Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на Европейской территории России

Новикова, Надежда Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на Европейской территории России
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на Европейской территории России"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ^ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

им. М.П.ЧУМАКОВА

Новикова Надежда Алексеевна ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И АНТИГЕННЫЕ ВАРИАНТЫ РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ НА ЕВРОПЕЙСКОЙ ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

( 03.00.06. - вирусология )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи УДК 616-34-002.578.91:578.53:088.1

Москва - 1998

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии

МЗ РФ

Научный консультант: доктор мед. наук, профессор, академик РАМН С.Г.Дроздов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Карпович

доктор медицинских наук, профессор В.П.Машилов

доктор биологических наук, старший научный сотрудник М.Б.Королев

Ведущее учреждение: Московский научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского МЗ РФ.

С О

Защита состоится Л- 1998 г. в /У час.

На заседании диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН по. адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан ¿1*1 ЦиЛ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук О.А.Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Дегидратирующие диарейные заболевания детей младшего возраста, этиологически обусловленные ротавирусами, являюся важной проблемой здравоохранения во всем мире. Широкая распространенность, значительный удельный вес в структуре небактериальных гастроэнтеритов, высокий процент случаев, требующих госпитализации, возможность летальных исходов и вариабельность сегментированного генома возбудителя определили сформулированную Всемирной Организацией Здравоохранения приоритетность развития исследований, направленных на всестороннее изучение генетического и антигенного разнообразия ротавирусов и особенностей их циркуляции в различных географических регионах мира, конечной целью которых является разработка эффективной вакцины против ротавирусных гастроэнтеритов [Бюлл. ВОЗ, 1991; Offit P.A., 1994; Kapikian A.Z. et al., 1995].

На территории Российской Федерации заболеваемость ротавирусным гастроэнтеритом среди детей сопоставима с заболеваемостью сальмонеллезом и дизентерией, занимает до 9,2 % структуры ОКИ и определяет 30 % и более случаев ОКИНЭ [Дроздов С.Г. и др., 1982; Букринская А.Г. и др., 1989; Рындыч A.A., 1991]. Всесторонне и детально изучены клинические проявления ротавирусного гастроэнтерита и эпидемиологические особенности ротавирусной инфекции [Дроздов С.Г. и др., 1982; Мазанкова Л.И., 1988; Букринская А.Г. и др., 1989; Тен Н.Л. и др., 1990; Вафакулова С.Х. и др., 1991; Константинович Е.И. и др., 1992]. Однако, исследования, направленные на изучение молекулярной природы циркулирующих на территории нашей страны вариантов ротавируса носят эпизодический характер. С использованием электрофоретипирования РНК охарактеризованы изоляты ротавируса группы А, собранные в Москве, Санкт-Петербурге, Кемеровской области [Букринская А.Г. и др., 1990; Хаустов В.И. и др., 1989; Васильев Б.Я. и др., 1995]. Сведения о распространенности ротавирусов антигенной группы С отсутствуют. Остается открытым вопрос о существовании связи между клиническими проявлениями инфекции и генетическими или антигенными

характеристиками вируса. Наблюдения за особенностями многолетней циркуляции природных штаммов ротавируса и смены их доминирования носят единичный характер не только в России, но и в мире, и не раскрывают закономерностей циркуляции ротавирусов разных антигенных типов [ Васильев Б.Я. и др., 1995; Bishop R.F. et al., 1991; Dimitrov D.H. etal., 1991; Beque R.E. et al, 1992].

Определение доминирующих антигеннных вариантов ротавируса, изучение их распространенности и относительного распределения на территориях различных стран показало существование как общих, повсеместно циркулирующих типов вируса, так и характерных для отдельных регионов земного шара [Beards G.M., 1992; Beards G.M. et al., 1989; Bishop R.F. et al., 1991; Brussow H. Et al., 1991, 1992]. Недостаточная изученность этого вопроса в нашей стране и отсутствие коммерческих тест-систем для определения антигенной специфичности ротавирусов выдвигает задачу унификации и разработки альтернативных молекулярно-генетическкх методов их дифференциации и делает актуальным проведение исследований по характеристике природных штаммов ротавируса человека, циркулирующих на территориях Российской Федерации.

Цель работы : Совершенствование методов РНК-дифференциации ротавирусов и комплексная молекулярно-генетическая и медико-биологическая характеристика природных штаммов ротавируса человека, распространенных на европейской территории Российской Федерации.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод электрофоретипирования РНК ротавирусов.

2. Изучить многообразие электрофоретипов РНК ротавирусов человека, определить доминирующие на территории европейской части России генетические варианты.

3. Синтезировать кДНК генов VP6 и VP7 эпидемически значимых генетических вариантов ротавируса и на основе анализа полных нуклеотидных последовательностей определить их подгрупповую и серотиповую принадлежность.

4. Сконструировать ДНК-зонды для выявления и дифференциации антигенных вариантов ротавируса группы А методом молекулярной гибридизации.

5. Провести дифференциацию природных штаммов ротавируса с использованием подгрупповых и серотиповых ДНК-зондов, изучить взаимосвязь электрофоретипа и гибридизационных свойств РНК, определить доминирующие антигенные типы вируса и оценить их относительное распределение.

6. Изучить особенности смены доминирования генетических и антигенных вариантов ротавируса на основе анализа их многолетней циркуляции.

7. Охарактеризовать клинические проявления гастроэнтерита, вызванного различными генетическими и антигенными вариантами ротавируса.

8. Изучить распространенность на европейской территории России ротавирусов антигенной группы С и дать характеристику вызываемого гастроэнтерита.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Предложен упрощенный способ выделения и очистки РНК ротавирусов непосредственно из копроматериала больных РВГЭ (Авт. свид. СССР N 1448448, приоритет от 24.02.1987 г.), используемый при диагностике РВГЭ методом электрофореза РНК и для очистки РНК ротавирусов с целью ее последующего клонирования.

Впервые, по результатам широких исследований, разработана классификационная схема электрофоретипов РНК ротавируса человека, отражающая многообразие генетических вариантов, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации.

Впервые в России сконструированы : 1. Универсальный ДНК-зонд для выявления ротавирусов группы А с различными электрофоретипами РНК (Авт. свид. СССР N 174411, приоритет от 26.12.1989 г.); 2. ДНК-зонды для специфического выявления ротавирусов группы А БИ и подгрупп (Патент РФ N 2031949, приоритет от 11.12.1991 г. и патент РФ N 2064502, приоритет от 01.09.92 г., соответственно); 3. ДНК-зонды для выявления последовательностей, определяющих в!, вЗ и 04 серотипы ротавируса.

Создание ДНК-зондов для выявления и дифференциации РНК ротавирусов может способствовать расширению методической базы эпиднадзора за ротавирусной инфекцией и проведению более углубленных научных исследований в области молекулярной эпидемиологии РВГЭ.

Впервые, на основе молекулярно-генетического изучения, охарактеризованы циркулирующие на территориях 14-ти городов России генетические варианты ротавируса. Показана принципиальная возможность формирования эпидемически значимого, общего для европейской части Российской Федерации, генетического варианта ротавируса, характеризующегося генетической стабильностью, широкой распространенностью, длительной циркуляцией, определяющего более интенсивный симптомокомплекс РВГЭ и наиболее часто вызывающего тяжелое течение заболевания.

По материалам выявления аллелей генов, кодирующих подгрупповые и серотиповые антигены, впервые охарактеризованы доминирующие на европейской территории России антигенные варианты ротавируса, относительное распределение которых, свидетельствующее о предоминировании 81Ю1, второй значимости 8Ю2 и третьей доле 81Ю4 антигенных типов, соответствует установленному для ряда территорий западной Европы.

Обнаружен вариант ротавируса группы А, выделенный от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, имеющий уникальную последовательность гена УР7, отличающуюся от описанных в литературе 14-ти О-серотипов ротавируса и генетически родственный ротавирусу свиней.

заболеваемости РВГЭ. Определены удельный вес, продолжительность периодов и длительность циклов доминирования ротавирусов 01-4 серотипов, что имеет важное значение для практической медицины в плане качественного прогнозирования тенденций к росту заболеваемости РВГЭ и разработки стратегии вакцинопрофилактики ротавирусной инфекции

При анализе случаев «чистых» РВГЭ, вызванных 10-ю доминирующими генетическими вариантами ротавируса четырех в-серотипов, получены новые данные о взаимосвязи выраженности основных клинических симптомов, тяжести течения заболевания и синдромов ее определяющих, и генетическими и антигенными характеристиками ротавируса.

Впервые показаны особенности циркуляции на территориях городов европейской части России атипичных ротавирусов группы С. Па фоне низкой выявляемое™ природных штаммов этой антигенной группы вируса установлен регион их более интенсивной циркуляции -Архангельская область, что имеет принципиальное значение для выбора адекватных средств диагностики РВГЭ в этом регионе.

Внедрение результатов исследования в практику.

Разработаны, утверждены на региональном и республиканском уровнях, опубликованы и внедрены в практику здравоохранения следующие информационно-методические материалы :

1. Информационное письмо «Электрофоретипы РНК ротавирусов человека и их классификационная схема». Горький, 1990 г. (Утверждено 15.15.90 г. Главным эпидемиологом Управления здравоохранения Горьковской обл. Т.М.Казанской). Используется в качестве методического пособия в работе научно-практического семинара «Новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний и способы типирования их возбудителей», включенного в план работы ГК СЭН РФ. Проведено обучение . методу электрофоретипирования ротавирусов 26-ти представителей 9-ти центров ГСЭН РФ.

2. Методические рекомендации «Детекция ротавирусов человека с использованием электрофоретического анализа нуклеиновых кислот

(ЭФАНК)». Н.Новгород, 1994. (Утверждены 30.12.94 г. Заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г.Онищенко).

3. Методические рекомендации «Выявление и дифференциация ротавирусов человека с использованием ДНК-зондов». Н.Новгород, 1994 г. (Утверждены 30.12.94 г. Заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г.Онищенко).

Разработки, защищенные авторскими свидетельствами использовались при проведении НИР, при выявлении ротавирусов в пробах стула больных ОКИНЭ с целью лабораторного подтверждения клинического диагноза РВГЭ и определения стратегии лечения больного. В процессе работы расшифрована этиологическая природа 29,0 % случаев ОКИНЭ, охарактеризован этиологический агент ряда вспышек ротавирусной инфекции. Результаты выявления ротавирусов у больных ОКИНЭ сообщались в центры ГСЭН Российской Федерации, где использовались для определения квоты ротавирусных гастроэнтеритов в структуре инфекционной заболеваемости.

Научные положения, следующие из работы, и методические приемы дифференциации ротавирусов используются в учебном процессе студентов кафедры молекулярной биологии биологического факультета Нижегородского государственного университета им.Н.И.Лобачевского.

Использование результатов работы в научных исследованиях, эпидемиологической, клинической и учебной практиках подтверждены актами внедрения РИАЦ ГК СЭН РФ, Нижегородского НИИЭМ МЗ РФ, НИИЭМ им.Г.Н.Габричевского МЗ РФ, Нижегородского областного ГЦ СЭН, Нижегородского городского ГЦ СЭН, детской инфекционной больницы N 8 г.Н.Новгорода, детской инфекционной больницы N 23 г.Н.Новгорода, детской инфекционной больницы N 11 г.Дзержинска и Нижегородского государственного университета им.Н.И.Лобачевского.

Положения, выносимые на защиту:

1.Создана методическая база для выявления и РНК-дифференциации ротавирусов, включающая унифицированный метод

электрофоретипирования штаммов и метод молекулярной гибридизации с использованием сконструированных ДНК-зондов.

2. На фоне многообразия электрофоретипов РНК природных штаммов ротавируса формируются доминирующие генетически стабильные эпидемические варианты, характеризующиеся широкой распространенностью,'длительной циркуляцией и относительно высокой вирулентностью.

3.Территория европейской части Российской Федерации характеризуется преимущественной циркуляцией разнообразных генетических вариантов ротавируса группы А с предоминированием SIIG1 антигенного типа и низкой частотой выявления параротавирусов.

4.Особенностями многолетней циркуляции природных штаммов ротавируса G1-4 серотипов являются ее форма, доля вариантов, длительность периодов и продолжительность циклов доминирования, существование внутрисезонной смены превалирующего генетического варианта и периодической межсезонной смены доминирующего антигенного типа вируса.

5.Выраженность основных клинических симптомов РВГЭ, частота возникновения тяжелых форм заболевания и интенсивность реакции со стороны респираторного тракта могут быть связаны с генетическими и антигенными характеристиками вируса, вызвавшего заболевание.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены : на научно-практической конференции по эпидемиологии, диагностике и профилактике вирусных инфекций (Свердловск, 1985); V Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Краснодар, 1985); научной конференции «Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика» (Горький, 1986); научно-практической конференции по актуальным вопросам эпидемиологии, диагностики и профилактики вирусных инфекций совместно с рабочим совещанием научно-производственного совета по республиканской программе «Вирусология и вирусные заболевания» (Свердловск, 1987); XVII съезде Всесоюзного общества ' эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Алма-Ата, 1989); международном симпозиуме «Синтетические олигонуклеотиды : проблемы и границы практического применения» (Москва, 1991); научной конференции, посвященной памяти

М.П.Чумакова (Москва, 1994); проблемной комиссии по микробиологии РАМН «Современные проблемы таксономии и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 1996). Материалы диссертации неоднократно обсуждались на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ, проблемных научных семинарах института, заседаниях Нижегородских отделений Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов и Всероссийского биохимического общества.

По теме диссертации опубликована 31 печатная работа.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 300 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 535 литературных источников отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками, 39 фотографиями и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

С использованием методов электронной микроскопии и электрофореза геномной РНК исследовано 9023 пробы стула детей в возрасте до 14 лет, больных острой кишечной инфекцией неясной этиологии (ОКИНЭ), поступавших в лабораторию из детских инфекционных стационаров г.Н.Новгорода и центров СЭН 14-ти городов, расположенных на европейской территории России, в период 1984-97 гг.. С применением метода молекулярной гибридизации проведен анализ 120 образцов смывов носа и глотки; исследовано 50 проб водных концентратов, предоставленных вирусологической лабораторией Нижегородского городского ГЦ СЭН.

Проанализированы 564 истории болезни детей, выделявших ротавирусы.

Электронную микроскопию копрофильтратов проводили по методу флотации [Королев М.Б,1986] с использованием парлодиевых пленок подложек и контрастированием 2 % фосфоволь-фрамовой кислотой или 1 % водным раствором уранилацетата, на электронном микроскопе 1ЕМ-100 СХ ("ЛЮЬ", Япония).

Электрофорез РНК в 7,5 %, 10 % и 12 % ПААГ осуществляли с использованием буферной системы Лэммли [Ьаетш1у .Т.К., 1970] или трис-боратном буферном растворе [Маниатис Т. и др., 1984] при 10 мА на гель в течение 18 ч. и при 50 мА в течение 2 ч. РНК окрашивали нитратом серебра в собственной модификации.

РНК ротавируса из копроматериала выделяли предложенным нами бесфенольным способом в условиях высокой ионной силы раствора при пониженной температуре. Для получения высокоочищенных препаратов РНК ротавируса обрабатывали ДНКазой I с последующей фенольной депротеинизацией.

РНК культивируемых кишечных вирусов выделяли непосредственно из культуральной жидкости методом фенольной депротеинизации. Использовали следующие штаммы: ротавирус обезьян шт.БАП, полученный в Институте ветеринарии ВАСХНИЛ; ротавирус телят шт.Линкольн, предоставленный С.-Петербургским НИИЭМ им. Пастера; ротавирус человека шт.08-1 р/1020/2-84, предоставленный К.-А.Петерсон (Шведская Национальная

бактериологическая лаборатория) при содействии Л.А.Анисимовой (ИБФМ РАН) и проф. Олы Сколд (Биохимический центр г.Упсала); вакцинный полиовирус шт.Сэбин I, полученный в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН; вирус гепатита А шт.НА8-15, предоставленный К.В.Блохиным (Нижегородский НИИЭМ МЗ РФ).

Ротавирусы размножали на клетках почки эмбриона свиньи (СПЭВ) с питательной средой 199 на растворе Эрла, содержащей 1 мкг/мл трипсина, при 37 °С в течение 24-48 ч.

Биомассу полиовируса наращивали в монослое перевиваемой культуры клеток Нер-2 при 33-35 °С в течение 48 ч.

С целью получения 32Р-РНК-зонда, ротавирионы очищали в градиенте 30-60 % глицерина при 80 тыс. об./мин. в течение 1 ч. при 4 °С.

РНК-РНК блот-гибридизацию осуществляли согласно рекомендаций [Li J.K. et al., 1987]. РНК метили 32Р-цитидиндифосфатом в процессе Т4-РНК лигазной реакции [Остерман Л.А., 1983].

Синтез кДНК и её клонирование проводили с использованием методических подходов, предполагающих полиаденилирование З'-концов РНК [McCrae М.А., Corquodale J.G., 1982], амплификацию кДНК гена VP 7 в процессе ПЦР [Gouvea V. et al.,1990] и оригинальную систему синтеза кДНК гена VP6 с применением статистических гексануклеотидов.

кДНК клонировали в бактериальных векторных системах с использованием векторных плазмидных ДНК pUC9, pUC18, pGEM3Z, pGEM4Z и клеток E.coli Z85, E.coli TGI.

Определение полных нуклеотидных последовательностей кДНК генов NS35 и VP6 проводили по методу Максама-Гилберта [Махат A.M., Gilbert W., 1977; Мазин А.В. и др., 1990], гена VP7 - с использованием метода Сэнгера в модификации, предложенной А.М.Бородиным с соавт. [Бородин A.M. и др., 1988].

При проведении рестрикционного анализа использовали эндонуклеазы рестрикции PstI, EcoRI, Hindlll, Smal, Bal31, EcoRV, FNU2. Фрагменты ДНК анализировали в 1-1,5 % агарозном геле в трис-боратной буферной системе при 100 v в течение 1,5-2,0 ч. ДНК окрашивали бромидом этидия.

Создание подгрупповых и серотиповых ДНК-зондов осуществляли на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей и выбора наиболее вариабельных участков кДНК с помощью программы "MicroGenie" ("Bekman", США), которые выделяли с использованием рестрикционных процедур или в

процессе ПЦР и субклонировали в бактериальных векторных системах.

Меченые кДНК дигоксигенином и постановку реакции молекулярной гибридизации проводили согласно инструкции по применению набора "DNA-digoxigenin labeling and detecting Kit" фирмы "Bochringer Manncheim", Германия.

Эпидемиологический анализ включал изучение частоты обнаружения ротавирусов в возрастных группах детей и многолетней динамики заболеваемости РВГЭ, для чего использовали данные городского центра ГСЭН о возрастной структуре населения в г.Н.Новгороде в 1984-97 гг. Анализ сезонности РВИ проводили согласно рекомендаций (Жданов, 1988). При сопоставлении сезонных особенностей помесячной частоты выявления ротавирусов с колебаниями среднемесячной температуры окружающей среды использовали данные БРИС ГИМЕТ г.Н.Новгорода.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятым методом расчета средней ошибки и показателя существенности и вероятности различия, при помощи методов вариационной статистики с использованием пакета программ "Медстат", разработанного в Нижегородской медицинской академии им.С.М.Кирова Н.Н.Мокичевым и Е.Д.Пятовой, а также математических методов эпидемиологического анализа.

Результаты и их обсуждение.

Настоящая работа посвящена основанной на анализе геномной РНК характеристике генетических и антигенных вариантов ротавируса человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации, а также изучению

эпидемиологических и клинических особенностей проявления инфекции, вызванной различными вариантами ротавируса. В связи с тем, что в отечественной практике отсутствуют коммерческие тест-системы для дифференциации штаммов ротавируса, существенная часть работы направлена на оптимизацию известных методов РНК-

типирования природных штаммов ротавируса и создание собственных ДНК-зондов для их выявления и подгрупповой и серотиповой дифференциации.

1. Характер истина генетических вариантов ротавируса человека с использованием электрофоретипирования геномной РНК.

Геном ротавируса (РВ) представлен 11-ю сегментами двунитевой рибонуклеиновой кислоты (РНК). При электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) сегменты РНК распределяются с образованием характерного профиля, состоящего из 4-х классов генов, относительное расположение которых является стабильным признаком штамма и определяет его электрофоретип (ЭФ-тип). Различия в электрофоретической подвижности сегментов и их распределении позволяет дифференцировать генетические варианты ротавируса.

С целью проведения массовых исследований подобраны оптимальные условия электрофоретипирования РНК ротавирусов. Предложен бесфенольный способ выделения РНК непосредственно из проб стула, основанный на способности додецилсульфата натрия осаждать белковые компоненты смеси в условиях высокой ионной силы раствора при пониженной температуре. Применение такого методического приема сократило сроки проведения исследования и не влияло на конечный выход РНК и ее чистоту в сравнении с фенол-хлороформенной депротеинизацией. Оценка эффективности оптимизированного метода электрофоретического анализа нуклеиновых кислот (ЭФАНК) при выявлении геномной РНК РВ показала 97,6 % совпадения с методом электронной микроскопии (ЭМ) и в 3 % случаев РНК РВ определена в пробах, где идентифицируемые ротавирионы отсутствовали.

Унификация метода электрофореза РНК с целью ее типирования включала стандартизацию условий постановки электрофореза -концентрации геля, параметров тока, продолжительности электрофореза. Необходимость стандартизации показана по

результатам изучения влияния смены условий постановки электрофореза на картину распределения сегментов РНК в ПААГ. Установлено, что сочетание смены буферного раствора и параметров тока существенно меняет относительную электрофоретическую подвижность сегментов внутри классов генов, затрагивая, как правило, 2-3-й и 7-8-й сегменты, но не влияет на электрофоретическую подвижность 10-11-го сегментов.

Оптимальными для ЭФ-типирования РНК определены система буферных растворов Лэммли, 10 % разделяющий ПААГ и 10 мА/гель в течение 18-20 часов.

Метод электрофореза РНК применен в сочетании с ЭМ в качестве диагностического теста и при изучении ЭФ-типов РНК РВ человека, распространенных на территории европейской части Российской Федерации. При исследовании 9023 проб стула детей с ОКИ неясной этиологии, РВ природа заболевания установлена в 29,0 % случаев, что позволило сократить число этиологически нерасшифрованных случаев острой кишечной инфекции.

Проведено электрофоретипирование РНК 2618 клинических изолятов ротавируса, собранных на территориях 14-ти городов европейской части России в 1984-97 гг. В 1984-91 гг. и 1995-96 гг. работа проводилась совместно с Н.В.Епифановой (Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ).

Получены электрофореграммы РНК 2203 изолятов РВ, определен 61 ЭФ-тип РНК, что еще раз подтвердило широкую вариабельность сегментированного генома РВ, которая может выражаться в еще большем количестве ЭФ-типов РНК, чем установлено нами [Таш J.S.et al., 1988; Selb В. et al., 1988]. Среди охарактеризованных ЭФ-типов РНК 58 имели профили с распределением сегментов на классы 4-2-3-2 (98,8 %), типичным для РВ антигенной группы А. Вариантов распределения 4-2-2-3, свойственных РВ группы В, не выявлено. Три ЭФ-типа РНК характеризовались распределением 43-2-2, которое является отличительным признаком РВ группы С (1,2 %). Установленная преимущественная циркуляция на европейской территории нашей страны РВ группы А и низкая выявляемость

параротавирусов согласуется с характеристикой популяций PB, распространенных на территориях других европейских стран [Nicolas J.C. et al., 1983; Arista S.et al., 1985; Bridger J.C. et al., 1986; Bothing В. et al., 1989; Димитров Д, Тихолова M., 1990].

По относительной электрофоретической подвижности 10-11-го сегментов 61 ЭФ-тип РНК распределен на 5 электрофорегрупп -"длинные" (78,8%), "короткие" (18,5 %), "промежуточные" (0,8 %), "широкие" (0,7 %) и "сверхдлинные" (1,2 %). При этом, группы "промежуточных" и "широких" ЭФ-типов РНК выделены нами впервые. Из приведенного расчета видно, что наибольший процент приходится на долю "длинных" ЭФ-типов РНК и их соотношение с "короткими", равное ориентировочно 4:1, характерно для всех регионов мира и отражает соотношение генетических вариантов ротавируса различных геногрупп [Estes M.К., Cohen J., 1989; Arista S. et al., 1990]. К настоящему времени охарактеризованы Wa геногруппа вируса ("длинный" ЭФ-тип РНК), DS-1 геногруппа ("короткий" ЭФ-тип РНК) и AU-1 геногруппа ( широкий разбег 5-6 и 10-11 сегментов РНК), представители которых не имеют генетического родства [Estes M.К., Cohen J., 1989; Nakagomi О. et al., 989]. Дифференциация ЭФ-типов РНК на электрофорегруппы легла в основу составленной классификационной схемы, которая отражает возможное многообразие генетических вариантов PB человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации и отличается от предложенных описательных схем [Lourenco М.Н., 1981; Димитров Д.Х., 1984; Moosai R.B. et al.,1984] наличием полных профилей миграции сегментов РНК.

Анализ частоты выявления PB с различными ЭФ-типами РНК показал, что на фоне многообразия природных штаммов ротавируса существуют доминирующие генетические варианты. Определено 8 "длинных" и 2 "коротких" превалирующих ЭФ-типа РНК ротавируса, каждый из которых определен в количестве, превышающем условный средний показатель, равный отношению числа типированных изолятов к числу определенных ЭФ-типов РНК (2203:61=36; 1,6 %). Из рис.1 видно, что уровень превалирования

отдельных генетических вариантов ротавируса составил 2,9-8,9 %. В то же время, 3-й ЭФ-тип РНК был определен в значительно большем числе случаев - 30,8 % (р < 0,001).

зо 25 20 15 10 5 О

Рис.1. Частота выявления доминирующих ЭФ-типов РНК ротавируса человека, номера которых обозначены арабскими цифрами.

у 4

У 1 ,¿71 я

< е/П^ г/Т^ <а ат

1 3 4 34 46 39 42 51 8 35

На рис. 2 видно, что среди доминирующих "длинных" ЭФ-типов РНК можно выделить две принципиальные картины распределения сегментов - с относительно медленно мигрирующим 4-м и быстро мигрирующим 9-м сегментами (1-й, 3-й, 4-й, 34-й) и быстромигрирующим 4-м геном и компактным распределением 7,8,9-го сегментов (39-й, 42-й, 51-й, 46-й).

Рис.2. Электрофореграммы РНК доминирующих ЭФ-типов. а - окраска бромидом этидия, б - нитратом серебра.

По материалам электрофоретипирования РНК изучены особенности доминирования и распространенность генетических вариантов РВ на территориях 14-ти городов европейской части России (Табл.1). Установлено, что на отдельных территориях распространены как характерные только для данного региона, так и общие для многих территорий варианты вируса. Выявлено 4 широко распространенных на европейской территории России генетических варианта РВ человека - с 1-м, 3-м, 39-м "длинными" и 35-м "коротким" ЭФ-типами РНК. При этом, вариант РВ,

характеризующийся 3-м ЭФ-типом РНК, выявлялся

повсеместно на протяжении всего периода наблюдения и постоянно занимал доминирующее положение. Интересно отметить, что картина распределения сегментов РНК 3-го ЭФ-типа сходна с профилем РНК генетического варианта ротавируса, вызвавшего наибольшее число случаев ротавирусного гастроэнтерита (РВГЭ) в Швеции [Шпоо I., Зуепвоп Ь., 1981]. Совместный электрофорез

Таблица 1.

Частота выявления генетических вариантов ротавируса группы А на территориях городов европейской части России.

N Город Сроки наблюдений Количество изолятов Обнару жено ЭФ-типов Доминирующие электрофоретипы РНК (%) Другие ЭФ-типы

гт. иссле- Обнаружено РВ типи- РНК 1 3 4 34 46 39 42 51 8 35 РНК (%)

довано а 5с. % рова-но

1 Н.Новгород 1984-97 6419 1718 26,8 1421 58 2,8 34,4 7,5 3,3 6,8 4,3 7,7 4,0 6,0 2.8 20,4

2 Дзержинск 1992-97 607 188 30,2 185 19 2,2 15,7 - 11.4 2,2 0.5 9,7 5,4 7,0 2,7 23,2

3 Сэров 1994-97 134 46 34,3 31 5 - 3,2 3,2 58,6 - 9,7 16,1 - - - 9.2

4 Йошкар-Ола 1986-91 408 187 45,8 165 15 1,2 37,6 6,7 0,6 - 2,4 3,0 - - 10,9 37,6

5 Чебоксары 1987-90 176 87 49,4 75 8 2.2 28,0 10,7 2,6 - - - - - 49,3 7,2

6 Липецк 1987-90 282 111 39,4 76 10 1,3 - 69,7 2,6 - 7,9 1,3 - - - 17,2

7 Пермь 1986-91 324 117 36,1 104 9 9,6 36,5 1.9 7,7 - 4,8 2,9 - - 14,4 22,2

8 Саранск 1989-90 55 13 23,6 13 7 7,7 30,8 7,7 15,4 - 15,4 - - - - 23,0

9 Екатеринбург 1986-90 107 38 35,5 34 10 2.9 52,9 2,9 - - - - - - 2,9 38,4

10 С.-Петербург 1986-87 50 16 32,0 14 4 - 64,3 - - - - - - - - 35.7

11 Ульяновск 1995-96 70 20 28,6 16 5 - 6,2 - - - - - 68,7 - - 25,1

12 Архангельск 1987-91 271 66 24,4 60 12 3,3 5,0 18,3 13,3 - - - - 16,7 43,4

13 Самара 1984-85 50 4 - 4 1 - - - - - - - - - - 100,0

14 Вологда 1988-89 70 7 - 5 3 - 60,0 - 20,0 - - - - - - 20,0

Всего: 1984-97 9023 2618 29,0 2203 1-58 2,9 30,8 8,9 5,0 6,6 4,9 9,1 3,5 4.5 6,2 19,6

РНК изолятов РВ, собранных на разных территориях, показал стабильность электрофоретических свойств сегментов РНК 3-го ЭФ-типа, что не наблюдалось в случаях РНК с другими картинами распределения сегментов и свидетельствовало о генетической стабильности этого варианта ротавируса. На основании изучения генетических взаимоотношений природных штаммов РВ с одинаковыми ЭФ-типами РНК, доминирующих на территориях разных городов в разные периоды сезонного подъема заболеваемости РВГЭ, с использованием РНК-РНК блот-гибридизации, установлена стабильность гибридизационных свойств всех сегментов РНК, что свидетельствует о их однородности в отношении подгрупповой и серотиповой принадлежности.

Таким образом, по материалам дифференциации природных штаммов РВ с применением оптимизированного метода электрофореза РНК охарактеризованы популяции ротавируса человека, распространенные на территорях 14-ти городов европейской части Российской Федерации. Показано разнообразие циркулирующих штаммов, определены общие для европейской территории России генетические варианты ротавируса, один из которых, характеризующийся 3-м ЭФ-типом РНК, в изучаемый период времени вызвал наибольшее число случаев РВГЭ и явился сформировавшимся генетически стабильным эпидемическим вариантом ротавируса человека. Методические разработки, касающиеся оптимизации электрофоретипирования РНК РВ, легли в основу информационно-методических материалов по применению метода электрофореза нуклеиновых кислот в диагностике РВГЭ и дифференциации штаммов РВ.

2. Характеристика антигенных вариантов ротавируса человека с использованием анализа геномной РНК.

При изучении антигенных свойств штаммов ротавируса, кроме иммунологических и серологических методов исследования, широко применяются альтернативные молекулярно-генетические подходы, основанные на анализе нуклеотидных и соответствующих им

аминокислотных последовательностей белков, несущих антигенные детерминанты вируса. Известно, что детерминанты, определяющие подгрупповую специфичность ротавируса, расположены на белке внутреннего капсида VP6, кодируемом 6-м сегментом РНК, а серотиповые - на гликопротеиде наружного капсида VP7, кодируемом 9-м геном [Estes М.К., Cohen J., 1989]. Мы применили такой подход для определения подгрупповой и серотиповой принадлежности ротавирусов с 3-м и другими ЭФ-типами РНК.

На матрице тотальной РНК 3-го ЭФ-типа РВ человека (изолят 4097) с использованием известного подхода синтезированы комплементарные дезоксирибонуклеиновые кислоты (кДНК), фрагменты которых клонированы в векторной плазмиде pUC9 и клетках E.coli Z85. В реакции РНК-ДНК блот-гибридизации кДНК идентифицированы с 1-м, 6-м и сегментами Ш-го класса генов. В совместной работе с Л.А.Кулаковым и В.Н.Ксензенко на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН проведено определение полных нуклеотидных последовательностей синтезированных кДНК генов NS35 и VP6.

ДНК, комплементарная 6-му сегменту ротавирусного генома состояла из 1365 пар нуклеотидов (п.н.), что свидетельствовало о полноразмерности полученной копии. При сравнении первичной структуры кДНК с известными последовательностями 6-го гена РВ разных серологических подгрупп - первой - SI (шт-SAl 1, шт.1076), второй - Sil (uit.Wa), ни первый ни второй - ни SI ни Sil (шт.Н-2) и первый и второй - SI/SII (iht.FI-14), показано наличие 98,7 % гомологии с последовательностью гена VP6 РВ человека iirr.Wa, определяющей специфичность Sil подгруппы (Табл.2).

В последовательности гена VP6 выделено 5 участков, кодирующих антигенные детерминанты, определяющие подгрупповую специфичность штамма ротавируса - A,B,C,D,E [Gorziglia J. et al., 1988]. В областях нуклеотидной последовательности, кодирующих антигенные детерминанты Sil подгруппы {регионы В - 249-276 и.о., D - 936-957 и.о., Е- 1023-1056 и.о.), наблюдалось 100 % гомологии, что позволило сделать

заключение о принадлежности РВ человека изолята 4097 ко второй (Sil) антигенной подгруппе, а фрагмент кДНК назвать dRV6-II.

Таблица 2.

Гомология нуклеотидных последовательностей гена VP6 ротавируса человека с 3-м ЭФ-типом РНК с аналогичными последовательностями штаммов ротавируса различных сероподгрупп.

РОТАВИРУСЫ Wa 1076 SAH Y-2 FI-14 Sil SI ' SI ни SI/SII SI/SII гомология нуклеотидных последовательностей (%)

4097 98,7 78,9 78,3 87,5 82,2

Штамм E.coli, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент dRV6-II, депонирован в ВКМ ИБФМ РАН под NBKM Cr-316D.

Эпидемическая значимость РВ с 3-м ЭФ-типом РНК послужила основанием выбора изолята 3718 для анализа гена VP7, определяющего G-серотиповую специфичность штамма. Также проведен анализ гена VP7 изолята РВ 1565, характеризующегося 9-м "широким" ЭФ-типом РНК и выделенного от новорожденного ребенка с бессимптомной формой инфекции. Синтез кДНК, ее амплификация в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и определение полной нуклеотидной последовательности были проведены в совместной работе с И.Н.Бессараб и А.М.Бородиным на базе Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Сравнительный анализ определенных нуклеотидной и соответствующей ей аминокислотной последовательностей VP7 исследуемых изолятов РВ с известными последовательностями VP7 14-ти G-серотипов показал значительное сходство РВ изолята 3718 со urr.Wa - 93,2 % гомологии нуклеотидной и 95,4 % гомологии

аминокислотной последовательностей. Гомология нуклеотидной и аминокислотной последовательностей VP7 ротавируса 1565 со штаммами РВ G1-4, 6, 8-14 серотипов составила 73,5-77,7 % и не превышала 90 % для iiit.OSU (81,9 %) и шт.УМ (87,1 %) РВ свиней. Для гликопротеида VP7 определено три вариабельных у ротавирусов разных серотипов участка, содержащих эпитопы, участвующие в нейтрализации вируса - А (87-101 а.о.), В (143-152 а.о.) и С (208-

A В С A В С

87 101 142 152 203 221 87 101 142 152 208 221

3718 TEASiqiHDCTWKDS KÏDQNLELDN QTTWDSFEWADI 1565 HDVTNQITDtOÍWKIlT KVDQCQLDH STTDPTIFEEVASI

Va (1) TEAST..H.GD.. .S ___QSLE. Q..NVDS. NI EN

N37 (1) .....s....... R TEAST..S.Œ...S ...Q.LE. R. NVDS. N. EN

D (1) TEAST..M.Q). ..S ...QSLE. Q. NVDS. NI.EN

Uo (1) ........D.... ____S... I TEAST..«.GD...S ...QSLE. Q. .NVDS. NI EH

DSI (2) A. .KXE.S.D..BH R. - ITTS.. A K. D.HTP.I. SS AEAK.E.S.CE.EN. R. .NT.E. .A K. ..VN.. ■ S

1IUS (2) A. .KME.S.D. EUT R. .HTC.. A K. D.HT. I. • SS AEAK.E.S.DE.EM. R..NT.E. A K. ..VN.. .S

S2 (Z) A. •KHE.S.D. .E3ÍT R..NTS.. V ICI D.D..El. .SS AEAX.E.S.DE.EH. R..NT.E. ï Kl .VD.. .S

P (3) .A.E...NS...T ...AT.Q. L. DTHT. E. .TA TEAATE.H. .S____ ...AIL.. L. ..T».. TA

SAH (3) •A.E...NS...T ...AT.Q. L. DATT. E. .TA TIAATE.H..S.... ...AIL.. L. ..TA.. TA

RRV (3) .A.E...NS...T ...AT.Q. L. DTAT. E. • TA TEAATE.H.. S.... ...AIL.. L. ..A... TA

ST3 (■0 S. .P...S.T____I RFVFGE.. I .TAT. T. .DS SEAPT. .S.U.... RFVFGEE. I Q. . NTA.. T. DS

VA70 (4) S. .P...S.К____I .FASGE.. I ..AT. .US SEAPT. .S..E.... FASŒEL I Q. .NVA.. H. DS

oso (5) H. • A.E.A.TK.TET ...G..Q. S. DIU.. T. .HA • EAATE.A.T. .TE. .....L.. .INS. T. HA

их (6) V. ..«E.A.T....T ...SIQ.. LI • P. T. T. -TT VEAS.E.A.TE____ ... STQE. LI D.D.. T. TN

NCDV (6) Y. .SNE.A.T....T ...STQ.. LI .P.T. T. VEAS.E.A.IE____ ...STQE. LI ■ N.D.. r. TT

69« (8) V. .E.E.A.SS...T .YHA.S.. L. DTTT. T. • TA VEAEIÏ.A.SS____ ..NA..E. L. .T... TA

B37 (8) V. .E.E.A.SS...T ..NA.S.. L. Ulli. T. .TA VEAETE.A.SS____ ..NA..E. L. ..T... TA

FIS (9) A. .....S.T____I ...ST... T. ■ TAT. E. .AS AEAST. .G. TE____ ...SILE. T. .NTA.. AS

»161 (9) A. .....G.T....I ...SI... r. .TAT. E. .AS AEAST..6.TE____ ...SILE. T. .NTA.. AS

61A (10) • R.E...N..TST R.NSSS.. • TRI. .E. • TA TEARII.H. .E.TS. R.NSSLE. Q. . HTR.. TA

8223(10) .R.E...N..IST R.NSS.K. ■ IGT. E. .TA TEARIE. N. .E.IS. R.HSSLK. q. .NTR.. .TA

ru (11) H. ■A...A.DK...T ...s.sq. L. DPTT. E. .SA HEAAT..A.D..... L A

L2S (12) NSVTTE. T. PD.TNT Q.QKS.A. V T. D.AT. E. .NA .S. .TE.. .PD.IN. Q.QNSLA. V T. ..VA.. .HA

L338(13) L.WSEL. .DS. .HT . .SIELQ.DI L. DTET. E. .TL . E. VSELN.DS. .M. . .STEL.. L. ..TE.. • TL

Fi23(H) .A...D.SS...T ...EA.Q. L. ..AT. T. .TS IEAATQ.D.SS____ ...EAL.. L. • NVA.. ■ TS

1565 (?) rnvra..I.NK.. .T ...G.sq. S. DPTT. E. .SI

Рис.З Сравнение аминокислотных последовательностей вариабельных районов А, В и С гликопротеида VP7 ротавирусов иэолятов 3718 и 1565 с аналогичными участками VP7 ротавирусов известных G-серотипов (серотип указан в скобках). Совпадающие аминокислотные остатки обозначены точками. Аминокислотные последовательности VP7 опубликованы в работах Green K.Y. et al., 1989, Taniguchi К. et а!., 1990, Browning G.F. et al., 1991.

221 a.o.) [Green K.J. et al., 1988, 1989; Matsui S.M. et al., 1989]. В этих участках последовательности VP7 ротавируса 3718 наблюдалось только по одной аминокислотной замене в сравнении с последовательностями, определяющими специфичность Gl серотипа, что позволило сделать вывод о принадлежности природного штамма РВ человека с 3-м ЭФ-типом РНК к Gl серотипу вируса (Рис.3). Анализ регионов А, В и С аминокислотной последовательности VP7 изолята РВ с 9-м "широким" ЭФ-типом РНК выявил полное совпадение региона В и наличие двух аминокислотных замен в регионе С в сравнении с аналогичными последовательностями гена VP7 РВ свиней iht.YM и наличие одной аминокислотной замены в регионе В в сравнении с РВ свиней iut.OSU, что свидетельствует о возможном родстве РВ изолята 1565, выделенного от новорожденного с бессимптомной формой РВ инфекции, с РВ свиней. Однако, последовательность аминокислот в регионе А VP7 изолята 1565 отличалась от региона А РВ свиней на 7 аминокислотных остатков, что не позволило отнести их к одному G-серотипу вируса. Среди проанализированных

последовательностей VP7 известных G-серотипов РВ мы не обнаружили гомологичной региону А последовательности VP7 РВ 1565, на основании чего сделан вывод о существовании нового G-серотипа ротавируса человека.

Таким образом, в результате проведенного анализа нуклеотидных последовательностей генов VP6 и VP7 и аминокислотных последовательностей VP7 природных штаммов РВ человека установлено, что эпидемически значимый генетический вариант РВ с 3-м ЭФ-типом РНК относится к SIIG1 антигенному типу вируса. Обнаружен вариант РВ человека, генетические характеристики которого позволяют говорить о новом G-серотипе ротавируса, имеющем генетическое родство с РВ свиней.

Проведены генно-инженерные работы по созданию панели ДНК-зондов для выявления и дифференциации ротавирусов методом молекулярной гибридизации. Для целей молекулярного клонирования генома природных штаммов РВ человека был

разработан способ очистки РНК от контаминирующих дезоксирибонуклеиновых кислот с использованием коммерческих препаратов ДНКазы-1 в условиях высокой ионной силы раствора. На способ получения очищенной РНК РВ непосредственно из проб стула больных РВГЭ получено авторское свидетельство N 1448448, приоритет от 24.02.87 г.

Синтез кДНК проводили на матрице тотальной РНК (с!11У7-Н, сЖУб-Н фрагменты), на матрице очищенного 6-го гена (сШУ6-1 фрагмент), в процессе ПЦР - синтеза полноразмерной копии 9-го гена (<ЖУ9-1, <111У9-15 фрагменты) и в процессе ПЦР-синтеза серотипспецифических участков 9-го гена (сШУ9-3, сШ.У9-4 фрагменты).

При создании ДНК-зондов (ШУб-Ш и ёЯУ9-1г с использованием программы "М1сгоОете" ("Весктап",США) проводили сравнительный анализ соответствующих нуклеотидных последовательностей ротавирусов разной антигенной специфичности и выбор наиболее вариабельных участков. Характеристика созданных ДНК-зондов представлена в табл.3.

Таблица 3.

Характеристика ДНК-зондов для выявления и дифференциации РНК ротавируса человека.

Рота- ЭФ-тип Название Размер Позиция Регион Специфичность

вирус РНК .зонда" (и.о.) (и.о.) вариа-

бельностр

3718 3 -"дл" dRV7-II 1059 1-1059 п.к. универсальный

3718 3 -"дл" dRV6-IIz 282 753-1035 D,E Sil подгруппа

2175 35"кор" dRV6-I 660 неустан. - SI подгруппа

4097 3 -"дл" dRV9-1 z 503 49-552 А,В Gl серотип

SA11 -' дл dRV9-3 374 687-1062 С G3 серотип

8795 42"дл" dRV9-4 583 479-1062 В,С G4 серотип

1565 9 -"ш" dRV9-15 503 49-552 А,В Ghob. серотип

н.о. - нуклеотидные остатки; п.к. - полноразмерная копия.

Проведены испытания созданных ДНК-зондов в реакции молекулярной гибридизации с использованием изотопной и дигоксигениновой меток. Установлено, что dRV7-II фрагмент, являющийся копией гена, кодирующего неструктурный белок NS35, выявляет РНК РВ человека "длинного" и "короткого" ЭФ-типов, РНК РВ обезьян (uit.SAI 1) и РНК РВ телят (шт.Линкольн) и не дает гибридизационного сигнала с РНК вируса гепатита А (iut.HAS-15) и полиовируса (шт.Сэбин1), что свидетельствует о специфичности dRV7-II фрагмента в отношении ротавирусного генома.

Чувствительность гибридизации при выявлениии генома гомологичных и гетерологичных штаммов РВ была различной и колебалась в пределах 1-10 пг для РНК "длинного" ЭФ-типа и 10100 пг для РНК "короткого" ЭФ-типа. Использование дигоксигениновой системы мечения и выявления ДНК позволило достигнуть чувствительности детекции РНК, сопоставимой с радиоизотопной меткой.

Сравнительный анализ метода молекулярной гибридизации с использованием dRV7-II фрагмента, меченного дигоксигенином, с методами ЭМ и ЭФАНК показал большую чувствительность метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) при выявлении РВ в клиническом материале. При этом получены результаты, свидетельствующие о перспективности использования dRV7-II фрагмента для выявления РНК РВ в водных концентратах. В результате генно-инженерных работ создан штамм E.coli N ВКМ CR- 317D, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую dRV7-II фрагмент - универсальный ДНК-зонд для выявления РНК различных ЭФ-типов РВ человека и животных методом молекулярной гибридизации. Приоритетность создания ДНК-зонда подтверждена авторским свидетельством N 17414111, приоритет от 26.12. 1989 г.

С использованием синтезированных кДНК и РНК референтных штаммов ( шт.БАП, iut.DS-1 - SI подгруппа) и РНК различных ЭФ-типов природных штаммов ротавируса изучена специфичность подгрупповых ДНК-зондов. Получены результаты,

свидетельствующие об отсутствии перекресных реакций и специфичности фрагментов кДНК в отношении последовательностей, определяющих SI и Sil подгруппу ротавируса. В результате генно-инженерных работ созданы штаммы E.coli TGI, несущие рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие фрагменты кДНК 6-го гена SI и SII подгрупп, которые депонированы в ВКМ ИБФМ РАН под N ВКМ Cr -367D и N ВКМ патентами Российской Федерации N 2031949, приоритет от 11.12. 1991 г. Cr - 354D, соответственно. Приоритетность создания ДНК-зондов для специфического выявления РВ SII и SI сероподгрупп подтверждена и N 2064502, приоритет от 01.09. 1992 г., соответственно.

В работе также представлены результаты проверки гибридизационных свойств серотиповых ДНК-зондов. Фрагменты ДНК, комплементарные последовательностям, определяющим Gl, G3 и G4 серотипы РВ, в реакции молекулярной гибридизации с гетерологичными кДНК и РНК РВ разных серотипов показали отсутствие перекрестных реакций, что обосновало применимость синтезированных последовательностей в качестве

серотипспецифичных ДНК-зондов.

Таким образом, в результате изучения нуклеотидных последовательностей генов VP6 и VP7 природных штаммов ротавируса человека и генноинженерных разработок создана панель ДНК-зондов для обнаружения РВ с различными ЭФ-типами РНК в клиническом материале и объектах внешней среды и выявления аллелей генов, определяющих подгрупповую и серотиповую специфичность ротавирусов, методом молекулярной гибридизации, что расширяет методическиу базу эпидемиологических исследований РВ инфекции и дает возможность более углубленного изучения антигенной вариабельности РВ.

Созданные ДНК-зонды для специфического выявления последовательностей РВ генома, определяющих подгрупповую (SI, Sil) и серотиповую (Gl, G3, G4) специфичность вируса, были применены для дифференциации природных штаммов РВ с различными ЭФ-типами РНК, собранных на территориях

европейской части России в разные периоды времени. Изучение гибридизационных свойств РНК 170 изолятов РВ показало наличие определенных корреляций между ЭФ-типом РНК и наличием аллелей генов, определяющих антигенные свойства вируса. Так, все исследованные РНК с "длинным" профилем миграции сегментов доминирующих генетических вариантов РВ содержали аллели гена VP6, определяющие специфичность Sil подгруппы, а с "коротким "ЭФ-типом РНК - SI. РНК "длинных" и "широких" минорных ЭФ-типов, 5-6-й сегменты которых имеют широкий разбег в ПААГ, что характерно для РВ животных, не гибридизовалась с Sil-ДНК-зондом, но давала гибридизационный сигнал с "зондами" SI и G3. Установлено также, что РНК "длинных", как доминирующих, так и минорных ЭФ-типов, характеризующаяся низкомигрирующим 9-м геном, давала выраженный гибридизационный сигнал с Gl-ДНК-зондом, что позволяет отнести штаммы с такими профилями миграции сегментов к Gl-серотипу вируса. О существовании корреляции между относительной электрофоретической подвижностью 9-го сегмента РНК и серотипом РВ в зарубежных научных источниках не сообщено. Можно предположить, что наличие такой взаимосвязи является отличительным признаком генетических вариантов РВ, циркулирующих на европейской территории России. РНК "длинных" ЭФ-типов, имеющая компактную миграцию сегментов Ш-го класса не давала гибридизационного сигнала с dRV9-lz фрагментом, но проявляла избирательные свойства по отношению к G3 и G4 ДНК-зондам. Установлено, что РНК 39-го доминирующего ЭФ-типа эффективно гибридизовалась с G3 "зондом", а 42-го и 51-го - с "зондом" G4. Кроме того, РНК 42-го и 51-го ЭФ-типов в процессе ПЦР с серотипспецифическими праймерами давала фрагмент кДНК размером 583 п.н., что еще раз подтвердило принадлежность генетических вариантов с такими профилями миграции сегментов к G4 серотипу РВ. При анализе гибридизационных свойств РНК различных ЭФ-типов нами проанализировано от 1-го до 25-ти изолятов с одинаковыми ЭФ-типами РНК, собранных на разных

территориях в разные периоды их циркуляции. При этом, случаев различий в гибридизационных свойствах с подгрупповыми и серотиповыми ДНК-зондами у РНК с одинаковыми профилями миграции сегментов нами не обнаружено.

На основе результатов электрофоретипирования природных штаммов РВ и изучения их подгрупповой и серотиповой принадлежности, проведенной на основе анализа генов УР6. и \Ф7, рассчитано относительное распределение антигенных типов РВ, распространенных на территории европейской части Российской Федерации (Рис.4). Долю популяций РВ в2 серотипа рассчитывали

Рис.4. Относительное распределение антигенных типов ротавируса человека, распространенных на европейской территории России.

по количеству изолятов вируса с "короткими" ЭФ-типами РНК, основываясь на опыте изучения природных штаммов РВ в мире. Установлено, что генетические варианты РВ группы А, относящиеся к БН подгруппе, имели "длинный" ЭФ-тип РНК и составили 72,5 %, подгруппы - 19,5 %. Среди популяций РВ, характеризующихся

наличием аллелей гена VP6, определяющих специфичность SI подгруппы, 18,5 % генетических вариантов PB имели "короткий" ЭФ-тип РНК, 1 % - "длинные" и "широкие" профили миграции сегментов. Популяции PB G1 серотипа определены в 55,6 % случаев, G2 - 18,5 % , G3 - 7,5 %, G4 - 10,4 %. При этом, среди PB G3 серотипа обнаружены как SI (0,7 %), так и SII (6,8 %) варианты. Распределение антигенных типов, свидетельствующее о преимущественной циркуляции на европейской территории России генетических вариантов PB с SIIG1 антигенными свойствами, характерно для всех регионов мира. В то же время, в нашем случае на третьем месте по по значимости находятся варианты PB, имеющие аллели гена VP7, определяющие специфичность G4 серотипа, что соответствует распределению антигенных типов PB на территориях стран западной Европы и отличается от ряда территорий США, Австралии и Индии, где на третьем месте по значимости находятся варианты G3 серотипа [Flores J. et al., G.M.et al., 1988; Beards 1989; Beards 1989; Arista S.et al., 1990; Gerna G.et al., 1990; Bishop R.F. et al.,1992]. Полученные результаты могут быть полезны при разработке стратегии вакцинопрофилактики РВГЭ на территории европейской части России.

3. Изучение эпидемиологических и клинических проявлений ротавирусной инфекции, вызванной различными генетическими и антигенными вариантами ротавируса.

По материалам г.Н.Новгорода изучены особенности многолетней циркуляции ротавирусов, вызывающих манифестные формы РВГЭ. Наблюдения за PB инфекцией (РВИ) в Н.Новгороде проводили в течение 13-ти эпидпериодов в 1984-97 гг. При исследовании 6412 проб стула детей в возрасте до 14 лет ротавирусы обнаружены в 26,8+0,6 % случаев (15,3 - 40,5 % в разные эпидпериоды). Болели преимущественно дети в возрасте 0-2 года (93,7 %), мальчики болели в 1,6 раза чац1е, чем девочки. При этом связи между полом болевших и генетическим вариантом ротавируса не выявлено. Обнаружены тенденции к преимущественному

инфицированию детей разного возраста тем или иным генетическим вариантом, которые, однако, наблюдались на разных этапах циркуляции РВ с различными ЭФ-типами РНК, относящихся к одному серотипу вируса, и, по всей вероятности, связаны с общими закономерностями развития эпидпроцесса РВИ , определяемыми инфекционно-иммунологическими отношениями популяций вируса и восприимчивого хозяина.

На следующем этапе работы впервые по материалам тринадцатилетних наблюдений с применением методов молекулярной генетики проведен анализ особенностей циркуляции ротавирусов с различными ЭФ-типами РНК. С целью изучения сезонных особенностей циркуляции ротавирусов и установления возможной роли отдельных генетических вариантов в развитии эпидпроцесса РВИ рассчитана среднедвенадцатилетняя среднемесячная кривая годовой динамики заболеваемости РВГЭ, позволившая говорить о зимне-весенней сезонности инфекции в г. Н.Новгороде, что характерно для центральных регионов России [Козловская Г.О. и др., 1988; Вашукова С.С. и др., 1989; Блохина Т.А. и др., 1991; Власова Л.В. и др., 1991]. Установлено наличие корреляционной взаимосвязи между динамикой помесячной частоты выявления РВ и колебаниями среднемесячной температуры воздуха в первые месяцы сезонного подъема заболеваний РВГЭ. Предполагается, что активизация эпидпроцесса РВИ в осенние месяцы, происходящая на фоне постоянно действующих причин, таких как скученность населения и снижение общей резистентности макроорганизма, связана со снижением температуры воздуха и интенсивности солнечной радиации, которое, способствуя длительному сохранению инфекционности ротавирионов в окружающей среде и накоплению их критической массы, выступает как фактор, определяющий активизацию механизмов передачи возбудителя. Сопоставление 13-ти ежегодных кривых помесячной частоты обнаружения РВ выявило различия в сезонности РВИ в отдельные эпидпериоды (Рис.5). Установлено существование трех

Г7П- 1 ЦЦ-- 3 Ш-8.35 39 ЕЗ 51 Е22- 42 ЕЕ- 46 ЕЭ- С.1 НЯ-

ноциркуляция

ЕЗ- 4 СИЗ" 34

Рис.5. Циркуляция ротавирусов с различными ЭФ-типами РНК в г.Нижнем Новгороде в 1984-1997 гг.

типов динамики помесячной частоты выявления РВ - зимне-весенней, характеризующейся двумя пиками положительной детекции РВ, зимней, имеющей один выраженный подъем, и весенней, когда пик выявляемости РВ смещен на февраль-март месяцы. При этом получены результаты, свидетельствующие, что характер сезонности РВИ может быть связан с особенностями циркуляции конкретного гентического варианта ротавируса.

Электрофоретипирование штаммов РВ и изучение генетических взаимоотношений доминирующих типов вируса в реакции РНК-РНК блот-гибридизации показали, что в эпидпериоды, характеризующиеся зимне-весенней сезонностью РВИ наблюдалась внутрисезонная смена превалирующего генетического варианта ротавируса, которая в 2-х случаях иа 4-х сопровождалась статистически достоверным повышением уровня его положительной детекции. Смена доминирования ЭФ-типа РНК РВ не всегда отражала смену антигенного варианта, но трижды приводила к доминированию РВ с 3-м ЭФ-типом РНК. Предположено, что особенности циркуляции РВ третьего электрофоретического типа могут быть связаны с биологическими свойствами этого генетического варианта, такими как устойчивость к воздействию факторов внешней среды, иммуногенность и вирулентность. Последнее было подтверждено тем, что генетический вариант РВ с 3-м ЭФ-типом РНК определял более интенсивный симптомокомплекс РВГЭ и наиболее часто вызывал тяжелое течение заболевания. Существование внутрисезонной смены доминирующего генетического варианта ротавируса, определяющей особенности сезонных проявлений инфекции и связанной с биологическими свойствами возбудителя, показано нами впервые и, по всей вероятности, используется вирусом в качестве механизма поддержки активной циркуляции.

Охарактеризованы особенности межсезонной смены доминирующего генетического варианта, не отражающей смены антигенного типа ротавируса. Смена генетических вариантов вируса, относящихся к одному антигенному типу, происходила постоянно с

периодичностью 1-2 эпидемических года. При этом, длительность непрерывного доминирования РВ с одинаковым ЭФ-типом РНК не превышала двух лет, после чего наблюдалась широкая коциркуляция РВ с различными электрофоретипами РНК. Обнаружено, что становление генетически стабильного варианта ротавируса, от начала его появления до периода доминирования, может происходить постепенно в течение 5. -10 эпидемических лет. Длительность непрерывной циркуляции одного генетического варианта РВ в условиях кодоминирования может составить 8 эпидпериодов, что показано для варианта РВ с 3-им ЭФ-типом РНК, который исчез из популяции только через 12 лет наблюдения. Однако, отсутствовав только в течение одного эпидпериода, генетический вариант РВ с 3-им ЭФ-типом РНК вновь появился в сезон 1997-98 гг., вызвав в первой половине эпидпериода 30 % случаев РВГЭ.

Получены новые данные, расширяющие представления об особенностях циркуляции РВ разных серологических типов, различающейся формой (постоянная, периодическая, эпизодическая), долей вариантов, продолжительностью периодов и длительностью циклов доминирования (Рис.6). Установлено, что РВ серотипа характеризуются постоянной циркуляцией с долей вариантов, достигающей 90 %, имеют продолжительность периода домирования, равную 3-4 эпидсезонам с периодичностью в 5-7 эпидемических лет, что соответствует средним циклам подъема вызываемой заболеваемости. РВ с "короткими" ЭФ-типами РНК также характеризуются постоянной циркуляцией, но имеют низкую долю вариантов (0,5-39,2 %), сверхкороткий период доминирования (0,5 эпидсезона) с малыми циклами активной циркуляции (1-3 года). РВ ОЗ серотипа, постоянно выявляясь как минорные, имели

эпизодическую форму активной циркуляции, характеризующуюся сверхкоротким периодом доминирования (0,5 эпидсезона). Единственный за 13-ти летний период наблюдения подъем заболеваемости РВИ, обусловленной РВ ОЗ серотипа, позволяет предполагать длинный или сверхдлинный циклы доминирования, или нерегулярный характер активной циркуляции. РВ в4 серотипа

/О ООО СО'

1304 19П5 19Ш 1087 1МИ 1309 1900 1931 1092 1393 1994 199П 1930 1307

Рис.6. Многолетняя динамика частоты обнаружения ротавирусов 31-4 серотипов (%) в сопоставлении с многолетней динамикой заболеваемости РВГЭ (10 ООО) в Н.Новгороде в 1984-97 гг.

имели период доминирования, равный 4-м эпидсезонам с уровнем, не превышающим 50 %. Однако, для установления цикличности доминирования РВ в4 серотипа требуются дальнейшие наблюдения.

Прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта РВ к другому, отражающие одновременный антигенный сдвиг, в связи с многолетней динамикой заболеваемости РВИ (Рис.6). Показано существование межсезонной смены доминирования антигенного типа ротавируса, сопровождающейся ростом заболеваемости РВГЭ, которая происходила с периодичностью в 4-5 эпидемических лет. Установление факта влияния смены доминирующего антигенного типа РВ на интенсивность эпидпроцесса РВИ свидетельствует о практической значимости контроля за циркуляцией природных

штаммов РВ с целью качественного прогнозирования тенденций роста заболеваемости РВГЭ.

Таким образом, анализ многолетней циркуляции ротавирусов с различными ЭФ-типами РНК, относящихся к разным О-серотипам, показал наличие превалирующих генетических вариантов РВ, возможность длительного доминирования некоторых из них, существование межсезонной смены превалирующего ЭФ-типа РНК, отражающей и не отражающей смену серотипа РВ, и возможность внутрисезонной смены доминирования, связанной с биологическими свойствами конкретного генетического варианта РВ. Полученные новые знания об особенностях многолетней циркуляции конкретных генетических вариантов РВ разных О-серотипов расширяют представления о внутренних механизмах развития эпидпроцесса РВИ и свидетельствуют о практической значимости контроля за циркуляцией штаммов РВ.

Проведен ретроспективный анализ 500 историй болезни детей, выделявших РВ. Установлено, что в 11,6 % случаев РВ были ассоциированы с условнопатогенными микроорганизмами -протеем (7,5 %), клебсиеллой (2,1 %), стафилококком (0,7 %), эшерихиями (1,3 %). В связи с этим, для изучения клинических проявлений РВГЭ, вызванного 10-ю доминирующими генетическими вариантами ротавируса 01-4 серотипов, были отобраны 317 историй болезни детей в возрасте 6 мес.-З года с моноротавирусной инфекцией. Оценку проявлений основных клинических симптомов - диареи, рвоты и лихорадки проводили по двум позициям - максимальной выраженности и продолжительности. Анализировали частоту регистрации тяжелых, среднетяжелых и легких форм заболевания.

Диарейный синдром был ведущим при РВГЭ, вызванном различными генетическими вариантами РВ и не отличался ни частотой стула, ни его продолжительностью. Различия отмечены лишь в характере диареи - у детей, инфицированных вариантами вируса 51-го и 42-го электрофоретических типов (81Ю4 антигенный тип, характеризующийся относительно низкомигрирующим 4-м

сегментом), чаще наблюдался водянистый обильный стул в первые 3 дня заболевания.

Достоверные типоспецифические различия установлены в интенсивности и продолжительности рвоты. При РВГЭ, вызванном генетическими вариантами вируса, относящимися к 81Ш1 антигенному типу, интенсивная (5 раз и более) и продолжительная (более 3-х дней) рвота наблюдалась достоверно более часто (р < 0,05). При этом, у большего числа детей (50 %) многократная рвота была ассоциирована с РВ 3-го электрофоретического типа (р < 0,001). В случаях инфицирования РВ с "короткими" ЭФ-типами РНК (8Ю2 антигенный тип) и 42-м, 51-м ЭФ-типами РНК (81Ю4 антигенный тип) многократная рвота практически отсутствовала, либо была однократной. Выраженность лихорадки у детей, выделявших РВ с различными ЭФ-типами РНК, была относительно одинаковой. В то же время, при инфицировании РВ 3-го электрофоретического типа у достоверно большего числа больных установлена продолжительная лихорадка, которая могла держаться до 10 дней, что не наблюдалось при других генетических вариантах вируса (р < 0,05). Полученные результаты свидетельствуют, что выраженность клинических симптомов гастроэнтерита, вызванного разными генетическими вариантами ротавируса может значительно колебаться в пределах нозологической формы и подтверждают возможность связи ЭФ-типа РНК со специфической клинической картиной РВГЭ и более высокой вирулентностью вируса.

Анализ частоты регистрации различных форм РВГЭ у больных, выделявших РВ с доминирующими ЭФ-типами РНК, показал, что тяжелое течение заболевания могло наблюдаться при инфицировании различными вариантами ротавируса (Табл.4). В то же время, наиболее часто среди других, тяжелые формы РВГЭ наблюдались у детей, выделявших РВ с 3-м ЭФ-типом РНК, при которых случаев легкого течения заболевания не зарегистрировано (р < 0,001). Статистическая достоверность связи между частотой регистрации тяжелых форм РВГЭ и 3-м ЭФ-типом РНК была

подтверждена путем проверки независимости двух признаков с использованием критерия X2 - Пирсона и точного метода Фишера.

Таблица 4.

Частота регистрации тяжелых, среднетяжелых и легких форм РВГЭ, вызванных ротавирусами с различными ЭФ-типами РНК.

ЭФ-тип Количество

РНК- обследо- Течение болезни (М+м), %

О-серо- ванных

типРВ больных

тяжелое ср.тяжелое легкое

1-01 31 12,9+6,0 77,4+7,5 9,7+5,3

3-01 34 38,2+7,3* 61,8+8,3 -

34-01 40 10,0+5,5 66,7+8,6 23,3+7,7

8-02 27 16,0+7,3 76,5+7,3 12,0+6,5

35-02 35 8,8+4,9 76,5+7,3 14,7+6,1

39-03 28 14,3+6,6 5 7,1 ±9,4 28,3+8,5

51-04 44 18,2+5,8 38,6+7,3 43,2+7,5*

42-04 45 9,5+4,4 42,8+7,6 47,9+7,7*

46-01 33 13,6+5,8 63,6+8,4 22,8+7,2

Всего: 317 15,9+2,1 60,0+2,9 24,1+2,5

*- статистически достоверно различающиеся показатели

Большая выраженность основных клинических симптомов гастроэнтерита и более частое возникновение тяжелых форм РВГЭ при инфицировании вариантом РВ с 3-м ЭФ-типом РНК могут свидетельствовать об относительно более высоких вирулентных свойствах эпидемического варианта ротавируса, характеризующегося 3-м ЭФ-типом РНК.

Представляло интерес установление возможной связи между особенностями клинических проявлений РВГЭ и антигенными свойствами ротавирусов. Показано, что гастроэнтериты, вызванные генетическими вариантами РВ, имеющими аллели гена УР7 04

серотипа, характеризовались меньшей выраженностью проявлений клинических симптомов и достоверно чаще протекали в легкой форме, что свидетельствует об относительно меньшей вирулентности РВ в4 серотипа. При этом отмечено, что тяжесть течения заболевания при инфицировании вариантами РВ разных О-серотипов определялась разными факторами. У детей, выделявших РВ с 1-м, 3-м и 34-м ЭФ-типами РНК (в1 серотип) и с "короткими" профилями миграции сегментов (02 серотип), ведущим в определении тяжести заболевания явился синдром токсикоза. Кроме лихорадки наблюдались и другие его проявления - адинамия, слабость, головные боли. Явление обезвоживания наблюдалось редко - в 5,8 % и 8,3 % случаев, соответственно. В то же время, тяжелые и среднетяжелые формы гастроэнтерита при инфицировании РВ с 42-м и 51-м ЭФ-типами РНК (04 серотип), наблюдаемые значительно реже, чем при других вариантах РВ, определялись явлениями эксикоза. Обезвоживание первой, реже второй степени, отмечено практически у всех больных с тяжелой и среднетяжелой формами заболевания. Складывалось впечатление, что различия в определяющих тяжесть течения заболевания факторах связаны с принадлежностью штаммов РВ к разным О-серотипам. Однако, наблюдения за РВИ в эпидпериод 1996-97 гг., когда доминирующее положение занял вариант РВ с 46-м ЭФ-типом РНК (01 серотип), гастроэнтериты характеризовались наличием обильной диареи, нередко сопровождавшейся эксикозом 1-й или Н-й степени. Генетические варианты РВ с 46-м и 42-м, 51-м ЭФ-типами РНК относятся к разным О-серотипам, но все характеризуются низкомигрирующим 4-м сегментом РНК. Эти наблюдения позволили предположить, что характер диареи и факторы, определяющие тяжесть течения заболевания, могут быть связаны не с й- , а с Р-серотиповой специфичностью штамма РВ, детерминируемой 4-м сегментом РНК, ответственным за вирулентность ротавируса.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлены различия в интенсивности проявлений основных клинических симптомов РВГЭ и частоте возникновения тяжелых

форм заболевания при инфицировании генетическими вариантами РВ разных О-серотипов, свидетельствующие о различиях в их вирулентных свойствах. Однако, полученные результаты, по всей вероятности, представляют лишь научный интерес и определение ЭФ-типа РНК или серотипа РВ не имеет клинического значения, так как отдаленных последствий для здоровья перенесенное заболевание не вызывает, независимо от инфицировавшего варианта РВ и подходы к лечению РВГЭ являются патогенетическими.

Проведенный анализ историй болезни детей с подтвержденным диагнозом РВГЭ показал, что у 79,1+2,8 % больных наблюдались симптомы ОРЗ, которые проявлялись в виде разной степени гиперемии дужек, миндалин, зернистости задней стенки глотки. У 14,6 % больных кроме симптомов ОРЗ диагносцированы такие заболевания, как катаральный отит, бронхит, бронхопневмония и пневмония. При этом установлено, что при гастроэнтеритах, вызванных РВ с 1-м и 3-м ЭФ-типами РНК серотипа, частота регистрации сопутствующих заболеваний органов дыхания составила 36,9 %. У детей, выделявших РВ с 42-м и 51-м ЭФ-типами РНК симптомы ОРЗ наблюдались реже (р < 0,05) и проявлялись лишь в умеренной гиперемии дужек.

Высокий процент регистрации у больных РВГЭ симптомов поражения верхних дыхательных путей и отсутствие убедительных данных об их этиологической природе послужило основанием для проведения исследований по обнаружению РНК РВ в смывах носа и глотки методом молекулярной гибридизации с использованием 32Р-РНК ротавируса шт.БАП. При исследовании 38 проб назофаренгиальных смывов от больных с подтвержденным диагнозом РВГЭ и 46 проб от больных с ОКИНЭ, РНК РВ обнаружена в 76,3 % и 34.7 % случаев, соответственно. В контрольных группах здоровых детей, детей с ОРЗ и ОКИ, в фекалиях которых обнаружены аденовирусы и мелкие неидентифицированные вирусы, результаты были отрицательными. Анализ историй болезни лиц с положительной реакцией на РНК РВ в носоглоточных смывах в 100 % случаев показал наличие катаральных явлений. Обнаружение РНК

РВ в секретах носа и глотки и совпадение результатов обнаружения РНК с наличием симптомов поражения респираторного тракта свидетельствуют о возможности транскрипции генома РВ в клетках слизистых оболочек верхних дыхательных путей и подтверждают ротавирусную природу катаральных явлений при РВГЭ.

Проведено комплексное изучение случаев гастроэнтерита, вызванного атипичными ротавирусами группы С. При анализе 2203 профилей миграции сегментов РНК, атипичные "сверхдлинные" картины миграции сегментов с распределением "4-3-2-2", характерным для ротавируса группы С, выявлены в 1,2 % случаев (Рис.7). Установлено, что по морфологии РВ группы С* не отличаются от РВ группы А, характеризуются вариабельностью генома и отсутствием генетических взаимосвязей с типичными РВ группы А, могут вызывать как спорадические случаи заболевания, так и вспышки инфекции, клинические проявления которой сходны с типичными РВГЭ.

РВ-С + SA11

Рис.7.Электрофореграмма РНК ротавируса группы С в сравнении с РНК ротавируса обезьян шт.БА11.

Распространенность РВ группы С, вызывающих манифестные формы РВГЭ, на территориях городов европейской части России в целом носит ограниченный характер. За 13-летний период наблюдения параротавирусы обнаружены на территориях четырех

городов в 1 случае на 93-177 эпизодов РВГЭ. В то же, время в Архангельской области ротавирусы группы С выявлялись в 1 случае из 3-х заболеваний РВГЭ (Табл.5).

Таблица 5.

Выявление ротавирусов группы С методом электрофоретипирования.

Территория Период наблюдения Количество изолятов (абс.), содержащих: Частота выявления РВ-С ЭФ-тип РНК

гг. РВ РВ-С сл./РВГЭ

г.Н.Новгород г.Дзержинск г.Иошкар-Ола Архангельская область: г.Новодвинск г.Вельск г.Мирный г.Морис д.Воронцы п.Березник 1984-97 1992-97 1986-91 1989-91 1421 185 165 44 8 2 1 15 1 1 2 1 8 2 1/177 1/ 93 1/165 1/ 3 30,44,45 44 45 44,45

Всего: 1984-97 1815 . 26 1/70 30,44.45

Обнаружение на территории России региона активной циркуляции РВ группы С имеет принципиальное значение для выбора методов лабораторной диагностики РВГЭ и эпидемиологического контроля за инфекцией на данной территории.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате молекулярно-генетических исследований с использованием оптимизированного метода электрофоретипирования РНК и созданных ДНК-зондов для подгрупповой и серотиповой дифференциации штаммов ротавируса охарактеризованы

генетические и антигенные варианты возбудителя РВГЭ, распространенные на территории европейской части России, рассчитано их распределение, получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции и существовании внутрисезонной смены генетического и межсезонной смены антигенного вариантов ротавируса, определяющих особенности некоторых проявлений эпидпроцесса РВИ, показано наличие связи между специфической клинической картиной РВГЭ и генетическими и антигенными свойствами вируса, установлена низкая частота выявления и неравномерность распространенности на европейской территории России параротавирусов. Полученные результаты работы в целом расширяют существующие представления о возбудителе небактериальных гастроэнтеритов - ротавирусах и открывают новые возможности изучения механизмов распространения РВ инфекции на молекулярно-генетическом уровне.

ВЫВОДЫ.

1. Унифицирован метод электрофоретипирования штаммов ротавируса, включающий оптимизированный бесфенольный способ выделения РНК, стандартизацию условий постановки электрофореза РНК и разработанную классификационную схему электрофоретипов РНК ротавируса человека.

2. С использованием оптимизированного метода электрофореза РНК и метода электронной микроскопии подтверждена ротавирусная природа 2618 случаев ОКИ неясной этиологии, зарегистрированных на 14-ти территориях европейской части России в 1984 -1997 гг. Частота обнаружения ротавирусов среди детей с манифестной формой ОКИНЭ составила 29 %.

3. Показано, что на фоне вариабельности сегментированного генома ротавируса, отражением которой явилось определение 61-го электрофоретипа РНК, существуют как характерные для отдельных регионов, так и общие для европейской территории России доминирующие генетические варианты.

4. Впервые для территории России показана возможность формирования эпидемического варианта ротавируса, характеризующегося широкой распространенностью, длительной циркуляцией, генетической стабильностью и повышенными вирулентными свойствами, вызвавшего в изучаемый период времени наибольший процент случаев РВГЭ ( 30,8 % ).

5. Впервые клонированы в бактериальных векторных системах гены эпидемически значимых для европейской территории России генетических вариантов ротавируса человека. На основе кДНК генов N835, УР6 и УР7 создана и охарактеризована панель ДНК-зондов для выявления и подгрупповой и серотиповой дифференциации ротавирусов методом молекулярной гибридизации.

6. На основании сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена УР7 и соответствующей ей аминокислотной последовательности УР7, определен новый в-серотип ротавируса человека, генетически родственный ротавирусу свиней.

7. По материалам электрофоретипирования РНК и выявления аллелей генов, определяющих подгрупповую и серотиповую специфичность, впервые рассчитано распределение на европейской территории России антигенных типов ротавируса, характеризующееся превалированием вариантов 81Ю1 ( 55,6 % ), второй значимостью БЮ2 (18,5 % ) и третьей долей 81Ю4 ( 10,4 % ). Среди ротавирусов вЗ серотипа определены как 8ЮЗ ( 0,7 %), так и 81ЮЗ ( 6,8 % ) антигенные варианты,

8. Проведено тринадцатилетнее наблюдение за циркуляцией природных штаммов ротавируса с различными электрофоретипами РНК. Впервые показано существование внутрисезонной смены доминирования, связанной с биологическими свойствами конкретного генетического варианта ротавируса и определяющей особенности сезонных проявлений ротавирусной инфекции.

9. Получены новые данные об особенностях циркуляции ротавирусов разных антигенных типов, заключающихся в доле вариантов, продолжительности периодов и длительности циклов доминирования. Установлено, что межсезонная смена

доминирования антигенного типа ротавируса сопровождается ростом заболеваемости РВГЭ..

10. Охарактеризованы клинические проявления гастроэнтерита, вызванного различными генетическими и антигенными вариантами ротавируса. Получены результаты, подтверждающие возможность связи электрофоретипа РНК со специфической клинической картиной РВГЭ и более высокой вирулентностью вируса. Установлено, что генетические варианты ротавируса 81Ю1 антигенного типа в период доминирования более вирулентны, чем Б1Ю4. Впервые отмечено, что при инфицировании ротавирусом 01 серотипа ведущим в определении тяжести заболевания является сидром токсикоза, при 04 - эксикоза.

11. В назофаренгиальных секретах больных РВГЭ методом молекулярной гибридизации обнаружена РНК ротавируса, что свидетельствует о его способности инфицировать клетки слизистых оболочек носоглотки и подтверждает ротавирусную природу катаральных явлений при ротавирусной инфекции. Гастроэнтериты, вызванные ротавирусом 81Ю1 антигенного типа характеризовались более интенсивными проявлениями симптомов ОРЗ, при этом у больных в 36,9 % случаев наблюдались сопутствующие заболевания органов дыхания.

12. Впервые показано, что распространенность ротавируса группы С на территориях городов европейской части России носит ограниченный характер ( 1,2 % случаев РВГЭ ). В то же время, Архангельская область является регионом их более активной циркуляции ( 34,1 % случаев РВГЭ ). Ротавирусы группы С по морфологии не отличаются от типичных ротавирусов группы А, характеризуются вариабельностью генома, отсутсвием генетических взаимосвязей с ротавирусами группы А, вызывают острую кишечную инфекцию, клинические проявления которой сходны с типичным РВГЭ.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Анцупова A.C., Домбровская JI.K., Залесских А.Ф., Альтова Е.Е., Новикова H.A. Обнаружение ротавирусов и антител к ним у больных гастроэнтеритом и здоровых. // В кн.: Вирусные инфекции. Этиология, эпидемиология, патогенез и диагностика.-Свердловск,- 1985.- С.100 - 103.

2. Новикова H.A., Анцупова A.C. Анализ электрофоретипов ротавирусов человека, выделенных в г.Горьком. // Вопр.вирусол.-

1987.-N2,- С.238 - 241.

3. Новикова H.A., Анцупова A.C., Альтова Е.Е., Епифанова Н.В., Тамойкина H.A., Кашников А.Ю. Некоторые особенности циркуляции ротавирусов по результатам электрофоретипирования.// В кн.: Эпидемиология и профилактика вирусных инфекций.- Свердловск.- 1987.- С. 71 - 74.

4. Новикова H.A., Епифанова Н.В., Тамойкина H.A. Способ получения двунитевой РНК ротавирусов. // Авт. свид. СССР N 1448448, приоритет от 24.02.1987 г.

5. Новикова H.A., Анцупова A.C., Закирова С.Ф., Епифанова Н.В., Тарских Е.А. Сравнительный анализ электрофоретипов ротавирусов человека, циркулирующих на территориях гг. Свердловска и Горького. // В кн.: Эпидемиология, диагностика и профилактика вирусных инфекций.- Свердловск.-

1988,-С. 63 - 66.

6. Епифанова Н.В., Новикова H.A., Тамойкина H.A., Кашников А.Ю. Влияние электрофоретических условий на распределение РНК генома ротавирусов в ПААГ. // В кн.: Физиология и молекулярная биология болезнетворных микроорганизмов.- Горький.- 1988,- С. 28 - 32.

7. Новикова H.A., Анцупова A.C., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е., Троицкая М.В. Электрофоретический анализ геномной РНК ротавирусов человека. // Молекул, генетика.- 1989.- N 5.- С. 45 -49. ,

8. Епифанова Н.В., Новикова H.A., Носкова Н.В., Бессараб И.Н., Пузырев В.Ф. Метод молекулярной гибридизации в изучении

ротавирусов. // В кн.: Иммунология и биотехнология,- Горький.-1989,-С. 64-69.

9. Анцупова A.C., Альтова Е.Е., Новикова H.A., Епифанова Н.В., Залесских А.Ф., Домбровская JI.K., Троицкая М.В. Итоги эпидемиологического надзора за ротавирусной инфекцией в крупном промышленном регионе. // Тез. докл. XVII съезда Всесоюз. общ. эпидемиол., микробиол., и паразитол. им. И.И.Мечникова. Алма-Ата, сент., 1989.- Москва.- 1989.- С. 8 - 9.

10. Васильев Б.Я., Семенов Н.В., Новикова H.A., Епифанова Н.В., Сухинин В.П., Сироткин А.К. Электрофоретическая гетерогенность популяции ротавирусов, выделенных в Ленинграде в осенне-зимний сезон 1986 - 1987 гг. // Вопр. вирусол. - 1990. - N 2.-С. 156 - 157.

11. Новикова H.A., Епифанова Н.В., Салимова Х.И., Ушнурцева A.B., Тамойкина H.A., Кашников А.Ю., Сергеев П.И. Смена доминирующего электрофоретипа РНК в популяциях ротавируса человека, циркулирующих в г. Йошкар-Ола Марийской АССР. // В кн.: Регуляция биологических систем.- Горький.- 1990.- С. 22 - 27.

12. Бессараб И.Н., Новикова H.A., Бородин A.M. Использование полимеразной цепной реакции для анализа ротавирусов. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего основной нейтрализующий антиген VP7 ротавируса человека нового G-серотипа. // Биоорганич. химия.-1990,- N 12.- С. 1689 -1691.

13. Новикова H.A., Носкова Н.В., Епифанова Н.В., Тамойкина H.A., Бурков А.Н. Оценка dRV7-II фрагмента при выявлении ротавирусов методом молекулярной гибридизации. // В кн.: Новое в практике лабораторных исследований,- Н.Новгород.-1991,- С.4-7.

14. Новикова H.A., Кулаков Л.А., Ксензенко В.А., Носкова Н.В., Епифанова Н.В., Кашников А.Ю. Молекулярное клонирование генома генетического варианта ротавируса человека, доминирующего

на территории РСФСР. // В кн.: Биотехнология и генетика.-Н.Новгород.- 1991.- С. 4 - 9.

15. Епифанова Н.В., Новикова Н.А. Молекулярная гибридизация РНК ротавирусов с одинаковыми и различными электрофоретипами. // Там же.- С. 9 - 15.

16. Новикова Н.А., Кулаков JI.А., Ксензенко В.А., Носкова Н.В., Епифанова Н.В. Клонирование гена VP6 ротавируса человека с "длинным" электрофоретипом РНК. // В кн.: Актуальные вопросы медицинской биотехнологии. Часть 2.- Томск.- 1991.-С. 44 - 45.

17. Бессараб И.Н., Епифанова Н.В., Новикова Н.А., Бородин A.M. Анализ гена, кодирующего основной нейтрализующий антиген VP7 изолята 1407 ротавируса человека. // Вопр. вирусол.-1991,-N6,-С. 480-483.

18. Новикова Н.А., Альтова Е.Е., Носкова Н.В., Епифанова Н.В., Тамойкина Н.А. Обнаружение ротавирусной РНК в носоглоточных смывах методом молекулярной гибридизации. // Журн. микробиол.- 1991,- N 4,- С. 23 - 25.

19. Bessarab I.N., Novikova N.A., Epifanova N.V., Borodin A.M. PCR-mediated analysis of human rotaviruses. // Internatinal Symposium "Synthetic oligonucleotides : problems and frontiers of practical application., Moscow, USSR, June 23-30, 1991. USSR Academy of Sciences, Shemyakin Institute of Bioorganic Chemistry. - 1991. - P.167-167.

20. Новикова H.A., Кулаков JI.A., Ксензенко B.H., Носкова Н.В., Епифанова Н.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pRV7-II, содержащая фрагмент dRV7-II для выявления ротавирусов человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент фрагмета dRV7-II для выявления ротавирусов человека. // Авт. свидет. СССР N 1744111, приоритет от 26.12 1989 г.- БИ. N 24 от 30.06.92 г.

21. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е., Душкин В.Н., Пудова К.В., Медведев К.Л. Электрофоретипирование ротавирусов при клинико- эпидемиологическом изучении инфекции. // Журн.микробиол.- 1992.- N 2.- С. 31 - 34.

22. Новикова Н.А., Носова Т.В., Голубева С.А. Оптимизация способа "зондовой" детекции РНК-содержащих кишечных вирусов. // В кн. Актуальные проблемы инфекционной патологии. Ч.З.- С.-Перербург,- 1993,- С. 84-84.

23. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Фардзинова В.Ф., Чечуева Л.И., Февралева E.JL, Кашников A.IO. Обнаружение атипичных ротавирусов человека и их характеристика. // Журн. микробиол,- 1994.- N 2,- С. 103 - 106.

24. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Макеева JI.B., Кашников АЛО., Голубева С.А., Домбровская Л.К. Сезонность ротавирусной инфекции в г.Нижнем Новгороде. //В кн. Актуальные вопросы медицинской вирусологии. Сб.науч.тр., Екатеринбург,-1994,- С. 8187.

25. Новикова Н.А., Кулаков Л.А., Ксензенко В.Н., Носкова Н.В., Бессараб И.Н. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVR6-Il3, предназначенная для специфического выявления ротавирусов II субгруппы, штамм бактерий Escherichia coli - носитель рекомбинантной плазмидной ДНК dVR6-Il3. // Патент РФ N 2031949, приоритет от 11.12.1991 г.- БИ N 9 от 27.03.95 г.

26. Новикова Н.А. Особенности циркуляции ротавирусов человека в Нижнем Новгороде. // В кн.: Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Межд.симп., поев, году Пастера. 6-10 июня 1995 г.-Санкт-Петербург,- 1995,- С.67 - 67.

27. Новикова Н.А., Епифанова Н.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVR6-I размером 3406 п.н., используемая для получения специфического ДНК-зонда для выявления ротавирусов человека 1-й подгруппы и штамм микроорганизмов E.coli, используемый для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pVR6-I и специфического зонда для выявления ротавирусов 1-й подгруппы. // Патент РФ N 2064502, приоритет от 01.09.1992 г. - БИ N21 от 27.07.1996.

28. Новикова Н.А., Голицына Л.Н., Епифанова Н.В. ДИГ-ДНК-зонды для выявления кишечных вирусов в водных объектах. //

Матер. VIII Всерос. съезда гигиен, и санит. врачей. Том.2.- Москва.-

1996,- С. 262 - 263.

29. Новикова H.A., Бессараб И.Н., Бородин A.M. Определение G-серотипа доминирующего гентического варианта ротавируса группы А. // Тез.докл.IV Российского национ. конгр. "Человек и лекарство",- 8-12 апреля 1997 г. Москва,- 1997,- С. 227-227.

30. Новикова H.A.., Бессараб И.Н., Бородин A.M., Голицина JI.H. Создание ДНК-зонда для специфического выявления ротавирусов Gl серотипа. // Тез. стенд, сообщений 11-го съезда биохимич. общества РАН. Москва, 19-23 мая 1997 г.- Пущино.-

1997.-Ч.1.-С. 152-152.

31.Новикова H.A., Носова Т.В., Епифанова Н.В., Животовский М.В. Применение метода электрофореза РНК в диагностике ротавирусного гастроэнтерита. // Матер. VII съезда Всерос.общ.эпидемиол.. микробиол. и паразитол. Москва, 28-31 января 1997 г., Т.Н.- Москва,- 1997,- С. 477 - 477.

Автор выражает глубокую признательность Домбровской Л.К., Альтовой Е.Е., Душкину В.Н., Животовскому М.В. (Нижний Новгород), Закировой С.Ф. (Екатеринбург), Васильеву Б.Я. (С.-Петербург), Козловской Г.А., Таранцевой Л.П. (Липецк), Лукиной А.И. (Пермь), Боголицыну Ю.Г., Чечуевой Л.И. (Архангельск), Сергееву Н.И., Васильевой И.В., Салимовой Х.И., Ушнурцевой А.В.(Иошкар-Ола), Першеву В.В., Георгиевой В.П. (Чебоксары), Чудову И.А. (Саранск), Чупровой А.Б. (Дзержинск), предоставивших пробы стула детей с ОКИНЭ для исследования.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Новикова, Надежда Алексеевна, Нижний Новгород

'ССИ.М

« ^ » ......19 : : , Y/f/fV

, ~ степень

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии

и микробиологии

На правах рукописи

Новикова Надежда Алексеевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И АНТИГЕННЫЕ ВАРИАНТЫ РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ НА ЕВРОПЕЙСКОЙ ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

( 03.00.06. - Вирусология )

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор С.Г.Дроздов

Нижний Новгород - 1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

III.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Характеристика генетических вариантов ротавируса человека с использованием электрофоретипирования геномной РНК.

1.1.Оптимизация методических приемов электрофорети-

1.2.Анализ электрофоретипов РНК ротавируса человека..93 1.3.Особенности доминирования генетических вариантов ротавируса группы А на территориях ряда городов.

2.Характеристика антигенных вариантов ротавируса человека с использованием анализа геномной РНК.

2.1.Создание ДНК-зондов для выявления и подгрупповой дифференциации ротавирусов.

2.1.1.Клонирование генома ротавирусов с 3-м ЭФ-типом РНК........................................113

2.1.2.ДНК-зонд для выявления ротавирусной РНК различных ЭФ-типов...............................117

2.1.3.ДНК-зонд для специфического выявления РНК ротавирусов Sil подгруппы........................125

2.1.4.ДНК-зонд для специфического выявления РНК ротавирусов SI подгруппы.........................131

2.2.Анализ гена VP7 природных штаммов ротавируса че-

пирования РНК

европейской части России

104

ловека.

2.2.1.Определение G-серотипа ротавируса на основе анализа нуклеотидной последовательности гена

VP 7..............................................133

2.2.2.ДНК-зонды для выявления РНК ротавирусов G1-,

G3-, С4-серотипов................................146

2.3.Дифференциация природных штаммов ротавируса методом молекулярной гибридизации с использованием ДИГ-ДНК-зондов...................................150

3.Изучение эпидемиологических и клинических особенностей ротавирусной инфекции, вызванной различными генетическими и антигенными вариантами ротавируса. 3.1.Многолетние наблюдения циркуляции ротавирусов в

г.Нижнем Новгороде.

3.1.1.Возрастные особенности ротавирусной инфекции ..............................................163

3.1.2.Сезонность ротавирусной инфекции ..........168

3.1.3.Анализ циркуляции ротавирусов с различными ЭФ-типами РНК....................................174

3.1.4.Анализ циркуляции ротавирусов разных серо-типов............................................184

3.2.Характеристика гастроэнтерита, вызванного разными генетическими и антигенными вариантами ротавируса группы А.

3.2.1.Клинические проявления гастроэнтерита......194

3.2.2.Выявление РНК ротавируса в носоглоточных смывах больных РВГЭ..............................202

3.3.Характеристика гастроэнтерита, вызванного ротави-

русами группы С..................................207

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................216

VI. ВЫВОДЫ.................................................240

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................244

Список сокращений

ОКИНЭ - острые кишечные инфекции неустановленной этиологии

РВГЭ - ротавирусный гастроэнтерит

РВ - ротавирусы

РВИ - ротавирусная инфекция

РПИ - расширенная программа иммунизации

днРНК - двунитевая рибонуклеиновая кислота

ЭФ-тип- электрофоретип

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

ЭМ - электронная микроскопия

ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

КРС - крупный рогатый скот

п.н. - пары нуклеотидов

а.о. - аминокислотные остатки

м.м. - молекулярная масса

кДа - килодальтон

е.а. - единица активности

ЭПР - эндоплазматический ретикулюм

МКА - моноклональные антитела

1д - иммуноглобулин

АТ - антитела

шт. - штамм

ЭДТА - этанолдиаминтетрауксусная кислота

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Дегидратирующие диарейные заболевания детей младшего возраста, этиологически обусловленные рота-вирусами, являются важной проблемой здравоохранения во всем мире. Широкая распространенность, значительный удельный вес в структуре небактериальных гастроэнтеритов, высокий процент случаев, требующих госпитализации, возможность летальных исходов и вариабельность сегментированного генома возбудителя определили сформулированную Всемирной Организацией Здравоохранения приоритетность развития исследований, направленных на всестороннее изучение генетического и антигенного разнообразия ротавирусов и особенностей их циркуляции в различных географических регионах мира, конечной целью которых является разработка эффективной вакцины против ротавирусных гастроэнтеритов [73,364,424].

На территории Российской Федерации заболеваемость ротави-русным гастроэнтеритом среди детей сопоставима с заболеваемостью сальмонеллезом и дизентерией, занимает до 9,2 % структуры ОКИ и определяет 30% и более случаев ОКИНЭ [13,40,76,77]. Всесторонне и детально изучены клинические проявления ротави-русного гастроэнтерита и эпидемиологические особенности ротави-русной инфекции [13,20,21,40,52,58,52]. Однако, исследования, направленные на изучение молекулярной природы циркулирующих на территории нашей страны природных штаммов ротавируса носят эпизодический характер. С использованием электрофоретипирования РНК охарактеризованы изоляты ротавируса группы А, собранные в Москве, Санкт-Петербурге, Кемеровской области [13,15,17,98]. Сведения о распространенности ротавирусов антигенной группы С

отсутствуют. Остается открытым вопрос о существовании связи между клиническими проявлениями инфекции и генетическими или антигенными характеристиками вируса. Наблюдения за особенностями многолетней циркуляции штаммов ротавируса и смены их доминирования носят единичный характер не только в России, но и в мире, и не раскрывают закономерностей циркуляции ротавирусов разных антигенных типов [17,122,130,139].

Определение доминирующих антигенных вариантов ротавируса и изучение их распространенности и относительного распределения на территориях различных стран показало существование как общих, повсеместно циркулирующих типов вируса, так и характерных для отдельных регионов земного шара [115,122,130,139,151,152]. Недостаточная изученность этого вопроса в нашей стране и отсутствие коммерческих тест-систем для определения антигенной специфичности ротавирусов выдвигает задачу унификации и разработки альтернативных молекулярно-генетических методов их дифференциации и делает актуальным проведение исследований по характеристике природных штаммов ротавируса человека, циркулирующих на территориях Российской Федерации.

Цель работы: Совершенствование методов РНК-дифференциации ротавирусов и комплексная молекулярно-генетическая и медико-биологическая характеристика природных штаммов ротавируса человека, распространенных на европейской территории Российской Федерации .

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод электрофретипирования РНК ротавирусов .

2. Изучить многообразие электрофоретипов РНК ротавирусов

человека, определить доминирующие на территории европейской части России генетические варианты.

3. Синтезировать кДНК генов УР6 и УР7 эпидемически значимых генетических вариантов ротавируса и на основе анализа полных нуклеотидных последовательностей определить их подгрупповую и серотиповую принадлежность.

8. Изучить распространенность на европейской территории России ротавирусов антигенной группы С и дать характеристику вызываемого ими гастроэнтерита.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Предложен упрощенный способ выделения и очистки РНК ротавирусов непосредственно из копроматериала больных РВГЭ ( Авт. свид. СССР N 1448448, приоритет от 24.02.1987 г.), используемый при диагностике РВГЭ методом электрофореза РНК и для очистки

РНК ротавирусов с целью ее последующего клонирования.

Впервые в России сконструированы: 1.Универсальный ДНК-зонд для выявления ротавирусов группы А с различными электрофорети-пами РНК ( Авт.свид. СССР N 174411, приоритет от 26.12.1989 г.); 2.ДНК-зонды для специфического выявления ротавирусов группы А Sil и SI подгрупп ( Патент РФ N 2031949, приоритет от 11.12.1991 г. и патент РФ N 2064502, приоритет от 01.09 92 г., соответственно ); 3.ДНК-зонды для выявления последовательностей, определяющих Gl, G3 и G4 серотипы ротавируса. Создание ДНК-зондов для выявления и дифференциации РНК ротавирусов может способствовать расширению методической базы эпиднадзора за ро-тавирусной инфекцией и проведению более углубленных научных исследований в области молекулярной эпидемиологии РВГЭ.

Впервые, на основе молекулярно-генетического изучения, охарактеризованы циркулирующие на 14-ти европейских территориях России генетические варианты ротавируса. Показана принципиальная возможность формирования эпидемически значимого, общего для европейской территории России, генетического варианта ротавируса, характеризующегося генетической стабильностью, широкой распространенностью, длительной циркуляцией, определяющего более интенсивный симптомокомплекс РВГЭ и наиболее часто вызывающего тяжелое течение заболевания.

По материалам выявления аллелей генов, кодирующих подгрупповые и серотиповые антигены, впервые охарактеризованы домини-

рующие на европейской территории России антигенные варианты ротавируса, относительное распределение которых, свидетельствующее о предоминировании 311С1, второй значимости 31С2 и третьей доле 31104 антигенных типов, соответствует установленному для ряда территорий западной Европы.

Обнаружен вариант ротавируса группы А, выделенный от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, имеющий уникальную последовательность гена МР7, отличающуюся от описанных в литературе 14-ти С-серотипов ротавируса и генетически родственный ротавирусу свиней.

Впервые в Российской Федерации проведено тринадцатилетнее наблюдение за циркуляцией ротавирусов группы А с различными электрофоретипами РНК в условиях крупного промышленного города ( Н.Новгород ). Установлено существование внутрисезонной смены доминирования электрофоретипа РНК ротавируса, связанной с биологическими свойствами конкретного генетического варианта возбудителя, отражающими степень его вирулентности. Показано, что межсезонная смена доминирующего антигенного варианта ротавируса, происходящая раз в 4-5 эпидемических лет, сопровождается ростом заболеваемости РВГЭ. Определены удельный вес, продолжительность периодов и длительность циклов доминирования ротавирусов С1-4 серотипов, что имеет важное значение для практической медицины в плане качественного прогнозирования тенденций роста заболеваемости РВГЭ и разработки стратегии вакцинопрофи-лактики ротавирусной инфекции.

При анализе случаев "чистых" РВГЭ, вызванных 10-ю доминирующими генетическими вариантами ротавируса четырех С-серотипов, получены новые данные о взаимосвязи выраженности основных

клинических симптомов, тяжести течения заболевания и синдромов ее определяющих, и генетическими и антигенными характеристиками ротавируса.

Впервые показаны особенности циркуляции на территорииях городов европейской части России атипичных ротавирусов группы С. На фоне низкой выявляемости природных штаммов этой антигенной группы вируса установлен регион их более интенсивной циркуляции - Архангельская область, что имеет принципиальное значение для выбора адекватных средств диагностики РВГЭ в этом регионе.

Внедрение результатов исследования в практику.

1. Информационное письмо " Электрофоретипы РНК ротавирусов человека и их классификационная схема ". Горький, 1990 г. ( Утверждено 15.05.90 г. Главным эпидемиологом Управления здравоохранения Горьковской обл. Т.М.Казанской ). Используется в качестве методического пособия в работе научно-практического семинара " Новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний и способы типирования их возбудителей", включенного в план работы ГК СЭН РФ. Проведено обучение методу электрофоретипирования ротавирусов 26-ти представителей 9-ти центров ГСЭН РФ.

2. Методические рекомендации " Детекция ротавирусов человека с использованием электрофоретического анализа нуклеиновых кислот ( ЭФАНК )". Н. Новгород, 1994. ( Утверждены 30.12.94 г. Заместителем председателя Госкомсанэпидназора России Г.Г.Они-щенко ).

3. Методические рекомендации " Выявление и дифференциация

ротавирусов человека с использованием ДНК-зондов", Н.Новгород, 1994 г. ( Утверждены 30.12.94 г. Заместителем председателя Гос-комсанэпидназора России Г.Г.Онищенко ).

Разработки, защищенные авторскими свидетельствами использовались при проведении НИР, при выявлении ротавирусов в пробах стула больных ОКИНЭ с целью лабораторного подтверждения клинического диагноза РВГЭ и определения стратегии лечения больного. В процессе работы расшифрована этиологическая природа 29,0 % случаев ОКИНЭ, охарактеризован этиологический агент ряда вспышек ротавирусной инфекции. Результаты выявления ротавирусов у больных ОКИНЭ сообщались в центры СЭН Российской Федерации, где использовались для определения квоты ротавирусных гастроэнтеритов в структуре инфекционной заболеваемости.

Использование результатов работы в научных исследованиях, эпидемиологической, клинической и учебной практиках подтверждены актами внедрения РИАЦ ГК СЭН РФ, Нижегородского НИИЭМ МЗ РФ, НИИЭМ им.Габричевского МЗ РФ, Нижегородского областного ГЦ СЭН, Нижегородского городского ГЦ СЭН, детской инфекционной больницы N 8 г.Н.Новгорода, детской инфекционной больницы N 23 г.Н.Новгорода, детской инфекционной больницы N 11 г.Дзержинска и Нижегородского государственного университета им.Н.И.Лобачевского.

Положения, выносимые на защиту:

1.Создана методическая база для выявления и РНК-дифференци-

ации ротавирусов, включающая унифицированный метод электрофоре-типирования штаммов и метод молекулярной гибридизации с использованием сконструированных ДНК-зондов.

2.На фоне многообразия электрофоретипов РНК природных штаммов ротавируса человека формируются доминирующие генетически стабильные эпидемические варианты, характеризующиеся широкой распространенностью, длительной циркуляцией и относительно высокой вирулентностью.

3.Территория европейской части Российской Федерации характеризуется преимущественной циркуляцией разнообразных гентичес-ких вариантов ротавируса группы А с предоминированием 311С1 антигенного типа, и низкой частотой выявления параротавирусов.

4.Особенностями многолетней циркуляции природных штаммов ротавируса С1-4 серотипов являются её форма, доля вариантов, длительность периодов и продолжительность циклов доминирования, существование внутрисезонной смены превалирующего генетического варианта и периодической межсезонной смены доминирующего антигенного типа вируса.

5.Выраженность основных клинических симптомов РВГЭ, частота возникновения тяжелой формы заболевания и интенсивность реакции со стороны респираторного тракта могут быть связаны с генетическими и антигенными характеристиками вируса, вызвавшего заболевание .

Апробация работы.

1985 ); научной конференции "Биология возбудителей инфекц

Информация о работе

Новикова, Надежда Алексеевна
доктора биологических наук
Нижний Новгород, 1998
ВАК 03.00.06

Диссертация

Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на Европейской территории России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы