофильность белка VP7. Изолят RUS-Omsk08-254 имеет высокую степень гомологии (99,3 %) нуклеотидных последовательностей соответствующих фрагментов генома с изолятами генотипа P[8]G4, циркулировавшими в это же время в Новосибирске.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК девятого гена, кодирующих белок VP7, показал, что штаммы ротавирусов генотипа G3 формируют три отдельных кластера (рис. 7). Восемь изолятов (включая моно- и микст-инфекции), выделенные в нашем исследовании, входят в многочисленную группу G3-I, содержащую изоляты, ассоциированные с генотипом Р[8]. Два изолята RUS-Nov06-K2 и RUS-Nov06-К10 входят в группу G3-II,состоящую из изолятов с генотипом Р[9].

Ротавирусы человека, имеющие генотип P[9]G3, с очень низкой частотой выявляют во многих странах мира. Изоляты RUS-Nov06-K2 и RUS-Nov06-K10 были выделены в копрофильтратах от детей в возрасте одного месяца, которые

ARUS-NOV05-701 G3+G1

▲ RUS-NOV05-640 G3+G1

▲ RUS-NO V06-98S G3+C1 A RUS-NOVO6-1329 G3 A RUS-NOV06-I358 G3 A RUS-NOV08-3141 G3 A RUS-NOV08-3281 G3 A RUS-NOV08-3404 G3 Rus-32 VN-582 Chi-182 5290/Japan СМН054 77FMadrid MaCH09404 G3-SP4.5-3

l-Ris-47 48vp7n lU26

KC814 P9

PA158-96 P9

A RUS-NOV06-K2 P9G3 RUS-NOV06-K10P9G3 CMH222 P3 HCR3

GM

C3-I

G3-II

-B4106 P14 BELG

П.П»

Рис. 7. Дендрограмма, построенная методом минимальной эволюции на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома (870 п.н.), кодирующего белок УР7 ротавирусов генотипа ОЗ. См. пояснения к рис. 4. Треугольником обозначены изоляты, выделенные в нашем исследовании.

входили в группу сопоставления. У них наблюдалась асимптоматическая форма ротавирусной инфекции. Аминокислотные последовательности белка VP7 этих изолятов имели высокую степень гомологии между собой (96,7 %) и с другими изолятами, входящими в группу G3-II (94,9 %).

При филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома ротавирусов, кодирующей домен VP8* белка VP4, видно, что изоляты RUS-Nov06-K2 и RUS-Nov06-K10, выделенные из клинических проб от детей с асимптоматической формой ротавирусной инфекции, входят в разные подгруппы генотипа Р[9] - степень гомологии 71,3 % (Рис. 8).

Белок VP4 связан с такими важными биологическими функциями ротавируса как проникновение в клетку и вирулентность. Между 93-208 а.о. расположен участок связывания сиаловых кислот. Изоляты RUS-Nov06-K10 и RUS-Nov06-K2 имеют замены в позициях Thr96-+Ser96, Thr93->Asn", Glu129—+His129, Ala180—»Ser180 и ThrU5-»Ile115, Glu'29->His129, Asn'49->Asp149, Ala203—>Ser203, соответственно. Возможно, эти замены приводят к нарушению третичной структуры домена VP8*, и Р-складки не образуются. Это влияет на способность ротавируса связывать сиаловые кислоты и снижает вирулентность. Аминокислотная последовательность домена VP8* изолята RUS-Nov07-2253 имеет высокую степень гомологии (99,6 %) с последовательностью штамма Hun8, выделенного также в фекальной пробе от ребенка с диареей. В них отсутствуют замены в позициях 76, 88, 96, 99, выявленные в изоляте RUS-Nov06-K10, и нарушения третичной структуры, вероятно, не происходит, так как вирус способен вызывать кишечную инфекцию.

RUS-Nov07-2253 P9G3 Hun8 G6 Ro-5193 G3

PAI5S/96 03 СаЙДЫк

RUS-Nov06-K2 P9G3

• RUS-Nov06-K10 P9G3

СМН134/04 Atb721-2AG12

CP1030G12 JAP CP727 GI2 T152G12

IA

Р9-И

P9-I

Рис. 8. Дендрограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома (867 п.н.), кодирующего домен VP8* белка VP4 ротавирусов генотипа Р[9]. См. пояснения рис. 4; feline - ротавирус кошек. Кружком обозначены изоляты, выделенные в нашем исследовании.

Ротавирусы генотипа P[4]G2 с 2003 по 2007 г. в Новосибирске были третьими по встречаемости, а в 2007-08 гг. они стали вторыми. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4, показал, что все шесть изолятов генотипа Р[4], выделенные в нашем исследовании, входят в один кластер P4-II (рис. 9). В рамках одного эпидемического сезона они имеют высокую степень гомологию нуклеотидных последовательностей (98,8 %) и не сильно изменяются со временем.

Рис. 9. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующих домен VP8* белка VP4 ротавирусов генотипа Р[4]. См. пояснения к рис. 4. Кружком обозначены изоляты, выделенные в нашем исследовании.

Анализ приведенных аминокислотных последовательностей белка VP7 показал, изоляты каждого эпидемического сезона имеют высокую степень гомологии между собой (98,5 % - 99,2 %) (рис. 10). Хотя в последовательностях VP7 изолятов 2007-08 гг. появилось несколько замен Arg49-»Lys49, Thr78—»Ala78, Ser179->Glym по отношению к изолятам 2005-06 гг. Изоляты RUS-C)msk08-257 и RUS-Nov08-3277, выявленные в один эпидемический сезон, по нуклеотидным последовательностям соответствующих фрагментов генома имеют высокую степень гомологии Ф9,8 %) между собой.

Ротавирусы генотипа P[6]G4 за пять лет исследования в Новосибирске были выявлены нами всего в двух случаях. Ряд исследователей считает, что генетическое разнообразие ротавирусов генотипа Р[6], выявленных у человека, формируется благодаря множественной межвидовой передаче между людьми и свиньями. Изолят RUS-Nov05-394, выявленный в фекальной пробе

MW333

I-1

0.005

-A. RUS-NO V05-29 P4G2

ARUS-NOVO 5-202 P4G2 к RUS-NO VOMÍS P4G2 ARUS-NOVÍ6-1283 P4G2 ro>44

Dtoi.7-03 MR4717/W) И»Ш6-04 MalU>l7-0S DI»kl26-06

A RUS-NO V07-2417 P4G2 RUS-NOV07-2277 P4G2 RUS-NOVO!-3277 P4G2 RUS-OMSKOS-2J7P402

GZ-IV

CZ-V

G2-I

G2-I

G2-I

Рис. 10. Филограмма, построенная методом минимальной эволюции на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК девятого фрагмента генома (856 п.н.), кодирующего белок УР7 ротавирусов генотипа 02. См. пояснения к рис. 4. Треугольником обозначены изоляты. выделенные в нашем исследовании.

от восьмимесячной девочки в июле 2005 г., располагается в кластере, показывающем наличие филогенетических связей между ротавирусами человека и вирусами свиньи (рис.11). Анализ эпидемиологических данных показал, что этого ребенка вывозили на несколько дней в деревню. В апреле 2007 г. ротавирусы генотипа P[6]G4 был определены еще в одной пробе от пятимесячной девочки, которую также вывозили из Новосибирска в сельскую местность. В Омской области ротавирусы генотипа P[6]G4 были определены в двух копрофильтратах от детей, проживающих в разных сельских районах. Возможно, инфицирование детей ротавирусами данного генотипа происходит при контакте с взрослыми людьми, ухаживающими за свиньями. Редкое выявление ротавируса: данного генотипа в Новосибирске может быть связано с отсутствием в большом городе контактов с сельскохозяйственными животными.

Таким образом, в Новосибирске с 2004 по 2008 г. циркулировали ротавирусы широко распространенных генотипов P[8]G1, P[8]G3, P[8]G4, P[8]G9 и P[4]G2. При анализе филогенетических связей изученных нами изолятов со штаммами, представленными в базе данных GenBank, показано, что они формируют естественные подгруппы внутри каждого генотипа. Изоляты, выделенные в течение одного эпидемического сезона, имеют высокую степень гомологии нуклеотидных и аминокислотных последовательностей (97-99%) между собой. Кроме этого в нескольких случаях были выявлены ротавирусы редких генотипов P[6]G4, P[9]G3, P[9]G4 и микст-инфекции.

Рис. 11. Бескорневое дерево, построенное методом минимальной эволюции на основе выровненных нуклеотидных последовательностей кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4 ротавирусов генотипа Р[6]. Кружком обозначен изолят, выделенный в нашем исследовании. Ротавирус: hu - человека, рог - свиньи.

ВЫВОДЫ

1. В структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику Новосибирска, ротавирусы группы А являлись основной этиологической причиной. В результате ПЦР-диагностики 4146 клинических проб ротавирусы были выявлены в 33,9 % (1405) случаях.

2. Ротавирусная моноинфекция была выявлена в 57 % случаев. В 43 % • случаев диагностировалась микст-инфекция с бактериальными

энтеропатогенами (22,4 %), норовирусами (9,7 %), астровирусами (5,1 %) и несколькими патогенами одновременно (5,8 %).

3. Исследование особенностей эпидемического процесса ротавирусной инфекции показало, что:

наблюдалась выраженная сезонность эпидемического процесса ротавирусной инфекции в холодное время года, в среднем пик выявления ротавирусов группы А наблюдался с февраля по апрель; - большинство госпитализированных детей с ротавирусной инфекцией были в возрасте от 3-х месяцев до полутора лет(87,1 %);

- ПЦР-диагностика 142 фекальных образцов от детей из группы сопоставления показала в 5,6 % случаев наличие ротавирусов группы А, что подтвердило возможность протекания ротавирусной инфекции у детей до 3-х месяцев в бессимптомной форме.

4. В структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику Новосибирска, ротавирусы группы С являлись достаточно редкой этиологической причиной. В результате ПЦР-диагностики 1462 клинических проб от госпитализированных детей до 3-х лет ротавирусы группы С были выявлены в 6 (0,4 %) случаях.

5. В результате генотипирования 738 изолятов, выделенных с июля 2003 по июнь 2008 г., впервые определена относительная встречаемость различных генотипов ротавирусов на территории Новосибирска: P[8]G1 (50,7 %), P[4]G2 (11,5 %), P[8]G3 (9,6 %), P[8]G9 (6,9 %), P[8]G4 (6,2 %). Выявлена динамика изменения генетического спектра популяции ротавирусов в течение пяти лет исследования.

6. Впервые проведен сравнительный анализ [PJG-генотипов ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске и Омске и Омской области. В эпидемический сезон 2007-08 гг. доминирующий в Новосибирске генотип P[8]G1 почти не встречался в Омске. Генотип P[8]G4, который преобладал в Омске, в то же время в Новосибирске был четвертым по встречаемости.

7. Впервые определены нуклеотидные последовательности кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4, для 23 изолятов и девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7, для 45 изолятов ротавируса группы А, циркулировавших в Новосибирске и Омске. Филогенетический анализ этих последовательностей показал, что они формируют естественные подгруппы внутри каждого генотипа; изоляты, выделенные в течение одного эпидемического сезона, имеют высокую степень гомологии (97-99 %) соответствующих нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

8. Аргал из нуклеотидных последовательностей вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4 ротавирусов генотипа P[9]G3, выявленных при асимптоматической форме ротавирусной инфекции, показал наличие у них ряда точечных мутаций в участке связывания сиаловых кислот по сравнению с ротавирусом данного генотипа, выделенном при вирусном гастроэнтерите.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Жираковская Е.В., Малеев В.В., Клемешева В.В., Боднев С.А., Корсакова Т.Г., Тикунов А.Ю., Юн Т.Э., Никифорова H.A., Нетесов C.B., Тикунова Н.В. Ротавирусы у детей раннего возраста в г. Новосибирске в 2005-2007 гг.: выявление и генотипирование // ЖМЭИ -2008. -№ 4. -с. 12-16.

2. Боднев С.А., Малеев В.В., Жираковская Е.В., Никифорова H.A., Корсакова Т.Г., Тикунов А.Ю., Нетесов C.B., Тикунова Н.В. Этиологическая значимость ротавирусов, норовирусов и астровирусов в структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста Новосибирска в период сезонного подъема заболеваемости // Инфекционные болезни. — 2008. - т. 6. - № 1. - с. 61 -64.

3. Горбунова М.Г., Тикунова Н.В., Жираковская Е.В., Стасенко B.JL, Ерофеев Ю.А., Вайтович М.А., Миленина В.М., Логиновских Н.В. Эпидемиологическая характеристика и особенности этиологии ротавирусной инфекции в Омской области // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2008. -№ 6. - с. 36-39.

4. Горбунова М.Г., Жираковская Е.В., Тикунова Н.В., Стасенко B.JI., Вайтович М.А., Тикунов А.Ю., Миленина В.М., Логиновских Н.В. Характеристика эпидемиологического процесса ротавирусной инфекции на территории Омской области в 1993-2007 годах // Сибирский медицинский журнал -2008. - т. 82. - № 7. - с. 113 -116.

5. Жираковская Е.В., Никифорова H.A., Корсакова Т.Г., Юн Н.Э., Тикунова Н.В. Ротавирусная инфекция у детей раннего возраста в г. Новосибирске. Генотипирование циркулирующих изолятов // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007.-№ 3. - с. 32-36.

6. Жираковская Е.В., Клемешева В.В., Боднев С.А., Корсакова Т.Г., Тикунов А.Ю., Никифорова H.A., Тикунова Н.В. Использование метода ПЦР для диагностики ротавирусной инфекции и генотипирования, выделенных в Новосибирске изолятов ротавируса группы А. // Молекулярная диагностика - 2007: Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Москва, 2007. -т. 3. - с. 251-253.

7. Тикунов А.Ю., Жираковская Е.В., Тикунова КВ., Игнатьев Г.М. Апробация ПЦР тест-системы "АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FEP" для выявления вирусных патогенов, вызывающих острые кишечные инфекции // Молекулярная диагностика - 2007: Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Москва, 2007. - т. 3. - с. 298-300.

8. Горбунова М.Г., Стасенко В.Л., Вайтович М.А., Логиновских Н.В., Тикунова Н.В., • Жираковская Е.В. Анализ заболеваемости ротавирусной инфекцией и

циркуляции ротавирусов разных типов на территории Омской области // 85-летие образования государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации: Материалы межрегиональной научно-практической конференции. - Тюмень, 2007.-е. 27-29.

9. Горбунова М.Г., Тикунова Н.В., Жираковская Е.В., Стасенко В.Л., Вайтович М.А. Анализ заболеваемости ротавирусной инфекцией и циркуляции ротавирусов разных типов на территории Омской области // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы VII межрегиональной научно-практической конференции с международным участием - Омск, 2007. - т. 2. - с. 115-118.

Тезисы докладов конференций

1. Zhirakovskaya Е., Bodnev S., Tikunov A., Gorbunova М., Tikunova N. Epidemiological profile of rotavirus infection in Western Siberia, Russia, July 2003 -December 2007: diversity of group A rotavirus genotypes. 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID)- 13-17 May 2008 - Graz, Austria - p. 402.

2. Bodnev S., Tikunov A., Zhirakovskaya E., Yun Т., Tikunova N. Sporadic cases of norovirus infection among young children in Novosibirsk, Russia, 2005-2007. 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID) -13-17 May 2008 - Graz, Austria - p. 196.

3. Tikunov A., Bodnev S., Zhirakovskaya E., Yun Т., Tikunova N. Molecular epidemiology of human astrovirus infections among young children in Novosibirsk,. Russia, 2005-2007. 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID) -13-17 May 2008 - Graz, Austria - p. 212.

4. Tikunova N., Zhirakovskaya E., Bodnev S., Tikunov A., Yun T. Diarrhea etiology in the children's hospital infectious department in Novosibirsk, Russia. 26th Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID) - 13-17 May 2008 - Graz, Austria - p. 212.

5. Yun Т., Zhirakovskaya E., Tikunov A., Bodnev S., Tikunova N. Detection and identification of bacterial pathogens by polymerase chain reaction and conventional techniques in childhood acute gastroenteritis in Novosibirsk, 2005-2007. 26й Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID) - 13-17 May 2008 - Graz, Austria - p. 214.

6. Tikunova N., Zhirakovskaya E., Bodnev S., Yun Т., Tikunov A., Korsakova Т., Klemesheva V., Nikiforova N. Molecular epidemiology of gastroviruses circulating in Novosibirsk, and their genotyping. 3"1 International Conference "Basic Science for Medicine" - 2-8 September 2007 - Novosibirsk, Russia - p. 189

7. Zhirakovskaya E., Bodnev S., Yun Т., Korsakova Т., Klemesheva V., Nikiforova N., Tikunova N. Changing distribution of group A human rotavirus genotypes circulating in Novosibirsk, Russia. 4й International Conference "Vaccines for Enteric Disease -VED 2007" - 25-27 April 2007 - Lisbon, Portugal.

8. Tikunova N„ Zhirakovskaya E., Bodnev S., Tikunov A., Yun Т., Korsakova Т., Klemesheva V., Nikiforova N. Surveillance of human rotavirus circulating among young children in Novosibirsk, Russia. 4th International Conference "Vaccines for Enteric Disease - VED 2007" - 25-27 April 2007- Lisbon, Portugal.

9. Жнраковская E.B., Боднев C.A., Никифорова H.A., Юн Т.Э., Тикунов А.Ю., Корсакова Т.Г., Клемешева В.В., Тикунова Н.В. Ротавирусная инфекция у детей раннего возраста в г. Новосибирске в 2005-2006 гг.: оценка этиологической значимост и генотжшрование циркулирующих изолятов. Ш Российская научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» - 27-29 сентября 2006 - Новосибирск - с. 115-116.

10. Боднев С.А., Жнраковская Е.В., Никифорова Н.А., Юн Т.Э., Тикунов АЛО., Корсакова Т.Г., Клемешева В. В., Тикунова Н.В. Норовирусы как этиологическая причина острых вирусных гастроэнтеритов у детей раннего возраста Новосибирска в 2005-2006 гг. Ш Российская научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" - 27-29 сентября 2006 - Новосибирск - с. 113-114.

11. Тикунов А.Ю., Жираковская Е.В., Боднев С.А., Никифорова H.A., Юн Т.Э., Корсакова Т.Г., Клемешева В.В., Тикунова Н.В.. Исследование роли астровирусов в этиологии острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в Новосибирске. III Российская научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" - 27-29 сентября 2006 - Новосибирск - с. 123.

12. Тикунова Н.В., Жираковская Е.В., Боднев С.А., Юн Т.Э., Никифорова H.A., Корсакова Т.Г., Клемешева В.В., Тикунов А.Ю., Нетесов C.B.. Этиологические особенности острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в г. Новосибирске. III Российская научная конференция "Проблемы инфекционной

, патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" - 27-29 сентября 2006 - Новосибирск - с. 124-125.

13. Zhirakovskaya Е., Bodnev S., Yun T., Tikunov A., Tikunova N. Epidemiological Features of Rotavirus Infection in Novosibirsk, Russia, 2005. 7 International Rotavirus Symposium -12-13 June 2006 - Lisbon, Portugal - p. 86.

14. Tikunova N., Zhirakovskaya E., Yun N., Netesov S. Epidemiological Profile of Rotavirus in Novosibirsk, Russia, July 2003 through June 2004: Molecular Emergence of G9P[8] strain. 7th International Rotavirus Symposium -12-13 June 2006 - Lisbon, Portugal - p. 86.

15. Тикунова H.B., Боднев C.A., Жираковская E.B., Клемешева В.В., Корсакова Т.Г., Никифорова H.A., Тикунов А.Ю., Нетесов C.B. Особенности этиологической структуры острых вирусных гастроэнтеритов у детей раннего возраста г. Новосибирска. Российская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных болезней" - 25-27 октября 2005 - Новосибирск - с. 241-243.

16. Жираковская Е.В., Тикунова Н.В., Боднев С.А., Корсакова Т.Г., Клемешева В.В., Никифорова H.A., Нетесов C.B. Сравнительная оценка эффективности различных тест-систем для диагностики ротавирусной инфекции у детей г. Новосибирска. Российская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных болезней" - 25-27 октября 2005 - Новосибирск - с. 178-179.

Жираковская Елена Владимировна

Молекулярно-генетическая характеристика ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске у детей раннего возраста

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 19.01.09. Заказ №7 Формат 60x84/16. Тираж 100 зкз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жираковская, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современные представления о ротавирусах и ротавирусной инфекции.

1.1. Классификация ротавирусов.

1.2. Структурная и молекулярная организация ротавируса.

1.2.1. Морфология и свойства ротавирусной частицы.

1.2.2. Геном ротавируса.

1.2.3. Вирусные белки.

1.2.3.1. Структурные белки.

1.2.3.2. Неструктурные белки.

1.3. Ротавирусная инфекция.

1.3.1. Значимость ротавирусного гастроэнтерита в инфекционной патологии детей раннего возраста на современном этапе.

1.3.2. Патофизиология ротавирусной инфекции.

1.3.3. Клинические проявления ротавирусной инфекции.

1.3.4. Лабораторная диагностика ротавирусной инфекции.

1.4. Эпидемиология ротавирусной инфекции.

1.4.1. Антигенная характеристика ротавирусов группы А.

1.4.1.1. Механизмы изменчивости ротавирусов.

1.4.1.2. Разнообразие [P]G генотипов ротавирусов.

1.4.1.3. Инфицирование несколькими штаммами ротавируса.

1.4.1.4. Зоонозный потенциал ротавирусной инфекции.

1.4.1.5. Асимптоматическая форма ротавирусной инфекции.

1.4.2. Сезонность ротавирусной инфекции.

1.4.3. Пути передачи ротавирусной инфекции.

1.4.4. Иммунитет при ротавирусной инфекции.

1.5. Вакцинопрофилактика ротавирусной инфекции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске у детей раннего возраста"

Актуальность темы. В настоящее время острые кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, уступая по частоте лишь гриппу и острым респираторным заболеваниям. Ротавирусы группы А (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются наиболее распространенной причиной тяжелого гастроэнтерита у детей младшего возраста во всем мире (Wilhelmi I. et al., 2003). Ежегодно регистрируется более 100 млн. случаев ротавирусного гастроэнтерита, являющегося причиной 2 млн. госпитализаций и около 600 тыс. смертей детей в возрасте до 5-ти лет, при этом до 80 % летальных случаев приходится на развивающиеся страны (Bryce J. et al., 2005; Parashar U. D. et al., 2006). Однако эпидемиологические исследования показывают, что и в экономически развитых странах данная проблема стоит достаточно остро (Newall А. Т. et al., 2006; Soriano-Gabarro М. et al., 2006; Fischer Т. К. et al., 2007). Ротавирусная инфекция относится к числу заболеваний, этиологически верный диагноз которых возможен только после лабораторного подтверждения. К сожалению, не во всех специализированных лечебных учреждениях РФ проводят диагностику этого заболевания. Поэтому в России показатели заболеваемости ротавирусной инфекцией ниже, чем в развитых странах. По данным Федерального Центра Госсанэпиднадзора, в 2004-2005 гг. в РФ было официально зарегистрировано свыше 33-38 тыс. случаев ротавирусной инфекции в год, из которых 90,3-91,7 % приходились на детей до 14 лет, при этом дети до 2-х лет составили 76,4 — 75,7 % от всех заболевших детей (Информационный сборник статистических материалов, 2006).

Ротавирусная инфекция является высококонтагиозным заболеванием с множественными путями распространения. Источником инфекции служит человек с манифестной или бессимптомной формой заболевания, а также вирусоноситель (Васильев Б. Я. и др., 2000). Проблема профилактики ротавирусной инфекции привлекает внимание специалистов во всем мире. В настоящее время накоплена обширная информация о генетическом разнообразии ротавирусов (Gentsch J. R. et al., 2005; Santos N., Hoshino Y., 2005). Современная классификация ротавирусов группы А разработана на основе вирусных антигенов VP7 и VP4, на которые вырабатываются вируснейтрализующие антитела (Gentsch J. R. et al., 1996; Kapikian A. Z., 2001). Среди ротавирусов человека различают 14 Р- и 10 G-генотипов (Gentsch J. R. et al., 2005; Santos N., 2005; Mascarenhas J. D. et al., 2007b). Существуют географические различия в распространенности ротавирусов различных генотипов даже в рамках одной страны, и частота их встречаемости изменяется со временем (Steele A. D. et al., 2003). Опубликованы данные о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавирусов и большом числе нетипируемых штаммов (Gentsch J. R. et al., 2005). В связи с этим для оценки эффективности уже созданных вакцин и разработки новых необходимо знание генетического спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории. Всемирный альянс вакцинации и иммунизации (GAVI) при сотрудничестве ВОЗ, Программы оптимальных технологий в здравоохранении (PATH, США) и Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC, США) в 2003 году активировал Ротавирусную программу вакцинации (http://www.rotavirusvaccine.org). В рамках этой программы созданы пять региональных сетей мониторинга ротавирусного гастроэнтерита, которые охватывают более 40 стран мира. Пока Россия не входит ни в одну из этих сетей мониторинга. Ранее было проведено изучение генетических вариантов ротавирусов на европейской территории России (Васильев Б. Я. и др., 2000; Епифанова Н. В. и др., 2001; Новикова Н. А. и др., 2007; Подколзин А. Т. и др., 20076; Сагалова О. И. и др., 2007). В то же время исследований ротавирусной инфекции и молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов, циркулирующих в Западной Сибири, не проводилось.

Цель исследования: изучить особенности эпидемического процесса ротавирусной инфекции у детей до 3-х лет, госпитализированных в специализированную клинику, и определить молекулярно-генетическое разнообразие выявленных изолятов ротавируса.

Задачи исследования:

1. Оценить этиологическую значимость ротавирусов в структуре острых кишечных инфекций у детей до 3-х лет и проанализировать сезонные особенности ротавирусной инфекции в Новосибирске.

2. Изучить генетическое разнообразие ротавирусов, циркулирующих на территории Новосибирска, выявить динамику встречаемости генотипов в течение пятилетнего периода исследования, сравнить с генотипами ротавирусов, циркулирующими в Омске и Омской области.

3. Определить нуклеотидные последовательности кДНК четвертого и девятого фрагментов генома ротавирусов, кодирующих белки VP4 и VP7.

4. Провести сравнительный филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей двух изучаемых фрагментов генома ротавирусов различных генотипов с ранее опубликованными в GenBank нуклеотидными последовательностями кДНК аналогичных генотипов.

Научная новизна

Впервые проведено пятилетнее комплексное молекулярно-эпидемиологическое исследование ротавирусной инфекции у детей раннего возраста в Новосибирске. Установлена высокая этиологическая значимость ротавирусов группы А в структуре спорадической заболеваемости детей острыми кишечными инфекциями. Представлены новые данные, свидетельствующие о широком распространении микст-инфекций: ротавирусно-вирусной и ротавирусно-бактериальной сочетанной этиологии.

Впервые проведено исследование молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов группы А, циркулирующих в Новосибирске. Выявлено изменение генетического спектра популяции ротавирусов в течение пяти лет. Проведено сравнение выявленных генотипов ротавирусов с генотипами, циркулирующими в Омске и Омской области. Показано, что генетические спектры ротавирусов, циркулировавших в Новосибирске, Омске и Омской области в один эпидемический сезон, существенно различались.

Показано, что ротавирусы группы С являются достаточно редкой этиологической причиной острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в Новосибирске.

Впервые определены и зарегистрированы в базе данных GenBank (NCBI, США) нуклеотидные последовательности кДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4, и девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7, изолятов ротавируса группы А, выявленных в Новосибирске и Омске.

Практическая значимость

Сравнительный анализ имеющихся в РФ диагностических тестов для выявления ротавируса группы А показал, что комплект реагентов для ПЦР-диагностики «АмплиСенс Rotavirus-290» (ЦНИИ эпидемиологии, Россия) по диагностической эффективности превосходит существующие ИФА-тесты и может быть рекомендован для детекции ротавирусов в клинических образцах и проведения молекулярно-генетических исследований.

Оперативное выявление и установление этиологически точного диагноза, позволило врачам специализированной детской клиники проводить более рациональное лечение детей раннего возраста и исключить развитие лекарственных осложнений. Такая своевременная диагностика сокращает время пребывания пациента в стационаре и снижает стоимость проводимого лечения.

Полученные данные о выявлении ротавирусной инфекции включены в статистические отчеты городской специализированной клиники и вошли в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области в 2006 и 2007 годах.

Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики.

Результаты мониторинга генетического спектра циркулирующих ротавирусов могут быть использованы при решении вопроса о проведении вакцинации детей раннего возраста с учетом соответствия антигенного состава существующих ротавирусных вакцин доминирующим в Западной Сибири генотипам вируса.

Апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 9 статей. Результаты работы были представлены на 5-ти российских и 4-х Международных конференциях: V Российская научно-практическая конференция "Генодиагностика инфекционных болезней", Новосибирск, 2005; III Российская научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2006; VII Межрегиональная научно-практической конференция с международным участием "Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения", Омск, 2007; Межрегиональная научно-практическая конференция "85-летие образования Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации", Тюмень, 2007; VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Молекулярная диагностика — 2007", Москва, 2007; 7th International Rotavirus Symposium, Lisbon, Portugal, 2006; 4th International Conference on Vaccines for Enteric Diseases - VED 2007, Lisbon, Portugal, 2007; 3rd International Conference «Basic Science for tVi i

Medicine», Novosibirsk, Russia, 2007; 26 Annual Meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID), Graz, Austria, 2008.

Вклад автора

Диссертационная работа была выполнена в 2003-08 гг. в лаборатории разработки средств экстренной профилактики ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках выполнения проекта МНТЦ №293 5р (рук. — академик РАМН В* В. Малеев).

Диагностика ротавирусной инфекции методом ИФА проводилась автором лично. Выделение препаратов РНК и комплексная ПЦР-диагностика вирусных (ротавирусы, норовирусы, астровирусы) патогенов осуществлялись автором совместно с А. Ю. Тикуновым и С. А. Бодневым. Бактериологический посев на Salmonella spp., Shigella spp. и условно-патогенную флору производился сотрудниками микробиологической лаборатории МУЗ ДГКБ №3. ПЦР-диагностика бактериальных патогенов {Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter) проводилась к.б.н. Т. Э. Юн. Создание базы данных, эпидемиологический анализ ротавирусной инфекции у детей раннего возраста за пятилетний период в Новосибирске и генотипирование выявленных изолятов ротавирусов выполнялись лично автором. Выделение препаратов РНК и генотипирование изолятов ротавирусов, выявленных в Омской области, проводилось автором лично. Секвенирование кДНК фрагментов генома ротавирусов, кодирующих белки VP4 и VP7, осуществлялось к.б.н. А. В. Качко и к.б.н. И. В. Бабкиным. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК четвертого и девятого фрагментов генома ротавирусов различных генотипов проводился автором лично.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы "Результаты и обсуждение", заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 41 рисунком, включает 22 таблицы и одно приложение. Библиография включает 445 работ: 55 — отечественных авторов и 390 - зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Жираковская, Елена Владимировна

5. ВЫВОДЫ

1. В структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику Новосибирска, ротавирусы группы А являлись основной этиологической причиной. В результате ПЦР-диагностики 4146 клинических проб ротавирусы были выявлены в 33,9 % (1405) случаях.

2. Ротавирусная моноинфекция была выявлена в 57 % случаев. В 43 % случаев диагностировалась микст-инфекция с бактериальными энтеропатогенами (22,4 %), норовирусами (9,7 %), астровирусами (5,1 %) и несколькими патогенами одновременно (5,8 %).

3. Исследование особенностей эпидемического процесса ротавирусной инфекции показало, что:

- наблюдалась выраженная сезонность эпидемического процесса ротавирусной инфекции в холодное время года, в среднем пик выявления ротавирусов группы А наблюдался с февраля по апрель;

- большинство госпитализированных детей с ротавирусной инфекцией были в возрасте от 3-х месяцев до полутора лет (87,1 %);

- ПЦР-диагностика 142 фекальных образцов от детей из группы сопоставления показала в 5,6 % случаев наличие ротавирусов группы А, что подтвердило возможность протекания ротавирусной инфекции у детей до 3-х месяцев в бессимптомной форме.

4. В структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику Новосибирска, ротавирусы группы С являлись достаточно редкой этиологической причиной. В результате ПЦР-диагностики 1462 клинических проб от госпитализированных детей до 3-х лет ротавирусы группы С были выявлены в 6 (0,4 %) случаях.

5. В результате генотипирования 738 изолятов, выделенных с июля 2003 по июнь 2008 г., впервые определена относительная встречаемость различных генотипов ротавирусов на территории Новосибирска: P[8]G1 (50,7%), P[4]G2 (11,5%), P[8]G3 (9,6%), P[8]G9 (6,9%), P[8]G4 (6,2 %). Выявлена динамика изменения генетического спектра популяции ротавирусов в течение пяти лет исследования.

6. Впервые проведен сравнительный анализ [PjG-генотипов ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске и Омске и Омской области. В эпидемический сезон 2007-08 гг. доминирующий в Новосибирске генотип P[8]G1 почти не встречался в Омске. Генотип P[8]G4, который преобладал в Омске, в то же время в Новосибирске был четвертым по встречаемости.

7. Впервые определены нуклеотидные последовательности к ДНК вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4, для 23 изолятов и девятого фрагмента генома, кодирующего белок VP7, для 45 изолятов ротавируса группы А, циркулировавших в Новосибирске и Омске. Филогенетический анализ этих последовательностей показал, что они формируют естественные подгруппы внутри каждого генотипа; изоляты, выделенные в течение одного эпидемического сезона, имеют высокую степень гомологии (97-99 %) соответствующих нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. .

8. Анализ нуклеотидных последовательностей вариабельной части четвертого фрагмента генома, кодирующей домен VP8* белка VP4 ротавирусов генотипа P[9]G3, выявленных при асимптоматической форме ротавирусной инфекции, показал наличие у них ряда точечных мутаций в участке связывания сиаловых кислот по сравнению с ротавирусом данного генотипа, выделенном при вирусном гастроэ нтерите. ш шшшт

Открыть ^t^ow

Объекты л. л Формы а Отчеты

Группы

Избранное

Л 2005-08

1 Вирусные .,. jjil диарее клинические данные контрольная группа основная группа симптомы температура и ЖКТ-синдромы Г основная rpyhna : форма

ЬГГЦ

Ж пробы пол Ц муж □ жен дата рождения ] дате 5а6опевания дата поступления дата выписки партия: код пациента*; неорг □ ясга-сад Q

Ь= возраст г выписка без выздоровления прием антибиотиков [ препарат: вскармливание грудное грудное до: смешанное искусственное Ц семья Q ДДУ Q выезд с территории проживания регион: отъезд: г^иезд:

Запись: (НЗЩ Г

3497 [Н] из 3497 = 1 рулпа сравнения : форма

-' Ь х партия: код пациенте: муж □ жен дата рождения неорг П Фа возраст дата заболевания дата поступления дата выписки клинически* диагноз:

Вскармливание грудное □ грудное до смешанное Q искусственное въезд с территории проживания Q регион от>еэд: приезд:

Вались; ИЗ |ТТ] из 143

-синдромы г фор».vi пробы: коа пациента*:

ЧСС ЧДД

АД

ШкСрвЛКв Q сутсг-№<е кслвблвнпвр.

С 1-2С 2'ЭС >ЭС □ □ □ □ омобы

Запись: | К II < ] | 3497 диарея : форма пробы: рн] из Э497 дни болея* 12 345 6789 10 >10 >15 ЖСТ-otupoH экажоз

3» □□□□□□□□□□□□ □ ОТ I П Ш

38,6-39 □ □□□□□□□□□□ □ □ ОГЭ □ □ □

М<Ю,5 □□□□□□□□□□□□ "«••«>

КМ» □□□□□□□□□□□ □ □ <» I Е ш

37,5 □□□□□□□□□□□ □ поэк □□□ <: > т код пациента*: стул на д/б-ни 1 Z 3 4 5 6 7 8 9 10 >10 >15

Оформленный □□□□□□□□□□□ □

Кашицвобразн П □□□□□□□□□□ □

Жидк каловый □□□□□□□□□□□□

Водянистый □□□□□□□□□□□ □

Ректплевок" □□□□□□□□□□□ □

Запись: (н][Т] I 3497 ► [Я] из 3497 примеси □ СЛИЗЬ

Пкровь

3 лож№)1е позывы Q тенезмы цвет

П физиол f~l зеленый □ желтый ^J черный симптомы : форма пробы: код пачивнтаЖ:

3 4 5 6 7 8 9 10 >10 >15

Q тошнота катаряеп □□□□□□□□ □ □ □ □□□□□□□□□ □□□□□□□□□ □□□□□□□□□ сопутствующее заболевание боли в животе Q

Q в элигастрии гол боли в незогэстрии □ миалгии | | в гилогастрии Ц артралгии другая клиническая симптоматика

Запись; ГЙРГГ] I [И] 3497 гробы: баканагеп еоэбуднтвль код пациента*:

Q бак полож П бакотрнц антчбиотис прочая терапия общий анализ кропи hb Эр Гкй П/я С/я Эоа М Г>**Ь СОЗ Геяатгжрмг бнохшическин анализ кроен обишй аиаш) «мн ночевий KpeaTww К

УЭИ брюиной полости заспоч»«г УЭИ ксорояогия ксностениня НЖ ЖК РК крак сгизь лак зрит яьш волокна цюстиге/ьи '-'УХь: [ЩПГ 3-197 СШ " 3497<

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты нашего исследования показали, что в Новосибирске ротавирусы группы А являются частой этиологической причиной ОКИ у детей раннего возраста - от 26 % до 40 % от всех случаев ОКИ в разные годы. Выявление случаев ротавирусного гастроэнтерита у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику, происходило на протяжении всего календарного года. Однако наблюдалась выраженная сезонность эпидемического процесса ротавирусной инфекции в холодное время года. В среднем сезонный подъем заболеваемости ротавирусным гастроэнтеритом в Новосибирске наступал в декабре и заканчивался в мае. Пик выявления ротавирусов наблюдался с февраля по апрель. Кроме этого, почти в 40 % случаев ротавирусной инфекции диагностировалась микст-инфекция, как с норовирусами и астровирусами, так и бактериальными энтеропатогенами. Наличие нескольких возбудителей меняло клиническую картину, свойственную моноинфекции, приводило к более тяжелому течению заболевания и увеличивало срок госпитализации.

В группе сопоставления (142 человека), в которую вошли дети, госпитализированные с острой респираторной инфекцией и не имевшие клинических проявлений кишечной инфекции, ротавирусы были выявлены всего в восьми копрофильтратах (5,6 %).

Анализ возрастной структуры обследованной группы детей показал, что ротавирусы достаточно редко выявлялись у детей с диареей младше трех месяцев жизни (6 %). Большинство (87 %) госпитализированных детей с ротавирусной инфекцией были в возрасте от 3-х месяцев до полутора лет. При этом у детей от года до 3-х лет в 50 % случаев именно ротавирусы являлись причиной госпитализации.

Для изучения молекулярно-генетического разнообразия ротавирусов группы А, циркулировавших в Новосибирске, было проведено генотипирование 738 изолятов ротавирусов, выявленных- с июля 2003 по июнь 2008 гг. В течение периода исследования циркулировали ротавирусы широко распространенных генотипов P[8]G1, P[8]G3, P[8]G4, P[8]G9, P[4]G2. В единичных случаях были выявлены редкие генотипы P[6]G4, P[9]G3, P[9]G4 и микст-инфекции.

Анализ данных генотипирования показал, что в Новосибирске в каждый эпидемический сезон доминировал широко распространенный во всем мире генотип P[8]G1, составлявший от 40 до 70% от всех генотипированных изолятов ротавируса. В тоже время наблюдался дрейф следующих по встречаемости генотипов. Генотип P[8]G9 мы впервые выявили в Новосибирске в феврале 2004 г. До августа 2005 г. он был вторым по встречаемости, затем его доля уменьшилась, и в 2008 году он выявлялся в единичных случаях. С сентября 2005 по август 2007 года вторым по встречаемости был генотип P[8]G3, тогда как в сезон 2003-04 гг. он не был выявлен ни разу. В 2007-08 гг. вторым стал генотип P[4]G2, который в предыдущие эпидемические сезоны встречался реже. В этот же период третьим по частоте выявления стал генотип P[8]G4, хотя до этого его доля была не велика.

Поскольку существует региональная вариабельность преобладающих генотипов, был проведен сравнительный анализ [PJG-генотипов ротавирусов группы А, циркулировавших в Новосибирске и соседней Омской области, расположенной в том же климатическом поясе. В течение двух эпидемических сезонов спектр генотипов, циркулировавших в них ротавирусов, отличался. Причем в 2007-08 гг. преобладающий в Новосибирске генотип P[8]G1 в Омске почти не встречался. А самым распространенный в Омске генотип P[8]G4 в Новосибирске был четвертым по встречаемости.

При анализе филогенетических связей изученных нами изолятов со штаммами, представленными в базе данных GenBank (NCBI, США), показано, что они формируют естественные подгруппы внутри каждого генотипа ротавирусов. Изоляты, выделенные в течение одного эпидемического сезона, имеют высокую степень гомологии (98-99 %) соответствующих нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

При филогенетическом анализе был также выявлен случай завозного инфицирования ротавирусом генотипа P[8]G1 (изолят RUS-Nov06-1486), который относится к редкой группе P[8-III], тогда как в Новосибирске циркулировали вирусы подгруппы Р[8-ПВ].

В группе сопоставления весной 2006 г. в пробах от двух детей без клинических проявлений кишечной инфекции были выявлены ротавирусы, имеющие редко встречающийся генотип P[9]G3. Сравнительный анализ конденсированных выравниваний выведенных аминокислотных последовательностей домена VP8* белка VP4 изолятов RUS-Nov06-K2 и RUS-Nov06-K10 показал, что в регионе, отвечающем за связывание сиаловых кислот (78-203 а.о.) есть множественные замены, которые, возможно, нарушили формирование третичной структуры белка и привели к снижению вирулентности ротавирусов. В июне 2007 г. из копрофильтрата от ребенка с кишечной инфекцией был выявлен изолят RUS-Nov07-2253 также генотипа P[9]G3. Сравнительный анализ выведенных аминокислотных последовательностей домена VP8* показал высокую степень гомологии (96,4%) с изолятом RUS-Nov06-K10, но последовательность в области 78-203 а.о. не содержала замен, нарушающих структуру белка.

Филогенетический анализ показал, что изолят RUS-Nov05-394 генотипа P[6]G4 имеет высокую степень гомологии с ротавирусами, которые имеют филогенетические связи с ротавирусами свиньи. За весь четырехлетний период исследования в Новосибирске было выявлено только два изолята генотипа P[6]G4, причем в фекальных пробах от детей, которые непосредственно перед заболеванием выезжали в сельскую местность. Вероятно, редкое выявление ротавируса данного генотипа в Новосибирске может быть связано с отсутствием в большом городе возможности частых контактов с сельскохозяйственными животными.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жираковская, Елена Владимировна, Кольцово

1. Анисимова Ю.Н., Цинзерлинг А.В. Дзюблик И.В. Инфекционно-токсический шок при генерализованной ротавирусной инфекции у новорожденных // Архив патологии. 1993. - Т. 55. - № 5- С. 32-38.

2. Беляев А.Л. Ротавирусный гастроэнтерит, как внутрибольничная вирусная инфекция // РЭТ-Инфо 2006. - Т. 59. - № 3. - URL: http://lib2005.rat-info.ru/ret info 3 2006.shtml

3. Блохина Т.А., Рябцева В.А., Аваков А.А. и др. Ротавирусная инфекция в родильном доме по данным вирусологических и серологических исследований // Вопросы вирусологии. 1991. - № 6. - С. 483-486.

4. Богомолов Б.П. Острые кишечные инфекции // Инфекционные болезни: неотложная диагностика, лечение, профилактика // Ньюдиамед, Москва. -2007.-С. 129-615.

5. Боковой А.Г., Карпович Л.Г., Евреинова Е.Э. и др. Респираторный сшгдром у детей, больных ротавирусным гастроэнтеритом // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - № 4. - С. 23-26.

6. Буланова И.А., Титова Л.В., Феклисова Л.В. и др. Ротавирусная инфекция в условиях Крайнего Севера // Экология человека. 2007. -№ 3. - С. 24-27.

7. Буркин А.В., Харченко Г.А. Клинико-эпидемиологическая характеристика острых кишечных инфекций у детей Нижнего Поволжья // ЖМЭИ 2006. -№ 1. - С. 69-72.

8. Васильев Б.Я., Семенов II.B., Сухинин В.П. и др. Сравнение методов лабораторной диагностики ротавирусных гастроэнтеритов в условиях практической лаборатории // Вопросы вирусологии. 1989. - Т. 34. - № 2. -С. 247-249.

9. Васильев Б.Я., Семенов Н.В., Новикова Н.А. и др. Элекгрофоретическая гетерогенность популяции ротавирусов, выделенных в Ленинграде в осенне-зимний сезон 1986-1987 гг. // Вопросы вирусологии. 1990. - Т. 35. -№2.-С. 156-157.

10. Васильев Б.Я., Москвин А.А., Семенов Н.В. и др. Молекулярная эпидемиология ротавирусов, циркулировавших среди населения Санкт-Петербурга в период с 1986 по 1991 г. // Вопросы вирусологии. 1995. - Т. 40. -№ 3.- С. 126-129.

11. Васильев Б.Я., Грицко Р.Ю., Марченко Л.Г., Васильева Р.И. Вирусоносительство при ротавирусной инфекции // Вопросы вирусологии. -1996.-№ 6.-С. 265-267.

12. Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция // Лань, Санкт-Петербург. 2000.- С. 272.

13. Ващукова С.С., Макарова Н.Г., Галко Н.В. и др. Материалы к изучению эпидемиологии ротавирусной инфекции в Ленинграде // ЖМЭИ 1988. -№ 11.-С. 41-45.

14. Гиневская В.А., Шекоян Л.А., Хаустов В.И. и др. Обнаружение ротавирусного антигена в клиническом материале и объектах окружающей среды с помощью различных вариантов иммуноферментного анализа // Вопросы вирусологии. 1988. - Т. 33. - № 4. - С. 493-497.15