Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ электрофоретипов РНК ротавирусов человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Анализ электрофоретипов РНК ротавирусов человека"

^ ' - РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Со ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ^ <ъ ИМ. М.П.ЧУМАКОВА

«Л/

на правах рукописи УДК 578.823.91:578.223:578:53:088.1

Епифанова Наталия Владимировна

Анализ электрофоретипов РНК ротавирусов человека.

03.00.06 -вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Н.А.Новикова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник МБ.Королев,

кандидат биологических наук Е.Э.Евреинова

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский

институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н. Габричевского Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится: «/^ » ¿^/#^'¿/^1997 г. в чаа. на заседании диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.ПЛумакова РАМН.

Автореферат разослан: 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.А.Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Ротавирусы (род Rotavirus, семейство Reoviridae) являются этиологическим агентом тяжелых дегидратирующих диарей преимущественно у детей младшего возраста, обусловливая в разных странах от 20 до 60% случаев, требующих госпитализации [Бюл. ВОЗ, 1991]. Интенсивное изучение ротавирусов человека со времени их открытия в 1973 г. позволило выявить существование различных серологических групп, подгрупп, серотипов, геногрупп вируса и электрофоретипов геномной РНК [Estes M., Cohen N.,1989]. Значение ротавирусов в инфекционной патологии человека, их антигенное и генетическое разнообразие определяют необходимость проведения постоянного контроля за циркулирующими штаммами. Использование при этом молекулярных характеристик стимулировалось сложностями культивирования ротавируса человека (РВЧ), что привело к поиску альтернативных серотипированшо подходов к дифференциации штаммов.

Одним из молекулярно-генетических методов дифференциации штаммов является элекгрофоретипирование ротавирусов, основанное на анализе профиля распределения одиннадцати сегментов двупитевой РНК ротавирусного генома при электрофорезе в геле [Kalica A.R., 1978, Espejo R.T., 1979]. Элекгрофоретипирование широко применяется за рубежом для характеристики циркулирующих штаммов, выявления доминирующих генетических вариантов вируса, установления эпидемиологических связей в очаге инфекции [Lonrenco М.Н., 1981; Cash P. et al, 1986; Clark J.D. et al, 1988; Stewien K.E. et al, 1994]. Однако, отсутствие единого подхода к типировашпо затрудняет сравнение результатов и обобщение данных, полученных разными авторами и обусловливает целесообразность проведения исследований по унификации метода элекгрофоретипирования ротавирусов.

Работы отечественных авторов посвящены использованию метода в диагностике ротавирусного гастроэнтерита (РВГЭ), выяснению клинического значения определения элекгрофоретипа РНК, оценке роли метода в изучении эпидемиологии ротавирусной инфекции [Букринская А.Г. и соавт., 1986; Хаустов В.И. и соавт., 1989; Тен H.A. и соавт., 1991; Васильев Б.Я. и соавт., 1995]. В то же время недостаточно внимания уделено изучению циркуляции ротавирусов с различными электрофоретипами (ЭФ-типами) РНК, оценке значения конкретных типов вируса в возникновении гастроэнтеритов, установлению доминирующих в популяциях генетических вариантов вируса и анализу их распространенности, что определило актуальность настоящей работы, направленной на исследование генетической гетерогенности ротавирусных популяций, циркулирующих на территории ряда городов европейской части Российской Федерации, и выявление наиболее значимых в этиологии РВГЭ генетических вариантов вируса.

Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ в качестве фрагмента № 004.06 к договору № 3-157-04 «Средства и методы, направленные на снижение заболеваемости энтеро- и ротавирусными инфекциями», № госрегистрации 018700099929.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение генетических вариантов ротавируса человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации, с использованием унифицированного метода элекгрофоретипирования штаммов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оптимизировать метод электрофоретипирования ротавирусов.

2. Провести электрофоретипирование ротавирусов человека, циркулирующих на территории ряда регионов европейской части России. Составить классификационную схему электрофорегипов РНК.

3. Определить доминирующие в популяциях электрофоретипы РНК, оценить распространенность различных генетических вариантов РВЧ на изучаемой территории.

. 4. Изучить генетические взаимоотношения между ротавирусами человека с доминирующими элекгрофоретипами РНК.

5. Оценить значимость электрофореза РНК в изучении ротавирусной инфекции человека. ,

Научная новизна работы. Впервые по результатам широких исследований с применением молекулярно-генетических методов охарактеризованы генетические варианты ротавируса человека, циркулирующие на территории четырнадцати городов Российской Федерации. Составлена классификационная схема, отражающая их многообразие и включающая в себя пять электрофорегрупп РНК. Определены доминирующие в популяциях элекгрофоретические типы ротавирусов. Впервые выявлен наиболее широко распространенный, генетически стабильный вариант ротавируса, вызывающий основную массу ротавирусных гастроэнтеритов на изучаемой территории.

Получены новые данные о распространенности на территории нашей страны ротавирусов группы С, обнаружен регион их интенсивной циркуляции.

Предложен бесфенольный способ обработки первичного копроматериала, новизна которого подтверждена авторским свидетельством №1448448 «Способ получения двунитевой рибонуклеиновой кислоты ротавирусов», приоритет от 24.02.87.

Практическая значимость работы. Унифицирован метод элекгрофоретипирования РВЧ путем оптимизации методических приемов получения картин миграции ротавирусной РНК в геле и анализа электрофорегипов на основе разработанной классификационной схемы. Составлено информационное письмо «Электрофоретипы ротавирусов человека и их классификационная схема» [Горький, 1990], являющееся практическим пособием по электрофоретшшрованию РВЧ, которое используется при

обучении специалистов центров СЭН в рамках действующего при ННИИЭМ семинара «Новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний и способы типирования их возбудителей».

Бесфенольный способ экстракции РНК ротавирусов был использован при создании ДНК-зондов для выявления и дифференциации ротавирусов человека, а также применен в лабораторной диагностике ротавирусной инфекции, результаты которой учитывались работниками лечебных учреждений при выборе методов лечения больных.

В процессе работы по теме расшифрована ротавирусная этиология 29,3% случаев острой кишечной инфекции небактериальной природы, охарактеризован этиологический агент ряда вспышек заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комплекс оптимизированных методических приемов, в том числе бесфенольная экстракция РНК, стандартизация условий электрофореза, упрощенная окраска гелей серебром, использование классификационной схемы ЭФ-типов РНК, обеспечивает надежную дифференциацию штаммов РВЧ методом электрофоретипирования.

2. На фоне широкой генетической вариабельности штаммов, циркулирующих на территории европейской части России, существуют доминирующие в популяциях электрофоретические типы ротавируса, один из которых, характеризующийся генетической стабильностью, широкой распространенностью и продолжительной циркуляцией, играет ведущую роль в возникновении небактериальных гастроэнтеритов на изучаемой территории.

3. Атипичные ротавирусы характеризуются низкой частотой выявления в целом и интенсивной циркуляцией в одном из исследованных регионов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях молодых ученых в Горьковском НИИ эпидемиологии и микробиологии (Горький, 1988) и в институте им. Пастера (Ленинград, 1988), на республиканской конференции «Актуальные вопросы медицинской вирусологии» (Свердловск, 1989), Всесоюзном съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Алма-Ата, 1989), на совместном заседании семинаров по проблемам эпидемиологии, микробиологии и вирусологии и по проблемам биохимии Нижегородского НИИЭМ (1991, 1996).

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 18 июня 1996 г.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения и выводов; изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, 5 рисунков, 12 фотографий. Список литературы включает 272 источника.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

В работе исследованы образцы стула 6478 больных детей в возрасте до 14 лет с острой кишечной инфекцией неясной этиологии (ОКИНЭ), полученные в 1984-1991 и 1995-1996 гг. из больниц и центров санэпиднадзора городов Нижний Новгород (4460 проб), Йошкар-Ола (408), Чебоксары (176), Саранск (55), Пермь (324), Липецк (282), С.-Петербург (50), Екатеринбург (107), Архангельск (271), Самара (50), Вологда (70), Дзержинск (126), Ульяновск (70), Саров (29).

Прямую электронную микроскопию осветленных суспензий копроматериала проводили по способу флотации [Королев М.Б., 1980]. Препараты контрастировали 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислотой и просматривали на электронном микроскопе JEM-100 СХ при ускоряющем напряжении 80 kV и инструментальном увеличении 53000.

Экстракцию РНК из копроматериала осуществляли предложенным нами бесфенольным способом либо фенол-хлороформной смесью [Clarke I.N., McCrae М.А., 1981] .

Электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в системе буферных растворов Лэ.ммли [Laemmly U.K., 1970] с окрашиванием РНК бромидом этидия или нитратом серебра по методу Svensson L. с соавт. [1986] в собственной модификации. В качестве элемента сравнения использовали РНК ротавируса обезьян, штамм SA-11, полученного из института экспериментальной ветеринарии ВАСХНИЛ (Москва). Ротавирус SA-11 культивировали на клетках почки эмбриона свиньи (СПЭВ) с добавлением трипсина в концентрации 0,1%.

Включение радиоактивной метки в РНК ротавирусов проводили с помощью Т4-РНК-лигазы в присутствии 5 -[?:Р] - цитидиндифосфата [Pealtiea D.A., 1979]. РНК-РНК-блот-гибридизацию осуществляли как описано Li L. с соавт [1988].

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами [Урбах В.Ю., 1975]. Достоверность полученных результатов оценивали по критерию у} -Пирсона.

Результаты и обсуждение.

1. Оптимизация метода электрофоретипнрования ротавирусов человека.

Электрофоретипирование штаммов ротавирусов включает в себя несколько этапов: выделение РНК из исследуемого материала, электрофорез в ПААГ, визуализацию РНК в теле. Каждый этап многостадиен, достаточно трудоемок, предполагает использование вредных химических веществ, что ставит задачу оптимизации метода для проведения массовых исследований.

Рис.1. Распределение сегментов РНК генома ротавирусов при

электрофорезе в ПААГ: в трис-боратной буферной системе при 10 мА, 18 ч (а); в системе буферных растворов Лэммли при 10 мА, 18 ч (б) и при 65 мА, 3,5 ч (в). Окраска РНК бромидом этидия.

С целью упрощения процедуры выделения РНК ротавирусов нами предложен бесфенольный способ экстракции нуклеиновой кислоты непосредственно из копроматериала без предварительной очистки вируса, основанный на осаждении растворимых компонентов копроэкстрактов в присутствии 1%-ного додецилсульфата натрия в условиях высокой ионной силы раствора (0,9-1,2 М №С1) при пониженной температуре (0°С ).

При электрофорезе в ПААГ или агарозе одиннадцать сегментов двунитевой РНК ротавирусов разделяются на четыре класса: 1-й класс включает 1,2,3,4 сегменты, П-й - 5,6, Ш-й - 7,8,9 и 1У-й - 10, 11 сегменты (Рис.1). Картина распределения сегментов на классы и внутри классов является стабильным признаком пггамма и определяет его электрофоретип. Однако, условия электрофореза, применяемые разными авторами при электрофоретипировании ротавирусов, широко варьируют, что обусловило необходимость изучения влияния параметров электрофореза на распределение РНК в геле и выбора оптимальных условий.

При исследовании 30 изолятов с десятью различными ЭФ-типами РНК было установлено, что картина распределения геномных сегментов в ПААГ существенно изменяется при смене концентрации геля, буферной системы и

параметров тока (Рис.1 а, б, в), что приводит к неправильной идентификации ротавирусного штамма. Следовательно, условия электрофореза должны учитываться при проведении электрофоретипирования и сравнении профилей миграции сегментов, полученных как в одной, так и в разных лабораториях. Использование буферной системы Лэммли, 3%-ного концентрирующего и 10%-ного разделяющего гелей, продолжительности электрофореза 18 ч при 10 мА/гель с последующей окраской серебром по усовершенствованнной нами методике дает четкие, воспроизводимые результаты и рекомендуется для электрофоретипирования ротавирусов.

Таким образом, в результате проведенных методических разработок предложен бесфенольный способ выделения РНК из копроматериала, показана необходимость стандартизации условий электрофореза, упрощена процедура визуализации РНК, что позволило оптимизировать процесс электрофоретипирования РВЧ и провести широкое изучение циркулирующих штаммов.

2. Электрофоретипы РНК ротавирусов человека и их классификационная схема.

При исследовании образцов стула, поступивших с территорий четырнадцати городов европейской части России от больных ОКИНЭ, методом электрофореза в ПААГ получены четкие профили РНК 1526 изолятов ротавируса.

Электрофоретипирование проводили путем визуального сопоставления, а также совместного электрофореза РНК исследуемых изолятов вируса между собой и с РНК ротавируса обезьян БА-П, «длинный» профиль которой характеризуется раздельной миграцией всех сегментов 1-го класса, большим расстоянием между сегментами П-го класса, слитной миграцией 7-8-9 генов и быстрой миграцией 10-11 генов. При этом, на первом этапе типирования принимали во внимание общую картину распределения сегментов на классы, позволяющую дифференцировать ротавирусы различных антигенных групп [Димитров Д.Х., 1985; Ыа£е8Ьа Н.Б.е! а1, 1989]. Затем оценивали характер миграции 10-го и 11-го сегментов РНК (IV класс генов) по отношению к соответствующим сегментам генома ротавируса БА-П, после чего последовательно анализировали 1-й, Ш-й и П-й класс генов, принимая во внимание раздельную или совместную миграцию сегментов и их относительную электрофоретическую подвижность.

Определено 54 электрофоретипа РНК, различающихся подвижностью одного или нескольких сегментов. ЭФ-типы обозначены порядковыми номерами, которые присваивались по мере выявления новых вариантов.

Среди выделенных нами ЭФ-типов РНК 51 имел распределение сегментов, типичное для ротавирусов группы А - 4-2-3-2 (98,7% изолятов). Вариантов расположения сегментов, свойственных ротавирусам группы В (4-2-2-1), не выявлено. Три ЭФ-типа (30-й, 44-й и 45-й ) по типу

распределения сегментов на классы - 4-3-3-2 - были отнесены к ротавирусам группы С или параротавирусам (1,3% изолятов). Преобладание среди отгапированных изолятов ЭФ-типов РНК с распределением сегментов 4-2-3-2 свидетельствует о преимущественной циркуляции на территории европейской части России ротавирусов группы А.

По признаку элекгрофоретической подвижности 10-11-го сегментов ЭФ-типы РНК разделены нами на пять электрофорегрупп (Рис.2):

1. ЭФ-группа «длинных» ЭФ-типов РНК (30 вариантов)

2. ЭФ-группа «коротких» ЭФ-типов РНК (11 вариантов)

3. ЭФ-группа «промежуточных» ЭФ-типов РНК (4 варианта)

4. ЭФ-группа «широких» ЭФ-типов РНК (6 вариантов)

5. ЭФ-группа «сверхдлинных» ЭФ-типов РНК (3 варианта)

Разделение ЭФ-типов РНК ротавирусов на «длинные» и «короткие»

общепризнано в литературе, причем большинство штаммов РВЧ с «длинным» типом генома принадлежит ко второй серологической подгруппе и к серотипам

01, вЗ и в4 [КаНса АД. е1 а1, 1981; Бует^оп Ь.й а1, 1986]. В нашем исследовании ротавирусы с «длинными» ЭФ-типами РНК представлены наиболее широко и по разнообразию вариантов и по их доле среди циркулирующих штаммов (74,5%). Ротавирусы с «коротким» типом РНК принадлежат, как правило, к первой серологической подгруппе и к серотипу

02, они составили 22,4% среди исследованных изолятов. Такое соотношение в популяциях ротавирусов с «длинными» и «короткими» ЭФ-типами РНК характерно для большинства изученных регионов мира и отражает долю ротавирусов серопша 02 среди циркулирующих штаммов [Тат 1.8. й а1, 1988; Апз1а в. е1а1,1990].

Нами была выделена группа «широких» ЭФ-типов, характеризующихся большим интервалом между 10 и 11 сегментами. Доля таких ротавирусов невелика (0,9%), однако, они, по-видимому, также отличаются по антигенной специфичности от ротавирусов с другими типами миграции 1У-го класса генов. Например, нами обнаружен случай двойного инфицирования одного больного ротавирусами с «широким» (5-м) и «длинным» (3-м) ЭФ-типами РНК, что наиболее вероятно при различной серотиповой принадлежности штаммов. Кроме того, известно, что изоляты РВЧ, характеризующиеся широким разбегом сегментов П-го и 1У-го классов относятся к новой геногруппе Аи-подобных штаммов [Кака§опи О., е1 а1,1989].

«Промежуточные» ЭФ-типы РНК (0,9% изолятов) по характеру миграции IV класса генов занимают среднее положение между «длинными» и «короткими» ЭФ-типами. На существование подобных вариантов расположения 10 и 11 сегментов обратил внимание Димитров Д.Х. (1984), однако каких-либо особенностей антигенной характеристики таких штаммов не отмечено.

Электрофорегруппа «сверхдлинных» типов РНК включает в себя три варианта миграции сегментов, характерных для ротавирусов группы С.

1. 2. 3. 4. 5.

РВЧ + БА РВЧ + БА РВЧ + БА РВЧ + БА РВЧ + БА

Рис.2. Примеры профилей миграции РНК ротавирусов

человека (РВЧ) разных электрофорегрупп в сравнении с РНК ротавируса обезьян БА-П (БА). Окраска нитратом серебра. Пояснение в тексте.

По результатам электрофоретипирования была составлена классификационная схема (Рис.3), в которой 54 выделенных нами электрофоретипа сориентированы относительно профиля РНК БА-П и разделены на пять электрофорегрупп. В отличие от имеющихся в литературе подходов к классификации ЭФ-типов [Ьоигепсо М.Н., 1981; Димитров Д.Х., 1984; Мооза1 И.В.е! а1, 1984], которые позволяют лишь приблизительно описать картину миграции и не учитывают различия в относительной подвижности отдельных сегментов РНК, классификационная схема, составленная нами, является функциональной и служит для определения электрофоретипа РНК ротавируса путем поэтапного анализа исследуемого профиля распределения сегментов и сопоставления с представленными в схеме. Данная схема ЭФ-типов РНК отражает многообразие генетических вариантов ротавирусов человека, циркулирующих на территории европейской части России, и в ходе дальнейшей работы может пополняться новыми вариантами.

-111 .«Длинные» типы РНК

БА 1 34 2 3 4 1820 26 2921 16 19 2425 27 56 11 15 37 47 38 12 46 48 39 41 42 43 51 52*

6360 1 170 16 1 1 1 12 3 2 2 И 6 1 4 1 1 5 1 1627 19 70 20 75 4 147** 522

2. «Короткие». 3. «Промежу- 4. «Широкие» 5. «Сверх-

точные» длинные»

SA 13 36 35 28 6 8 23 33 14 32 50 7 22 31 57 5 10 49 9 17 40 30 44 45*

35 39 47 7 66 2 22 4 1 1 1 6 3 3 5 1 4 1 1 1 ---

Ш 14 15**

Рис. 3. Классификационная схема электрофоретипов РНК

ротавирусов человека, циркулирующих на территории европейской части России. * - номера ЭФ-типов,

** - количество изолятов каждого ЭФ-типа.

3. Генетические варианты ротавируса человека, доминирующие на территории европейской части России

Обнаруженное многообразие электрофоретипов РНК является отражением генетической неоднородности ротавирусных популяций. Для выяснения роли отдельных генетических вариантов ротавируса в возникновении РВГЭ у человека, была проанализирована частота встречаемости и распространенность РВ с различными ЭФ-типами РНК на изучаемой территории и установлены доминирующие в популяциях электрофоретические типы вируса.

Анализ частоты обнаружения конкретных ЭФ-типов РНК (Рис.3) показал, что многие варианты миграции сегментов выявлялись в единичных или небольшом числе случаев. Наибольшее количество уникальных ЭФ-типов обнаружено на территории Нижнего Новгорода, что, по всей вероятности, объясняется наиболее длительным периодом наблюдения и значительном числом отгипированных изолятов. ЭФ-типы, выявленные только на одной территории, обнаружены в Йошкар-Оле (31-й), Липецке (37-й, 38-й), С.-Петербурге (32-й), Самаре (9-й), Екатеринбурге (50-й), Архангельске (49-й).

Наиболее часто в популяциях ротавируса встречались 1-й (4,1%), 3-й (34,2%), 4-й (11,2%), 34-й (3,9%), 39-й (4,6%), 42-й (4,9%) из группы «длинных» и 35-й (7,9%) из группы «коротких» профилей (Табл.) Каждый из этих ЭФ-типов был определен в количестве, превышающем средний условный показатель, равный отношению числа отгипированных изолятов к числу охарактеризованных ЭФ-типов РНК (1526:54 «28). Обращает на себя внимание наибольший процент изолятов ротавируса, имеющих 3-й, «длинный» ЭФ-тип, характеризующийся совместной миграцией 2-3-го и 7-8-го сегментов РНК, выявляемый достоверно чаще других доминирующих типов (р<0,001, Х2=13,791-27,855). При сравнении РНК 3-го ЭФ-типа изолятов РВ, собранных на территориях разных городов и на одной территории в разные эпидпериоды, с использованием совместного электрофореза наблюдалось полное совпадение всех одиннадцати сегментов, что может свидетельствовать о генетической стабильности этого варианта ротавируса. При аналогичных исследованиях РНК других ЭФ-типов, такой стабильности не обнаруживалось.

При анализе распространенности ротавирусов с доминирующими ЭФ-типами РНК выявлены особенности их циркуляции на отдельных территориях (Табл.). Так, генетический вариант ротавируса с 1-м ЭФ-типом РНК, обнаруженный на восьми территориях, нигде не занимал доминирующего положения. Штаммы ротавируса 4-го электрофоретического типа, также выявленные на восьми территориях, доминировали в Н.Новгороде в эпидпериод 1988-89 гг., а в Липецке занимали превалирующее положение на протяжении трех лет подряд (1987-90 гг.), вызвав 69,7% случаев РВГЭ. Аналогичная ситуация наблюдалась и в отношении штаммов с 34-м, 39-м и 42-м ЭФ-типами РНК. Циркулируя на разных территориях, они преимущественно выявлялись на

Таблица.

Частота выявления ротавирусов группы А с доминирующими электро-форетипами РНК на территориях городов европейской части России.

Город Период наблюдения Кол-во типиро-ванных штаммов Доминирующие ЭФ-типы РНК (%) Другие ЭФ-типы РНК (%)

1 3 4 34 39 42 35

Н.Новгород 1984-91 1995-96 897 4,9 40,0 9,3 0,8 5,8 5,5 3,7 30,0

Саров 1995-96 11 - - - 81,8 - - - 18,2

Дзержинск 1995-96 49 - 8,1 - 42,9 2,0 22,4 - 24,6

Йошкар-Ола 1986-90 165 1,2 37,6 6,7 0,6 2,4 3,0 10,9 37,6

Чебоксары 1987-90 75 2,7 28,0 10,7 2,7 - 49,3 6,6

Саранск 1987-90 7 7,7 30,8 7,7 15,4 15,4 - - 23,0

Пермь 1986-91 104 9,6 36,5 1,9 7,7 4,8 2,9 14,4 22,2

Липецк 1987-90 76 1,3 - 69,7 2,6 7,9 1,3 - 17,2

Архангельск 1987-91 60 3,3 5,0 18,3 13,3 - 1,7 26,7 31,7

Екатеринбург 1986-90 34 2,9 52,9 2,9 - - - 2,9 38,4

С.Петербург 1987-87 14 - 64,3 - - - - - 35,7

Самара 1984-85 4 100,0

Вологда 1988-89 5 - 60,0 - 20,0 - - - 20,0

Ульяновск 1995-96 19 - 5,2 - - - - 21,0 73,8

Всего 1984-91 1995-96 1526 4,1 34,2 11,2 3,9 4,6 4,9 7,9 29,2

одной из них. Так, наибольшее число изолятов с 34-м ЭФ-типом РНК выявлено в Дзержинске, а с 39-м и 42-м - в ННовгороде.

Иная картина циркуляции наблюдалась для ротавирусов с «короткими» ЭФ-типами РНК. Как правило, на территории каждого города преобладали штаммы с различными «короткими» профилями РНК. Только ротавирусы 35-го электрофоретического типа имели более широкое распространение, выявлялись на территориях семи городов, на четырех из них доминировали - в Йошкар-Оле, Чебоксарах и Архангельске в 1988-1989 гг., в Перми - в 1989-90 гг. и соответственно вызвали большее число случаев РВГЭ, чем другие штаммы с «короткими» профилями миграции сегментов.

Однако, особое место среди доминирующих генетических вариантов РВЧ занимает 3-й электрофоретический тип вируса, который не только выявлялся на большинстве изученных территорий, но и доминировал на восьми из них в разные периоды времени: в Нижнем Новгороде (1984-1988 гг.), Йошкар-Оле (1987-1988 гг.), Чебоксарах (1987-1988 и 19989-1990 гг.), Саранске (1989-1990 гг.), Перми (1988-1989 г.г.), Архангельске (1990-1991 г.г.), Екатеринбурге и С.-Петербурге (1986-1987 гг.). Высокая частота обнаружения

(34,2%), широкая распространенность и постоянное доминирование позволили заключить, что генетический вариант ротавируса, характеризующийся 3-м ЭФ-тилом РНК, играет ведущую роль в возникновении РВГЭ на территории европейской части России.

4. Изучение генетических взаимоотношений между ротавирусами человека с доминирующими ЭФ-типами РНК.

Электрофоретипирование дает ориентацию в многообразии циркулирующих штаммов ротавируса. Однако, не всегда сходство или различие в электрофоретической подвижности сегментов отражает сходство или различие в их нуклеотидной последовательности. Известно, что штаммы ротавируса с одинаковыми ЭФ-типами РНК могут различаться по степени гомологии отдельных сегментов [Clarke I.N., McCrae V.A., 1981,1982] и относиться к разным серотипам [Beards J.M., 1982]. Для изучения генетических взаимоотношений между ротавирусами с одинаковыми и различными ЭФ-типами РНК использовали метод РНК-РНК блот-гибридизации, позволяющий оценить степень гомологии нуклеотидных последовательностей, а также проводить серотиповую и подгрупповую дифференциацию штаммов на основе характера гибридизации сегментов РНК, кодирующих соответствующие антигенные детерминанты [Lin M. et al, 1985; Midthun К. et al, 1987].

Для получения радиоактивного зонда апробировали четыре способа введения изотопа 32Р в РНК ротавирусов. Наиболее эффективным оказалось мечение РНК по З'-ОН концу с помощью Т4-РНК-лигазы.

Исследовали варианты ротавирусов с 1-м, 3-м, 4-м, 39-м («длинными») и 8-м, 35-м («короткими») ЭФ-типами РНК, доминировавшими на территории Нижнего Новгорода в разные эпидсезоны (Рис.4а). В качестве зонда использовали меченую тотальную РНК 3-го ЭФ-типа, полученную из изолята PB, выделенного в эпидсезон 1984-1985 гг.

На Рис.4б видно, что в гомологичной реакции (зонд сам на себя) наблюдались одинаковые по интенсивности гибридизационные сигналы в области всех сегментов генома. При взаимодействии зонда с РНК 1-го и 4-го ЭФ-типов отмечено ослабление гибридизационного сигнала в области 5-го гена, кодирующего неструктурный белок (►), в то время как 6-е и 9-е гены, определяющие подгрупповую и G-серотиповую специфичность штамма, интенсивно гибридизовались с соответствующими сегментами зонда. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ротавирусы с 1-м, 3-м и 4-м ЭФ-типами РНК однородны в отношении подгрухшовой и серотиповой принадлежности, но являются разными генетическими вариантами одного антигенного типа вируса.

Иная картина гибридизации наблюдалась для ротавируса 39-го ЭФ-типа, РНК которого не взаимодействовала с зондом по 9-му сегменту (■*) при наличии интенсивных гибридизационных сигналов в области остальных генов. Это означает, что данный штамм относится к той же подгруппе, что и РВЧ с 3-м

а) 1 3 8 3 3 3

"И&'ёк ____ .

/«яП> *-■=—*

4 39 35 4 ЭФ-типы

***** «»-*-»

|

Ш

1984- 1985- 1986- 1987- 1988- 1989- Эпид--1985 -1986 -1987 -1988 -1989 -1990 сезоны

У 11

4

Рис.4. Электрофореграммы РНК ротавирусов, доминировавших на территории Нижнего Новгорода в 1984-1990 гг. (а). Радиоавтограммы гибридизации данных РНК с 32Р-РНК 3-го ЭФ-типа (б).

ЭФ-типом РНК, но к другому G-серотипу. Вероятно, компактная миграция сегментов Ш-го класса, отличающая 39-й ЭФ-тип от других исследуемых типов РНК, может отражать различия в серотипопределяющем гене.

РНК ротавирусов с «короткими» ЭФ-типами (8-м и 35-м) практически не взаимодействовали с зондом ни по одному сегменту генома (И ), включая 6-й и 9-й. Данные штаммы относятся не только к иному серотипу и подгруппе, но и к другой геногруппе ротавирусов, что согласуется с данными Flores J. и соавт. [1982] и Nakagomi О. с соавт. [1989].

Таким образом, метод блот-гибридизации подтвердил выявляемые с помощью электрофореза РНК различия между штаммами ротавируса и позволил дифференцировать генетические варианты вируса одного антигенного типа, а также выявить среди исследуемых штаммов с разными ЭФ-типами РНК представителей трех различных серологических типов, двух подгрупп и двух гсногрупп.

Исследовали генетические взаимоотношения ротавирусов с одинаковыми ЭФ-типами РНК, доминировавших на одной территории в разные эпидсезоны, а также выделенных на территориях разных городов. В качестве зондов использовали меченные РНК нижегородских изолятов соответствующих ЭФ-типов.

При гибридизации РНК ротавирусов с 3-м ЭФ-типом РНК, циркулировавших в разные годы в Нижнем Новгороде, не выявлено различий в интенсивности гибридизационных сигналов в области каких-либо сегментов (Рис. 4а, б), следовательно, эти штаммы проявляют высокую степень гомологии по всем генам, что отражает генетическую стабильность ротавирусов с 3-им ЭФ-типом РНК.

Ротавирусы с одинаковым ЭФ-типом РНК, выделенные на разных территориях (исследовали доминирующие варианты - 3-й, 4-й, 35-й и 39-й ЭФ-типы), также не проявляли различий по каким-либо генам, что позволило сделать вывод о их генетическом родстве и однородности в отношении подгрупповой и серотиповой принадлежности.

5. Обнаружение и характеристика параротавирусов человека.

Анализ 1526 профилей миграции сегментов РНК отгапированных изолятов РВЧ в 1,3% случаев выявил атипичные картины распределения генов. По отношению к РНК ротавируса обезьян SA-11, атипичные РНК имели «сверхдлинный» электрофоретип, характеризующийся наличием 3-х сегментов во втором классе генов. Сочетание «сверхдлинного» профиля миграции сегментов с их распределением 4-3-2-2 является специфическим признаком ротавирусов серологической группы С, на основании чего 20 атипичных изолятов отнесены к этой группе. Обнаружено три различных электрофоретипа РНК PB группы С - 30-й, 44-й и 45-й (Рис. 3), что свидетельствует о существовании вариабельности генома параротавирусов так же, как и ротавирусов группы А.

Исследовали способность РНК параротавирусов гибридизоваться с РНК РВ группы А в реакции точечной гибридизации. При этом, даже в условиях низкой жесткости не было зафиксировано гибридизационного сигнала, что подтверждает данные об отсутствии генетических взаимосвязей между ротавирусами групп А и С, полученные другими авторами [ КадевИа Н.Я^ а1, 1988; 01ап У.е1а1,1991].

При электронной микроскопии образцов стула, содержащих РВ группы С, обнаружены ротавирионы, морфологически не отличимые от двухкапсидных частиц РВ группы А. Обращает на себя внимание отсутствие в препаратах параротавирусов однокапсидных вирионов, что может свидетельствовать о различиях во внутренней организации вирусных частиц РВ разных серологических групп.

Анализ циркуляции РВ, отнесенных по характеру профиля миграции к группе С, показал, что они распространены на изучаемой территории очень неравномерно. Атипичные РВ были обнаружены только в четырех из 14 городов. В Н.Новгороде, Йошкар-Оле и Дзержинске параротавирусы выявлены в единичных случаях, что составило соответственно 0,3%, 0,6% и 2% случаев РВГЭ, несмотря на длительпый период наблюдения и значительное число отгипированных изолятов. В Архангельской области, напротив, наблюдалась их интенсивная циркуляция: они выявлялись на протяжении двух лет из 4-х летнего периода наблюдения, вызвали спорадические случаи заболевания в четырех районах области и вспышку ОКИ в детском дошкольном учреждении, обусловили в 1989-1991 гг. 34,1% диагностированных случаев РВГЭ. Обнаружение на территории Российской Федерации региона преимущественной циркуляции ротавирусов группы С имеет принципиальное значение для выбора методов лабораторной диагностики РВГЭ и эпидемиологического контроля за инфекцией на данной территории.

6. Оценка значимости метода электрофоретипирования в изучении ротавирусной инфекции.

Уникальный характер распределения сегментов РНК ротавирусов в геле определяет возможности электрофоретипирования как высокоспецифичного метода диагностики ротавирусной инфекции. При оценке диагностической эффективности оптимизированного нами метода ЭФ-типирования было показано, что он позволяет выявить ротавирусную РНК в 97,6% проб, положительных на ротавирусы по методу электронной микроскопии, и в 3,0% проб, где морфологически идентифицируемые вирионы отсутствовали.

Применение этого метода позволило выявить ротавирусы у 1895 из 6478 больных с острой кишечной инфекцией неясной этиологии и на 29,3% уменьшить число этиологически нерасшифрованных случаев заболевания.

При изучении ЭФ-типа РНК в ходе инфекционного процесса показана стабильность генома при острой ротавирусной инфекции. Изменения в профиле миграции сегментов РНК РВ обнаружены только в двух из 31 случая: в одном

случае появились дополнительные полосы, вероятно являющиеся результатом геномных перестроек, в другом - во время пребывания больного в стационаре зафиксировано повторное инфицирование вторым штаммом РВ, когда на фоне исходного «длинного» профиля появился «короткий», что, по всей вероятности, свидетельствует о внутрибольничной инфекции.

Метод был применен при расшифровке ряда вспышек ОКИ неясной этиологии. Показано, что вспышка кишечной инфекции в детском дошкольном учреждении п. Березники Архангельской области была вызвана ротавирусом группы С с 45-м ЭФ-типом РНК, который был выявлен у всех восьми заболевших. Обнаружение ротавирусов с одинаковым ЭФ-типом РНК, свидетельствующее о единстве этиологического агента заболевания, предполагает общность источника инфекции. Ротавирусы с одинаковым (42-м) ЭФ-типом РНК были также обнаружены при исследовании шести случаев заболевания детей на участке, связанном с одной из молочных кухонь в Нижнем Новгороде в феврале 1996 г.

Напротив, при исследовании копроматериала от больных, вовлеченных в крупную вспышку кишечной инфекции в Сарове Нижегородской области в феврале-марте 1996 г., выявлены ротавирусы с тремя различными ЭФ-типами, один изолят содержал двойной набор сегментов РНК. Такое разнообразие ЭФ-типов РНК, свидетельствующее об отсутствии единого источника инфицирования, позволило предположить, что ротавирусная инфекция в данном случае не была связана с развитием вспышки, причиной которой, как было установлено позднее, явился бактериальный агент.

Как было показано выше, ЭФ-типирование позволяет обнаружить атипичные РВ и дифференцировать представителей различных серологических групп, что невозможно с помощью имеющихся в нашей стране тест-систем иммунологического анализа, сконструированных на основе ротавирусов группы А.

Электрофоретипирование даст возможность следить за циркуляцией различных электрофоретических типов вируса, выявлять доминирующие генетические варианты, то есть позволяет получать информацию о реально существующих популяциях РВЧ и происходящих в них генетических изменениях.

Таким образом, электрофорез нуклеиновых кислот может быть использован в эпидемиологической практике для расшифровки спорадических случаев и вспышек РВГЭ, анализа внутрибольничных инфекций, контроля за циркуляцией штаммов. Многоплановость информации, получаемой с помощью метода электрофоретипирования ротавирусов, позволяет рекомендовать его для более широкого применения в системе эпиднадзора за ротавирусной инфекцией.

выводы.

1. Оптимизирован метод электрофоретипирования ротавирусов человека, включающий бесфенольный способ выделения РНК из копроматериала, стандартизацию условий электрофореза, упрощенную окраску гелей серебром.

2. Охарактеризованы 54 электрофоретипа РНК ротавирусов человека. Разработана функциональная классификационная схема, отражающая многообразие генетических вариантов ротавируса человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации.

3. На основании электрофоретипирования и изучения генетических взаимоотношений ротавирусов с одинаковыми и различными электро-форетипами РНК определены семь доминирующих генетических вариантов ротавируса группы А, один из которых, характеризующийся стабильностью генома, широкой распространенностью и постоянной циркуляцией, играет ведущую роль в возникновении РВГЭ на изучаемой территории.

4. Установлена низкая частота выявления (1,3%) и неравномерная распространенность на территории европейской части нашей страны ротавирусов группы С. Впервые выявлен регион их интенсивной циркуляции (Архангельская область). Показано, что атипичные ротавирусы проявляют вариабельность генома, морфологически сходны, но не имеют генетических взаимосвязей с ротавирусами группы А, вызывают как спорадические случаи, так и вспышки острого кишечного заболевания.

5. Продемонстрирована значимость электрофоретипирования в изучении ротавирусной инфекции, основанная на возможности детекции и дифференциации ротавирусов, позволяющей использовать метод для диагностики инфекции, контроля за циркуляцией штаммов и исследования конкретных эпидемиологических ситуаций. Применение электрофореза РНК в диагностических целях позволило установить ротавирусную этиологию 29,3% случаев ОКИНЭ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Новикова H.A., Анцупова A.C., Епифанова Н.В., Альтова ЕЕ., Тамойкина H.A., Кашников А.Ю. Некоторые особенности циркуляции ротавирусов по результатам электрофоретипирования // Эпидемиология и профилактика вирусных инфекций / Свердловск.-1987. - С. 71-74.

2. Епифанова Н.В., Кашников А.Ю. Выявление ротавирусов методом электрофореза геномной РНК// Тез. докл. конф. молодых ученых. «Совр. пробл. мед. вирусологии» / Рига.-1987,-С. 17.

3. Епифанова II.В., Новикова H.A., Тамойкина H.A., Кашников А.Ю. Влияние электрофоретических условий на распределение РНК генома ротавирусов в ПААГ //' Межвуз. сб. Физиол. и мол. биол. болезнетв. микроорганизмов / ГГУ - Горький.- 1988.- С. 28-32.

4. Новикова H.A., Анцупова A.C., Епифанова Н.В., Алыова Е.Е., Троицкая М.В. Электрофоретический анализ геномной РНК ротавирусов // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1989,- № 5,- С. 45-79.

5. Епифанова Н.В., Новикова H.A., Носкова Н.В., Бессараб И.Н., Пузырев В.Ф. Метод молекулярной гибридизации в изучении ротавирусов // Межвуз. сб. Иммунология и биотехнология/ ГГУ - Горький. - 1989,- С. 64-70.

6. Анцупова A.C., Альтова Е.Е., Новикова H.A. Епифанова Н.В., Залесских А.Ф., Домбровская Л.К., Троицкая М.В. Итоги эпидемиологического надзора за ротавирусной инфекцией в крупном промышленном регионе // Тез. докл. XVII съезда Всесоюзн. общ. микробиол., эпидемиол. и паразитол. (Алма-Ата, 1989)/М., 1989.

7. Новикова H.A., Епифанова Н.В., Салимова Х.И., Ушнурцева A.B., Тамойкина H.A., Кашников А.Ю., Сергеев Н.И. Смена доминирующего электрофоретина РНК в популяциях ротавирусов человека, циркулирующих в г. Йошкар-Ола Марийской АССР// Межвуз. сб. Регуляция биол. систем / ГГУ.-Горький,- 1990,- С.22-27.

8. Епифанова Н.В., Новикова H.A. Молекулярная гибридизация РНК ротавирусов с одинаковыми и различными электрофоретипами // Межвуз. сб. Биотехнология и генетика / НГУ,- Н.Новгород. -1991,- С. 9-15.

9. Новикова H.A., Епифанова Н.В., Альтова ЕЕ., Душкин ВН., Пудова К.В., Медведев К.Л. Электрофоретипирование ротавирусов при клинико-эпидемиологическом изучении инфекции // Ж. микробиол. эпидемиол., иммунобиол- 1992. - №2 .- С. 31-34.

10. Новикова H.A., Епифанова Н.В., Фардзинова В.Ф.,Чечуева Л.И., Февралева Е.Л., Кашников А.Ю. Обнаружение атипичных ротавирусов человека и их характеристика // Ж. микробиол. эпидемиол., иммунобиол.- 1994. -№2 .-С. 103-106.

11. Новикова H.A., Епифанова Н.В., Тамойкина H.A. Способ получения двунитевой рибонуклеиновой кислоты ротавирусов // Авторское свидетельство № 1448448, приоритет от 24.02.87.

Автор выражает глубокую благодарность доктору медицинских наук Александре Степановне Анцуповой за консультативную помощь и ценные советы при написании диссертации, а также искреннюю признательность эпидемиологам, инфекционистам и вирусологам Душкину В.Н., Альтовой Е.Е., Животовскому В.М. (Н.Новгород), Закировой С.Ф. (Екатеринбург), Васильеву Б.Я. (С.-Петербург), Козловской Г.А., Таранцевой Л.П. (Липецк), Лукиной А.И. (Пермь), Боголицину Ю.Г., Чечуевой Л.И. (Архангельск), Сергееву П.И., Салимовой Х.И., Ушнурцевой A.B. (Йошкар-Ола), Першеву В В., Георгиевой В.П. (Чебоксары), предоставившим клинический материал от больных с острой кишечной инфекцией неясной этиологии для исследования методом электрофоретигшрования.