Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и анализ гена, кодирующего основной нейтрализующий антиген VP7 ротавирусов человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и анализ гена, кодирующего основной нейтрализующий антиген VP7 ротавирусов человека"

"Д о 9

^^ ( I Г ' •

' российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

БЕССАРАБ Ирина Николаевна

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНА,

КОДИРУЮЩЕГО ОСНОВНОЙ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ АНТИГЕН УР7 РОТАВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1992

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Госкомитета РСФСР та санитарно-эпидемиологическому надзору.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Бородин A.M.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Манко C.B.

кандидат химических наук Гршгин A.B.

Ведущая организация: Всесоюзный научный медико - генетический

центр АМН России

Защита состоится "JUL* 1992 г. в fO час.

на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте Сиоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биоорганическо2 химии им. М.М. Шемякина РАН.

Института

Автореферат разослан

■АЛ?

bUCyunÔL-

1992 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета ИБХ им. М.М. Шемякина РАН кандидат химических наук

Несмеянов В.А.

МУД fr;

^'Дел « ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

jWCCßiV.liHfi ч

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Ротавирусы - PIffi-содеркащив виру си, образующие один из родов семейства Reovlrldcт&. Ротавирусы являются наиболее частой причиной детских инфекционных гастроэятеритоь, они вызывают ~ЬО% всех гастроэнтеритов у детей в течение голо и 90S - 8 ет/мнеэ время.

Изучение циркуляции ротавирусов о различными электрофоре типами РНК на территории Нижнего Новгорода и 10 других городов России позволило выявить домишируидие алектроХю^зтичоские типы ротавирусов человека. Однако серотиповая принадлежность ротавирусов человека, распространенных на территории России, но изучена. Серотип штамма мокэт Оыть установлен в реекции нейтрализации с соответствующей антиснворотнсЗ, с помощью сзроттоспецифичэских монокладалышх онтитол в иммунофэрмэнтном анализе. Предположения о принадлежности штамма к определенному саротипу могут бить высказаны на основе анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирудда серотипопределяиаие белки.

ЦЗЛЬ РАБОТЫ. Целью исследовашя являлось клонирование п анализ гена, кодирующего основной нейтрализукщкй антиген vpr клинических изолятов ротавирусов о различными алоктрофореткпами РНК. В связи с втии в данной работе были поставлены следующие задачи:

1. Определение условий полимеразной цепной реакция (PCR) для идентификации ротавирусов человека.

2. Клонирование н. анализ нуклеотидной последовательности гена, кодирующего основной -нейтрализующий антиген VÎT с целью определения серотяпа клинических изолятов ротавирусов человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТЙЧВИСДЯ ЦЕННОСТЬ РАВОШ. В результате ' проделанной работы определены условия полимеразной цепной реакции, позволяющие проводить идентификацию ротавирусов человека. Впервые клонирована последовательности, кодирующие основной нейтрализующий антиген VP7 трех клинических изолятов ротавирусов„ циркулирующих на территории Россия. Лровэден сравнительный анализ икмуногеншг участков авлкв VP7, в результате которого определена серотиповая принадлежность исследованных изолятов. lia основе анализа структуры белка VP7 изолята 1565 высказано предположение о существовании нового серотипа ротавирусов.

ОБЪЕМ РАБОШ. Диссертационная работа изложена на

- г -

19 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, експериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (Ä/ ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Характеристика ротавирусов, использованных в работе *.

В работа использованы клинические изолята ротавирусов человека, полученные в розультатв исследований, проводимых в Нижнем Новгороде и 9 городах Европейской части России в 1981 -1991 г.г., а таюкэ ротавирус обезьян SA 11, адаптированный к росту на культуре клеток линии СПЭВ. Клиническкэ изолята ротавирусов человека охарактеризованы в соответствии с принятой в ■нституте классификационной схемой, основанной на сравнении електрофоротической подвижности РНК исследуемых вирусов. В качества стандарта используется РНК ротавируса обезьян SA11. Выявлено 45 различных влэктрофоретнпов РНК. Большинство электрофоретшов встречалось в единичных случаях, некоторые выявлены в небольпом количестве. Пять 8лектрофоретипов преобладают в изучаемых популяциях ротавирусов, из них три "длинных" (электрофоретипы 1, 3, 39) и два "коротких" (влектрофор яш 8 и 35) {Новикова H.A. с соавт., 1992].

Для дальнейшего исследования выбраны изоляты с "длинным" (1405 и ЗТ18) и "широким" (1565) електрофоретическим типом РНК. Изоляты 1407 и 3718 имеют первый и третий электрофоретип соответствено, изолят 1565 - девятый (рис.1.). Первый электрофоре тип характеризуется раздельной миграцией сегментов во всех четырех грушах генов; у ротавирусов, принадлежащих к третьему электрофоретдау сегменты 2 и 3, 7 и 8 мигрируют совместно; для ротавирусов с девятым электрофоретипом характерна совместная миграция сегментов 2 и 3, 8 и 9, в также болев медленная по сравнению с SA11 миграция сегмента 10.

Ротавирусы с первым электрофоретипом РНК циркулировали на территории Нижнего Новгорода в эпидемический сезон 1984 - 1985 г. г., в точение которого ими было вызвано 70» случаев ротавирусного гастроэнтерита среда детей первого года жизни. Ротавирусы с третьим электрофоретипом РНК доминировали в разное время на территории 6 городов, вызвав за период 1981 - 1991 г.г.

"Данный этап работа выполнен совместно с Новиковой H.A. и Епифановой Н.В.

SA11 .1 3 9 SAH 1 SAH 3 SAH 9

группа сегментов

1

I г з.л

ggg ад^ fes3 ^^ fisl

Рис.1. Элоктрофоротипн РНК ротавирусов, использованных в работе;

а) Схема распределения сегментов

б) Электрофорез геномной РНК в поли акрил шидном геле. Окраска нитратом серебра.

Обозначения: SA 11 - профиль миграции геномной РНК рогавируса обезьян SA11, используемый в качестве стандарта 1 - первый, "длинный" электрофоретип (N 1407) 3 - третий, "длинный" электрофоретип (N 3718) 9 - девятый, "широкий" электрофоретип (Н 1565)

39.4Ж случаез ротавмрусного гастроэнтерите. Выбор изолята 1565 обусловлен том, что он имеет необычную электрофоретическую подвихность и охарактеризован как изолят о а идентифицированным ранее "широким" электрофоре типом РНК {Новикова H.A. с соавг., 19871.

2. Выбор олигонуклеотидкых праймеров. *

Для получения кДНК и вмплаЕихации гена, кодирующего основной нейтрализущий антиген ротавирусов, синтезированы три 20~членных праймэра, комплементарных консервативным участкам гена VP7 : Н 63 49-68 п.о., Н 62 1062-1043 И.О., К 64 932-913 П.о. (рис.2.). В результате амплификации ротавирусноЯ кДНК с использованием праймзров К 62 ч II 63 образуется фрагмент 1014 п.о., который r-лючает структурный ген VP7 и 3'- некодирувдую область. При амплификации с праймероз N 63 и Н 64 синтезируется фрагмент ДНК 894 п.о., в которой отсутствует последовательность, кодирующая 31 аминокислотный остаток С-кокцевой части белка VP7. Как в первом, так н во втором случае продукт PCR содеркит нуклеотидные последовательности, кодируиаие участки белка, участвующие в образовании нэйтрялнэуших зпитопов (а.о. 87 - 22П iEstee И.К & Cohen J.» 19891.

кДНК, -слученная с использованием праймеров Н 62 и N 63 имеет "тупые" конвд, что затрудняет клонирование продукта PCR. С целью повышения эффективности лигирования в структуру этих праймеров внесени изменения, которые привели к образованию в составе праймеров гексануклеотидных последовательностей, соответствующее сайтам узнавания эндонуклеази рестрикции EcoR I (рис.2.). ЕсоН I сайт редко встречается в последовательностях гена VP7 ротавирусов. Из 20 проанализированных последе^ ательностэй этот сайт содержал ген VP7 двух штаммов ротаьирусов свиней Po/YH и Po/Oeu, а также штамма ротавирусов человека Hu/Austrslla/5/77. В каадой из этих последовательностей ЕсоП I - сайт находится перед участком гена, кодирующим нейтрализующие эпигош.

3. Клонирование гена, кодирующего основной

нейтрализущий айтиген ротавирусов человека.

'Прайиеры, использованные в данной работе, синтезированы Грязшвым C.U., ИБХ РАН и Черновым И.П., ФИБХ РАН, г.Пущино.

Н 63 5* АТСТАТСОГАКГОШАГАС 3'

v г

N 160 3' МГСТТААСАТАСТАСАСТО 5*

25ооя1

Рис.2. Олигоиуклеотидшэ праймеры, использованные для получения нДНК и амплификации гена VP7. Координата гена приводятся по (Both G.W. et al., 19831. Нукпеотидпые замены в праймерах 159 и 160 обозначены стрелками. Сайта расщепления ендонуклеазой рестрикции ЕсоП I выделены жирным шрифтом и подчеркнута.

- б -

кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы из вируса миелобластоза птиц (AHV). При получении кДНК гена VP7 ротавируса обезьян SA11, изолята 1565 и изолята 1407 в качестве олигонуклеотидной затравки использовали праймеры N 62 и N 63. кДНК изолята 3718 получали с помощью праймеров N 159 и N 160.

Для отработки условий полимеразной цепьой реакции использовали кДНК ротавируса обезьян SA11 и олигонуклеотидные праймеры N 62, N 63, N 64. Реакционная смесь (SO мкл) содержала 67 мМ Трис HCl, pH 8.8, 6.7 мЫ HgC^ . 16.7 мМ (NH^SO^ 10 мМ меркалтоэтанол, 6.7 мкМ ЭДТА, 60 пмоль какдого праймера, 500 мкМ (ЙИР. PCR (30 циклов) проводили в следующем режиме: денатурация при 95° с в течение 30 сек, откиг при 55° С в течение 1 мин, элонгация цепи при 7(Р С в течение 9 мин. Для амплификации кЛНК изолятов 1565 к Н07 использовали олигонуклеотидные праймеры N 62, .. 63 и параметры реакции, описанные выше (рис.3.).

1 2 М

1353 Ю7в

етг

603

Гис.З. Амплификация кДНК изолятов 1565 и 1407 с использованием праймеров N 62 и N 63.

Обозначения: 1 - продукт амплификации кДНК изолята 1407 2 - продукт амплификации кДНК изолята 1565 К - маркер молекулярных масс <рХ174/Нае III -»■ - фрагмент ДНК 1014 п.о.

Амплификацию кДНН изолята 3718 проводили с использованием праймэров N 159 и N 160, для которых проведена оптимизация условий реакции. Исследовалось влияние концентрации MgCl2 и концентрации праймера на эффективность и специфгиость PCR. Буфер для амплификации содержал 67 мМ Трис HCl, pH 8.8, 16.7 мЫ (NH4)2S04, 1 Ш ДТТ. Оптимальная концентрация MgCl2 составляет 3 мМ {рис.4.), оптимальная концентрация какдого праймера -1.2 мкМ.

ato tai ara атт e¡w таг авс аса ait ста асс tit тта ata тез си ata ттт ata aat so

MY01EYIT ILTFL15L1F 1 N 20

*

tai »1» ттт aaa аса атс асс аят асэ ala qac tit атс атс tac аса ит из ттт bti izo

y 1 F к т i i s i м о f i i y r f l f v to

Aia ari sia na oca cca itt атт aaa acq caa aat tai oga ota aat тта oca ata act iao

I4»VLPPFVKTQ»YQVH\PII ВО

en тсс at3 bat acq cca tat ata aat tca aca ota азт вал tca itt tia act тст act 240

3 s m o t p y i n s t vsesfitst 80

O ч

ста тит ata tat tat cca aac qac ota acq aac cab атс aca oat aat aaa tüü aaa oat уоо

lciyypnoytnqitdnkvko 1ü0

i->

act cti тс» саз ста itt ctt act aaa 033 too tca аса eot tca ijtt tac ттт aaa gaa 380

tlsqlfltkqtfstqsvyfke izo

P О

tat bca qat СТО аез tca ТТТ tct ota aat cca cqc cia tat TOT oat tai aac att ОПЗ «0

yaolasfsvnprlycuyn 1 v 1*0

tt3 атэ aaa tat sat 33a aat tca caa ста "at at3 tct baa пз эст вас tia ata тта <80

lmkyobnsqlomseladl i l 160

• V

aat заа тш ттэ tot aat cca ato qat ott aaa ctc tat tat tac caa caa aca üat qaa 840

nevlchpmbvklyyyqqioe 1b0

О ОС

oca aat aaa tq3 ata tca atq шс qac тся 131 аса ati aaa43ta tot cca ctc aat tca 600

ankvismbdsct1kvcplhs zcx)

О

сая act cit эоа атс 03a тот ткэ act act вас cca аса аса itt qaa qaa gta gct tct 680

qtlbibcsttopttfeevas z2u

ata ваз aaa тта 3t3 ata act вас gtt ota bat 3?a att aat cat aaa tta gat 3tc aca 72q

iekly1tdvvdg1nhkl0vt 240

О О ▼

дос зст аса тот аса att a3q aac тэт aaa aaa ctt boa cca ada зал aac git oca ata 780

tatctirnckklqprenvai 260

<7 tf

ati caa (jta aoa э03 tca aat ata ctc qat ati аса oca qat oca асс аса oct cca caa 8*0

iqvaasNiLDiTAOPTTAPg zso

act baa aba ato atq cot ata aat тэз aaa aaa tos tq3 саз 3ta tit tat act ata otb 900

termiirihvkkwvqyfytiv 300

3ai tai 3tt aac caa атс ota caa ota atq icc aa3 coa tct cot tct tia aat toc oct 060

d y v n q i vqvmskrsrslnsa 320

oct tit tat tat COB ott tab ata tat ctt ааз тта ш& п® XSX зя1 018 00} 1014

a f y y r » 226

Ряс.7. Нуклеотидная последовательность гена и соответствующая ей аминокислотная последовательность белка VP7 изолята 1565. Обозначения: о - консервативные остатки цястоииа.

V - консервативные остатки пролива. — - замена Pro -»• Ser (пояонеиие в тексте). Инишпфупдио кодо:ш обозначены звездочками. Потенциальный сайт глихозшшрования Авп69-Ser - Thi71 подчеркнут. Жирным шрифтом выделены последовательности, соответствующие прайморем,

использованным в PCR.

атз таг овд атт сад тат дос аза

и Г О 1 Ч К I Я

тт ста атс ттт стз ата тса атс атт ста стс аас

60 го

тат ата тта ала тса вш аст сзз атз ато вас тас адг ата гаг аза ттт ттз ттз атт Т1ЬК5У1ЯиМ0Г)1УКГЬ11

120 <0

тот эта оса тта ттт асс тто аса аил ост саз аат тат 303 стт аас тта сса ата аса SVAlFALTRAQNYai.nl i т

180 ео

00а тса атз зас аст вса тас ол аас тст аст саа заа зза ата ттт. ста аса тсс аса 05110тата n § т (jeq1fltst

240 во

тта тот ттз тат тат сса лст оаа оса аот аст саа атт аат ват онт оаа тоо ааа оас LCLYYPTEASTQINDOEVKD

300 100

тса ттз тса саа атз ттт стс аса ааа озт тэз оса аса эза тса втс тат ттт ааа 6аз 5L5QMPLTKQVPTGSYYFKE

тат тса аот атт отт оат ттт тот стт оат сса саа тта тат тот зат тат аас тта ота У 5 5 YDFSVOPQLYCDYNLV

гоо 120

420 140

ста атз ааа тат зат саа аат стт саа тга оат атз тса ваз тта ост оат тта ата ттз

LMKYOQNLELDI4SELAOLIL • »

аат оаа таз тта тот аат сса атс сат ата аса тта тат тат тат саа саа тсо оза зал NEVLCNPUD 1TL^YYQQSBE

О О V

тса аат лаз г03 ата тса атс (на тса тса тит аст втз ааа зтз тот сса стз аат асз SNKVISUЗSSCTVKYCPLNT

430 180

840 180

боо 200

саа асз тта зоа .А оот тот САА аса аса аат зта зас тсз ттт заа АТЗ отт зст ваз qtlq i ос0ттм¥о5ремуае

ево гга

аат оаэ ааа тта эст ата вто оат отс отт оат 033 ата аат тат ала ата аат ттз аса 720

neklalydvvdglhykl n l т 240 « ® *

аст асз аса ют аст атт сза аат тот ааз ааа тта эст сса аза ваз. аат (па ост ота 780

тттст iriickklgpreиvav 200

* V

ата саа отт эот 03с тст аат ста тга оас ата аса оса вас сса асз аст аат сса саа 840

lC¡vaOSKYLOlTADPTTKPq 230

аст зао аоа атз атз аоа 010 аат тоз ааа ааа тоз тоз саа вта ттт тат аст ата ота ЕКММ II УХУККУУд У.РУТ 1 V

900

300

ват тат атт аас саз атс ото саа ота атз тсс ааа аоа тса аоа тса тта аат тст оса и т 1 n о i yqvmskh5kslnьa

«00

гго

зст ттт тат тат аза ота таз «та тат стт аоа па ш* пс тат ва1 вш ас а г v г к у

1013 зге

рис.8. Нуклеотадная последовательность гена и соответствующая ей аминокислотная последовательность белка УР7 изолята 3718. Обозначения такие хэ как на рис.6.

Чуклеотидную и соответствующую ей аминокислотную последовательность каждого из изолятов сравнивали с последовательностями 7Р7 ротавирусов, принадлежащих к различным серотипам. Ранее было показано, что в штаммах ротавирусов, принадлежащих к одному серогипу, гомология аминокислотных последовательностей VP7 составляет 91% - 100%, причем для штаммов вирусов, вызываицих инфекцию внутри одного круга хозяев сходство выше - 95% - 100*. Для штаммов с разными серотипами эта величина как правило не превышает 86% [Green K.Y., et al., 1987; Nlehlkawa К. et al., 1989). Как видно из таблицы 1, гомология нуклеотидных последовательностей VP7 изолятов 1407 и 3718 с последовательностями VP7 штаммов, относящихся к серотипам 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и 12 составляет от 72.3% до 76.7%, аминокислотных - от 73.0% до 83.1«. В то же время, эти последовательности высоко гомологичны друг другу (97.5% величина гомологии нуклоотидных и аминокислотных последовательностей) и каждая из этих последовать чьностей обладает значительным сходством с VP7 штамма Ща ротавирусов человека (1 серотип). Гомология нуклеотвдных последовательностей VP7 штамма Wa и VJ7 изолятов 1407 и 3718 составляет 93.9% и 93.2%, аминокислотных - 95.755 и 55.4%. Аминокислотные последовательности VP7 изолятов 1407 и 3718 также высоко гомологичны последовательностям белка VP7 штаммов Mo, D, 1137, относящихся к серотипу 1 (таблица 2).

Гомология нуклеотидной последовательности гена VP7 изолята 1565 со штаммами, принадлежащими к серотипам 1 - 4, б, 8 - 10 составляет 73.5% - 77.7% и не превышает 90% для штаммов 0SU (81.9%) и YH (07.1%). Гомология аминокислотной последовательности - 73.3% - 82.5%, 84.4 % и 90.2% соответственно.

Восемь остатков цистеина и девять остатков пролина, консервативных во всех штаммах ротавирусов, присутствуют в последовательности каждого из изолятов. Исключение составляет остаток пролина в положении 112. VP7 изолята 1565 содержит замену Pro112-* Ser (рис.7.). Аналогичная замена присутствует также в последовательности VT7 штамма ротавируса свиней YM (серотип 11).

VP7 является гликозилированным белком. Из 4 потенциальных сайтов, по которым происходит гликозилирование в различных штаммах ротавирусов (а.о. 69, 146, 238 и 318), последовательность VP7 изолята 1565 содержит 1 потенциальный сайт Asn69-Ser-Thr71. В аминокислотной последовательности VP7 изолятов 1407 и 3718 - 2 потенциальных сайта N-гликозилирования: Aen69-Ser-Thr71 и A3n238-Leu-Thr2 .

Таблица 1.

Сравнение нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последователь! стой УР7 изолятов 1407, 1565, ЗТ18 к последовательностей УР7 штаммов рот^ыгрусов разных соротипов.

йот 1565 3718

штамм серотип процокт гомологии о пооладоввтвльноотью нукяаотмдной / аиикокколстной

Ни/Яа 1 93.9/95.7 73.9/76 .1 93 .г/95. 4

Ни/АшЛ;г/5/77 2 73.7/73.6 73.7/73 .3 73 .7/73. 0

Б1/БА11 3 76.3/03 1 77.3/вг .5 76 .1/81. 6

Ни/БГ-З 4 Т7.0/79.1 74.7/73 .о V« .2/77. 3

ро/оэи 5 76.0/79.1 81.9/81 .4 75 .3/70. г

Во/ЫСБУ 6* 74.а/ог.г 75.5/78 .в 74 .3/81. 9

Ни/69М 8 72.3/76.7 75.0/79 .1 71 .9/75. в

НЦ/И1-61 9 76.6/81.9 77.7/81, .6 76 .7/61. 0

Во/ -61А 10 75.7/79.1 73.5/76 .7 75 .7/78. 5

Ро/УН 11 74.8/79. 4 87 .1/90 .2 74 .3/78. 5

Ни/126 12 74.6/76.1 75.3/80 .4 74 .2/75. 5

потенциальные сайты

гликозилирования, а.о.

69 - .1 + + +

146 - 148 - - -

238 - 240 + -

318 - 320 - - -

общее число 2 1 2

число консервативных а.о.

цистеина 8 8 8

пролнна 9 8 9

Обозначения: Ни/ - ротавирус человека» Б1/ - ротавирус обезьян, Ро/ - ротавирус свиней, Во/ - ротавирус крупного ■ рогатого скота

* - последовательность УР7 штаммов ротавирусов, относящихся к серотипу 7, в настоящее 1мл не определена.

Высокие сходство аминокислотных последовательностей в района С белка VP7 ранее было показано для штаммов ротавирусов, имеющих серотиш 3 и 8 (1 аминокислотная замена), 3 и 11 (2 аминокислотных замены) Шит С.P. et &1., 1989; Ruiz A.M. et al., 1988). Недавно выделены два штамма ротавирусов лошадей L338 и PI23, которые по результатам серологических тестов и анализа нуклеотидной последовательности гена VP7 предположительно имеют новые (13 и 14) серолшы. Районы С белка VP7 о тих птаммов тоже обладают высокой гомологией с районом С белка VP7 ротавирусов, име:тцих серотип 3. На основании этого выдвинута гипотеза, согласно которой основной вклад в определение серотиповой специфичности ротавирусов вносит вариабельный район A [Browning G.F. et al., 1991). Особенностью района А белка VP7 изолята 1565 является наличие остатка аспарагтша в положении 88. Все известные к настоящему времени последовательности VP7 в этом положении содержат отстаток глютаминовой кислоты (за исключением о.татка серина в VP7 штамма 126).Район A VP7 изолята 1565 отличается от района A VP7 штамма YM на 7 аминокислотных остатков.

Таким образом, анализ структуры основного гейтрализуицего антигена VP7 изолята 1565, указывает на то, что изолят 1565 относится к новому серотипу ротавирусов.

В U Б О Д Li

1. Разработан метод идентификации ротавирусов группы А, основанный на специфической амплификации (PCR) гена, кодируемого основной нейтрализущий антиген VP7.

2. Определена нуклеотцдавя последовательность клонированных генов, кодирующих балок VP7 трех клинических изолятов ротавирусов человека, циркулирующих на территории Россииt

' 3. Анализ стрлтстурн основного нейтрализующего антигена VP7 указывает на то, что изоляты ротавирусов 1407 и 3718 относятся к первому серотицу, а изолят 1565 является представителем нового серотипа ротавирусов.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Бессараб И.П.. Новикова Н.Л., Бородин A.M. Использование полимеразной цепной реакции для анализа ротавирусов. Нуклеогидная последовательность гена, кодирующего основной нейтрализующий антиген VP7 ротавируоа человека нового С - серотипа. Биоорганичэская химия. 1990. Т.16 Н 12. 0.1689-1692.

2. Beosarab I.N., БрШтота N.V., Hovlkova N.A., Borodin А.И. FCR-roediatedL analyslo of human rotaviruses. International aympoBlum "Synthetic ollgonucleotldlee: problems and frontiers of practical application." 1991. Moscow. P.167.

3. Бессараб И.Н., Епифанова H.B., Новикова H.A., Бородин A.M. Анализ гена, кодирующего основной нейтрализующий антягон YP7 изолята 1407 ротавируоа человеке. Вопросы вирусологик, 1.Л. N.6. 0. 480 - 483