Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов

Фёдорова, Оксана Фёдоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов"

на правах рукописи

Фёдорова Оксана Фёдоровна

Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных в[Р] типов

03 00.06. - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»

Научный руководитель: доктор биологических наук

Новикова Надежда Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Королев Михаил Борисович

кандидат медицинских наук Подколзин Александр Тихонович

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский

институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ.

Защита состоится: » ¿¿¿€3 2006 г. в час на

заседании диссертационного совета Д. 001.026 01. при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П Чумакова» РАМН

Автореферат разослан:

бии^ЫЛ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.А. Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ротавирусы (семейство Reovmdae, род Rotavirus) являются основным этиологическим агентом острого гастроэнтерита у детей первых лет жизни Анализ исследований, опубликованных в период с 1986 по 2000 годы показал, что каждый год в мире регистрируется 111 млн эпизодов ротавирусного гастроэнтерита, 25 млн визитов в клинику, 2 млн госпитализаций и 352000-592000 (в среднем 440 тыс) смертей среди детей в возрасте до 5 лет [Parashar, 2003], что определяет необходимость разработки ротавирусной вакцины и совершенствования эпиднадзора за инфекцией К настоящему времени в мире накоплена обширная информация об экстраординарном генетическом и антигенном многообразии ротавирусов. Среди ротавирусов человека группы А идентифицированы 10 G серотипов (детерминируются гликопротеином VP7), 9 «Р»-серотипов (детерминируются протеазочувствительным белком VP4) и 11 [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов ротавируса, засчет возникновения различных комбинаций G и [Р] [Santos, 2005]

В связи с этим для разработки универсальной вакцины и оценки эффективности уже разработанных вакцин необходимо знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией ротавирусов разных G[P] типов Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [Wood, 2005] Однако в России научные работы подобного плана не проводятся Ранее в Нижегородском НИИЭМ было проведено изучение генетических и антигенных вариантов РВ, доминировавших на Европейской территории России в 1984-1996 гг Были получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции ротавирусов основных G серотипов и

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С-Птроург 09 2U0¿knr/-ао

прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта вируса к другому. В то же время исследований по изучению разнообразия [Р]-генотипов ротавируса, С[Р] ассоциаций, их распределению и установлению особенностей смены [Р]-генотипов РВ, не проводилось

Цель исследования: оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов, изучение временных особенностей циркуляции ротавирусов разных 0[Р] типов и их молекулярно-биологическая характеристика.

Задачи исследования: 1 Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для выявления гена УР4 ротавирусов группы А и дать оценку его эффективности

2. Разработать праймеры для идентификации [Р]-генотипов и Р[8] субтипов ротавирусов.

3 Определить электрофоретипы РНК и 0[Р] типы ротавирусов, обнаруженных на территориях г Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в период 1997-05 гг., рассчитать их относительное распределение.

4. Изучить особенности смены доминирования субтипов Р[8]-1 и Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции ротавирусов 01 Р[8] типа.

5 Дать сравнительную характеристику клинических проявлений инфекции, вызванной ротавирусами генотипов С1Р[8]-1 и С1Р[8]-2

6. Охарактеризовать молекулярно-биологические свойства ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Научная новизна и практическая значимость работы: Оптимизирован метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ротавирусов разных электрофоретипов, эффективный в отношении штаммов, актуальных для России, что может служить основой для создания диагностической амплификационной тест-системы.

Впервые определен спектр 0[Р] типов ротавируса, идентифицированных на двух территориях Нижегородской области в 1997-05 гг. Территории городов Нижний Новгород и Дзержинск являются единственными в Российской Федерации, для которых установлен антигенный профиль природных штаммов РВ, что может быть использовано для оценки эффективности применения разработанных в мире ротавирусных вакцин

Разработан способ субтипирования аллелей гена УР4 генотипа Р[8] с использованием ПЦР Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года).

Разработана новая технология С[Р]-генотипирования ротавирусов с использованием ПЦР, включающая: набор оригинальных праймеров, совместимых для мультиплексной постановки, контрольную постановку и универсальную программу амплификации Рекомендована к утверждению расширенным заседанием Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ (Пр. № 168-уч. от 6 декабря 2004 года).

Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] различия в выраженности ОРВИ при клинических проявлениях ротавирусной инфекции. Показано, что РВ-01Р[8]-2 характеризуются слабой выраженностью или отсутствием симптомов поражений слизистых верхних дыхательных путей.

Выявлен и охарактеризован новый вариант ротавируса С9Р[6]М8Р4(А), выделенный от новорожденных с бессимптомной формой инфекции

Впервые определена первичная структура гена трех российских

изолятов ротавируса с генотипом 09Р[6]К8Р4(А) (00270101, 00270102, 00270103), что расширяет представления о вариабельности гена энтеротоксина ^Р4 ротавируса в мире.

Внедрение результатов исследования в практику:

В процессе работы была установлена этиологическая роль РВ в возникновении 2454 эпизодов ОКИ. Результаты использованы в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты использовались лечащим врачом для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированные и разработанные праймеры для обнаружения РНК ротавирусов группы А (11о4-1, Яо4-2), для идентификации [Р]-генотипа (Р[4]Л, Р[8]1*) и субгенотипа Р[8] (Я-Р[8]-1, Я-Р[8]-2), обеспечивают генотипирование штаммов ротавируса, актуальных для территорий России

2. Спектр С[Р] типов ротавирусов, циркулировавших среди детей на территории Нижегородской области в период 1997-05 гг, включает основные С1-4 серотипы и Р[4], Р[6], Р[8], Р[9] генотипы, представленные семью С[Р] комбинациями, распределение которых изменяется во времени

3 Особенностью циркуляции ротавируса G1P[8] является постоянное доминирование, поддерживаемое сменой субтипа Р[8]-генотипа, сопровождающейся изменениями в клинических проявлениях инфекции

4 Ротавирус, обнаруженный у новорожденных детей с бессимптомной формой инфекции имеет генотип G9P[6]NSP4(A) и реорганизованный 11 -й геномный сегмент

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены и обсуждены

• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г Н Новгород, 2002 г ),

• на заседании Нижегородского научного биохимического общества (г Н. Новгород, 2004 г);

• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И Н Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 15 декабря 2005 г Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 192 источника литературы отечественных и зарубежных авторов Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ им. академика ИН. Блохиной в качестве фрагмента № 034/087/007-002 01 к договору с МЗ РФ № 034/087/007 «Новые технологии в профилактике, диагностике и лечении инфекционных заболеваний и их использование в эпиднадзоре».

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

В работе использовали:

• образцы фекалий детей в возрасте 0-14 лет с диагнозом ОКИ, госпитализированных в инфекционные стационары г Нижнего Новгорода, г Дзержинска Нижегородской области в период 1997-05 гг. и г. Омска в период 2002-04 гг Всего исследовано 6627 проб

• типовые штаммы ротавируса группы А - Wa (G1P[8]), DS-1 (G2P[4]), SAH (G3P[1]), любезно предоставленные К-А. Петерсон (Национальная бактериологическая лаборатория Швеции), природные изоляты РВ группы С; вирус гепатита А (шт HAS15); полиовирус вакцинного происхождения (Вакцина полиомиелитная пероральная 1, 2, 3 типов, производства ФГУП ПИПВЭ им М П. Чумакова РАМН)

• нуклеотидные последовательности геномных кДНК ротавирусов, собранных в базе данных GenBank /ЕМВЬ/ DDBJ

• компьютерные программы «Oligo 4,0», 1989-91 (США), «GeneDoc, версия 2 5 000», 1997 (США), «ClustalW», «Biostat, версия 4.03», 1998 (США)

Иммуноферментный анализ проводили с использованием тест-системы «Рота-антиген» производства фирмы НПП «Аквапаст» г С-Петербург

Прямую электронную микроскопию осветленных суспензий копроматериала осуществляли по методу флотации [Королев, 1980] Препараты контрастировали 2% фосфорно-вольфрамовой кислотой (pH 4,0) или 1% раствором уранилацетата и просматривали на электронном микроскопе JEM-100Х («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV и инструментальном увеличении 53000.

Экстракцию РНК и её электрофоретиттирование методом электрофореза в ПААГ осуществляли, как описано [Новикова, Епифанова, 1994]. РНК ротавирусов для постановки ОТ-ПЦР выделяли по способу Мейхи (1988 г), в собственной модификации Олигонуклеотидные праймеры для постановки ОТ-ПЦР синтезировали в фирме «Литех», Москва Продукты Г1ЦР анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле

Определение G и [Р] типа ротавируса проводили согласно схемам предложенным Das В К с соавторами (1994 г) и Gentsch J R с соавторами (1992 г.) в собственной модификации

Определение нуклеотидной последовательности гена NSP4 осуществляли в автоматическом режиме на приборе АВТ Prism 7000, согласно рекомендациям производителя

Статистическую обработку осуществляли общепринятыми методами с использованием коэффициента Стьюдента и непарамегрического критерия у2 [Гланц, 1999]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методологии [Р]-генотипирования ротавирусов

Методология идентификации G серотипов и [Р]-генотипов ротавируса с использованием ПЦР требует постоянной оптимизации праймеров, связанной с высоким уровнем изменчивости их генома В настоящей работе проведена разработка унифицированной методологии, позволяющей проводить обнаружение РНК ротавирусов в исследуемом материале, [Р]-генотипирование и субтипирование природных штаммов.

На первом этапе работы с использованием программы GeneDoc (версия 2.5 ООО) был проведен сравнительный анализ 56-ти выровненных полных нуклеотидных последовательностей гена VP4 ротавирусов человека и животных, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ Установлено, что в области универсальных праймеров для обнаружения РНК гена VP4, предложенных Gentsch J R с соавторами в 1992 году (праймеры conl и соп2) наблюдается вариабельность последовательностей Данные праймеры оптимизированы с учетом имеющихся нуклеотидных замен путем введения вырожденных оснований и удаления концевых нуклеотидов Оптимизированные праймеры Ro4-l, Ro4-2 фланкируют фрагмент гена VP4 размером 211 но, расположенный в области с 676 по 887 н о Сравнительный анализ последовательностей праймеров и геномных последовательностей ряда кишечных вирусов (энтеровирусов, астровирусов, калицивирусов, аденовирусов, ротавирусов групп А и С), показал, что оптимизированные олигонуклеотиды специфичны в отношении гена VP4 ротавирусов группы А человека и животных и не имеют существенной гомологии с другими нуклеотидными последовательностями Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 150-ти коллекционных природных изолятах ротавируса группы А, имеющих различные

электрофоретипы РНК - «длинные», геногруппа \¥а; «короткие», геногруппа 05-1; «широкие», геногруппа А11-1; «аномальные» (Рис 1) В результате однораундовой ПЦР с использованием оптимизированной версии праймеров РНК ротавирусов с различными ЭФ-типами РНК была обнаружена в 100% случаев, что подтверждает их универсальность в отношении различных аллелей гена УР4 (Рис 2).

Рис 1 Профили миграции сегментов генома

РНК различных электрофоретипов ОТ-ПЦР

ротавирусов человека, ротавируса.

1 - «длинный» ЭФ-тип РНК ротавирусов

2 - «короткий» -II-

3 - «широкий» -//-полиовируса

4 - «аномальный» -II-

5 - ротавирус группы С HAS 15);

(pUC19/Msp1).

Рис. 2 Результаты амплификации кишечных вирусов методом для обнаружения гена VP4

1 -5 - РНК различных ЭФ-типов

(как на рис 1),

6 - РНК вакцинного

7 - РНК энтеровируса ECHO 24; 8 - РНК вируса гепатита А (шт.

М - маркер размерности ДНК

Проведено сравнение эффективности обнаружения ротавирусов у больных с диагнозом острый гастроэнтерит с использованием разработанной методики ОТ-ПЦР и методов РНК-ПААГ и ИФА, основанного на поликлональных антителах При исследовании случайной выборки, состоящей из 233 образцов фекалий от детей с ОКИ ротавирусы были обнаружены методом ИФА в 47,6±3,3 % случаев, методом РНК-ПААГ - в 45,9i3,3 %, с использованием ОТ-ПЦР гена VP4 - в 57,9+3,2 % случаев (р-^0,01) Достоверно более высокий процент положительных находок, полученных при использовании ОТ-ПЦР. наглядно демонстрирует относительно большую результативность метода генодиагностики, которая, несомненно, связана с его высокой аналитической чувствительностью

Для установления относительной чувствительности метода ОТ-ПЦР был исследован 151 образец фекалий, положительный на ротавирусы по итогам трех методов Установлено, что метод ОТ-ПЦР, основанный на праймерах Ro4-1 и Ro4-2, при индикации РВ в клиническом материале обладает относительной чувствительностью, превосходящей метод РНК-ПААГ на 18,9%, метод ИФА -на 24,5% Полученные результаты имеют практическое значение, т к. оптимизированная лабораторная методика, адаптированная к российским штаммам ротавируса, может служить основой для конструирования диагностической тест-системы на основе ОТ-ПЦР

Следующим этапом работы явилась оценка эффективности известных методик и схем G и [Р] геногипирования и их применимости для анализа местных штаммов ротавируса Методология определения G серотипа с использованием ОТ-ПЦР детально описана в литературе, в частности в работах Gouvea V с соавторами (1990 г) и Das В К с соавторами (1994 г) Предложенные этими авторами методики позволяют определять G1-G4 и G9 серотипы в мультиплексных постановках В нашей работе определение принадлежности ротавируса к G серотипу мы проводили с использованием схемы Das В К, включающей один общий F-праймер и несколько типовых R-праймеров Данная схема была оптимизирована введением ттраймера для идентификации серотипа G3 в совместной работе с к б н. Епифановой Н В

Для определения [Р]-генотипа штаммов ротавируса использовали схему, предложенную Gentsch J R. с соавторами (1992 г). Однако при анализе выборки штаммов ротавируса, выделенных в один эпидсезон на одной территории и имеющих один ЭФ-тип РНК, что предполагает их клональное

родство, часть штаммов типировалась праймером, определяющим Р[8]-генотип, а часгь нет. В другом случае, РВ с «коротким» ЭФ-типом РНК, которые, как правило, имеют генотип Р[4], также часто не обнаруживалась при использовании специфичного для этого генотипа праймера. Неудачи по [Р]-генотипированию РВ, циркулирующих в настоящее время на территории Нижегородской области, а также расширение информации о нуклеотидных последовательностях гена УР4, представленной в базе данных СепВапк/ЕМВЬ/ООВ1 к настоящему времени, послужили основанием для проведения собственного сравнительного анализа гена УР4 и оптимизации типовых олигонуклеотидов. Был проведен сравнительный анализ 56-ти полных выровненных нуклеотидных последовательностей гена УР4 в области типовых праймеров Установлено, что наибольшее количество нуклеотидных замен находится в регионах, принадлежащих олигонуклеотидам, определяющим генотипы Р[8] и Р[4]. С учетом обнаруженной вариабельности последовательности нуклеотидов в регионах типовых праймеров нами предложены модифицированные праймеры К-Р[4|т и К-Р[8]т Апробация данных версий олигонуклеотидов показала их эффективность в отношении вариантов ротавирусов, актуальных для изучаемых территорий и дававших неоднозначные результаты при использовании исходных версий праймеров.

Кроме модификации праймеров для обнаружения РНК гена УР4 и идентификации генотипов Р[8], Р[4] и 03, была разработана универсальная программа амплификации специфических фрагментов кДНК и подобраны пулы совместимых типовых праймеров для мультиплексной постановки. Разработанная методология определения С[Р] типа и метод электрофоретипирования РНК ротавирусов были использованы для изучения природных изолятов ротавируса, распространенных на территориях двух городов Нижегородской области в период 1997-05 г. и выделенных от новорожденных детей из г. Омска.

2. Особенности циркуляции ротавирусов разных С[Р] типов в Нижегородской области в 1997-05 гг.

Методом ЭФ в ПААГ было исследовано 6545 образцов фекалий от детей в возрасте до 14 лет с диагнозом ОКИ, включающих 4950 образцов из г. Н Новгорода и 1595 образцов из г Дзержинска. Ротавирусы были обнаружены в

35,8±0,68% и 46,9^1,25% (р^0,001) случаев, соответственно Среди заболевших 91% составили дети в возрасте до 3-х лет Среднемноголетний показатель заболеваемости РВГЭ детей в данной возрастной группе составил для г Н Новгорода - 7 о/оо, для г Дзержинска - 15 о/оо Проведено изучение генетической гетерогенности обнаруженных ротавирусов. С использованием электрофоретипирования РНК в ПААГ ЭФ-тип РНК был определен у 2454 изолятов РВ, идентифицировано 60 профилей миграции сегментов РНК Выявлено 35 вариантов «длинных» Wa-подобных, 12 вариантов «коротких» DS-1-подобных и 13 вариантов «широких» Аи-1 подобных ЭФ-типов РНК Следует отметить, что доминирующие генетические варианты ротавируса, обнаруженные у детей из городов Н Новгород и Дзержинск, были идентичны Проведено определение G 1-4, 9 серотипов и Р[4, 6, 8, 9]-генотипов ротавирусов с доминирующими и необычными ЭФ-типами РНК, собранных в анализируемый период времени на обеих территориях Проанализирован 1721 изоляг РВ, выделешгый от детей, госпитализированных в стационары г Н. Новгорода и 733 изолята РВ из i Дзержинска. В ходе исследования установлено, что на обеих территориях выявляются ротавирусы основных G1-4 серотипов. распределение которых по суммарным данным выразилось следующим соотношением G1 - 81,3%; G2 - 8,9%; G3 - 6,8%; G4 - 2,6%; G9 - 0%; н/т - 0,4% Рассчитано распределение [Р]-генотипов ротавируса: Р[8] -85,8 %; Р[4] - 8,9 %; Р[6] - 3,5 %; Р[9] - 1,3%; н/т - 0,4%. Антигенный спектр РВ представлен как минимум 7-ю G[P] комбинациями Распределение РВ разных G[P] гилов показано на рисунке 3 Данное распределение, рассчитанное нами впервые и свидетельствующее об абсолютном доминировании ротавируса G1P[8], соответствует распределению типов ротавируса, рассчитанному для территорий Европы, Северной Америки и Австралии в аналогичный период времени [Santos, 2005]

По результатам электрофоретипирования РНК и G[P] титтирования изолятов ротавируса проведен анализ многолетней динамики частоты обнаружения РВ разных G[P] типов на двух территориях Нижегородской области в период 1997-2005 гг Пример такого анализа представлен на рисунке 4 Анализ показал, что на обеих территориях обнаружен одинаковый спектр

0[Р] типов и одинаковая динамика частоты их обнаружения Установлено, что активная циркуляция РВ-С1Р[8] продолжалась на территориях г Н. Новгорода и г. Дзержинска на протяжении всего 8-летнего периода наблюдения.

Рис 3 Распределение 0[Р] типов ротавируса группы А, обнаруженных у детей г Н Новгорода и г Дзержинска в период 1997-05 гг

Наибольшее число случаев РВГЭ, вызванного РВ-С1Р[8], зарегистрировано в эпидсезон 2001-02 гг На фоне стабильного доминирования РВ-01Р[8] типа в 1997-04 гг, в последние годы на обеих территориях нами отмечено перераспределение доминирования в[Р] типов ротавируса Так в г Н. Новгороде в эпидсезон 2003-04 гг. подъем заболеваемости был вызван РВ-С1Р[6] (21,8%), а в эпидсезон 2004-05 гг. заболеваемость была обусловлена ротавирусами трех антигенных типов (С2Р[4], ОЗР[8], С4Р[8]). Доля 01 Р[8] составила только 29,7% Аналогичная ситуация наблюдалась и в г Дзержинске. В эпидсезон 2004-05 гг., подъем заболеваемости там был вызван РВ-С2Р[4] (68,3%), также циркулировали РВ других типов. Доля С1Р[8] составила 16,3%

Представленные результаты свидетельствуют о смене доминирующего типа в сезон 2004-05 гг на обеих территориях Распределение в[Р] типов в сезон 2004-05 гг по суммарным данным было следующим' С1Р[8|-24%, С2Р[4]-37%, С,ЗР[8]-21%, СЗР[9]-Э,8%, С4Р[81-12%, н/т-2%.

120 0

1000

60 0

800

20 0

400

||<32Р[4]

|р54Р18]-2

§ННТ

таР(6 8 9]

1997-98 1998-99 99-2000 2000-01 2001-02 2002-03 2003-04 2004-05

Рис 4 Динамика частоты обнаружения ротавирусов разных 0[Р] типов в г Н Новгороде в 1997-2005 гг

Представленный спектр С[Р] типов ротавируса свидетельствует об исчезновении штаммов С1Р[6] и вЗР[6] типов, снижении активности циркуляции С1Р[8] и увеличении доли вариантов вируса П2Р[4] Получешгые результаты могут свидетельствовать о том, что период доминирования серотипа С1 в популяции ротавируса на территориях г Н Новгорода и г Дзержинска заканчивается Увеличение доли разнообразных антигенных типов в эпидсезон 2004-05 гг. может служить предвестником смены доминирующего С[Р] типа ротавируса.

Представленные результаты изучения спектра С[Р] типов ротавируса с использованием разработанной методологии ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК, являются первым сообщением по изучению распределения С[Р] типов ротавируса в России, что имеет значение для теоретической оценки эффективности созданных в мире ротавирусных вакцин и разработки стратегии вакцинопрофилактики РВГЭ.

При анализе ЭФ-типов РНК изолятов ротавируса одного С[Р] типа было установлено существование в пределах РВ-01Р[8] генетических вариантов, кардинально различающихся электрофоретической подвижностью 4-го геномного сегмента Обнаружены варианты вируса с медленномигрируютцим и быстромигрирующим геном УР4, что свидетельствовало о существовании у штаммов ротавируса как минимум двух аллелей гена, определяющих Р[8]

генотип. К началу наших исследований было уже известно о существовании, по данным разных авторов, 2-3-х субгенотипов Р[8], которые дифференцировали с использованием секвенирования соответствующих участков гена УР4 [СипН1Те, 2002; Соиуса, 1999; Иигпга-Сотага, 2000]. Была поставлена задача разработать праймеры для идентификации субгенотилов Р[8] методом ПЦР Был проведен сравнительный анализ 33-х выровненных нуклеотидных последовательностей гена УР4 ротавирусов Р[8] генотипа Сравнивали области, кодирующее консервативные аминокислоты, соответствующие трем известным субтипам По результатам анализа нами впервые сконструированы обратные праймеры Р[8]-Ш и Р|8|-2Я, которые позволяют проводить дифференциацию субтипов ротавируса генотипа Р[8] с использованием ПЦР, не применяя при этом секвенирование Предложенные праймеры в однораундовой ПЦР с общим Р-праймером, фланкируют участок гена УР4 размером 410 пн Оценку специфичности предложенных праймеров проводили с использованием референтного ротавируса человека - шт. имеющего субтип Р[8]-1. В настоящем исследовании нами установлена строгая корреляция между электрофоретической подвижностью четвертого геномного сегмента и субтипом последовательности гена УР4 РНК всех исследуемых изолятов ротавируса с 3-м, 4-м, 34-м ЭФ-типом РНК имеющая медггенномитрирующий четвертый сегмент, детектировалась с использованием праймера, специфичного в отношении субгенотипа Р[8]-1. РНК, имеющая быстромигрирующий четвертый сегмент (61-й, 72-й ЭФ-тип), детектировалась только с праймером, специфичным в отношении субгенотипа Р[8]-2 Способ определения субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2 с использованием ПЦР предложен нами впервые. Новизна подтверждена патентом № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 г

Разработка нового методического приема дифференциации штаммов ротавируса позволила нам более углубленно изучить штаммы РВ-С1Р[8] Проведен анализ ассоциаций различных субгенотипов Р[8] с в серотипом. Анализ комбинаций различных в серотипов с субтипами Р[8] показал, что и тот и другой субтипы были ассоциированы с серотипами 01. СЗ и 04, основная масса которых была связана с субтипом Р[8]-2. Комбинации ОЗР[8]-1 и С4Р[8]-1 были представлены только единичными изолятами Рассчитано соотношение субгенотипов Р[8], показавшее, что в г. Н Новгороде 12,3% изолятов составили варианты РВ-Р[8]-1 и 73,5% - РВ-Р[8]-2 В г Дзержинске

частота обнаружения субаллелей гена УР4 генотипа Р[8] составила 7,0 % для РВ-Р[8]-1 и 78,6% для РВ-Р[8]-2. Таким образом, установлено, что в 1997-05 гг на территориях г Н. Новгорода и г. Дзержинска абсолютно-доминирующее положение занимали штаммы РВ-вТ Р[8]-2 - 68,0%

Проанализирована многолетняя динамика циркуляции РВ-01 по материалам текущего и ретроспективного определения субгенотипа Р[8] Установлено, что в процессе циркуляции, происходило постепенное замещение вариантов РВ-С1Р[8]-1 (3-й, 4-й, 34-й ЭФ-тип РНК) на штаммы РВ-С1Р[8]-2 (61-й, 72-й ЭФ-тип РНК). На полное замещение штаммов с новым субгенотипом Р[8] ротавирусу серотипа ОI потребовалось 15 эпидемических лет, в течение которою РВ-С1Р[8]-2 трша сменил пять генетических вариантов (Рис 5)

72 72 72 72 72 72 61 61 61 61 61 61 61 48 48 48 48 48 48 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 46 44444444444 44 4 . 333333333333 333

Рис 5 Смена субтипов Р[8]-1/Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции

РВ-С1Р[8]

- доля штаммов РВ 01 Р[8]-1 (3. 4, ЭФ-типы РНК), ВШШВЯ - доля штаммов РВ 01Р[8]-2 (46, 48, 61, 72 ЭФ-типы РНК), Г 1 - доля штаммов РВ 01Р[6]

Представляется вероятным, что смена субгенотипа Р[8] поддерживала активную циркуляцию РВ серотипа 01 Нами установлено, что изучаемый период времени абсолютно-доминирующее положение в г. Н Новгороде занял

61-й генетический вариант ротавируса С1Р[8]-2 В период доминирования в 2001-02 гг РВ С1Р[8]-2-61 вызвал подъем заболеваемости РВГЭ, обусловив 75% госпитализаций

Представляло научный интерес оценить клинические особенности РВГЭ, вызванного РВ С1Р[8]-2-(61) Проведен анализ выписок из амбулаторных карт 51-го ребенка с моноротавирусной инфекцией, выделявших РВ 01Р[8]-2-(61) Результаты частоты регистрации максимально выраженных и продолжительных симптомов РВГЭ при инфицировании 01Р[8]-2-(61) сравнили с аналогичными архивными показателями, установленными для С1Р[8]-1-(3) Установлено, что при инфицировании детей РВ-01Р[8]-2-61 достоверно чаще наблюдался диарейный стул в течение более 4-х дней, многократная рвота наблюдалась достоверно реже, симптомы ОРВИ зарегистрированы у достоверно меньшего числа детей и были выражены слабо Ведущим синдромом в определении тяжести заболевания был токсикоз с эксикозом Это отличало ротавирус С1Р[8]-2-(61) от ротавируса 01Р[8]-1-(3), при инфицировании которым ведущим синдромом, определяющим тяжесть течения заболевания, был токсикоз в сочетании с ОРВИ По всей вероятности, различия в интенсивности диарейного симптома в частоте проявлений и выраженности поражений слизистых верхних дыхательных путей при инфицировании ротавирусами С1Р[8]-] и С1Р[8]-2 не связаны с О серотиповой принадлежностью вируса, а определяются геном УР4, и коррелируют с Р[8]-субтиповой принадлежностью штамма.

3. Молекулярно-биологическая характеристика ротавирусов, выделенных

от новорожденных детей

Дана молекулярно-биологическая характеристика ротавирусов обнаруженных, у новорожденных, госпитализированных в ГКПЦ г Омска Обследование новорожденных на ротавирусный антиген методом ИФА проводилось сотрудниками Омской государственной медицинской академии совместно с сотрудниками Центра ГСЭН в Омской области В настоящей работе исследовано 82 образца фекалий детей, положительных на ротавирусы, собранных в период с мая 2002 года по сентябрь 2004 года. Изоляты РВ, были изучены с использованием молекулярно-генетических методов С[Р] типирования, ЭФ типирования РНК, секвенирования гена ^Р4

При электрофоретипировании РНК неонаталънъгх изолятов РВ обнаружено два различных профиля миграции сегментов (Рис 6)

Классы Сегменты 1 2

Рис 6 Электрофореграмма РНК ротавирусов, обнаруженных в пробах стула новорожденных детей

1 - типичный профиль РНК РВ-С1Р[8],

2 - аномальный профиль РНК РВ С9Р[6|

В 20,7 % случаев идентифицирован типичный для РВ группы А «длинный» электрофоретип РНК, который характеризовался быстромигрирующим 4-м сегментом и соответствовал 72-му ЭФ-типу РНК нижегородских штаммов Другие изоляты РВ (79,3%) имели необычный профиль миграции сегментов' четвертый класс генов содержал один сегмент, а второй класс три Изменение стандартной картины распределения сегментов РНК на классы, характерной для РВ группы А, свидетельствует о наличии геномных перестроек у данных штаммов Находки аномальных штаммов РВ, у которых происходит перемещение генов из одного класса в другой, описаны в литературе [Саик, 1992;Ма15ш, 1990; МаШоп, 1990].

С использованием разработанной нами методологии 0[Р] типирования установлено, что РВ с типичным ЭФ-типом РНК имели генотип С1Р[8] Следует отметить, что принадлежность штаммов к генотипу Р[8] была установлена только с использованием модифицированного нами праймера - Л-Р[8]ш. Все изоляты РВ с генотипом Р[8] имели субгенотип Р[8]-2 Это может свидетельствовать о том, что РВ 01Р[8]-2 специфичности в изучаемый период времени циркулировали не только на территории городов Нижегородской области, но и на столь удаленной территории, как г Омск

Изоляты ротавируса с аномальным профилем миграции сегментов имели генотип <39Р[6] Охарактеризованный необычный генетический вариант

ротавируса генотипа G9P[6] является первым представителем штаммов серотипа G9, обнаруженным у детей России

Ротавирус генотипа G9P[6] по данным литературы является наиболее часто выявляемым при бессимптомной инфекции у новорожденных [Hoshino, 2003; T.inhares, 2002, Santos, 2005] На основании выписок из историй болезни 29 детей (предоставлены Стасенко В. Л) в возрасте 7-10 дней, госпитализированных в ГКПЦ, проведен анализ клинических проявлений РВИ у новорожденных, выделявших PB-G9P[6] и PB-G1P[8] Установлено, что у детей, выделявших PB-G9P[6], инфекция протекала бессимптомно Для проверки гипотезы о существовании связи между G9P[6] типом и бессимптомным течением инфекции был рассчитан непараметрический критерий х, который оказался равным 10,1 (р=0,001) Эти значения свидетельствуют, что гипотеза о существовании связи между G9P[6] типом и бессимптомным течением инфекции верна

Мы предположили, что бессимптомное течение РВИ, вызванной G9P[6] типом ротавируса, может быть обусловлено свойствами энтеротоксина NSP4, кодируемого 10-м геномным сегментом РНК и играющего ключевую роль в патогенезе ротавирус ной инфекции [Raming, 2004; Zhang, 2000] Проведено секвенирование полноразмерного гена NSP4 трех изолятов PB-G9P[6], нуклеотидные последовательности которых депонированы в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ под номерами DQ270101, DQ270102. DQ270103 Секвенирование проводили в совместной работе с к б н Д В Новиковым (Институт молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им НИ Лобачевского) Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 РВ G9P[6] и штаммов РВ с известным генотипом NSP4 показал, что омские изоляты PB-G9P[6] находятся в одном кластере со штаммами РВЧ, имеющими генотип NSP4(A) (Рис 7) Аллель гена NSP4 генотипа А ведет свое происхождение от ротавирусов животных Можно предположить, что присутствие у PB-G9P[6] гена энтеротоксина, близкородственного РВ животных, определяет отсутствие диареи у инфицированных новорожденных Вариант РВ G9P[6] является новым в глобальной коллекции штаммов

130 140 150 160 170

Ов-1 (С2РИ1-А) I У1Ж1 мм^то ЕШМТКЕШО КМ\Т{ТЬЕЕ\\Е ■чоючру ерке \TAAM

РАХ51 (С6Р[9]-А) . Н----А--- - е-........ - --к...... -- и....... .....

1181205 (С9Р6]-А) .....I..... .......... . К -1---- в......... .....

\Уи (С1Р[8]-В) - Н-1*-1Т-РУ- V- - - е- - г- - --1 к--о--- в.......в-

1ТО (01Р]8]-В) - Н -1 ГКРУ- V- - . в - - к- - - I К--1)--- в.......Б - -в-

вт-з (С4Р[6]-В) - НЛ-1ТИРУ\ V- - - вм- г- - -I к--т>--- ей......в -

А1М (СЗР[9]-С) - Н-М-ПКРУ- к-.-во-г-- л Е -Е....... ---вь

Е\У («31>(16|-|)> - - -\1MVV-ONR ----в-.т-- - АГК - - НО-С -Ш*-УПП\ТГ> -1-РЬ

СЬ-1 (\SP-F) - -Р Ь- К^ КРЕО - N1 в ЭЕТ - ДУЕТ—\V.S- -КОРУОРТИА - в-ь

0ш5к02. (С9Р[6]( - Н......Р-- ---к...... ^_________

ОтвкОЗ. (С9Р[6]> - Н......Р-- ---к...... 5.........

ОтвММ. (С9Р161) - н......Р-- ---------- ---к...... в.........

Рис 6 Сравнение аминокислотных последовательностей Ы8Р4 в регионе цитоплазматического домена штаммов ротавируса разных \ЯР4 генотипов

Аминокислотные последовательности №Р4 в регионе, определяющем генотип, представлены в работе Иигп/а-Оотага (2003 г)

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы, направленной на адаптацию методологии С[Р] генотипирования к местным штаммам ротавируса, оптимизированы универсальные олигонуклеотидные праймеры для обнаружения гена УР4 ротавирусов группы А, предложены собственные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], разработана оригинальная пара праймеров для субгенотипирования Р[8] аллелей гена УР4 методом ОТ-ПЦР. С использованием разработанных методик установлено распределение 0[Р] типов ротавирусов, циркулировавших среди населения двух городов Нижегородской области в период 1997-2005 гг., свидетельствующее об абсолютном доминировании генетических вариантов ротавируса 01Р[8] и отсутствии штаммов серотипа 09 В 2003-05 гг зафиксировано увеличение активности циркуляции РВ-С1Р[6] и РВ-С2Р[4], что может служить предвестником смены доминирующего 0[Р] типа ротавируса Показано существование генетических вариантов РВ-С1, различающихся субгенотипом Р[8], впервые продемонстрирована многолетняя динамика их смены и

установлены различия в кинических проявлениях инфекции, вызванной ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2 Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса с реорганизованным 11-м сегментом G9P[6]NSP4(A) типа, вызывающий бессимптомное течение РВИ Опыт применетгия G[P] генотипирования в практике здравоохранения показал эффективность разработанных методик в расшифровке локальных вспышек ОКИ в закрытых коллективах; установлении внутрибольничной циркуляции ротавирусов; осуществлении мониторинга за циркулирующими вариантами ротавируса с целью установления смены доминирующего G[P] типа ротавируса, сопровождающейся ростом заболеваемости РВГЭ

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавируса группы А на основе оптимизированных праймеров Ro4-l и Ro4-l универсален в отношении ротавирусов разных [Р]-генотипов и позволяет повысить относительную чувствительность выявления ротавирусов в клиническом материале по сравнению с РНК-ПААГ на 18,9%, по сравнению с ИФА на 24,5%.

2. Разработаны оригинальные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4], Р[8] и субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2, адаптированные к вариантам ротавируса актуальным для территорий России

3. Установлено, что в период 1997-05 гг. на территории Нижегородской области циркулировали ротавирусы семи G[P] типов- G1P[8] (78,6%), G1P[6] (2,6%), G2P[4] (9,0%), G3P[8] (4,6%), G3P[6] (0,9%), G3P[9] (1,3%) G4P[8] (2,6%), h/t (0,4%). В сезон 2004-05 гг. зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса: G1P[8] (24%), G2P[4] (37%), G3P[8] (21%), G3P[9] (3,8%), G4P[8] (12%), н/т (2%).

4 Показано, что ротавирус G 1P[8] типа имеет как минимум два субгенотипа Р[8], перераспределение которых во времени поддерживает активную циркуляцию вариантов ротавируса серотипа G1 Период 1997-05 гг в Нижегородской области характеризовался доминированием ротавирусов генотипа Р[8]-2 (75,1%)

5. Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] особенности в клинических проявлениях РВГЭ. Установлено, что эпидемически значимый

вариант ротавируса GlP[8]-2-61 вызывает гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейньш синдромом и отсутствием или слабой выраженностью симптомов ОРВИ.

6 Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным 11-м геномным сегментом, вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Новикова Н А , Федорова О.Ф., Епифанова Н В , Ефимов Е И Различия в клинических проявлениях ротавирусного гастроэнтерита, ассоциированные с [Р]-генотипом ротавируса // Матер науч конф «Проблема инфекций в клинической медицине», СПб - 2002 -С 237

2 Новикова Н А., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В, Чупрова А Б. Распределение G[P]-thttob ротавируса в 1996-2003 гг в Нижегородской области России // Матер третьей междунар конф поев 80-летию СПб инст. им Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - 2003 - С 115

3 Новикова H.A., Епифанова Н В., Федорова О.Ф., Стасенко В Л, Вайтович М J1, Миленина В М . Чепурко Т Г , Николаев С В , Иванов С.П Обнаружение ротавируса G9P[6] типа с геномными перестройками // Матер, третьей междунар конф поев 80-летию СПб инст им Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» - 2003 - С 116.

4 Новикова Н А , Епифанова Н В , Федорова О.Ф. Вакцинопрофилактика ротавирусной инфекции Состояние и перспективы // Матер науч конф посвящ. 75-летию ННИИЭМ - 2004 - С 64-73

5. Новикова Н А, Епифанова Н В, Федорова О.Ф. Цикличность эпидемического процесса ротавирусного гастроэнтерита и её причины // Матер науч конф посвящ 75-летию ННИИЭМ - 2004 - С. 744-77

6 Епифанова Н В . Новикова Н А , Федорова О.Ф., Луковникова Л Б , Голицына Л Н , Капгников А Ю Этиологическая расшифровка вирусных ОКИ с использованием ПЦР // Матер науч конф посвящ 75-летию ННИИЭМ - 2004 - С. 89-93.

7. Далматов В В , Миленина В М , Вайтович М А , Стасенко В Л , Новикова Н А , Обухова Т М , Турчанинов Д В , Епифанова Н В , Федорова О.Ф.,

Николаев С В, Кмито Л Н , Иванов С П Эпидемиологические особенности ротавирусной инфекции в стационарах для новорожденных детей // ЗНиСО -2004. -№12 - С 15-17

8 Федорова О.Ф., Новикова Н А , Епифанова Н В , Луковникова Л Б , Княгина О Н, Грачева Е В, Богачева Оптимизация метода ОТ-ПЦР для идентификации гена УР4 ротавирусов группы А и оценка его диагностической эффективности//Вопр вирусол -2005.-№1 -С. 39-41.

9 Федорова О.Ф.. Епифанова Н В , Новикова Н А Оптимизация методик Р] типирования ротавирусов с использованием обратной транскрипции-

полимеразной цепной реакции // Труды науч конф «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций», СПб. - 2005 -С. 149-151

10 Фёдорова О.Ф , Новикова Н А , Епифанова Н В Способ идентификации субтипов ротавирусов Р[8] генотипа. Патент на изобретение №2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года.

Подписано в печать 24 04 2006г Бумага офсетная Тираж 70 экз Заказ №64

Отпечатано ООО «Стимул - СТ» 603155 г Нижний Новгород, у л Трудовая, 6 Тел 36-86-40

Í- 96 9 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фёдорова, Оксана Фёдоровна

I. ВВЕДЕНИЕ.

П.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Значимость РВГЭ в инфекционной патологии детей на современном этапе.

2. Структурная и молекулярная организация ротавириона.

2.1. Вирион и его структурные белки.

2.2. Неструктурные белки ротавируса.

2.3. Геном.

3. Разнообразие G[P] типов ротавирусов.

3.1. G[P] типы ротавируса человека и их распределение в мире.

3.2. Механизмы изменчивости и возникновения новых G[P] типов ротавирусов.

3.3. Разработка ротавирусной вакцины.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Исследуемые объекты.

2. Иммуноферментный анализ.

3. Электронная микроскопия.

4. Электрофоретипирование РНК ротавирусов в ПААГ.

5. Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция.

6. G и [Р]-генотипирование ротавирусов с использованием ПЦР.

7. Определение нуклеотидной последовательности гена энтеротоксина NSP4.

8. Статистический анализ результатов.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Разработка методологии [Р]-генотипирования ротавирусов.

1.1. Оптимизация метода ОТ-ПЦР для выявления РНК гена VP4 и оценка его эффективности.

1.2. Оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]- генотипирования ротавирусов.

2. Особенности циркуляции ротавирусов разных G[P] типов в Нижегородской области в 1997-2005 гг.

2.1. Электрофоретипирование РНК ротавирусов.

2.2. G и [Р] генотипирование природных изолятов ротавируса и анализ их распределения

2.3. Определение субтипа ротавирусов Р[8] генотипа.

2.3.1. Разработка методики субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8].

2.3.2. Анализ смены субгенотипа в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа.

2.3.3. Клинические проявления РВГЭ, вызванного ротавирусом типа G1P[8]-2.

3. Молекулярно - биологическая характеристика ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов"

Актуальность проблемы. Ротавирусы (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются основным этиологическим агентом острого гастроэнтерита у детей первых лет жизни. Анализ исследований, опубликованных в период с 1986 по 2000 годы показал, что каждый год в мире регистрируется 111 млн эпизодов ротавирусного гастроэнтерита, 25 млн визитов в клинику, 2 млн госпитализаций и 352,000-592,000 (в среднем 440 тыс.) смертей среди детей в возрасте до 5 лет [144], что определяет необходимость разработки ротавирусной вакцины и совершенствования эпиднадзора за инфекцией. К настоящему времени в мире накоплена обширная информация об экстраординарном генетическом и антигенном многообразии ротавирусов. Среди ротавирусов человека группы А различают 10 G серотипов (детерминируются гликопротеином VP7), 9 «Р»-серотипов (детерминируются протеазочувствительным белком VP4) и И [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов ротавируса, за счет существования различных комбинаций G и [Р] [163].

К настоящему времени показано существование географических различий в распространенности различных серотипов и генотипов ротавируса, установлен факт их временного перераспределения, зафиксировано появление большого количества нетипируемых штаммов и постоянно сообщается о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавируса [68]. В связи с этим для разработки универсальной вакцины и оценки эффективности уже разработанных вакцин необходимо знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией ротавирусов разных G[P] типов. Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [185]. Однако в России научные работы подобного плана не проводятся. Ранее в Нижегородском НИИЭМ было проведено изучение генетических и антигенных вариантов РВ, доминировавших на Европейской территории России в 1984-96 гг. Были получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции ротавирусов основных G серотипов и прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта вируса к другому. В тоже время исследований по изучению разнообразия [Р]-генотипов ротавируса, G[P] ассоциаций, их распределению и установлению особенностей смены [Р]-генотипа РВ, не проводилось.

Цель исследования: оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов, изучение временных особенностей циркуляции ротавирусов разных G[P] типов и их молекулярно-биологическая характеристика.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавирусов группы А и дать оценку его эффективности.

2. Разработать праймеры для идентификации [Р]-генотипов и Р[8] субтипов ротавирусов.

3. Определить электрофоретипы РНК и G[P] типы ротавирусов, обнаруженных на территориях г. Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в период 1997-05 гг., рассчитать их относительное распределение.

4. Изучить особенности смены доминирования субтипов Р[8]-1 и Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа.

5. Дать сравнительную характеристику клинических проявлений инфекции, вызванной ротавирусами генотипов G1P[8]-1 и GlP[8]-2.

6. Охарактеризовать молекулярно-биологические свойства ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Оптимизирован метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ротавирусов разных электрофоретипов, эффективный в отношении штаммов, актуальных для России, что может служить основой для создания диагностической амплификационной тест-системы.

Впервые рассчитано распределение G[P] типов ротавируса, идентифицированных на двух территориях Нижегородской области в 1997-05 гг. Территории городов Нижний Новгород и Дзержинск являются единственными в Российской Федерации, для которых установлен антигенный профиль природных штаммов РВ, что может быть использовано для оценки эффективности применения разработанных в мире ротавирусных вакцин.

Разработан способ субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8] с использованием ПЦР. Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года).

Разработана новая технология G[P] генотипирования ротавирусов с использованием полимеразной цепной реакции, включающая: набор оригинальных праймеров, совместимых для мультиплексной постановки, контрольную постановку и универсальную программу амплификации. Рекомендована к утверждению расширенным заседанием Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ (Пр. № 168-уч. от 6 декабря 2004 года).

Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] различия в клинических проявлениях ротавирусной инфекции, свидетельствующее о существовании «респираторного» (G1P[8]-1) и «кишечного» вариантов ротавируса GlP[8]-2.

Выявлен и охарактеризован новый вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A), вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

Впервые определена первичная структура гена NSP4 трех российских изолятов ротавируса с генотипом G9P[6]NSP4(A) (DQ270101, DQ270102, DQ270103), что расширяет представления о вариабельности гена энтеротоксина NSP4 ротавируса в мире.

Внедрение результатов исследования в практику:

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированные и разработанные праймеры для обнаружения РНК ротавирусов группы A (Ro4-l, Ro4-2), для идентификации [Р]-генотипа (P[4]R, P[8]R) и субгенотипа Р[8] (R-P[8]-l, R-P[8]-2), обеспечивают генотипирование штаммов ротавируса, актуальных для территорий России.

2. Спектр G[P] типов ротавирусов циркулировавших среди детей на территории Нижегородской области в период 1997-05 гг. включает основные G1-4 серотипы и Р[4], Р[6], Р[8], Р[9] генотипы, представленные семью G[P] комбинациями, распределение которых изменяется во времени.

3. Особенностью циркуляции ротавируса G1P[8] является постоянное доминирование, поддерживаемое сменой субтипа Р[8]-генотипа, сопровождающейся изменениями в клинических проявлениях инфекции.

4. Ротавирус, обнаруженный у новорожденных детей с бессимптомной формой инфекции имеет генотип G9P[6]NSP4(A) и реорганизованный 11-й геномный сегмент.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2002 г.);

• на заседании Нижегородского научного биохимического общества (г. Н.

Новгород, 2004 г.);

• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научнопрактических семинарах института.

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 15 декабря 2005 г.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 192 источника литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Фёдорова, Оксана Фёдоровна

VI. ВЫВОДЫ:

2. Разработаны оригинальные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4], Р[8] и субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2, адаптированные к вариантам ротавируса, актуальным для территорий России.

3. Установлено, что в период 1997-05 гг. на территории Нижегородской области циркулировали ротавирусы семи G[P] типов: G1P[8] (78,6%), G1P[6] (2,6%), G2P[4] (9,0%), G3P[8] (4,6%), G3P[6] (0,9%), G3P[9] (1,3%) G4P[8] (2,6%), н/т (0,4%). В сезон 2004-05 гг. зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса: G1P[8] (24%), G2P[4] (37%), G3P[8] (21%), G3P[9] (3,8%), G4P[8] (12%), н/т (2%).

4. Показано, что ротавирус G1P[8] типа имеет как минимум два субгенотипа Р[8], перераспределение которых во времени поддерживает активную циркуляцию вариантов ротавируса серотипа G1. Период 1997-05 гг. в Нижегородской области характеризовался доминированием ротавирусов генотипа Р[8]-2 (75,1%) .

5. Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] особенности в клинических проявлениях РВГЭ. Установлено, что эпидемически значимый вариант ротавируса GlP[8]-2-61 вызывает гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и отсутствием или слабой выраженностью симптомов ОРВИ.

6. Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным 11-м геномным сегментом, вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отсутствие знаний о G[P] типах природных штаммов ротавируса, распространенных на территориях России, и необходимость оптимизации методик [Р]-генотипирования, определили актуальность проведения настоящего исследования.

Работа посвящена изучению разнообразия G[P] типов ротавируса группы А человека, анализу их временного распределения и комплексной характеристике природных штаммов ротавируса, изолированных на двух относительно удаленных территориях России в период 1997-05 гг., с использованием оптимизированных и разработанных методик ОТ-ПЦР для обнаружения и [Р]-генотипирования РНК.

Необходимость периодического проведения исследований по оптимизации методик ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК ротавируса и адаптации их к местным штаммам постулируется в научной литературе, так как в процессе длительной циркуляции ротавирусов может произойти накопление мутаций в области типовых праймеров, что снижает эффективность применяемых методик. Наиболее актуальны такие исследования в отношении гена VP4 ротавируса, т.к. праймеры, используемые для идентификации G типа находятся в консервативных областях, кодирующих серотиповые детерминанты.

На первом этапе работы была проведена оптимизация метода ОТ-ПЦР для обнаружения РНК гена VP4. С использованием программы «GeneDoc» был проведен сравнительный анализ 56-ти выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ к началу наших исследований. Установлено, что в области универсальных праймеров для обнаружения РНК гена VP4, предложенных ранее Gentsch J. R. с соавторами (праймеры conl и соп2) наблюдается вариабельность последовательностей. Мы оптимизировали данные праймеры с учетом имеющихся нуклеотидных замен путем введения вырожденных оснований и создали собственную версию универсальных праймеров. Праймеры Ro4-l и

Ro4-2, предложенные нами, фланкируют фрагмент гена VP4 размером 211 н.о., расположенный в области с 676 по 887 н.о. Проведена теоретическая оценка специфичности разработанных праймеров путем сравнительного анализа последовательностей праймеров и 15-ти нуклеотидных последовательностей генома ряда кишечных вирусов (энтеровирусов, астровирусов, калицивирусов, аденовирусов, ротавирусов групп А и С). Анализ показал, что оптимизированные олигонуклеотиды специфичны в отношении гена VP4 ротавирусов группы А человека и животных и не имеют существенной гомологии с другими нуклеотидными последовательностями генома кишечных вирусов.

Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 150-ти коллекционных природных штаммах ротавируса группы А, имеющих различные электрофоретипы РНК - «длинные», геногруппа Wa; «короткие», геногруппа DS-1; «широкие», геногруппа AU-1; «аномальные». В результате однораундовой ПЦР с использованием собственной версии праймеров РНК ротавируса данных геногрупп была обнаружена в 100% случаев, что подтверждает их универсальность в отношении различных аллелей гена VP4.

Проведено сравнение эффективности обнаружения ротавирусов у больных с диагнозом острый гастроэнтерит с использованием разработанной методики ОТ-ПЦР и методов РНК-ПААГ и ИФА на основе поликлональных антител. При исследовании случайной выборки из 233 образцов фекалий от детей с ОКИ ротавирусы были обнаружены методом ИФА в 47,6±3,3 % случаев, методом РНК-ПААГ - в 45,9±3,3 %, с использованием ОТ-ПЦР гена VP4 - в 57,9±3,2 % случаев (р<0,01). Достоверно более высокий процент положительных находок, полученных при использовании ОТ-ПЦР, наглядно демонстрирует относительно большую результативность метода генодиагностики, которая, несомненно, связана с его высокой аналитической чувствительностью. В наших исследованиях результаты обнаружения ротавирусов с использованием ОТ-ПЦР и РНК-ПААГ совпали на 88,4 %, ОТ

ПЦР и ИФА на 76,0 %, электрофореза РНК и ИФА - в 80,2 % случаев. Совпадение положительных и отрицательных результатов в трех используемых методах составило 72,1 ±2,9 %. Для установления относительной чувствительности метода ОТ-ПЦР был исследован 151 образец фекалий, положительный на ротавирусы по итогам трех методов. Установлено, что метод ОТ-ПЦР, основанный на праймерах Ro4-l и Ro4-2, при индикации РВ в клиническом материале обладает относительной чувствительностью, превосходящей метод РНК-ПААГ на 18,9%, метод ИФА - на 24,5%. Полученные результаты имеют практическое значение, т.к. оптимизированная лабораторная методика, адаптированная к российским штаммам ротавируса, может служить основой для конструирования диагностической тест-системы на основе ОТ-ПЦР.

Проведенная теоретическая разработка и лабораторные испытания показали, что метод ОТ-ПЦР на основе праймеров Ro4-l и Ro4-2 универсален в отношении ротавирусов различных [Р]-генотипов, что позволило использовать его для контрольной постановки, подтверждающей наличие гена VP4 в пробе при генотипировании природных штаммов ротавируса.

Следующим этапом работы явилась оценка эффективности известных методик и схем G и [Р]-генотипирования и их применимости для анализа местных штаммов ротавируса.

Методология определения G серотипа с использованием ОТ-ПЦР, представленная в научной литературе, основана на праймерах, расположенных консервативных областях последовательности гена VP7, кодирующих серотиповые детерминанты. При этом показана строгая корреляция между G генотипом и G серотипом ротавируса. В наших исследованиях была применена схема G типирования, разработанная Das В.К. с соавторами (1994 г.). Однако в процессе работы возникла необходимость ее модификации. Если праймеры, предложенные для определения Gl, G2, G4, и G9, на наших штаммах работали стабильно, то праймер для G3 серотипа давал неоднозначные результаты. В совместной работе с Н.В. Епифановой была сконструирована оригинальная стабильно работающая версия праймера G3R. В качестве прямого общего праймера GF также была использована другая версия, предложенная И.Н. Бессараб с соавторами (1990 г.).

Для определения [Р]-генотипа штаммов ротавируса использовали схему, предложенную Gentch J.R. с соавторами (1992 г.). Однако при работе с праймерами 2Т-1 и 1Т-1 для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], соответственно, возникли сомнения в их специфичности. Так, при анализе выборок штаммов ротавируса, выделенных в один эпидсезон на одной территории и имеющих один ЭФ-тип РНК, что предполагает их клональное родство, часть штаммов типировалась с использованием праймеров, предложенных Gentch J.R., а часть нет. В связи с этим был проведен сравнительный анализ 56 полных выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4 в области типовых праймеров. Установлено, что наибольшее количество нуклеотидных замен находится в регионах, принадлежащих олигонуклеотидам, определяющим генотипы Р[8] и Р[4], что свидетельствовало о необходимости их оптимизации. Праймеры для идентификации генотипов Р[6] и Р[9] не требовали модификации. С учетом обнаруженной вариабельности последовательности нуклеотидов в регионах типовых праймеров нами сконструированы модифицированные праймеры R-Р[4]т и R-P[8]m, имеющие в ряде позиций вырожденные основания и нуклеотидные замены. Апробация собственных версий олигонуклеотидов показала их эффективность в отношении штаммов РВ, актуальных для изучаемых территорий и дававших неоднозначные результаты при использовании исходных версий праймеров.

Кроме модификации праймеров для обнаружения РНК гена VP4 и идентификации генотипов Р[8], Р[4] и G3, была разработана универсальная программа амплификации специфических фрагментов кДНК и подобраны пулы совместимых типовых праймеров для мультиплексной постановки. Разработанная методология определения G[P] типа и метод электрофоретипирования РНК ротавирусов были использованы для изучения природных штаммов ротавируса группы А человека, обнаруженных на территориях России (г. Н.Новгород, г. Дзержинск и г. Омск) в период 1997-05 г.

С использованием молекулярно-генетических методов были исследованы 4950 образец фекалий от детей в возрасте до 14 лет с диагнозом ОКИ из г. Н. Новгорода и 1595 образцов из г. Дзержинска. Ротавирусы обнаружены в 1774 (35,8+0,68%) и 748 (46,9+1,25%) случаях, соответственно. Среди заболевших 91% составили дети в возрасте до 3-х лет. Среднемноголетний показатель заболеваемости РВГЭ детей в данной возрастной группе составил для г. Н. Новгорода - 7 о/оо, для г. Дзержинска — 15 о/оо. По всей вероятности высокий уровень заболеваемости РВГЭ детей г. Дзержинска связан с экологическим фактором, т.к. территория г. Дзержинска является зоной экологического неблагополучия. Результаты обнаружения ротавирусов у детей с ОКИ сообщались в Центр СЭН в Нижегородской области, где использовались в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты сообщались лечащему врачу для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Проведено изучение генетической гетерогенности обнаруженных ротавирусов. С использованием электрофоретипирования в ПААГ было идентифицировано 60 профилей миграции сегментов РНК: 35 вариантов «длинных» Wa-подобных, 12 вариантов «коротких» DS-1-подобных и 13 вариантов «широких» Аи-1 подобных ЭФ-типов РНК. Доминирующим генетическим вариантом на обеих территориях явился 61-й ЭФ-тип РНК, на долю которого пришлось 39,0% и 38,5% на территории г. Н. Новгорода и г. Дзержинска, соответственно. Следует отметить, что доминирующие генетические варианты ротавируса, обнаруженные в г. Н. Новгороде и г. Дзержинске, были идентичны. Идентифицировано 28 общих вариантов ротавируса. В тоже время в г. Н. Новгороде выявлено 26 вариантов РВ, которые не обнаружены в изолятах из г. Дзержинска. Среди штаммов РВ из г. Дзержинска обнаружено только 6 вариантов вируса, характерных для данной территории. Большая гетерогенность популяции РВ в г. Н. Новгороде может быть связана как с большим числом типированных изолятов РВ, так и с более интенсивной миграцией населения.

Проведено определение G серотипа и [Р]-генотипа природных штаммов ротавируса с доминирующими и необычными ЭФ-типами РНК, собранных в анализируемый период времени на обеих территориях. Проанализирован 1721 ротавирус-содержащий образец из г. Н. Новгорода и 733 изолята РВ из г. Дзержинска. В ходе исследования установлено, что на обеих территориях выявляются ротавирусы основных глобально распространенных G1-4 серотипов в комбинациях с одинаковым спектром [Р]-генотипов. Эти результаты послужили основанием для расчета распределения антигенных типов РВ по суммарным данным обеих территорий.

Рассчитано распределение G серотипов ротавируса: G1 - 81,3%; G2 -8,9%; G3 - 6,8%; G4 - 2,6%; G9 - 0%; и/т - 0,4%.

Рассчитано распределение [Р]-генотипов ротавируса: Р[8] - 85,8 %; Р[4] -8,9%; Р[6] - 3,5 %; Р[9]-1,3%; н/т- 0,4%.

Рассчитано распределение G[P] типов ротавируса: G1P[8] — 78,6%; G1P[6] - 2,6%; G2P[4] - 9,0%; G3P[8] - 4,6%; G3P[6] - 0,9%; G3P[9] - 1,3%; G4P[8] - 2,6%; h/T - 0,4%.

Из представленных результатов видно, что на территориях г. Н. Новгорода и г. Дзержинска Нижегородской области России циркулируют ротавирусы, относящиеся как минимум к 7-ми антигенным типам. Данное распределение, рассчитанное нами впервые и свидетельствующее об абсолютном доминировании на изученной территории Нижегородской области ротавируса G1P[8], соответствует распределению типов ротавируса, рассчитанному для территорий Европы, Северной Америки и Австралии в аналогичный период времени.

Проведен анализ многолетней динамики частоты обнаружения РВ разных G[P] типов на территориях г. Н. Новгорода и г. Дзержинска. Установлено, что на фоне стабильного доминирования РВ G1P[8] типа в период 1997-05 гг., в последние годы отмечено перераспределение доминирования типов ротавируса. В сезоны РВГЭ 2003-04 гг. в Н. Новгороде и 2004-05 гг. в г. Дзержинске зафиксирована смена доминирования PB-G1P[8] на G1P[6] и G2P[4], соответственно. Зафиксировано пять G[P] типов, распределение которых в сезон 2004-05 гг. по суммарным данным было следующим: G1P[8]-24%, G2P[4]-37%, G3P[8]-21%, G3P[9]-3,8%, G4P[8]-12%, н/т-2%. Увеличение активности циркуляции новых вариантов ротавируса может свидетельствовать о формировании иммунной прослойки населения, устойчивой к ротавирусу G1P[8], и являться предвестником смены доминирующего типа ротавируса. Представленные результаты изучения спектра G[P] типов ротавируса с использованием разработанной методологии ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК являются первым сообщением по изучению распределения G[P] типов ротавируса на одной из территорий России, что имеет значение для теоретической оценки эффективности созданных в мире ротавирусных вакцин и разработки стратегии вакцинопрофилактики РВГЭ. Представляется вероятным, что предсказываемая нами смена доминирующего G[P] типа ротавируса может снизить эффективность использования моновалентной вакцины Rotarix в последующие годы.

При анализе ЭФ-типов РНК изолятов ротавируса одного G[P] типа было установлено существование в пределах PB-G1P[8] генетических вариантов, кардинально различающихся электрофоретической подвижностью 4-го геномного сегмента. Обнаружены варианты вируса с медленно-мигрирующим и быстромигрирующим геном VP4, что свидетельствовало о существовании у исследуемых нами штаммов ротавируса как минимум двух аллелей гена, определяющих Р[8] генотип. К началу наших исследований было уже известно существование, по данным разных авторов, 2-3-х субгенотипов Р[8], которые определяли с использованием секвенирования соответствующих участков гена VP4. Учитывая возможности лаборатории, была поставлена задача сконструировать праймеры для идентификации субгенотипов Р[8] методом ПЦР. Проведен сравнительный анализ 33-х выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4 ротавируса Р[8] генотипа. Сравнивали области нуклеотидной последовательности гена VP4, кодирующей консервативные аминокислоты, соответствующие трем известным субтипам. По результатам анализа нами впервые сконструированы праймеры P[8]-1R и P[8]-2R, которые позволяют проводить дифференциацию субтипов ротавируса генотипа Р[8] с использованием ПЦР, не применяя при этом секвенирование. Предложенные праймеры в однораундовой ПЦР с общим F-праймером, фланкируют участок гена VP4 размером 410 п.н. Оценку специфичности предложенных праймеров проводили с использованием референтного ротавируса человека - шт. Wa, имеющего субтип Р[8]-1. В настоящем исследовании нами установлена строгая корреляция между электрофоретической подвижностью четвертого геномного сегмента и субтипом последовательности гена VP4. РНК всех исследуемых штаммов РВ (3, 4, 34 ЭФ-тип РНК), имеющая медленно мигрирующий четвертый сегмент, амплифицировалась с использованием праймера, специфичного в отношении субгенотипа Р[8]-1, а РНК, имеющая быстро мигрирующий четвертый сегмент, амплифицировалась только с праймером, специфичным в отношении субгенотипа Р[8]-2. Способ определения субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2 с использованием ПЦР предложен нами впервые. Новизна подтверждена патентом № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года.

Разработка нового методического приема дифференциации субаллелей Р[8] позволила нам более углубленно изучить штаммы PB-G1P[8]. Проведен анализ ассоциаций различных субгенотипов Р[8] с G серотипом. Анализ комбинаций различных G серотипов с субтипами Р[8] показал, что и тот и другой субтипы были ассоциированы с серотипами Gl, G3 и G4, основная масса которых была связана с субтипом Р[8]-2. Комбинации G3P[8]-1 и G4P[8]-1 были представлены только единичными изолятами (два G3P[8]-1- в г. Н. Новгороде и один G4P[8]-1- в г. Дзержинске). Соотношение субгенотипов Р[8] в изучаемый нами период времени 1997-2005 гг. было следующим: в г. Н. Новгороде 12,3% изолятов составляли РВ с субгенотипом Р[8]-1 и 73,5% - РВ с субгенотипом Р[8]-2; в г. Дзержинске частота обнаружения субаллелей Р[8] составила 7,0% для РВ-Р[8]-1 и 78,6% для РВ-Р[8]-2. В суммарном распределении G[P] типов ротавируса на долю вариантов ротавируса с генотипом Р[8]-1 пришлось 10,7 %, с генотипом Р[8]-2 - 75,0%. Наиболее часто обнаруживались варианты ротавируса GlP[8]-2, доля которого составила 68,0% в выборке изученных штаммов ротавируса. Определение доминирующего субгенотипа Р[8] ротавируса проведено впервые.

С учетом данных, полученных в Нижегородском НИИЭМ при мониторинге антигенных типов РВ в 1984-1996 гг., стабильно активная циркуляция ротавирусов серотипа G1 продолжается на территории г. Н. Новгорода уже более 20 лет. Мы проанализировали многолетнюю динамику циркуляции PB-G1P[8] по материалам текущего и ретроспективного определения субгенотипов Р[8]. Установлено, что в процессе многолетней циркуляции (1984-2005 гг.) ротавирусов, происходило постепенное замещение генетических вариантов PB-G1P[8]-1 на варианты PB-GlP[8]-2. На полное замещение штаммов с новым субгенотипом Р[8] ротавирусу серотипа G1 потребовалось 15 эпидемических лет. Для этого PB-GlP[8]-2 типа сменил пять генетических вариантов. Представляется вероятным, что смена субгенотипа Р[8] поддерживала активную циркуляцию РВ G1 серотипа.

Нами установлено, что изучаемый период времени абсолютно-доминирующее положение в г. Н. Новгороде занял 61-й генетический вариант ротавируса GlP[8]-2. В период доминирования в 2001-02 гг. РВ GlP[8]-2-(61) вызвал резкий подъем заболеваемости РВГЭ, обусловив 75% госпитализаций. Представляло научный интерес оценить клинические особенности РВГЭ, вызванного ротавирусом этого типа. Проведен анализ выписок из историй болезни 51-го ребенка с моноротавирусной инфекцией, выделявших РВ G1P[8]-2-(61). Результаты частоты регистрации максимально выраженных и продолжительных симптомов РВГЭ при инфицировании GlP[8]-2-(61) сравнили с аналогичными архивными показателями, установленными для GlP[8]-l-(3). Установлено, что при инфицировании детей PB-GlP[8]-2-(61) достоверно чаще наблюдался диарейный стул в течение более 4-х дней, многократная рвота наблюдалась достоверно реже, симптомы ОРВИ зарегистрированы у меньшего числа детей и были выражены слабо. Ведущим синдромом в определении тяжести заболевания был токсикоз с эксикозом. Это отличало ротавирус GlP[8]-2-(61) от ротавируса GlP[8]-l-(3), при инфицировании которым ведущим синдромом, определяющим тяжесть течения заболевания, был токсикоз в сочетании с симптоматическими поражениями верхних отделов респираторного тракта. По всей вероятности, различия в частоте проявлений и выраженности поражений слизистых верхних дыхательных путей и выраженности диарейного синдрома при инфицировании ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2 не связаны с G серотиповой принадлежностью вируса, а определяются субаллелями гена VP4. Ротавирус GlP[8]-l-(3) типа определен нами как респираторный вариант вируса, a G1P[8]-2-(61) - как кишечный. Различия в клинических проявлениях РВГЭ, связанные с субгенотипом Р[8], показаны нами впервые.

На следующем этапе работы проведено изучение молекулярно-генетических особенностей штаммов РВ, выделенных от новорожденных, госпитализированных в ГКПЦ г. Омска. Обследование новорожденных на ротавирусный антиген методом ИФА, проводилось сотрудниками Омской государственной медицинской академии Стасенко B.JI. и Милениной В.М., совместно с сотрудниками ЦГСЭН в Омской области. В нашей лаборатории было исследовано 82 образца фекалий детей, положительных на ротавирусы, собранных в период с мая 2002 года по сентябрь 2004 года. Изоляты РВ, были изучены с использованием молекулярно-генетических методов: G[P] типирования, ЭФ типирования РНК, секвенирования гена NSP4.

ЭФ-типирование РНК штаммов показало наличие двух видов профилей РНК - длинного, типичного для РВ группы А (20,7% и аномального (79,3%). Необычный профиль миграции сегментов содержал в четвертом классе генов один сегмент, а втором классе — три. Такое изменение стандартной картины распределения сегментов РНК на классы, характерной для РВ группы А, свидетельствует о геномных перестройках у штаммов РВ.

С использованием разработанной нами методологии G[P] типирования установлено, что РВ с типичным ЭФ-типом РНК (соответствует 72-ому нижегородскому ЭФ-типу) имели генотип GlP[8]-2, а с аномальным - G9P[6]. При инфицировании новорожденных данным вариантом РВ в 75% наблюдалось бессимптомное течение инфекции, в 25% наблюдался жидкий стул (%=10,1 р=0,001). Эти значения свидетельствуют, что о существовании связи между G9P[6] типом и бессимптомным течением инфекции.

Проведено секвенирование полноразмерного гена NSP4 трех изолятов PB-G9P[6], собранных в разные годы, определенные нуклеотидные последовательности депонированы в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ под номерами DQ270101, DQ270102, DQ270103. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 омских изолятов и штаммов РВ с известным генотипом NSP4 показал, что омские изоляты PB-G9P[6] находятся в одном кластере со штаммами РВЧ, имеющими генотип NSP4(A). Аллель гена NSP4 генотипа А ведет свое происхождение от ротавирусов животных. Вариант РВ G9P[6] является новым в глобальной коллекции штаммов.

Полученные нами результаты обнаружения РВ с использованием молекулярно-генетических методов (ОТ-ПЦР, РНК-ПААГ) и генотипирования штаммов сообщались в Омскую медицинскую академию и ЦГСЭН в Омской области, где были учтены при расшифровке причин роста внутрибольничной заболеваемости ОКИ новорожденных детей. Эпидемиологическое расследование позволило установить, что штамм ротавируса G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным геномом был занесен в перинатальный центр из родильного дома, где получил внутрибольничное распространение и циркулировал в течение трех лет. По результатам комплексных исследований с учетом полученных нами результатов сотрудниками Омской медицинской академии и Центра ГСЭН для предупреждения заноса и распространения РВИ в стационарах и отделениях для новорожденных детей разработан комплекс профилактических рекомендаций и проведены адекватные противоэпидемические мероприятия.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы, направленной на адаптацию методологии G[P] генотипирования к местным штаммам ротавируса, оптимизированы универсальные олигонуклеотидные праймеры Ro4-l и Ro4-2 для обнаружения гена VP4 ротавирусов группы А, предложены собственные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], разработана оригинальная пара праймеров для субгенотипирования Р[8] аллелей гена VP4 методом ОТ-ПЦР. С использованием разработанных методик установлено распределение G[P] типов ротавирусов, циркулировавших среди населения двух городов Нижегородской области в период 1997-2005 гг., свидетельствующее об абсолютном доминировании генетических вариантов ротавируса G1P[8] и отсутствии штаммов серотипа G9. В 2003-5 гг. зафиксировано увеличение активности циркуляции РВ генотипов G1P[6], G2P[4] и G3P[8], что может служить предвестником смены доминирующего G[P] типа ротавируса. Показано существование генетических вариантов PB-G1, различающихся субгенотипом Р[8], впервые продемонстрирована многолетняя динамика их смены и установлены различия в кинических проявлениях инфекции, вызванной ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2. Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса с реорганизованным 11-м сегментом G9P[6]NSP4(A) типа, наиболее часто вызывающий бессимптомное течение РВИ и явившийся причиной нозокомиальной инфекции новорожденных детей на втором этапе выхаживания.

Опыт применения G[P] генотипирования в практике здравоохранения показал эффективность разработанных методик в расшифровке локальных вспышек ОКИ в закрытых коллективах; установлении внутрибольничной циркуляции ротавирусов; осуществлении мониторинга за циркулирующими вариантами ротавируса с целью установления смены доминирующего G[P] типа ротавируса, сопровождающейся ростом заболеваемости РВГЭ.

125

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фёдорова, Оксана Фёдоровна, Нижний Новгород

1. Васильев Б.Я. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция / Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. — СПб.: «Лань», 2000. 272 с.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. -459 с.

3. Дроздов С.Г., Покровский В.И., Шекоян Л.А., Машилов В.П. Ротавирусный гастроэнтерит. М.: Медицина, 1982. - 160 с.

4. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2000-2001 гг. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М., 2002.

5. Карпович Л.Г., Петухов В.Г., Евреинова Е.Э. Калашникова Т.В., Карпова Е.В. Оценка эффективности препаратов для диагностики ротавирусной инфекции в условиях натуральных испытаний // Вопр. вирусол. — 1999. — N 2. — С.82-85.

6. Королев М.Б. Электронно-микроскопические методы выявления вирусов // Итоги науки и техники. Вирусология. Т.9 М., 1980. - С. 114-151.

7. Мухина А.А., Шипулин Г.А. Боковой А.Г. и др. Диагностика ротавирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции // Эпидемиол. и инф. болезни. 2002. - N 2. - С.43-47.

8. Новикова Н.А., Анцупова А.С., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е. Электрофоретический анализ геномной РНК ротавирусов человека // Молекул, генетика. 1989. -N 5. - С.45-49.

9. Новикова Н.А., Альтова Е.Е., Носкова Н.В. и др. Обнаружение ротавирусной РНК в носоглоточных смывах методов молекулярной гибридизации // Журн. микробиол. 1991. - N 4 - С.23-25.

10. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е. и др. Электрофоретипирование ротавирусов при клинико-эпидемиологическом изучении инфекции // Журн. микробиол. 1992. - N 2 - С.31-34.

11. Новикова Н.А. Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на европейской территории России: Автореф. дис.д-ра биол. наук. Москва, 1998.-49 с.

12. Приоритетные направления научных исследований, предпринимаемых в целях создания вакцин против диарейных болезней: меморандум ВОЗ // Бюл. ВОЗ. 1991.-N6.-С. 19-28.

13. Сенгер М., Берг П. Гены и геномы: в 2-х томах. М. - 1998. - 373 с.

14. Сироткин А.К., Романовская-Романько Е.А., Третьякова Н.В. Циркуляция ротавирусов группы А в Санкт-Петербурге в 2002-2003 гг. // Матер. 3-й Междунар конф.: Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. СПб. -2003.-С. 118.

15. Цилинский Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов. М.: Медицина, 1988.-240 с.

16. Anand Т., Narasa Raju T.A., Vishnu C. et al. Development of Dot-ELISA for the detection of rotavirus antigen and comparison with RNA-PAGE // Letters of Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 32. - P. 176 - 180.

17. Arias C., Isa P., Guerrero A. et al. Molecular biology of rotavirus cell entry //Arch, of Med. Research. 2002. - Vol. 33.-P. 356-361.

18. Arias C., Dector M., Segovia L. et al. RNA silencing of rotavirus gene expression // Virus Research. 2004. - Vol. 102. - P. 43-51.

19. Banyai K., Gentsch J.R., Glass R.I. et al. Eight-year survey of human rotavirus strains demonstrates circulation of unusual G and P types in Hungary // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42, N 1. - P. 393-397.

20. Barro M, Patton J.T. Rotavirus nonstructural protein 1 subverts innate immune response by inducing degradation of IFN regulatory factor 3 // PNAS USA. -2005.-Vol.102.-P. 4114-9.

21. Beards G. M., Desselberger U., Flewett Т. H. Temporal and geographical distributions of rotavirus serotypes, 1983 to 1988// J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27.-P. 2827-2873.

22. Besalaar T. G., Rosenblatt A., Kidd A.H. Atypical rotavirus from South African neonates: Brif report // Arch. Virol. 1986. - Vol. 87. - P. 327-330.

23. Bhan M. K., Lew J.F., Sazawal S. et al. Protection conferred by neonatal rotavirus infection against subsequent diarrhea // J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 168. -P. 282-287.

24. Bines J. E, Ivanoff В., Justice F., Mulholland K. Clinical case definition for the diagnosis of acute intussusception // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2004. - Vol. 39.-P. 511-518.

25. Bines J.E. Rotavirus vaccines and intussusception risk // Curr. Opin. Gastroenterol. 2005. - Vol. 21. - P. 20-25.

26. Bishop R.F., Unicomb L.E., Barnes G.L. Epidemiology of rotavirus serotypes in Melbourn, Ausralia, from 1973-1989 // J. Clin. Microbiol. 1991. -Vol. 29, N 5. - P. 862-868.

27. Bishop R. F., Masendycz P.J, Bugg H.C. et al. Epidemiological patterns of rotaviruses causing severe gastroenteritis in young children throughout Australia from 1993 to 1996//J. Clin. Microbiol.-2001.-Vol. 39.-P. 1085-1091.

28. Bowman G.D., Nodelman I., Levy O. et al. Crystal structure of the oligomerization domen of NSP from rotavirus reveals a core metal-binding site // J. Mol. Biol. 2000. - Vol. 304. - P. 861-871.

29. Bresse J.S., Glass R.I., Ivanoff В., Gentsch J.R. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries // Vaccine. 1999. - Vol. 17. - P. 2207-2222.

30. Broor S., Ghosh D., Mathur P. Molecular epidemiology of rotaviruses in India // Indian. J. Med. Res. 2003. - Vol. 118. - P. 59-67.

31. Brussow H., Bruttin A., Marc-Martin S. Polypeptide composition of rotavirus empty capsids and their possible use as a subunit vaccine // J. Virol. 1990. -Vol. 64, N8.-P. 3635-3642.

32. Carpio R.V., Gonzalez-Nilo F.D., Jayaram H. Role of the histidine triadlike motif in nucleotide hydrolysis by the rotavirus RNA-packaging protein NSP2 // J. Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 10624-33.

33. Chen Y., Zhao J., Yan L. Comparison of three methods in detection of rotavirus in neonates // Zhongulua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi -1999.-Vol. 31.-P. 180-182.

34. Clark H.F., Bernstein D.I., Dennehy P.H. et al. Safety, efficacy, and immunogenicity of a live, quadrivalent human-bovine reassortant rotavirus vaccine in healthy infants // J. Pediatr. 2004. - Vol. 144. - P. 558.

35. Clarke I.N., McCrae. A rapid and sensitive method for analyzing the genome profiles of field isolates of rotavirus // J. of Virol. Methods. 1981. - Vol. 2. -P. 203-209.

36. Coluchi N., Munford V., Manzur J. et al. Detection, subgroup specifity and genotype diversity of rotavirus strain in children with acute diarrhea in Paraguay // J. Clin. Microbiol. -2002. Vol. 40. - P. 1709-1714.

37. Cook JP, McCrae MA. Sequence analysis of the guanylyltransferase (VP3) of group A rotaviruses // J. Gen Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 929-932.

38. Costa P., Cardoso D., Grisi S. et al. Rotavirus A infections and reinfecrions genotyping and vaccine implications // J. Pediatr (Rio J). 2004. - Vol.80. - P. 119122.

39. Coulson B.S., Gentsch J.R., Das B.K., et al. Comparison of enzyme immunoassay and reverse transcriptase PCR for identification of serotype G9 rotaviruses//J. Clin. Microbiol. 1999.-Vol. 37, N 10. - P. 3187 - 3193.

40. Crawford Sue E., Mukherjee S.K., Estes M.K. et al. Trypsin cleavage stabilizes the rotavirus VP4 spike // J. of Virology. 2001. - Vol.75, N 13. - P. 60526061.

41. Cunliffe N.A., Gondwe J.S., Graham S.M. et al. Rotavirus strain diversity in Blantyre, Malawi from 1997 to 1999 // J. of Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 3.-P. 836-843.

42. Cunliffe N.A., Breses J.S., Gentsch J.R. et al. The expanding diversity of rotaviruses // Lancet. 2002. - Vol. 359. - P. 640-641.

43. Cunliffe N.A., Nakagomi O. A clinical time for rotavirus vaccine: a review // Expert Rev Vaccines. 2005. - V. 4. - P. 521-532.

44. Das B.K., Gentsch J.R., Cicirello H.G. et al. Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 7.-P. 1820-1822.

45. De Leener K., Rahman M., Matthijnssens J. et al. Human infection with a P14., G3 lapine rotavirus // Virology 2004. - Vol. 20. - P. 11-17.

46. De Vos В., Vesikari Т., Linhares A.C. et al. A rotavirus vaccine for prophylaxis of infants against rotavirus gastroenteritis // Pediatr. Infect. Dis. J. -2004.-Vol. 23.-P. 179-182.

47. Dormitzer P.R., Greenberg H.B., Harrison S.C. Proteolysis of monomeric recombinant rotavirus VP4 yields an oligomeric VP5* core // J. Virol. 2001. - Vol. 75.-P. 7339-7350.

48. Dormitzer P.P., Sun Z-Y. J., Wagner G., Harrison S.C. The rhesus rotavirus VP4 sialic acid binding domain has a galestin fold with a novel carbohydraten binding site // The EMBO Journal. 2002. - Vol. 21, N 5. - P. 885-897.

49. Dus Santos M. J., Wigdorovitz A. Transgenic plants for the production of veterinary vaccines // Immunol. Cell. Biol. 2005. - Vol. 83. - P. 229-38.

50. Eichwald C., Rodriguez J.F., Burrone O.R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation // J. Gen Virol. 2004-Vol. 85.-P. 625-34.

51. Estes M.K., Cohen J. Rotavirus gene structure and function // Microbiological Reviews. 1989. - P.410-449.

52. Estes M.K. Rotaviruses and their replication. In Fields B.N., Knipe D.N., Howley P.M. et al. Fields virology, Raven Press, New York, 1996. P. 1625-1655.

53. Estes M. K. Rotaviruses and their replication. In Fields B.N. Knipe D.N., Howley P.M., Griffin D.E. et al. Virology, Philadelphia, 2001. P. 1747-1785.

54. Fischer Т.К., Steinsland H., Molbak K. et al. Genotype profiles of rotavirus strains from children in a suburban community in Guinea-Bissau, Western Africa // J. of Clin. Microbiol. 2000.-Vol. 38, N l.-P. 264-267.

55. Fischer Т.К., Eugen-Olsen J., Pedersen A.G. Characterization of rotavirus strains in a Danish population: high frequency of mixed infections and diversitywithin the VP4 gene of P8. strains I I J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 10991104.

56. Flewett Т.Н., Woode G.N. The rotaviruses. Brief review // Arch. Virol. -1978. Vol.57, N 1,-P. 1-23.

57. Gault E., Chikhi-Brachet R., Delon S. et al. Distribution of human rotavirus G types circulating in Paris, Frace, during the 1997-1998 epidemic: high prevalence of type G4 // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 2373-2375.

58. Gault E., Schnepf N., Poncet D. et al. A human rotavirus with rearranged genes 7 and 11 encodes a modified NSP3 protein and suggests an additional mechanism for gene rearrangement// J. Virol. 2001. -Vol. 75. - P. 7305-14.

59. Gentsch J.R., Glass R.I., Woods P. et al. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. -P. 1365-1373.

60. Gentsch J.R., Woods P.A., Ramachandran M. et al. Review of G and P typing results from a global collection of rotavirus strains: implications for vaccine development // J. Infect. Dis. 1996. Vol. 174, N 1. - P. 30 -36.

61. Gentsch JR, Laird AR, Bielfelt B. et al. Serotype Diversity and Reassortment between Human and Animal Rotavirus Strains: Implications for Rotavirus Vaccine Programs // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 12. - P. 146-59.

62. Gerna G., Sarasini A., Matteo A. et al. Serotype 3 human rotavirus strains with subgroup I specificity // J. Clin. Microbial. 1990. - Vol. 26, N 6. - P. 13421347.

63. Gilbert J.M., Feng N., Patton J.T., Greenberg H.B. Rotavirus assembly -interaction of surface protein VP7 with middle layer protein VP6 // Arch. Virol. -2001.-Vol. 146. P. 1155-1171.

64. Glass R.I., Kilgore P.E., Holman R.C. et al. The epidemiology of rotavirus diarrhea in the United States: surveillance and estimates of disease burden // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 174, N 11. - P. 5-11.

65. Glass R.I., Bresee J.S., Ivanoff B. Rotavirus vaccines for developing countries // Weakly Epidemiol. Rep. 1997. - Vol. 6. - P. 35-40.

66. Glass R.I., Bhan M.K., Ray P. et al. Development of candidate vaccines derived from neonatal strain in India // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 30-35.

67. Glass R.I., Bresee J.S., Turcios R. et al. Rotavirus vaccines: targeting the developing world // J. Infect Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 160-6.

68. Golantsova N.E., Gorbunova E.E., Mackow E.R. Discrete domains the rotavirus VP5* direct peripheral membrane association and permeability // J. Virol. -2004. Vol.78. - P. 2037-44.

69. Gouvea V., Glass R., Wood P. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens // J. Clin. Microbiol. 1990. -Vol. 28, N2.-P. 276-282.

70. Gouvea V., Lima R., Linhares R. et al. Identification of two lineages (Wa-like and F45-like) within the major rotavirus genotype P8. // Virus Research. 1999. -Vol. 59.-P. 141-147.

71. Gunson R.N., Miller j., Leonard A. et al. Importance of PCR in the diagnosis and understanding of rotavirus illness in the community // Common. Dis. Public. Health. 2003. - Vol. 6. - P. 63 - 65.

72. Haber P., Chen R.T., Zanardi L.R. et al An analysis of rotavirus vaccine reports to the vaccine adverse event reporting system: more than intussusception alone? // Pediatrics. 2004. - Vol. 113. - P. 353-9.

73. Haffejee I. Neonatal rotavirus infections // Rev. Infec. Diseases. 1991. -Vol. 13, N5.-P. 957-962.

74. Heaton P.M., Gouvea M.G., Miller J.M. et al. Development of a Pentavalent Rotavirus Vaccine against Prevalent Serotypes of Rotavirus Gastroenteritis // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 17-21.

75. Herring A.J., Inglis N.F., Ogen C.K. et al. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrilamide gels // J. Clin. Microbiol. 1982. - V. 16, N 3. - P. 473-477.

76. Herrmann J.E., Chan S.C., Fynan E.F. Protection against rotavirus infection by DNA vaccination // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 174, N 11. - P. 93-97.

77. Herrmann J.E., Chan S.C., Jones D.H. et al. Immune responses and protection obtained by oral immunization with rotavirus VP4 and VP7 DNA vaccine encapsulated in microparticles // Virology. 1999. - Vol. 259, N 1. - P. 148-153.

78. Holmes J.L., Kirkwood C.D., Gerna G., et al. Characterization of unusual G8 rotavirus strains isolated from Egyptian children // Arch. Virol. 1999. - Vol. 144, N 7. - P.1381-1396.

79. Hoshino Y., Kapikian A.Z. Classification of rotavirus VP4 and VP7 serotypes // Arch Virol. 1996. - Vol. 12. - P. 99-111.

80. Hoshino Y, Jones RW, Ross J et al. Human rotavirus strains bearing VP4 gene P6. allele recovered from asymptomatic or symptomatic infections share similar, if not identical, VP4 neutralization // Virology. 2003. - Vol. 10. - P. 1-8.

81. Hoshino Y., Jones R. W., Ross J., Kapikian A. Z. Porcine rotavirus strain Gottfried-based human rotavirus candidate vaccines: construction and characterization // Vaccine. 2005. - Vol. 31. - P. 3791-9.

82. Iturriza-Gomara M., Green J., Brown W.G. David et all. Diversity within the VP4 gene of rotavirus P8. strains: implications for reverse transcription-PCR genotyping//J. of Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 898-901.-P. 898-901.

83. Iturriza-Gomara М., Green J., Brown W.G., David. Molecular epidemiology of human group A rotavirus infections in the United Kingdom between 1995 and 1998 //J. of Clin. Microbiol. 2000.-Vol.38, N 1. - P. 4394-4401.

84. Iturriza-Gomara M., Isherwood В., Desselberger U., Gray J. Reassortment In Vivo: Driving Force for Diversity of Human Rotavirus Strains Isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999 // J. Virology. 2001. - Vol. 75. - N 8. - P. 3696-3705.

85. Iturriza-Gomara M., Anderton E., Kang G. et al. Evidence for genetic linkage between the gene segments encoding NSP4 and VP6 proteins in common and reassortant human rotavirus strains // J. Clin Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 3566-3573.

86. Iturriza-Gomara M., Kang G., Gray J. Rotavirus genotyping keeping up with an evolving population of human rotaviruses // J. Clin Virol. 2004. — Vol. 31. -P. 259-65.

87. Iturriza-Gomara M., Kang G., Mammen A. et al. Characterization of G10P11. rotaviruses causing acute gastroenteritis in neonates and infants in Vellore, India // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 2541-2547.

88. Jayaram H., Estes M.K., Prasad V. Emerging themes in rotavirus cell entry, genome organization, transcription and replication // Virus Research. 2004. - Vol. 101.-P. 67-81.

89. Johansen K., Bernet R., Bondesson K. et al. Incidence and estimates of the disease burden of rotavirus in Sweden // Acta Paediatr. 1999. - Vol. 88, N 426. - P. 20-23.

90. Kapikian A.Z., Hoshino R.M., Chanock I.P.-S. Advances in the development of a rotavirus vaccine for preventing severe pediatric gastroenteritis // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Междунар. симп., поев, году Пастера. — 1995, СПб.-Р. 146-146.

91. Kapikian A.Z., Simonsen L., Vesikari Т. et al. A Hexavalent Human Rotavirus-Bovine Rotavirus (UK) Reassortant Vaccine Designed for Use in

92. Developing Countries and Delivered in a Schedule with the Potential to Eliminate the Risk of Intussusception // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 22-29.

93. Kasule M., Sebunya Т.К., Gashe B.A. et al. Detection and characterization of human rotavirus among children with diarrhea in Botswana // Trop. Med. Int. Health. 2003. - Vol. 8. - P. 1137 - 42.

94. Kearney K., Chen D., Taraporewala Z.F. et al. Cell-line-induced mutation of the rotavirus genome alters expression of an IRF3-interacting protein // The EMBO Journal. 2004. - Vol. 23. - P. 4072-81.

95. Kelkar S.D., Ray P.G., Bedekar S.S. Assay of neutralizing antibodies to animal rotavirus strains and human rotavirus serotype G8 by a modified method in the residents of Pune, India // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1996. - Vol. 14, N 2. - P. 101-106.

96. Khalili B, Cuevas LE, Reisi N. et al. Epidemiology of rotavirus diarrhea in Iranian children // J. Med. Virol. 2004. - Vol. 73. - P. 309-312.

97. Kilgore P.E., Unicomb L.E., Gentsch J.R. et al. Neonatal rotavirus infection in Bangladesh: strain characterization and risk factors for nosocomial infection // Pediatr. Infect. Dis. J. 1996. - Vol. 15, N 8. - P. 672-677.

98. Kirkwood C.D., Bishop R.F., Coulson B.S. Human rotavirus VP4 contains strain-specific, serotype-specific and cross-reactive neutralization sites // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141, N 3-4. - P. 587-600.

99. Kirkwood C., Palombo E. Genetic characterization of the rotavirus nonstructural protein, NSP4 // Virology. 1997. - Vol. 236. - P. 257-265.

100. Kirkwood C.D., Gentsch J.R., Hoshino Y. et al. Genetic and antigenic characterization of a serotype P6.G9 human rotavirus strain isolated in the United States // Virology. 1999. - Vol. 256, N 1. - P. 45-53.

101. Kirkwood C., Bogdanovic-Sakran N., Ruth B. et al. Report of the Australian Rotavirus Surveillance Program 2003-2004 // Commun. Dis. Intell. -2004.-Vol. 28.-P. 481-485.

102. Kojima К., Taniguchi К., Kawagishi-Kobayashi M. et al. Rearrangement generated in double genes, NSP1 and NSP3, of viable progenies from a human rotavirus strain // Virus Res. 2000. - Vol. 67. - P. 163-171.

103. Laemmli U.K. Cleavage of structure proteins during the assembly of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

104. Laird A. R., Gentsch J. R., Nakagomi T. et al. Characterization of Serotype G9 rotavirus strain isolated in the United States and India 1993-2001 // J. of Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 3100 -3111.

105. Larralde G., Gorziglia M. Distribution of conserved and specific epitopes on the VP8 subunit of rotavirus VP4 //J. Virol. 1992. - Vol. 66, n 12. - P. 74387443.

106. Laubereau В., Gateau S., Ehlken B. et al. Rotavirus gastroenteritis in infants and children. Results of a prospective study in the area of Geneva and Basel 1997/1998 // Schweiz. Med. Wochenschr. 1999. -Vol. 129, N 7. - P. 1822-1830.

107. Lepault J., Peptidas I., Erk I.et.al. Structural polymorphism of the major capsid protein of rotavirus // The ENBO Journal. 2001. - Vol. 20, N 7. - P. 1498 -1507.

108. Linhares A.C., Mascarenhas I.D., Gusmao R.H. et al. Neonatal rotavirus infection in Belem, Northen Brazil: Nosocomial transmission of a P6.G2 strain // J. Met. Virol. 2002. - Vol. 67, N 3. - P. 418-426.

109. Linhares A.C., Ruiz-Palacios G.M., Guerrero M.L. et al. A short report on hinhlights of worl-wide development of RIX4414: A Latin American experience // Vaccine.-2005.

110. Liprandi F., Gerder M., Bastidas Z. et al. A novel type of VP4 carried by a porcine rotavirus strain // Virology. 2003. - Vol. 25. - P. 373-80.

111. Liu X., Li J. Q., Xiong X. Y. et al. Protective efficacy of recombinant rotavirus epitope-based vaccine in mice // Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2005. - Vol. 27. - P. 216-22.

112. Lo J.Y., Szeto K.C., Tsang D.N. et al. Changing epidemiology of rotavirus G-types circulating in Hong Kong, China // J. Med. Virol. 2005. - Vol. 75. - P.170.173.

113. Lopes Т., Camacho M., Zayas R. et al. Silencing the morphogenesis ofф rotavirus // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 184-192.

114. Mascarenhas I.D., Linhares A.C., Gabbay Y.B. Detection and characterization of rotavirus G and P types from children participating in a rotavirus vaccine in Belem, Brazil // Met. Inst. Oswaldo Cruz. 2002. - Vol. 97, N 1. - P. 113-117.

115. Masendycz P.J., Unicomb L.E., Kirkwood C.D., Bishop R.F. Rotavirus serotypes causing severe acute diarrhea in young children in six Australian cities, 1989 to 1992 // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 9. - P. 2315-2317.

116. Mattion N.M., Bellinzoni R.C., Blackhall J.O. et al. Genome rearrangements in porcine rotaviruses: Biochemical and comparisons between a supershort strain and standard counterpart // J. Gen. Virol. 1990. - Vol. 71. - P. 335-362.

117. Maunula L., Bonsdorff C.-H. Short sequences define genetic lineage's phylogenetic analysis of group A rotavirus based on partial sequences of genome segment 4 and 9 // J. Gen. Virol. 1998. - Vol.79. - P.321-332.

118. Mclntyre M., Rosenbaum V., Rappold W. et al. Biophysical characterization of rotavirus particles containing rearranged genomes // J. Gen. Virol.- 1987. Vol. 68. - P. 2961-2966.

119. Midthun K., Halsey N.A., Jett-Goheen M. et al. Safety and immunogenicity of human rotavirus vaccine strain M37 in adults, children and infants // J. Infect. Dis.- 1991. Vol. 164. - P. 792-796.

120. Min B.S., Noh Y.J., Shin J.H. et al. Surveillance study (2000 to 2001) of G- and P-type human rotaviruses circulating in South Korea // J. Clin. Microbiol. -2004.-Vol. 42.-P. 4297-99.

121. Mohan K.V., Muller J., Som I., Atreya C.D. The N- and C-terminal regions of rotavirus NSP5 are the critical determinants for the formation of viroplasm-like structures independent of NSP2 // J Virol. 2004. - Vol. 78 - P. 4951.

122. Mori Y, Sugiyama M, Takayama M. et al. Avian-to-mammal transmission of an avian rotavirus: analysis of its pathogenicity in a heterologous mouse model // Virology. 2001. - Vol. 15. - P. 63-70.

123. Nakata S., Gatheru Z., Ukae S., Adachi N. et al. Epidemiological study of the G serotype distribution of group A rotaviruses in Kenya from 1991 to 1994 // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 58, N 3. - P. 296-303.

124. Nakagomi O., Nakagomi Т., Akatani K., Ikegami N. Identification of rotavirus genogroups by RNA-RNA hybridization // Mol. and cell. Probes. 1989. -Vol. 9.-P. 251-261.

125. Nakagomi O., Isegawa Y., Heola S. et al. Nucleotide sequence comparison of the VP4 gene of rotaviruses processing AU-1 gene 4 allele // J. Gen. Virol. 1993. -Vol. 74, N8.-P. 1709-1713.

126. O'Brien G.J., Bryant C.J., Voogd C. et al. Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rods and also assembles into virus-like particles // Virology. 2000. - Vol. 270, N 2. - P. 444-453.

127. Offit P.A. The rotavirus vaccine // J. Clin. Virology. 1998. - Vol. 11. - P. 155-159.

128. Oh D.Y., Gaedicke G., Schreier E. Viral agents of acute gastroenteritis in

129. German children: prevalence and molecular diversity // J. Med. Virol. 2003. - Vol.71, N 1. P. 82-93. i

130. OMahony J., Foley В., Morgan S. VP4 and VP7 genotyping of rotavirus samples recovered from infected children in Ireland over a 3-year period // J. of Clin. Microbiol. 1999.-Vol. 38, N6.-P. 1699-1703.

131. Padilla-Noriega L., Mendez-Toss M., Menchaca G. et al. Antigenic and genomic diversity of human rotavirus VP4 in two consecutive epidemic seasons in Mexico // J. Clin Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 6. - P. 1688-1692.

132. Palombo E.A. Genetic and antigenic diversity of human rotaviruses: potential impact on the success of candidate vaccines // FEMS Microbiol. Lett. -1999.-Vol. 181,N1.-P. 1-8.

133. Parashar U.D., Hummelman E.G., Bresee J.S. et al. Global illness and deaths caused by rotavirus disease in children // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9. -P. 562-572.

134. Parra G.I., Bok K., Martinez M., Gomez J.A. Evidence of rotavirus intragenic recombination between two sublineages of the same genotype // J. Gen. Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 1713-6.

135. Patton J. and Spencer E. Genome replication and packaging of segmented double-stranded RNA viruses // Virology. 2000. - Vol. 277. - P. 217-225.

136. Patton J.T., Taraporewala Z., Chen D. et al. Effect of intragenic rearrangement and changes in the 3' consensus sequence on NSP1 expression and rotavirus replication // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 2076-86.

137. Pesavento J.B., Lawton J., Estes M.K. The reverse consideration and expansion of the rotavirus genome // PNAS. 2001. - Vol. 98, N 4. - P. 1381-1386.

138. Phua K.B., Quak S.H., Lee B.W. et al. Evaluation of RIX4414, A Live, Attenuated Rotavirus Vaccine, in a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Phase 2 Trial Involving 2464 Singaporean Infants // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. -P. 6-16.

139. Podewils L.J., Antil L., Hummelman E. et al. Projected cost-effectiveness of rotavirus vaccination for children in Asia // J. Infec.t Dis. 2005. — Vol. 192. - P. 133-45.

140. Pongsuwanna Y., Guntapong R., Chiwakul M. et al. Detection of a human rotavirus with G12 and P9. specificity in Thailand // J. Clin Microbiol. 2002. -Vol. 40.-P. 1390-1394.

141. Prasad B.V., Marietta E., Estes M.K., Chiu W. Localization of VP4 neutralization sites in rotavirus by threedimensional cryo-electron microscopy // Nature. 1990. - Vol. 343, N 6257. - P. 476-479.

142. Protocol on rotavirus surveillance and health care utilization for gastroenteritis in children. WHCW&B/02.15. 2002.

143. Rahman M., Sultana R., Podder G. et al. Typing of human rotavirus: Nucleotide mismatches between the VP4 gene and primer are associated with genotyping failure // Virol. 2005. - Vol. 24. - P. 24.

144. Rahman M., Matthijnssens J., Goegebuer T. et al. Predominance of rotavirus G9 genotype in children hospitalized for rotavirus gastroenteritis in Belgium during 1999-2003 // J. Clin Virol. 2005. - Vol. 33. - P. 1-6.

145. Rahman M., Matthijnssens J., Nahar S. Characterization of a novel P25.,G11 human group a rotavirus // J. Clin Microbiol 2005. - Vol .43. - P. 32083212.

146. Ramachandran M., Gentsch J.R., Parashar U.D. et al. Detection and characterization of novel rotavirus strains in the United States // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36, N 11. - P. 3223-3229.

147. Ramachandran M., Kirkwood C. D., Unicomb L. et al. Molecular characterization of Serotype G9 rotavirus strain from a global collection // Virology. 2000. - Vol. 278. - P. 436-444.

148. Raming R. F. Genetics of the rotaviruses // Annu. Rev. Microbiol. 1997. -Vol. 51.-P. 225-55.

149. Raming R. Pathogenesis of intestinal and systemic rotavirus infection // J. Virol. 2004. - Vol. 78, N 19.-P. 10213-10220.

150. Sanchez-Fauquier A., Wilhelmi I., Colomina J. et al. Diversity of group A human rotavirus types circulating over a 4-year period in Madrid, Spain // J. Clin.r Microbiol.-2004.-Vol. 42.-P. 1609-1613.

151. Santos N-et al. VP4 genotyping of human rotavirus in the United States // J. ф Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 1. - P. 205-208.

152. Santos N, Hoshino Y. Global distribution of rotavirus serotypes/genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine // Rev. Med. Virol. 2005. - Vol. 15. - P. 29-56.

153. Shuttleworth G., Eckery D.C., Awram P. Oral and intraperitoneal immunization with rotavirus 2/6 virus-like particles stimulates a systemic and mucosal immune response in mice // Arch. Virol. -2005. Vol. 150. - P. 341-9.1. Y'

154. Silvestri L.S., Taraporewala Z.F., Patton J.T. Rotavirus replication: plus-sense templates for double-stranded RNA synthesis are made in viroplasm // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 7763-74.

155. Simonsen L., Morens D.M., Eixhauser A. et al. Effect of rotavirus vaccination programme on trend in admission of infants to hospital for intussusception // Lancet. 2001. - Vol. 358. - P. 1224-1229.

156. Simonsen L., Viboud C., Elixhauser A. et al. More on RotaShield and Intussusception: The Role of Age at the Time of Vaccination // J. Infect. Dis. 2005.1л -Vol. 192.-P. 36-43.

157. Soares-Weiser K., Goldberg E., Tamimi G. et al. Rotavirus vaccine for ^ preventing diarrhea // Cochrane Database Syst Rev. 2004.

158. Song M.O., Kim K.J., Chung S. I. et al. Distribution of human group a rotavirus VP7 and VP4 types circulating in Seoul, Korea between 1998 and 2000 // J. Med. Virol. 2003. - Vol. 70. - P. 324-328.

159. Souza M.B., Racz M.L., Leite J.P. et al. Molecular and serological characterization of group a rotavirus isolates obtained from hospitalized children in Goiania, Brazil, 1998-2000 // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - Vol. 22. -P. 441-443.

160. Taraporewala Z.F., Patton J.T. Nonstructural proteins involved in genome packaging and replication of rotaviruses and other members of the Reoviridae // Virus Res. 2004. - Vol. 101. - P. 57-66.

161. Tsai C., Chiu H., Abe T. Epidemiologic features infection in Taiwan: A review // Pediatrics International. 2000. - Vol.42. - P. 411-414.

162. Unicomb L.E., Bishop R.F. Epidemiology of rotavirus strains infecting children throughout Australia during 1986-1987. A study of serotype and RNA electrophoretype // Arch. Virol. 1989. - Vol. 106, N 2. - P. 23-35.

163. Ushijima H., Koike H., Mukoyama A. et al. Detection and serotyping of rotaviruses in stool specimens by using reverse transcription and polymerase chain reaction amplification // J. Med. Virol. 1992. - Vol. 38, N 4. - P. 292-297.

164. Van der Heide R., Koopmans M.P., Shekary N. et al. Molecular characterizations of human and animal group a rotaviruses in the Netherlands // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 669-75.

165. Varghese V., Das S., Singh N.B. et al. Molecular characterization of a human rotavirus reveals porcine characteristics in most of the genes including VP6 and NSP4 // Arch Virol. 2004. - Vol. 149. - P. 155-72.

166. Vende P., Tortorici M.A., Taraporewala Z.F., Patton J.T. Rotavirus NSP2 interferes with the core lattice protein VP2 in initiation of minus-strand synthesis // Virology. 2003. - Vol. 313. - P. 261-73.

167. Vesikari Т., Karvonen A., Puustinen L. et al. Efficacy of RIX4414 live attenuated human rotavirus vaccine in Finnish infants // Pediatr. Infect. Dis. J. -2004. Vol. 23.-P. 937-43.

168. Villena C., El-Senousy W.M., Abad F. X. et al. Group A rotavirus in sewage samples from Barcelona and Cairo: Emergence of unusual genotypes // Applied and Environmental Microbiol. 2003. - Vol.69, N 7. - P. 3919-3923.

169. Vitour D., Lindenbaum P., Vende P. et al. RoXaN, a novel cellular protein containing TPR, LD, and zinc finger motifs, forms a ternary complex with eukaryotic initiation factor 4G and rotavirus NSP3 // J. Virol. 2004 Vol. 78. - P. 3851-62.

170. Wang L., Huang J.A., Nagesha H.S. et al. Bacterial expression of the major antigenic regions of porcine rotavirus VP7 induces a neutralizing immune in mice. Order this document. // Vaccine. 1999. - Vol.17, N 20-21. - P. 2636-2645.

171. Ward RL. Rotavirus vaccines: is the second time the charm? // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2005. - Vol. 6. - P.798-803.

172. Watanabe M, Nakagomi T, Koshimura Y, Nakagomi O. Direct evidence for genome segment reassortment between concurrently-circulating human rotavirus strains. // Arch. Virol. 2001. - Vol. 146, N 3. - P. 557-70.

173. Wilhelmi I., Mier C., Roman E. et al. The molecular epidemiology of the rotavirus in Spanish children // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1999. - Vol. 17, N 10.-P. 509-514.

174. Wood D. WHO informal consultation on quality, safety and efficacy specifications for live attenuated rotavirus vaccines Mexico City, Mexico, 8-9 February 2005 // Vaccine 2005.

175. Yuan L., Azevendo M.S., Gonzales A.M. et al. Mucosal and systemic antibody responses and protection induced by a prime/boost rotavirus-DNA vaccine in a gnotobiotic pig model // Vaccine. 2005. - Vol. 23. - P. 3925-36.

176. Zarate S., Romero P., Espinosa R. et al. VP7 mediates the interaction of rotaviruses with integrin alphavbeta 3 through a novel integrin-binding site // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 10839-47.

177. Zbinden R., Kunz J., Schaad U. et al. Incidence and diagnosis of infection in neonates: result of two studies // J. Perinat Med. 1990. - Vol. 18. - P. 363-368.

178. Zeng M., Zhu Q.R., Zhang Y. et al. Molecular epidemiologic survey of rotaviruses from infants and children with diarrhea in Shanghai // Zhonghua Er Ke Za Zhi.- 2004. -Vol. 42. -P. 10-15.

179. Zhang M., Zeng C., Morris A. et al. A functional NSP4 enterotoxin peptide secreted from rotavirus-infected cells // J. of Virology. 2000. - Vol. 74. - P. 1166311670.

180. Zhang L.J., Du Z.Q., Zhang Q. et al. Rotavirus surveillance data from Kunming Children's Hospital, 1998 2001 // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. -2004.-Vol. 25.-P. 369-399.

181. Zimmerman C.M., Bresee J.S., Parashar U.D. et al. Cost of diarrhea-associated hospitalizations and outpatient visits in an insured population of young children in the United States // Pediatr. Infect. Dis. J. 2001. - Vol. 20, N 1. - P. 1419.

Информация о работе

Фёдорова, Оксана Фёдоровна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2006
ВАК 03.00.06

Диссертация

Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы