Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Коронавирусная инфекция обезьян

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гончарук, Елена Ивановна

Введение

Глава 1. Коронавирусная инфекция человека и обезьян 5 (обзор литературы).

Плава 2. Материалы и методы.

1. Материалы.

1.2. Методы.

Глава 3. Спонтанная коронавирусная инфекция обезьян.

3.1. Инфицированноеть обезьян по данным постмортального 22 ^следования.

3.2. Результаты параллельного вирусо-патоморфологического 25 ^следования.

3.3. Коронавирусная инфекция макак и павианов (данные 31 фижизненного обследования). лава 4. Характеристика свойств изолятов коронавируса, обна- 44 зуживаемых у обезьян.

И.Морфологическая характеристика вирионов.

-.2.Некоторые физико-химические характеристики коронавирусов.

2.1 .Концентрирование и фракционирование вирионов с целью 46 >пределения плавучей плотности.

-.2.2.Полипептидный состав вирионов.

-.3•Биологические свойс тва.

-.3.1.Чувствительность клеточных линий к изучаемым изолятам.

-.3.2. Патогенность коронавируса обезьян для новорожденных 5Ь ^елых мышей и других лабораторных животных.

-.3.3. Гемагглютинирующие свойства изолятов.

3.4. Антигенные взаимоотношения штаммов коронавируса, 61 ыделенных от обезьян, с прототипными штаммами коронавируса еловека. лава 5. Экспериментальная коронавирусная инфекция макак 67 езусов. бсуждение 73 ыводы писок литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Коронавирусная инфекция обезьян"

В проблеме инфекционной патологии человека вирусные инфекции занимают ведущее место, что определяет постоянный интерес к ним не только органов здравоохранения, но и представителей различных отраслей 1ауки. Без комплексного изучения этой проблемы вряд ли можно рассчитывать на быстрое решение вопросов профилактики и борьбы с вирусными шфекциями, которые причиняют вред не только здоровью человека, но и ганосят порой огромный экономический ущерб. Достаточно привести приме-зы распространенности вирусных инфекций верхних дыхательных путей ;грипп и большая группа других вирусов), но не менее серьезной проблемой являются желудочно-кишечные заболевания, причиной большей части ¡гаторых являются вирусы.

В последние годы возникла задача изучения ряда вирусов, ранее связываемых с возникновением заболеваний верхних дыхательных путей, но способных вызывать и кишечную патологию, К таким вирусам относятся юронавирусы, группа новых и малоизученных вирусов. Сложности в изучения представителей этого семейства связаны с трудностями культивированы их в экспериментальных условиях, что затрудняет успешное решение юпросов диагностики этой инфекции, особенно у человека. Если удалось наделить КВЧ от больных заразным насморком (штаммы ОС 43, 229Е), то гока практически безуспешными оказались попытки выделения штаммов от зольных с кишечной формой коронавирусной инфекции, остался пока открытым вопрос об антигенных взаимоотношениях КВЧ, обнаруживаемых при зазной клинической патологии человека, не создана адекватная экспериментальная модель инфекции.

Представляемая работа обобщает многолетние исследования инфициро-^анности коронавирусами обезьян, являющихся уникальными лабораторными швотными, наиболее близкими человеку. Многими исследователями убеди-?ельно показано, что по чувствительности к вирусам обезьяны почти не сличаются от человека, более того, они являются единственными живот-1ыми5 у которых вирусные инфекции протекают практически с теми же гроявлениями. В литературе нет сведений о выделении коронавируса от эбезьян, а следовательно, нет окончательного ответа на вопрос о том, шфицированы ли обезьяны каким-либо штаммом коронавируса человека либо 4 самостоятельным видом КБ обезьян. Отсюда остается открытым вопрос о возможности моделирования коронавирусной инфекции на обезьянах, а также вопросы диагностики, профилактики и лечения инфекции; отсутствие этих данных обуславливает отсутствие ответа на вопросы о резервуарах инфекции, длительности сохранения вируса в организме и т.д. Все вышеперечисленные вопросы обуславливают актуальность нашей работы. Целью исследования было изучение коронавирусной инфекции обезьян и свойств штаммов вируса, выделенных от этих животных. В задачи исследования входило:

1). Подбор и разработка вирусологических и иммунологических методов диагностики КБ инфекции.

2). Вирусологическое и серологическое обследование обезьян с ■делыо описания спонтанной коронавирусной инфекции.

3). Выделение оригинальных штаммов КВ от обезьян с последующей разносторонней их характеристикой (морфологические, физико-шмические, биологические свойства, антигенные отношения с 1звестными представителями семейства).

I). Воспроизведение инфекции в эксперименте на макаках резусах с *елью подтверждения этиологической роли и патогенности изучаемых вирусных агентов для обезьян, а также исследование возможности [спользования экспериментальной инфекции в качестве модели для сзучения КВ инфекции человека.

ПАВА 1. КОРОНАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ЧЕЛОВЕКА И ОБЕЗЬЯН (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ).

Желудочно-кишечные заболевания, как и заболевания дыхательных путей, представляют собой значительную проблему здравоохранения. Клинические симптомы гастроэнтерита развиваются при многих известных болезнях - дизентерии, холере, сальмонеллезе. Они могут быть вызваны эшерихиями, протеем, клебсиелами, иерсиниями, гафниями и другими микроорганизмами. В экономически развитых странах по числу случаев на первом месте стоят респираторные заболевания, а на втором - заболевания острым гастроэнтеритом, которые также являются одной из наиболее частых причин детской смертности.

Большое число случаев пневмоний, а также кишечных расстройств (до 80$) остаются этиологически нерасшифрованными /9/, хотя существуют эпидемиологические данные, свидетельствующие об их инфекционной природе. Большая часть этих заболеваний не поддается лечению с помощью широкого спектра антибиотиков, а лабораторные исследования не позволяют установить их этиологическую связь с известными бактериальными агентами.

Было выдвинуто обоснованное предположение о вирусной природе этих заболеваний и начаты поиски вирусов-возбудителей. Что касается гастроэнтеритов, проводились широкие исследования, касающиеся участия з заболеваниях вирусов, Установлена этиологическая роль ротавирусов в шшечных заболеваниях новорожденных /у/. Были проведены также многочисленные попытки выяснить участие в заболеваниях представителей )бширной группы энтеровирусов ECHO и Коксаки. Достаточно часто обна-зуживали энтеровируеы в фекалиях больных с симптомами гастроэнтерита, [то послужило основанием к тому,что ряд вирусов ECHO и Коксаки был >тнесен к числу энтеропатогенных. Однако частое обнаружение аналогичных типов энтеровирусов у здоровых людей говорит скорее о том, что ■ти вирусы являются сопутствующими при большинстве острых желудочно-шечных заболеваний. Американскими исследователями установлена этио-:огическая роль в возникновении желудочно-кишечных заболеваний у ;етей агента Norwalk, относящегося к парвовирусам. В многолетних :сследованиях Г.А.Тимофеевой с совт. /11/ показано, что в условиях детской больницы, куда попадают дети с диареями, наиболее частыми были вирусные диареи (44%)> затем бактериальные инфекции (22%) и вирусо-бактериальные инфекции (15%). У больных обнаруживались разнообразные вирусы - адено (8,5%), ECHO (8,5%), полио (5%, Коксаки (1%) и нетипируемые вирусы (34%). Обращает на себя внимание тот факт, что в высоком проценте случаев ассоциированные с заболеванием вирусные агенты не были идентифицированы. В настоящем обзоре мы попытались осветить место и роль коронавирусов в кишечной и респираторной патологии человека и обезьян.

Анализ состояния проблемы изучения коронавирусов и коронавирус-ной инфекции в современной научной литературе свидетельствует о все увеличивающемся интересе исследователей к этой проблеме. Основываясь на материалах сборников "Current contents", издаваемых институтом заучной информации Юджина Гарфилда, СМ, можно подсчитать, что работы, относящиеся к изучению коронавирусов, появляются с частотой 1-3 в чеделю. Итак, род Coronavirus - единственный в семействе Coronaviri-iae - включает в себя вирусы, поражающие млекопитающих и птиц. Это вирусы среднего размера (60-220 нм), округлые или полиморфные, несуще на поверхности булавовидные выступы размером около 20 mi, форми-зующие типичную картину, напоминающую солнечную корону /40, 47/. систематика этого семейства еще окончательно не сложилась, число его [ленов постоянно увеличивается и составляет в настоящее время 13 [редставителей, не считая неклассифицированные изоляты / 59, 65? 71/. Иоронавирусы широко распространены среди животных разных видов, обла-;ают политропностью и вызывают патологию различных органов у естественных хозяев, однако преимущественно поражают респираторный и пшце-арительный тракты /19/. Члены семейства коронавирусов представлены таблице 1.1.

Известно более 20 штаммов коронавируса, изолированных от чело-ека, все они вызывают легкие респираторные заболевания. В семейство ключены только два наиболее изученных штамма коронавируса человека КВЧ) в качестве прототипных. Один из них - 229Е, выделенный Hamre и rocnow в 1966 году на диплоидной линии клеток легкого эмбриона эловека WI 38 /32/. Другой - ОС 435 изолированный Mcintosh, et al.B

Таблица 1.1. Основные антигенные группы коронавирусов животных.

КОРОНАВИРУСЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Группа 1 Группа 2

КВЧ 229Е и другие серотипы - КВЧ ОС 43 и другие серотипы коронавирус человека коронавирус человека

Т0ЕУ - вирус трансмиссивного МНУ - вирус гепатита мышей гастроэнтерита свиней SDAV -вирус сиалодакрио

ИРУ - вирус инфекционного аденита крыс перитонита кошек ВСУ - коронавирус крупного

ГЕСУ - коронавирус энтерита рогатого скота кошек HEY -вирус гемагглютинирующе

ОСУ - коронавирус собак го энцефаломиелита свиней

РИСУ - респираторный корона- вирус свиней

КОРОНАВИРУСЫ ПТИЦ

Группа 3 Группа 4

IBY -вирус инфекционного ТСУ - коронавирус синюшной бронхита кур болезни индюков

96? г. на органной культуре трахеи эмбриона человека, а затем в [ассажах на мозге новорожденных белых мышей /46/. Штаммы обладают ипичной для коронавирусов морфологией, вирионы имеют плавучую плот-:ость в хлориде цезия 1,24 г/см^, а в градиенте плотности сахарозы о

19 г/см';. Геном представлен однонитчатой РНК положительной полярости, размером от 16 до 21 килобаз. КВЧ, подобно другим представителям семейства, обладает уникальным механизмом транскрипции, при котором в клетке одновременно функционируют 7 мРНК с общими 3'концами /34» 42/. В состав вирионов входят 3 основных класса полипептидов: пепломерный (Б,* 180кД), мембранный (М, * 23 кД), нуклео-капсидный (И, % 50 кД) и несколько минорных белков.Три основных класса полипептидов ассоциированы с тремя основными антигенами, которые не дают реакций с гетерологичными штаммами в реакции перекрестного иммуноэлектрофореза /62/.

Штаммы ОС 43 и 229 Е могут реагировать между собой в реакции связывания комплемента, а сыворотка к ОС 43 реагирует со штаммом 229 Е и в реакции нейтрализации в культуре клеток /20/. В количественном отношении пропорция гетероштаммовых связывающих комплемент детерминант очень невелика и составляет 1/16 - 1/32 часть гомологичных /3/.

Штамм ОС 43 наряду с представителями коронавирусов некоторых животных обладает гемагглютинирующей активностью. В свете последних данных эту активность связывают с наличием гемагглютининэстеразного гликопротеина НЕ с молекулярной массой около 65 кД /25/.

Штамм КВЧ 229Е удалось успешно культивировать не только в диплоидной линии клеток II 38, но и в ряде других клеточных линий /61/ и лакрофагах человека /53/. В противоположность этому существуют только единичные сообщения о культивировании штамма ОС 43 в диплоидных или геревиваемых линиях клеток /61/, причем подчеркивается отсутствие ювторяемости результатов /21/. Стабильного культурального штамма ОС 1-3 не получено. Поскольку коронавирусы являются труднокультивируемы-1И, это затрудняет изучение коронавирусной инфекции и объясняет отсутствие в настоящее время коммерческих тест-систем для ее диагностики. ; зависимости от целей работы и возможностей исследователи применяют ■■азличные методы для вирусологических и серо эпидемиологических иссле-ований /13/. Это реакция связывания комплемента /6/, реакция тормо-ения гемагглютинации /7/, реакция нейтрализации в культуре клеток 35/, иммуноферментный анализ /63/, метод гибридизации нуклеиновых кислот /52/.

В последние годы сделан резкий скачок в изучении генома КВЧ. элучены кДНКовые копии геномов как ОС 43, так и 229Е и установлены нуклеотидные последовательности М, N и 3 генов и генов, кодирующих ряд мРНК /36, 37, 54, 55, 64/. Интересным представляется тот факт, что исследования на молекулярно-биологическом уровне вносят вклад и в постоянно изменяющуюся систематику этого широко исследуемого семейства вирусов /25/. Так, исследования БапсЬег et а1 /59/, проведенные с использованием моноклональных антител ,наводят на мысль о необходимости выделения штамма 229Е из 1-й антигенной группы корона-вирусов млекопитающих, прототипным представителем которой он является, в самостоятельную группу.

Неослабевающий интерес исследователей к коронавирусам человека и попытки обнаружения этих вирусов в желудочно-кишечном тракте, к которому тропны многие коронавирусы животных, привели к успеху. В 1975 году появились /22,50/ а затем нарастающим потоком пошли сообщения об обнаружении в фекалиях людей вирусных частиц с типичной для коронавирусов морфологией. Попытки культивировать эти вирусы были, за редким исключением безрезультатны, поэтому в течение многих лет единственным способом детекции вирусных агентов была электронная микроскопия - ЭМ /23, 45, 51, 66/' или иммуноэлектронная микроскопия /'38/. Однако этот метод не позволяет провести идентификацию изолированных вирусов и большинство исследователей до окончательного изуче-шя свойств называли обнаруживаемые агенты коронавирусоподобными истицами (КВПЧ). Применение ЭМ метода делает необходимым проведение шалифицированной дифференцировки наблюдаемых КВПЧ от мембранных грофилей и реснитчатых частиц, ведущих свое происхождение от эпите-шя слизистой оболочки тонкого кишечника и существует ряд исследова-[ий, посвященных этому вопросу /23, 28, 60/.

В одном из исследований /56/ удалось выделить в органной куль-'уре кишечника человека два штамма - человеческий кишечный коронави-ус (ЧКК) А 14 и ЧКК С 14 - от детей, больных некротизирующим энте-околитом и подробно их изучить. Штаммы имели типичную для коронави-усов морфологию, 8 классов полипептидов (молекулярные массы основ-ых из них 190, 50 и 23 кД). Они реагировали с сыворотками реконва-есцентов в реациях простого радиального гемолиза, иммуноблотинге, ммуноферментном анализе, однако не выявлено перекрестных реакций с использованными прототипными штаммами коронавируса человека и животных, а также вирусами группы Breda и Berne. Авторы предлагают считать эти штаммы прототипными представителями кишечного КВ человека, )днако официально штаммы пока в семейство не включены. Касаясь здесь годробнее вопроса об антигенных взаимоотношениях КВПЧ, выявляемых гри некротизирующем энтероколите, с прототипными штаммами КВЧ, надо >тметить, что в работе других групп исследователей выявлено нарастете антител к штамму КВЧ ОС 43 (или антигенно родственных ему МНУ и Ш) в сыворотках детей-реконвалесцентов /30, 31 , 43/.

Следует отметить, что ряд вирусных агентов, описанных только [а основании их характерной морфологии как коронавирусподобные, при дальнейшем изучении оказались не относящимися к роду Coronavirus .Это гроизошло с КВПЧ, обнаруженными у австралийских аборигенов /60/, у ;етей и взрослых с острым гастроэнтеритом /"17, 18/, а также вирусами 'руппы Breda, выделенными от коров и Berne, выделенными от лошадей "72 /. Углубленное изучение полипептидного состава, плавучей плотнос-и вирионов, антигенных характеристик показали отсутствие родства с редставителями семейства коронавирусов и позволили считать штаммы, ыделенные в трех последних случаях, кандидатами в члены семейства 'oroviridae.

В состоянии активного изучения находится проблема исследования озможной этиологической роли КВПЧ, обнаруживаемых в фекалиях, в ишечной патологии человека. Сообщения об обнаружении коронавирусов в екалиях лиц без клинических проявлений заболеваний вносят дополните-ъную сложность в определение каузальной роли этих вирусов /27, 48, 9, 66, 67/. Тем не менее в работах ряда авторов /"26, 56, 57, 69, О/ убедительно показано, что коронавирусы являются причиной тяжелого екротизирующего энтероколита новорожденных в родильных домах. Симп-омами заболевания являлись непереносимость пищи, вздутие живота, крытая кровь в стуле, рентгенологически определяемый пневматоз кише-ника. В ряде случаев заболевание оканчивалось фатальным исходом, ^следование медицинского персонала родильных домов, непосредственно онтактировавшего с новорожденными, а также матерей выявило инфициро-анность их КВПЧ /26/, не сопровождавшуюся, однако, клиническими появлениями. Связь КВПЧ с кишечными заболеваниями установлена и для детей раннего возраста - до 3 лет - помещенных в больницы Тускона, итат Аризона /51/. Наиболее частым симптомом болезни была диарея [94% пациентов), реже рвота и лихорадка {Ь3% и Ь'\% больных сответст-зенно). Сезонное распределение ассоциированных с КВПЧ энтеритов было жодным с таковым для ротавирусных энтеритов - максимум случаев 1аблюдался во время дождливого сезона осенью и в начале зимы. Зависимость частоты ассоциированных с КВПЧ диарей от климатологических факторов - влажного или сухого сезона выявлена и в Габоне, Африка '67/.

В целом имеющиеся данные наводят на мысль, что острое, манифес-?ное течение инфекции наблюдается либо у новорожденных с их еще не зполне сформированной иммунной системой, либо у больных со вторично )слабленным иммунным ответом. Так, в последние годы появились сообще-шя о кишечных заболеваниях, ассоциированных с КВПЧ, у больных СПИДом '39/. Как известно, широко применяемые в наше время химиотерапевтиче-зкие мероприятия, в частности, антибиотик©терапия, приводят к ослаб-гению иммунного статуса отдельных контингентов человеческой популяции. Учитывая этот фактор, а также более высокий уровень развития вирусологической науки, можно говорить о возросшей роли вирусных агентов, которые ранее не были известны или вызывали более узкий круг щфекций, в частности, коронавирусов, в патологии человека.

Коснемся теперь вопроса о таком лабораторном животном, как обезьяна. Обезьяны как животные - ближайшие родственники людей - предс-?авляют уникальные возможности при изучении патологии человека. Многими исследователями убедительно показано,что по чувствительности к зирусам обезьяны почти не отличаются от человека. Более того, они шляются единственными животными,у которых инфекции протекают с теми se проявлениями, что у человека /14/. Это и не удивительно, ведь эволюция вирусов шла параллельно с эволюцией хозяев, большинство зирусных агентов человек получил от общего предка и не случайно многие вирусы человека являются "двойниками" вирусов обезьян (оспа, юта, адено, гепатит А и т.д.). Сообщения о коронавирусной инфекции эбезьян также скудны, К началу нашего исследования сведения ограничивались единичными сообщениями об обнаружении нетипированных КВПЧ в ¡зекалиях обезьян, причем обычно это не сопровождалось патологией /15, Ц, 68/. Инфицированы были человекообразные обезьяны, павианы гамад-зилы, макаки. Интересно, что в некоторых работах, касающихся изучения шрусной флоры обезьян, упоминается о частом наблюдении КВПЧ в фека-шях без всякой связи с патологическими процессами /15/. В последние юды появились два сообщения, в которых сделаны попытки охарактеризовать КВПЧ, обнаруживаемые в фекалиях обезьян, в частности выявить штигенное родство с известными представителями семейства коронавиру-;ов. Так, сообщается об обнаружении КВПЧ (в сочетании с ОатруХоЬас-;ег) у мармозет с диареей и колитом /58/. Вспышки болезни наблюдали в центре по изучению мармозет в течение двух лет среди За^шиз оесарив >есИрив9 За§1аги18 ЛьзсхсоХИв врр. и СаПНпх ¿ассив, содержащихся :ак одиночно, так и в группах. Колиты гистологически характеризова-гись инфильтрацией в основном мононуклеарными клетками в интерстиции, >асширением крипт с уплощением эпителия и скоплением нейтрофилов, а •акже дегенерировавших некротизированных эпителиальных клеток в люме-се-/44/. В сыворотках инфицированных мармозет и тамаринов в тесте :ммуноблотинга выявлены антитела к коронавирусу крупного рогатого кюта. В другой работе /29/ авторы обнаружили коронавирусы в фекалиях ;вух обезьян - макаки мавра и шимпанзе, содержащихся в зоопарке, ирусы были найдены в образцах, собранных во время острой диареи у ивотных, с помощью электронной микроскопии и ИФА, с помощью послед-:его метода показано антигенное родство изолятов с коронавирусом еловека, штамм ОС 43 и коронавирусом крупного рогатого скота, отно-ящимися ко второй антигенной группе коронавирусов млекопитающих, опытки размножения изолятов КВ, обнаруженных у обезьян в культуре леток или мозге НЕМ были безуспешными. Кроме того, в отечественной итературе опубликовано подробное исследование морфологии коронавиру-ов, обнаруживаемых в фекалиях обезьян /4/.

Анализируя литературу, касающуюся изучения коронавирусов челове-а и обезьян и одноименной инфекции можно сделать следующие выводы. ). Роль КВ в патологии животных и птиц изучена лучше, чем в патоло-ии приматов (человека и обезьян); 2). В последнее десятилетие значительно увеличилось количество работ, посвященных изучению как КБ, так и их роли в патологии человека и обезьян; 3). Тем не менее в настоящее время в семействе КБ всего лишь два штамма КБ человека из более чем 20 изолятов, которые до конца не охарактеризованы. Представителя КБ обезьян в семействе нет; 4). Довольно значительное количество работ посвящено роли КБ в патологии респираторного тракта человека, в отечественной литературе имеется обобщающая монография; 5)» Вопрос о роли КБ в патологии ЖКТ человека изучен недостаточно: имеются ориентировочные исследования, указывающие на этиологическую роль в развитии некротизирующего энтероколита новорожденных, однако штаммы, за одним исключением, не выделены и не включены в семейство; 6). Остается открытым вопрос о том, один и тот же штамм может вызывать поражения респираторного и ЖТ или это разные штаммы; 7). Отсутствует адекватная модель КБ инфекции человека.

Что касается коронавирусной инфекции обезьян можно констатировать, что она изучена мало.Оледует отметить ряд проблем, которые требуют своего разрешения. Нет описания коронавирусной инфекции обезьян, имеются лишь отдельные работы, указывающие на то, что КБ могут вызывать заболевания, протекающие с поражением желудочно-кишечного Практа. Особенный интерес вызывает вопрос о том, что может означать ?акое частое обнаружение КБ в фекалиях без связи с патологией. Штампы коронавируса от обезьян на выделены, свойства этих агентов не гзучены. Не выяснена окончательно их видовая принадлежность, т.е. нет жончательного ответа на вопрос о том, инфицированы ли обезьяны ка-:им-либо штаммом коронавируса человека в порядке обмена вирусной шорой или не описанным до настоящего времени самостоятельным видом видами) коронавируса обезьян - "двойником" КБ человека.

Обобщая все эти данные мы пришли к выводу о том, что изучение понтанной КБ инфекции обезьян актуально с двух точек зрения. Во-ервых, это важно для приматологии в плане характеристики обезьяны ак обьекта для медико-биологических исследований. Во-вторых, это ущественно в аспекте создания модели одноименной инфекции челове-а, учитывая как сходство вирусов-возбудителей инфекций, так и безьян и человека по чувствительности к ним. Причем модель важна в риматамя

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

В работе использованы 282 обезьяны - 104 павиана гамадрила, 148 макак разных видов (резусы, яванские, ассамские, бурые, лапун-деры), 15 зеленых мартышек, 15 гелад, мандрилов, лангуров и животных других видов. Обезьяны были представлены как резидентными (родившимися в питомнике) животными, так и особями, привезенными из мест естественного обитания. Возраст животных варьировал от нескольких дней до 21 года, в том числе было обследовано 43 детеныша до 1 года, 58 подростков (до 3,5 лет у макак и до 4 лет у павианов), 181 половозрелая особь. Среди подопытных обезьян было 130 самок и 152 самца.

В иммунологических исследованиях изучено 297 сывороток обезьян разных видов.

Вирусологическому исследованию подвергнуты 1807 материалов. Из них 498 суспензий фекалий, 212 суспензий легкого, по 45 суспензий печени, почки, сердца, 22 - головного мозга, 32 носоглоточных смыва, 908 культуральных материалов.

Использованы два прототипных штамма коронавируса человека: 1).0С43, полученный из Института вирусологии АМН СССР от проф. Т.Я.Закстельской и прошедший в нашей лаборатории 30 пассажей на половном мозге новорожденных белых мышей (НЕМ) в виде 10% суспензии половного мозга; 2).229Е, полученный из ВНИИ гриппа МЗ СССР от фоф. Т.И.Юрловой в виде культуральной жидкости зараженной диплоид-юй клеточной линии легкого эмбриона человека ЧЛ. Специфические ;ыворотки к этим штаммам получали путем иммунизации кроликов и юрских свинок.

В работе использованы перевиваемые линии клеток почки зеленой [артышки АОМК, ВЗС-1 и 4647, почки эмбриона макаки резус РРМ-4? ¡абдомиосаркомы человека КБ, диплоидной линии клеток легкого эмбри-на человека ЧЛ, суспензионные лимфобластоидные линии клеток чело-ека Ра»]1 и ЧСЛ-1, макаки МАЛ-4, павиана ПЛ-11.

Использованы новорожденные белые мыши, 492 помета (2280 живот-ых), в возрасте 1-3 дня, 30 половозрелых белых крыс, 15 морских свинок и 10 кроликов черной абхазской породы; эритроциты кур и белых крыс.

2.2. Методы.

В связи с отсутствием в литературе данных по изучению свойств штаммов коронавируса, обнаруживаемых у обезьян, в работе был использован широкий набор современных вирусологических и иммунологических методов. Применялись как стандартные методы с оценкой их пригодности для изучения коронавирусной инфекции обезьян, так и специально подобранные модификации различных методов с использованием штаммов коронавируса, выделенных от обезьян.

Вирусологические методы. Основным методом детекции изучаемых вирусов был злектронномикроскопический (ЭМ), а именно негативное контрастирование /'5/. Вначале подбирали оптимальный режим центрифугирования. Обработку нативных материалов от обезьян производили в трех вариантах: приготавливали 10$ суспензию на растворе Хэнкса или дистиллированной воде, затем осветляли ее центрифугированием при 3, 4, 5 или 6 тыс.об/мин, в течение 30 или 60 минут на центрифуге ЦДР—1 при +4°С. Часть материала оставляли для исследования, а оставшийся супернатант делили на 2 части, одну из которых обрабатывали три непрерывном встряхивании равным объемом фреона-113 (1,1*3 три-шзртрифторэтан фирмы Serva, ФРГ) в течение 15 минут и изучали злектронномикроскопически. Вторую часть подвергали ультрацентрифу-чарованию в течение 1 часа в роторе SW 28 центрифуги Beokman при OOOOOg с целью осаждения вирусных частиц на дно центрифужной пробирки, ре суспендировали в 1-2 каплях дистиллированной воды и также гсследовали в ЭМ. Исследуемые материалы наносили на сеточки с под-южкой из парлодиона, напыленные углем. Препараты контрастировали \% раствором уранилацетата. Материалы просматривали в электронных ¡икроскопах JEM 100В и JEM 100U фирмы Jeol (Япония) при ускоряющем напряжении 80кВ и инструментальном увеличении 5000-50000. При осаж-;ении вирусов на дно пробирки путем ультрацентрифугирования качество препаратов было невысоким из-за плотных массивов осажденных алластных белков. Наилучшая морфологическая сохранность и высокое ачество препаратов достигались при очистке с помощью фреона 113, однако для рутинных ЭМ исследований вполне удовлетворительным оказалось осветление суспензии при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин.

При проведении исследований по адаптации изолятов к .пиниям клеток культуры в состоянии 70-90% монослоя отмывали трижды от ростовой среды раствором Хэнкса, содержащим антибиотики (100 единиц пенициллина и 0,0001 г стрептомицина на 1 мл). Затем проводили заражение. Контакт с вируссодержащим материалом составлял 1 час при 1;0 +37°С, +35°С или +32°С, потом материал сливали и добавляли поддерживающую среду без сыворотки. Пробирки или флаконы с зараженными клетками содержали при тех же значениях I;0 и наблюдали в течение 72 часов. Затем материал подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию, тестировали на наличие вирусных частиц и использовали для исследования или дальнейшего пассирования. В ряде опытов испытывали действие полианиона ДЕАЕ-декстрана на размножение коронавируса в культуре клеток. Во время заражения к вируссодержащему материалу добавляли равный обьем ДЕАЕ-декстрана (конечная концентрация 30 мкг/мл). В этом случае время контакта составляло 30 минут, Ь°+37°С, затем виру с содержащую жидкость с даАЕ-декстраном удаляли и добавляли бессывороточную поддерживающую среду.

Заражение лимфобластоидных суспензионных линий клеток производили в дозе 5~25 млн. вирусных частиц на 1 миллион клеток. Культуры содержали при +37°С.Пассажи проводили на 5-7 день, на уровне 5 гассажа было проведено ЭМ исследование.

Заражение животных. Новорожденные белые мыши. Заражение осуще-;твляли путем внутримозгового введения 1-3 дневным животным 10 мкл ¡ируссодержащего материала, тщательно проверенного на стерильность, ¡ля пассажей использовали 10% суспензии головного мозга зараженных ышей на растворе Хэнкса. НБМ забивали на высоте развития симптомов нцефалита, а при слепых пассажах - через 5 суток. Обезьяны. Для оспроизведения коронавирусной инфекции обезьянам двукратно вводили ируссодержащий материал в виде очищенной 10% суспензии фекалий омбинированным способом - 2 мл орально и 1 мл внутривенно. Актива-ия персистентной инфекции была проведена с помощью внутривенного вукратного введения циклофосфана с интервалом 2 дня из расчета 50 мг i 100 мг на 1 кг массы животного /1/. Умерщвление животных проводили з помощью внутривенного введения нембутала в дозе 10 мг на каждый кг даосы обезьяны.

Реакцию гемагглютинации (РТА) применяли в двух вариантах. îo-первых, использовали стандартную постановку реакции с 0,5% эритроцитами кур и белых крыс /13/. Кроме того, использовали метод шдикации коронавируса в фекалиях с помощью РГА, описанный Woode et il /73/. В лунки панели раскапывали двукратные разведения '\0% сус-гензий фекалий. Затем добавляли эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота, обработанную крысиными эритроцитами до исчезновения эффекта спонтанной агглютинации (если он наблюдался) и разведенную ■':40. На следующем этапе добавляли '\% суспензию эритроцитов крыс с ),1% BSA. Инкубировали при +20°С в течение 1,5 часов и учитывали результаты.

Очистка и концентрация вирусов. Осветленную вируссодержащую суспензию делили на две части. Одну часть концентрировали через 30% раствор сахарозы на подушку 60% сахарозы, другую на подушку хлорисо г:ого цезия (1,12 г/см° - 1,36 г/см°). Центрифугирование проводили в роторе SW 28 центрифуги Beckman при 100000g в течение 1,5-2 часов. Зпалесцирующие зоны отбирали и разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:5. Полученные материалы тестировали в ЭМ на присутствие КВ и их морфологическую сохранность. Вируссодержащие зоны, юлученные после концентрации на подушке сахарозы или хлористого дезия подвергали 2-х кратной очистке в линейных градиентах плотности соответствующих растворов при 100000g. Полученные градиенты ^акционировали по 1 мл, определяли коэффициент рефракции и плаву-•1ую плотность каждой фракции. Соотношение количества белка и нукле-'шовых кислот устанавливали по светопоглощению при длинах волн 260 -1 280 А. Присутствие КВ во фракциях определяли с помощью ЭМ.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ ). Аналитический рск-электрофорез проводили в пластинках ПААГ 100x150x0,75 мм в руферной системе Лэммли /41/. В разделяющем геле использована градиентная концентрация 7,5-20% акриламида и постоянная 0,5% метилен-5исакриламида. Разделяющий гель содержал 0,375 мМ трис-Н01 рН 8,8 и

0,1$ додецилсульфата натрия. Концентрирующий гель содержал 140 мМ трис-НС1 рН 6,8 и 0,1$ додецисульфата натрия. Электродный буфер состоял из 200мМ трис-глицината рН 8,4 и 0,1$ додецилсульфата натрия, Лизирующий буфер содержал 125мМ трис-Н01, рН 6,8, 5М мочевины, 10$ 2-меркаптовтанола, 20$ глицерина, 4$ додецилсульфата натрия и 0,0002$ бромфенолового синего. Перед нанесением на гель к вируссо-держащим образцам добавляли равный обьем лизирующего буфера и инкубировали в течение 5 минут при 100°С. Электрофорез проводили при постоянном токе. Для определения молекулярных масс полипептидов в соседние треки вносили белки-маркеры с известными молекулярными массами. Гели окрашивали Кумасси ярко-голубым 11-250. Гель двукратно этмывали в водном растворе, содержащем 10$ этанола и 10$ ледяной уксусной кислоты. Затем окрашивали раствором, содержащим 0,05 кра-зителя, 50$ этанола, 4$ ледяной уксусной кислоты, отмывали гель вновь в растворе,состоящем из 10$ этанола и 10$ ледяной уксусной шслоты в воде.

Иммунологические методы. В наших исследованиях был использован ряд шмунологических методов. Для выявления антител применяли реакцию звязывания комплемента - РОК /6/ и реакцию торможения гемагглютина-щи - РТГА /10/ в стандартной постановке. Использовали также имму-гоэлектронную микроскопию, которую ставили по методике, описанной в '8/.Ориентировочным титром сыворотки считали ее разведение, которое вызывало агглютинацию примерно 50$ вирионов /26/.

Для детекции антител в сыворотках нами была также налажена >еакция непрямой гемагглютинации - РИГА. Использована постановка »еакции, применяемая для определения антител к вирусу гриппа в годификации, налаженной во ВНИИ гриппа МЗ СССР. Однако для определения коронавирусной инфекции реакция была впервые разработана нами использованием специально приготовленных компонентов - антигена и нтисыворотки. РНГА ставили с помощью микротитратора Такачи. Соеди-ение коронавирусных частиц с формалинизированными бараньими эрит-оцитами производили с помощью посредника - би-диазотированного ензидина (ВДВ). Для этого 0,23 г порошкообразного бензидина производства Венгрии) растворяли в 45 мл С)925И ИаС1 на магнитной мешалке при постоянном охлаждении. Отдельно в пробирке с 5 мл охлажденной до 0-1 °С дистиллированной воды растворяли 0/175 г азотистого натрия. Раствор по каплям добавляли к смеси бензидина с соляной кислотой. Таким образом получали концентрированный маточный раствор, который затем аликвотировали по 2-5 мл и замораживали. Перед употреблением готовили рабочее разведение ВДВ на фосфатном буфере (1:15). Затем отрабатывали дозу БДБ. Для этого брали по 0,5 мл двукратных разведений вируса, добавляли 0,1 мл 50$ формалинизированных бараньих эритроцитов и инкубировали 15 минут при комнатной температуре при постоянном встряхивании. Затем в пробирки приливали ряд доз ВДВ (например, 0,5 мл, 1,1 мл, 1,7 мл и т.д.) и инкубировали при встряхивании в течение 30 минут при 37°С. Затем нагруженные вирусом эритроциты трижды отмывали и доводили обьем в каждой пробирке до 5 \лл. Стандартные сыворотки к коронавирусам человека и обезьян титровали на 1% нормальной кроличьей инактивированной сыворотке, из которой Зыли предварительно сорбированы неспецифические антигемагглютинины к 5араньим эритроцитам. Реакцию учитывали через 1 час контакта (после зсаждения эритроцитов в контроле). После учета результатов титрования з пробными препаратами проводили дальнейшее уточнение дозы БДБ, беря Золее дробные дозы (в нашем примере 0,5 мл, 0,7 мл, 0,9 мл, 1,1 мл и зр.) После подбора оптимальной дозы ВДВ приготавливали необходимый эбьем диагностикума, который хранили при +4°С либо подвергали лиофи-аьной сушке.

Использовали также метод непрямого иммуноферментного анализа -Ш /12/. Лунки сенсибилизировали антигеном, затем наносили исследуемые сыворотки, после чего добавляли антивидовую сыворотку против иммуноглобулинов человека или кролика, в зависимости от вида живот-юго (обезьяна или кролик), от которого получена испытуемая сыво-ютка. Антивидовая сыворотка была коньюгирована с пероксидазой и гроизведена в Ленинградском НИИ вакцин и сывороток. После добавлены субстрата ортофенилендиамина реакцию учитывали на спектрофото-1етре "Унискан" фирмы Plow при длине волны 492 нм. Результаты оце-гивали как положительные, если отношение среднего значения оптичес-:ой плотности опытного образца к отрицательному контролю превышало

21

5 I ■

Иммунизация морских свинок и кроликов абхазской породы. Очищений и сконцентрированный посредством молекулярно- биологических пособов материал подвергали диализу против 0,001М трис-буфера и водили животным. Количество вирусного белка в 1 мл составляло -7,5 мг. Как наилучшая была отобрана схема иммунизации, описанная /16/. Она заключалась в трехкратном введении вируса с применением олного, а затем неполного адьюванта Фрейнда через 1 и 4 недели соответственно. Вирусный материал вводили в бедро (внутримышечно) и о множественные точки вдоль позвоночника (подкожно), а кроликам и подушечки лап. Сыворотку получали на 21, 28, 35 день после имму-изации, а также после реиммунизации, затем готовили пул.

ГЛАВА 3.СПОНТАННАЯ КОРОНАВИРУСНАЯ ИНФЕКЦИЯ ОБЕЗЬЯН.

3.1. Инфицированность обезьян коронавирусами по данным постмортального исследования.

В задачи данного раздела входило вирусологическое исследование органов обезьян, погибших от различных причин. Интересным представлялось также определение сравнительной инфицированности животных разных видов. Нами был использован метод ЭМ, с помощью которого было исследовано 595 материалов от 212 обезьян. Животные распределялись по видам следующим образом: 99 павианов гамадрилов, 83 макаки, в том числе 42 резуса, 19 лапундеров, 14 яванских, 7 бурых, 1 ассамская; 15 зеленых мартышек и 15 обезьян других видов: лангуры, гелады, мандрилы, красная обезьяна (патас). Исследованию подвергали содержимое кишечника, поджелудочную железу, легкие. Как представлено на рис. 3.1.1» коронавирусы были обнаружены у "104 из 212 обследованных животных, что составило 49,1%. Павианы гамадрилы были инфицированы с частотой 51 из 99 животных (51,5$), макаки - 43 из 83 (51,3$). Что касается других видов обезьян, КВ выявлены у 6 из 15 зеленых мартышек и у 4 из 15 обезьян других видов. Чаще всего КВ обнаруживали в кишечнике - 47%» затем в поджелудочной железе (25,5%) и в легких (20,8%). В 41% случаев (43 из 104 положительных на наличие вируса животных) вирусы выявляли одновременно в фекалиях и поджелудочной железе, в 45% (49 из 104 обезьян) - одновременно в фекалиях и легких, в 27% случаев(28 из 104 животных) - во всех трех исследуемых материалах. Данные результаты свидетельствуют о том, это примерно у половины инфицированных животных КВ обнаруживали в 2-3 органах одновременно.

Распределение обследованных обезьян по возрасту было следующим: 139 из них являлись половозрелыми животными, 38 - подростками а 35 - детенышами. В наших исследованиях не обнаружено различий в шфицированности разных возрастных групп. Однако была установлена звязь частоты обнаружения КВ и сезона, в котором погибали обезьяны. Гак, отмечалось небольшое увеличение числа инфицированных животных все виды

15 15 ь ^ павианы гамадрилы макаки зеленые мартышки прочие виды

- число обследованных обезьян.

- число обезьян, у которых обнаружены КВ.

Рис. 3.1.1. Частота обнаружения коронавирусов у погибших обезьян разных видов. осенне-зимний период (период дождей - с ноября по март) по срав [ению с весенне-летним периодом (53% против 41% соответственно), 'ти различия, однако, оказались статистически недостоверными. Не ыявлены также различия в зависимости от пола обезьян, а также ¡ежду погибшими резидентами и вновь прибывшими животными.

Распространенность коронавирусов в организме обезьян. Резуль-аты, полученные при изучении инфицированиести различных видов изших обезьян свидетельствовали о том, что у погибших животных КВ бнаруживаются как в пищеварительном, так и в респираторном траках. Однако известно, что многие представители семейства Согопау!idae обладают более широкой тропностью к органам хозяина. Нам 1редставилась возможность более подробно исследовать органы у группа из 45 обезьян с целью выяснения распространенности КВ в организ-ie и выяснения органа-мишени. Результаты исследования представлены ïa рис. 3.1.2. Животные были представлены половозрелыми павианами ^мадрилами и макаками, как самками, так и самцами. Как изображена на рисунке, от каждой обезьяны (45 особей) исследовано по 7 органов, а у 22 животных также и головной мозг. Всего с помощью ЭМ изучено 327 образцов. По частоте обнаружения КВ органы распределятонкии толстый поджелу- легкие сердце печень почки головной кишечник дочная мозг железа

Ц - число обследованных органов |Щ - число органов,в которых обнаружены КВ. Рис. 3.1.2. Частота обнаружения КВ в различных органах обезьян. ись следующим образом: тонкий кишечник - 47%» толстый кишечник -9%, поджелудочная железа - 20%, легкие - 9,8%, сердце - 7,3%,печень, очки, головной мозг - 2,5%'

Таким образом, проведенными исследованиями была установлена высо-ая инфицированность обезьян разного вида, возраста, пола, как одившихся в Сухумском питомнике, так и импортированных из разных лест. Чаще всего вирусы обнаруживали в кишечнике, поджелудочной келезе, легких и реже - в других органах.

3.2. Результаты параллельного вирусо-патоморфологического исследования.

Сопоставление результатов вирусологического исследования с 1атоморфологическими данными было проведено на материалах от 212 )безьян. Инфицированность этих животных по вирусологическим данным шла описана выше. Морфологические исследования были проведены в ШИЭПиТ АМН СССР, в лаборатории, руководимой д.м.н. Р.И.Крыловой, с которой нами была выполнена совместная плановая НИР.

У большинства обезьян при обнаружении КБ в кишечнике наблюдали гакроскопические изменения в различных отделах желудочно-кишечного 'ракта, которые проявлялись в виде катарального воспаления, причем :аще выявляли катаральный колит и энтерит, реже - гастроэнтерсжо-[ит. Гистологически отмечали отек, гиперемию слизистой оболочки юответствующего отдела желудочно-кишечного тракта, слущивание юверхностного эпителия и диффузную лимфоцитарную инфильтрацию !Лизистой оболочки. В толстой кишке инфильтрация захватывала и щслизистый слой (рис. 3-2.1.) В тонкой кишке характерным было юявление на вершинах ворсинок групп макрофагов с признаками фагоцитоза (рис.3.2.2.)

Клинически у большинства животных наблюдалась диарея. У павиа-:ов гамадрилов в ряде случаев она носила затяжной характер и не оддавалась антибиотикотерапии, причем клиническая картина сопрово-далась резким истощением животных с явлениями анемии. Все эти :авианы имели комплекс изменений,сходный с синдромом приобретенного ммунодефицита обезьян.

У 20,5$ обезьян при наличии КВ в кишечнике изменения были бнаружены только при гистологическом исследовании и носили харак-ер своеобразной иммунологической реакции. Как правило, не обнару-ивали изменений в лимфатическом аппарате кишечника, в лимфоидных олликулах. Отмечалась диффузная инфильтрация лейкоцитами слизистой болочки, особенно ее мышечной пластинки и реже подслизистого слоя

Рис. 3.2.1. Колит. Лимфоцитарная инфильтрация слизистой и подслизистого слоя. Гибель поверхностного эпителия. Окраска гематоксилином и эозином. х180. Здесь и далее препарат Р.И.Крыловой.

Рис. 3.2.2. Энтерит. Макрофагальная реакция на вершинах ворсинок. Окраска гематоксилином и эозином. хЗОО.

5 желудке, тонкой и толстой кишках (рис.3.2.3.) Инфильтрация могла )граничиваться одним каким-либо отделом желудочно-кишечного тракта [ли распространяться на все его отделы. Клинической симптоматики в :аких случаях не наблюдалось.

Рис. 3.2.3. Толстый кишечник. Инфильтрация лимфоцитами слизистой оболочки и подслизистого слоя. Окраска гематоксилином и эозином.х250.

При наличии КВ в легких макроскопически у 45% обезьян опреде ялись очаги уплотнений чаще небольшого размера по типу бронхопнев-онии, преимущественно в прикорневых отделах. Изредка обнаруживать лобарная пневмония с признаками карнификации. Гистологической собенностью бронхопневмонии при коронавирусной инфекции был сероз-о-макрофагальный характер экссудата с наличием гигантских клеток с иперхромными, часто лопастными ядрами или многоядерных типа гиган-ских клеток инородных тел (рис.3.2.4.)• Наблюдалась умеренная лимфо-истиоцитарная инфильтрация перегородок и периваскулярных прост-анств. У части обезьян пневмония носила преимущественно'интерстициа м• ' чтгЧ Г * г-.—л у« У ^.¿жУ*. •' - V ^ : , • • '•V ; > , у -Л .лиг* < Л-'А' • * - • - • - '

Рис.3*2.4. Серозно-десквамативная пневмония с большим количеством гигантских гиперхромных ядер и лимфоцит арными периваокулярными инфильтратами.Окраска Г+Э, х80. уГ^ ч Ч ^' * 4 Тли*»:» » 1

Рис.3.2.5. Карнифицирующая пневмония с гигантскими клетками типа клеток инородных тел и массивной лимфоцитарной инфильтрацией перегородок. Окраска Г+Э, х180. ъный характер о появлением крупных клеток с гиперхромными фрагмента ованными ядрами, выступающими в просветы альвеол. В случае лобарной невмонии с карнификацией наблюдались крупные макрофагальные элементы . гигантские многоядерные клетки в организующемся экссудате рис.3.2.5.) Межальвеолярные перегородки были утолщены и инфильтриро-■аны лимфоцитами. У 12% обезьян экссудат имел гнойный характер, типи-:ный для бактериальных инфекций. У некоторых из этих животных при :актериологическом исследовании была обнаружена патогенная микрофлора Bordetella bronchiseptica и др.)

У 40% обезьян изменения в легких выявляли только при гистоло-'ическом исследовании: наблюдалось заметное утолщение межальвеоляр-ых перегородок, умеренная их гиперемия, инфильтрация их лимфоци-■ами, а также наличие крупных гиперхромных образований, имеющих вид ■родливых ядер, дающих резко положительную реакцию на ДНК. В препа->атах указанных животных встречались непостоянно гигантские клетки ! крупными фрагментированными ядрами, выступающими в просвет альвеол.

У нескольких обезьян при наличии коронавирусов в легких не было ¡ыявлено никаких изменений. При этом обезьяны погибали от тяжелых ¡аболеваний, протекающих на фоне анергии - травматического сепсиса, •емобластоза, амилоидоза. Наличие КВ в легких в таких случаях, по-дедимому, было следствием терминальной генерализации агента в преда-■ональном и атональном периодах.

При обнаружении КВ в поджелудочной железе у 74% обезьян выяв-[ены изменения, отличающиеся разнообразием. Чаще всего наблюдали [анкреонекроз (рис.3.2.6.)

У павианов гамадрилов встречался амилоидоз экзокринной части юджелудочной железы, у макак резусов - поражение островков Ланге-хганса. У части обезьян (7,5%) наблюдался липоматоз поджелудочной <елезы. С такой же частотой (7,5%) обнаруживались воспалительные [зменения, носящие у половины животных характер острого панкреатина, у другой половины - хронического воспаления. При остром панкреатите отмечался отек, пропитывание фибрином междольковой ткани и шфильтрация лимфоцитами и сегментоядерными лейкоцитами. В случае

Рис.3.2.6. Панкреонекроз. Окраска Г+Э, х120. фонического воспаления наблюдалась умеренная диффузная инфильтрация лимфоцитами как междольковой ткани, так и внутри долек.

В качестве отрицательного контроля была обследована патомор-ьШогически группа, состоящая из 108 обезьян, в органах которых гри ЭМ исследовании не выявили КВ. Изменения, которые мы считаем :арактерными для коронавирусной инфекции, наблюдали в 18 случаях .16%) - в 14 кишечниках и 4 легких и носили в основном умеренный ".арактер. Анализируя эти результаты мы пришли к выводу, что отсутствие обнаружения КБ в этих случаях, возможно, связано с недоста-'очной чувствительностью ЭМ метода. С целью проверки этого предпо-южения было проведено повторное исследование этих органов с поморью более чувствительного метода - ИЭМ, которое в 5 из 18 случаев ;ало положительный результат - были обнаружены КВ.

Таким образом, инфицирование обезьян КВ сопровождается разви-ием выраженных морфологических изменений как в кишечнике, так и в егких, однотипных для всех видов обследованных животных рис.2.3.7.)

О 100

80

40 нет изменений 12 иммуноло гическая реакция

20.5 гастро энтеро колит 14.5 энтерит

14 энтеро колит

39 нет изменений 15 иммуноло гическая реакция

40 пневмония

45 нет изменений

26 панкреа тит 7.5 липоматоз 7.5 амилоидоз

22.5 некроз 36.5 жкт

Легкие

Поджелудочная железа

Рис. 3.2.7. Морфологические изменения, обнаруживаемые в органах при наличии в них коронавирусов.

3.3. Коронавирусная инфекция макак и павианов (данные прижизненного обследования).

Основанием к прижизненному вирусологическому и иммуноло-чдческому исследованиям животных явилось выявленное нами частое >бнаружение КВ у погибших в Сухумском питомнике обезьян. В задачи )аздела исследования входило установление особенностей течения ;понтанной коронавирусной инфекции: инфицированности по вирусоло-'ическим и серологическим показателям, длительности вирусовыделе-гая, клинических признаков инфекции и данных патоморфологии. С четом трудности культивирования коронавирусов вирусологическое :сследование было проведено с помощью прямой ЭМ материалов иссле-;уемых животных.

Данные вирусологического исследования. Были обследованы 2 :артии макак резусов, поступивших в питомник из Вьетнама. Материа-:ом исследования были фекалии, которые забирались у животных в различные сроки. Уже первые исследования фекалий животных позволи-и обнаружить вирусные частицы с морфологией, типичной для предс-'авителей семейства коронавирусов (подробное описание- морфологии ирионов приводится ниже в разделе 4.1.) У отдельных животных :аряду с КВ обнаруживались и другие представители вирусной флоры: икорна, парамиксо и аденовирусы. Результаты обследования первой :артии животных, состоящей из 18 макак резусов, представлены на ис.3.3.1. На протяжении 2 месяцев после поступления в питомник »безьян обследовали трехкратно. Как видно из рисунка,при первом ^следовании животных (сразу после прибытия) КВ были обнаружены в I образцах фекалий, во второй срок обследования(через 1 месяц) - в ', и в третий (спустя 2 месяца) - также в 7 образцах из 18. При »бследовании спустя 5, 8, 11, 14 и 18 месяцев у 4 из них КВ про-¡олжали обнаруживаться, что наводит на мысль о возможности длите-[ьной персистенции этих вирусов в организме обезьян.

Результаты обследования второй партии животных из 16 макак [редставлены на рис. 3.3.2. При первичном обследовании, произво-(ившемся сразу по поступлении, КВ были выявлены у 5 животных, [ерез месяц - у 10 и спустя 2 месяца - у 13 из 16 обезьян. К 0-му месяцу наблюдения число инфицированных животных сократилось \о одной обезьяны, которая выделяла вирус с фекалиями до 20 меся-¡¡ев включительно.

Обращает на себя внимание различие в степени инфицирования >тих двух групп животных. Первая партия обезьян перед прибытием в Сухумский питомник в течение 2 месяцев находилась в с промежуточном гункте содержания. Эта группа прибыла в питомник в стабильном состоянии и количество инфицированных животных во время наблюдения существенно не менялось. Обследование же обезьян второй группы, к-во ж обезь ян к-во * обезь ян п □ а □ а □ □ □ □ о □ □ □ а □ □ о о о о ш ■ о □ о о □

• ш □ □ о □ □ □ ш □ □ □ □ □ □ ш ■ ■ ■ % * • р 0 ■ * и V ■ в ■ А № в ■ ■ ■ * к

0 8 11 14 18 о о о а ■ в п ■ в ч а □ о □ о о □ а □ ш □ □ □ □ □ о □ □ □ в Й ■ ■ □ □ □

• ■ ■ ■ ■ □ □ □ я ■ ■ ■ ■ □ □ □ щ ■ ■ ■ ■ ■

0 1 2 5 8 11 14 18

- -коронавирусы обнаружены партия 1 дения (месяцы) партия 2 □ □ о □ а ■

20 срок наблюдения (месяцы, -коронавирусы не обнаружены

Рис.3.3.1. Экскреция КВ с фекалиями у макак резусов в динамике (группы 1 и 2). рибывших непосредственно из мест естественного обитания, выявило артину активного инфицирования животных именно во время нахожде-ия в карантине, в течение первых двух месяцев. Уже по прибытии 4 соби были инфицированы и в течение последующих месяцев наблюда-ось активное распространение инфекции. Важным представляется факт лительного (до 20 месяцев) присутствия КВ в организме животных, то может свидетельствовать о наличии у обезьян персистентной оронавирусной инфекции.

Было проведено также вирусологическое обследование обезьян ида павиан гамадрил. На рис.3.3.3. представлены результаты исс-едования фекалий 5 павианов, родившихся в питомнике, наблюдение а которыми велось в течение 2,5 лет. При первом однократном сследовании фекалий этих животных вирусы не были обнаружены, ерез 1 год животные были обследованы повторно и у двух из них ыл обнаружены КВ, выделение которых с фекалиями продолжалось на ротяжении 15 месяцев (интервал между обследованиями 3 месяца) и к-во . обезь ян □ □ □ а

-12 □ □ 0 а о о а □ □ п а □ □ □

12

15 о □ □

18 □ □ □ □

21 -коронавирусы обнаружены □ -коронавирусы не обнаружены срок наблюдения (месяцы)

Рис.3.3.3. Экскреция КВ с фекалиями у павианов гамадрилов в динамике. эпровождалось перемежающейся диареей. В последующие сроки наблю-эния (18, 21 месяц) КВ не были обнаружены.

Иммунологические данные. Исследование было проведено на мате-нале 4-х партий животных. Кроме серологического обследования лакак резусов двух партий,вирусологическое изучение инфицирован-юсти которых описано выше, исследованы сыворотки еще 23 обезьян - макак резусов, также импортированных из Вьетнама и составляющих 3 и 4 партии. Парные сыворотки животных изучали на наличие антител к штаммам КБ человека ОС 43 и 229Е. Первая сыворотка была *зята у животных сразу после прибытия в питомник, вторая - спустя ! месяца, при выходе животных из карантина. Результаты исследова-еия в РСК на наличие антител к вышеуказанным штаммам представлены 5 таблице 3.3.1. Как видно из таблицы, 12 из 18 животных первой сартии уже при поступлении в питомник имели в сыворотках выявляете в РСК антитела к штамму 229Е человека. Количество инфицированных квотных существенно не изменялось, индекс прироста антител был несколько выше единицы. У 6 из 18 обезьян этой партии в первых сыворот-:ах и у 8 - во вторых были выявлены комплементфиксирующие (КФ) нтитела к штамму КВЧ ОС 43- Титры антител несколько увеличились в :оследний срок наблюдения.

Среди 16 животных второй партии антитела к 229Е после приво-а имели 8 обезьян, через 2 месяца - 9. Средние геометрические итры (СГТ) антител несколько упали (индекс прироста составил ,8). Динамика инфицирования животных и динамика антителообразо-ания к штамму 229Е у животных второй партии не отличались от аковых у обезьян первой партии. Однако обращает на себя внимание олее чем двукратное увеличение количества животных, инфицирован-ых КВЧ ОС 43 (с 6 до 14), что сопровождалось приростом антител с ндексом, равным 5,3.

При исследовании сывороток обезьян 3 и 4 групп в РСК с двумя таммами КВЧ получены следующие результаты. При обследовании разу после прибытия у 8 животных из 12 были выявлены антитела к ВЧ 229Е и у 7 - к КВЧ ОС 43. Через два месяца после прибытия оличество обезьян, инфицированных как первым, так и вторым штам-эм, несколько увеличилось (на 1-2 животных), несколько выросли и ГТ антител. Особый интерес представляет обследование обезьян 4 руппы. На фоне стабильного достаточно высокого уровня антител к 3 43 и количества инфицированных этим штаммом животных наблюдали

Таблица 3-3-1

Обследование макак резусов на наличие антител к штаммам КВЧ 229Е и ОС 43 в РСК.

Серологические показатели Номер партии обезьян

1 о 1— 3 4

Количество обезьян с антителами к 229 1-сразу после привоза 12/18 8/16 8/12 3/11

2- через 2 месяца 13/18 9/16 10/12 10/11

1о§0СГТ антител к 229Е 1 3,4 4,9 4,1 1,3

2 3,9 5,2 5,1 5,0

Индекс прироста антител к 229Е 1,2 1,4 2 12,8

Количество обезьян с антителами к ОС 43 1 6/18 6/16 7/12 9/11

2 8/18 14/16 9/12 10/11

1с^0СГТ анти- с. тел к ОС 43 1 1,0 1,2 2,1 11,5

2 1,5 3,6 3,1 12,8

Индекс прироста антител к ОС 43 1,5 5,3 2.0 1,5 эзкое увеличение СГТ антител к 229Е Цс^СГТ возрос с 1.3 до ,0) и числа инфицированных обезьян (с 3 до 10 животных). Сравне-ле динамики антителообразования у обезьян 4 и 2 групп наводит на эедположение о возможной параллельной циркуляции среди популяции квотных штаммов КВЧ ОС43 и 229Е (либо антигенно родственных им гаммов). Если во 2 группе наблюдается увеличение числа инфициро-шных животных и подьем уровня КФ антител к штамму ОС 43 на фоне

Таблица 3-3.2.

Обследование макак резусов на наличие антител к КВЧ ОС 43 в РТГА и КВМР 281 в РИГА.

Серологические показатели Номер партии обезьян

1 2 3 4

Количество обезьян с 1-сразу после привоза 6/18 3/16 8/12 9/11 антителами к ОС 43 2- через 2 месяца 8/18 14/16 9/12 10/11 log9CrT анти- 1- 1,0 0,7 2,7 4,8 тел к ОС 43 в РТГА 2 2,9 3,0 3,9 5,6

Индекс прироста антител к ОС 43 2 4,9 2,3 1,7

Количество обезьян с 1 6/18 8/16 9/12 11/11 антителами к КВМР 281 2 7/18 15/16 12/12 11/11 loggCrT антител к КВМР 1 8,1 8,52 6,2 7,95

281 в РНГА 2 8,75 10,7 7,9 8,2

Индекс прироста антител к КВМР 281 1,7 4,6 3,2 1,4 юкоторого даже падения титров антител к 229Е, то в 4 группе шблюдается резкое нарастание количества инфицированных особей и ТТ антител к штамму 229Е на фоне относительно стабильной картины щфицирования штаммом ОС 43.

Было проведено также изучение сывороток четырех описываемых :артий макак резусов на наличие антител в реакции непрямой гемаг-лютинации (РИГА) с выделенным нами от макаки резус оригинальным :таммом КВМР 281 (подробно данные о штамме приводятся в главе 4) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со штаммом КВЧ ОС 43. Как известно, РТГА способна улавливать антигемагглютинирующие антитела, которые хотя и не свидетельствуют о свежей инфекции, как КФ антитела, однако являются более длительно сохраняющимися. РИГА же является реакцией широкого спектра, выявляющей как свежую инфекцию, так и перенесенную ранее. Задачей данного исследования являлось выявление антител к собственному штамму коронавируса, выделенному от обезьян и сравнение" динамики антителообразования к этому штамму с таковой к штамму КБ человека. Результаты изучения сывороток животных приведены в таблице 3.3.2. Как видно из таблицы, при использовании упомянутых реакций в сыворотках животных всех партий выявлены антитела как к собственному штамму, так и к штамму ОС 43. Интересно, что как динамика инфицирования животных, так и динамика антителообразования к этим 2 штаммам коррелировали между собой, что может свидетельствовать об антигеной близости штамма, выделенного от макак, и штамма ОС 43.

Представлялось интересным также провести сравнительный анализ инфицированности по вирусологическим и серологическим показателям обезьян 1 и 2 групп. Результаты представлены на рис. 3.3. З.и 3.3.4. Как отмечалось уже ранее, в первой группе за время наблюдения количество инфицированных обезьян увеличилось на одну. Это сопровождалось незначительным увеличением числа обезьян, имеющих антитела ко всем использованным штаммам КБ и титров этих антител. На рис. 3.3.4. представлено сравнение вирусологических и серологических данных, полученных при обследовании животных 2 группы. Более чем двукратное увеличение числа выделяющих с фекалиями КБ обезьян сопровождалось резким нарастанием числа животных с антителами к собственному штамму и к штамму коронавируса человека ОС 43 и существенным увеличением титров к этим штаммам. В отношении штамма коронави руса человека 229 Е подобная закономерность отмечена не была. Данные обследования этих двух групп свидетельствуют о существовании связи между динамикой инфицирования животных по вирусологическим показателям и динамикой образования антител к итамму коронавируса, выделенному от макак, а также штамму коронаируса человека ОС 43. log2CrT антител

11

10 9 8 7 i

5 4 3 2 к КВМР 281 в РИГА к 229Е в РСК к ОС 43 в РСК -общее число обезьян | - число обезьян, выделяющих KB Число обезьян, имеющих антитела к: - штамму 229Е в РСК,

§ - штамму ОС 43 в РСК, - штамму КВМР 281 в РИГА.

Рис. 3.3.3.Результаты сравнительного изучения инфицированности макак резусов 1 группы по вирусологическим и серологическим показателям.

1о^СГТ антител

11

10 9 8 7 6 5 4 3 р с. 1

КВМР 281 в РИГА

229Е в РСК

ОС 43 РСК

Рис. 3.3.4.Результаты сравнительного изучения инфицированиести макак резусов 2 группы по вирусологическим и серологическим показателям. Условные обозначения те же, что на рис. 3.3.3.

Клинические данные. Было проведено выборочное клиническое иблюдение за 13 инфицированными макаками из 1 и 2 партий. Резу-1ьтаты показали, что из 8 животных, у которых вирусовыделение 5ыло кратковременным (до 2 месяцев) у двух наблюдались признаки

ОСС^чСЧй* I л.1 ГЬсуда»'с * • ЦбЯИфШШ \ пневмонии и у одной - диарея. Все 5 обезьян, длительно (до 9 месяцев и дольше) выделявших вирус, перенесли пневмонию. У них также наблюдалась клинически выраженная картина энтероколита с диареей, рвотой, потерей аппетита и веса. Бактериологическое обследование животных не выявило присутствия патогенной флоры в фекалиях.

Патоморфологически было обследовано 4 макаки со спонтанной коронавирусной инфекцией. Две из них погибли. У обоих животных в фекалиях обнаруживали КВ в течение соответственно 4 и 12 месяцев наблюдения. Клинически у этих обезьян во время первого месяца пребывания в питомнике наблюдалась пневмония, у одного во время наблюдения периодически обнаруживали жидкий стул. Обезьяны погибли от присоединившегося дизентерийного колита, подтвержденного 5актериологически. У обоих погибших животных при морфологическом ■доследовании обнаружено сочетание признаков дизентерийного колита я катаральных форм гастрита и энтерита с диффузной инфильтрацией зсей толщи слизистой и подслизистого слоя лимфоцитами, гибелью товерхностного эпителия и макрофагальной реакцией в ворсинках слизистой. В легких этих обезьян имелись крупные гиперхромные )бразования, имеющие вид уродливых конгломератов ядер и небольшие шмфоцитарные инфильтраты в межальвеолярных перегородках.

Две другие обезьян были умерщвлены. У одной из них КВ в зекалиях выявлялись в течение 1,5 лет без клинических признаков шевмонии или энтероколита. При гистологическом исследовании материала от этого животного наблюдали диффузную лимфоцитарную шфильтрацию глубоких отделов слизистой тонкого кишечника. У ¡торой забитой обезьяны КВ были обнаружены однократно, клиничес-:их проявлений энтероколита или пневмонии у этого животного не габлюдали. Морфологических признаков инфекции в кишечнике и лег-:их обнаружено не было.

Таким образом, нами впервые в литературе дано описание спон-!анной коронавирусной инфекции обезьян. Показано длительное выде-:ение КВ с фекалиями. Примерно у половины из 20 длительно наблю-;авшихся инфицированных макак резусов и павианов гамадрилов выявили экскрецию вируса с фекалиями в течение 5-20 месяцев, что в юлынинстве случаев сочеталось с клиническими проявлениями в виде дареи или пневмонии, а также изменениями в кишечнике и легких, юторые мы считаем характерными для коронавирусной инфекции. У ругой половины животных выделение вируса носило кратковременный арактер (до 2 месяцев) и редко сопровождалось клиническими проя-лениями.

Интересными представляются данные о независимом инфициро-ании групп обезьян различными штаммами КВЧ ОС 43 и 229Е, что ожет свидетельствовать о параллельной циркуляции среди животных тих штаммов вирусов либо антигенно родственных им. Параллельный ирусо-иммунологический анализ в группах обезьян свидетельствует том, что по мере распространения кишечной коронавирусной инфек-ии, определяемой по вирусовыделению с фекалиями, наблюдается арастание титров антител к собственному штамму КВ, выделенному г макак, а также к штамму ОС 43.

Спонтанная КВ инфекция обезьян является персистентной, ротекаюшей с поражением респираторного и/или ЖКТ, сопровождается зриодическими обострениями, во время которых наблюдаются клини-зские проявления энтероколита и/или пневмонии. Гибель животных зступает в основном от присоединившихся заболеваний, чаще бакте-дальной природы.

В ряде случаев инфекция протекает в манифестной форме и явля-гся, по-видимому, причиной гибели животных. В большинстве своем ги обезьяны имели комплекс изменений, свидетельствующий о резком шжении иммунного ответа (гемобластоз, состояние после облуче-1Я, ОСШЩ).

Близкое сходство объекта нашего исследования с человеком, а также зедварительные данные, указывающие на родство со штаммами КВЧ позво-ют в первом приближении распространить данные, полученные нами при $учении КВ инфекции обезьян, на человека. Мы считаем, что сама по >бе спонтанная инфекция обезьян является неплохой моделью одноимен-)й инфекции человека, изучение которой может внести существенный ;лад в далеко не разработанные проблемы коронавирусной инфекции.

43

Спонтанную коронавирусную инфекцию обезьян можно использовать для излучения данных, проясняющих вопросы эпидемиологии, диагностики, 1рофилактики и лечения инфекции человека.

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ ШТАММОВ КОРОНАВИРУСА,

ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ОБЕЗЬЯН.

Одной из важнейших задач нашего исследования было выяснение вопроса об этиологии и свойствах возбудителя описываемой нами инфекции. Установление высокой инфицированности обезьян разных видов вирусным агентом, морфологически описанным как коронавирус, поставил на первый план вопрос детальной характеристики свойств этого вируса. Важным представлялось прежде всего выделение оригинальных штаммов вируса от обезьян с последующей детальной характеристикой их морфологии, молекулярно-биологических и биологических свойств, а также установления антигенных взаимоотношений с известными представителями семейства коронавирусов, в первую зчередь прототипными штаммами коронавируса человека ОС 43 и 229Е. Изучение этих вопросов позволило бы установить видовую принадлежность (либо возможную самостоятельность) штаммов КВ, выделенных dt обезьян, а также ответить на вопрос о сходстве либо различии лежду штаммами КВ, выделенными от обезьян разных видов. Установление антигенного родства между штаммами КВ человека и обезьян позволило бы решить проблему отсутствующих в настоящее время диагнос-гикумов, и позволило бы в перспективе считать экспериментальную соронавирусную инфекцию обезьян подходящей моделью при изучении эдноименной инфекции человека.

Ниже представлены исследования, проведенные в рамках постав-1енной задачи, и приведшие к выделению и характеристике штаммов соронавируса макак и павианов. Изучали как свойства изолятов, гредставленных нативными вируссодержащими материалами от спонтан-го инфицированных обезьян, так и свойства штаммов коронавируса, выделенных на линиях клеток и НБМ. В каждом конкретном случае это 5удет оговорено в тексте.

4.1. Морфологическая характеристика вирионов.

Изучение морфологии вирионов ряда изолятов, полученных от >безьян (КВМР 281, КВМР 966, КВМР 20254, КВП 750, КВП 815) пока-¡ало, что они обладают совокупностью признаков, характерных для редставителей семейства коронавирусов. Вирусные частицы обладали ядом характерных особенностей, в первую очередь наличием вокруг ириона типичной "короны". Корона формировалась отходящими от ела вириона пепломерами с утолщением на дистальных концах рис.4.1.1.). Вирионы были полиморфными: округлыми, овальными, ытянутыми, грушевидными, иногда с наличием впадин в теле. Сред-ий диаметр вириона без учета структур короны составлял 150-200

Рис. 4.1.2. Морфология вирионов КВ, обнаруживаемых у обезьян А - коронавирус из гомогената фекалий макаки N 281. В - коронавирус из гомогената фекалий павиана N 750. Негативное контрастирование, уранилацетат, инструментальное увеличение 50000. нм. Примерно в равных количествах наблюдались мелкие (50-100 нм) я крупные вирионы (200-500 нм) с длинными и короткими отростками. 3 небольшом количестве встречались вирионы-гиганты (до 600 нм) и карлики (до 20 нм). Параллельно изменялись и размеры центрального гела в пределах от 15 до 150 нм и более. Довольно часто нуклеоид ювторял контуры вириона, заполняя всю внутреннюю полость либо 1асть ее. Форма нуклеоида могла быть полигональной, клиновидной, эн часто находился в тесной связи с наружной оболочкой. Часто ■еонтуры его были неразличимы. Короны вирионов также обладали юлиморфизмом, что выражалось в различной длине отростков в связи 2 разной длиной шейки. Длина пепломеров составляла от 10 до 30-45 ш. В области шейки отростки были очень тонкими (до 0,5 нм). В рстальном направлении они утолщались до 2 нм и заканчивались жруглыми булавовидными либо коническими утолщениями. Количество зтростков, приходящихся на один вирион, варьировало от 10 до 20. )тношение длины отростков к размеру головок было переменным и доставляло 1:1, 3:1, 4:1 и не зависело от штамма. Отношение длины отростков и диаметра вирионов также было переменным. Наблюдали сак крупные вирионы с небольшими отростками, так и мелкие с довольно длинными пепломерами. Однако отмечено, что частота посадки геиломеров возрастала с увеличением размера тела вириона.

4.2.Некоторые физико-химические характеристики коронавирусов.

С целью более детального исследования и типирования изолятов соронавирусов, обнаруживаемых у обезьян, представлялось целесооб-зазным провести изучение молекулярно биологических характеристик, ?аких, как плавучая плотность и полипептидный состав вирионов.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гончарук, Елена Ивановна

ВЫВОДЫ.

1.Впервые в мировой литературе охарактеризована спонтанная шфекция макак и павианов. Она является персистентной, протекает з поражением пищеварительного и/или респираторного трактов, сопровождается периодическими обострениями, во время которых заблюдаются клинические проявления энтероколита и/или пневмонии.

2. Впервые выделены штаммы коронавируса обезьян. Полученные итаммы охарактеризованы (см. таблицу) и депонированы с подтверждением их оригинальности в Государственой коллекции вирусов МЗ ЗССР 8. 10. 1990г.: штамм коронавируса макак резусов за N 2257 и итамм коронавируса павианов за N 2258.

3. Установлено антигенное родство штаммов, выделенных от збезьян, с прототипным штаммом коронавируса человека ОС 434. Показана параллельная циркуляция среди обезьян штаммов

ЖЧ ОС 43 и 229Е либо антигенно родственных им.

5. С помощью штамма вируса, выделенного от макак резусов, воспроизведена коронавирусная инфекция на макаках, которая предлагается в качестве модели для изучения нерешенных вопросов одноименной инфекции человека.

6. Выделенные штаммы использованы для диагностики коронави-русной инфекции обезьян. Проводится апробация их для диагностики эдноименной инфекции человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончарук, Елена Ивановна, Сухуми

1. Закстельская Л.Я., Шеболдов A.B., Коронавирусы человека и животных. М., Медицина, 1977, 224с.

2. U Иванов М.Т., Шевцова З.В., Сажченко Л.А. Морфология коронавирусов зазных видов обезьян Сухумского питомника // Вопр. вирусологии. -¡986. N6. - с. 5-8.

3. Королев М.Б., Электронномикроскопические методы выявления вирусов. '/ Сборник ВИНИТИ Итоги науки и техники, серия Вирусология, т.9. Электронная микроскопия вирусов и вирусных инфекций. / Под ред. М.Б.Коро-1ева. М.: Б.и. 1980. - с.114-157.

4. Методические указания по работе опорных баз Всесоюзного центра по фиппу и острым респираторным заболеваниям / Под ред. Г.И.Карпухина. -.: Б.и. 1986. с.42-46.

5. Наличие антител к коронавирусам в сыворотках людей, живущих в !ССР./ Закстельская Л.Я., Шеболдов A.B., Васильева В.Г. и др. // Вопр. ¡ирусологии 1972. - т-17- - с. 161-165.

6. Носков Ф.С. Иммуноэлектронная микроскопия. // Иммунологическая ¡иагностика вирусных инфекций./ Под ред. Т.В.Перадзе и П.Халонена. -.: Медицина. 1985. с.232-242.

7. Ротавирусный гастроэнтерит / Дроздов С.Г., Покровский В.И., Шекоян :.А. и др. // М.: Медицина. 1982. с.5-22.

8. Смородинцев A.A. Реакция торможения гемагглютинации./У Иммунологи-еская диагностика вирусных инфекций / Под ред Т.В.Перадзе и П.Халоне-а. М.: Медицина. 1985- - с.49-76.

9. Тимофеева Г.А., Цинзерлинг Ф.В. Вирусные диареи.// Острые кишечные нфекции у детей Л.: Медицина. 1983. - с. 226-256.

10. Фримель X., Хольцхайдт Г. Иммуноферментный анализ //' Иммунологичес-ие методы: Пер. с нем. / Под ред Г.Фримеля. М.: Медицина. 1987. -.162-170.

11. Фролов А.Ф., Шевченко Л.Ф., Широбоков В.П. Практическая вирусоло-'ия. Киев: Здоровья. 1989. - с.82-89.

12. Шевцова З.В., Лапин Б.А., Сравнительный аспект изучения вирусных шфекций обезьян и человека. // Вестник АМН СССР. 1987. N10 - с. '0-74.

13. Ashley C.R., Caul Е.О., Clarke S.K.R. et al. Rotavirus infection In apes. Lancet, 1978, v.2, p.477.

14. Bastardo J.W, Holmes I.H. Attachment of SA-11 rotavirus to erytro-;yte receptors. Inf. and Immun., 1980, v.29, N3, p.1134-1140.

15. Beards G.M., Hall C., Green J. et al. An enveloped virus in the stools of children and adults with gastroenteritis that resembles sreda virus in calves. Lancet, v.1, p.1050-1052.

16. Beards G.M., Brown D.W.G., Green J., Flewett T.A. Preliminary characterization of Тогоvirus-like particles of humans: comparison dth Berne virus of horses and Breda virus of calves. J of medical drology, 1986, v.20, p. 67-78.

17. Blenden D.C., Adldinger H.K. Transmission and control of viral soonoses in the laboratory. In Laboratory Safety: Principes and Prac-;ice, Washington, D.C., 1986, p.86.

18. Bradburne A.P. Antigenic relationship amongst coronavuses. Arch, resamte virusforsh., 1970, v.31, p.352-364.

19. Bruckova M., Mcintosh K., Kapikian A.Z., Channock R.M. The adapta-;ion of two human coronavirus strains (00 38 and 0C 43) to growth in •■ell monolayers. Proc. Soc. Exp. Biol., N.Y., 1970, v. 135, p. 413-435.

20. Caul E.O., Pawer W.K., Clarke S.K.R. Coronavirus paryicles in 'aeces from расient with gastroenteritis. Lancet, 1975, v.'l, p.1192.

21. Caul E.O., Ashley С R., Egglestone S.I. Recognition of human ente-lc coronaviruses by electron microscopy. Med. Lab. Sci., 1977, v. 34,259.263.

22. Caul E.O., Egglestone S.I. Coronavirus like particles present in imian faeces. Vet.Rec., 1979, v.104, N8, p. 168-169.

23. Clarke S.K.R., Caul E.O., Egglestone S.I. The human enteric coro-.aviruses Postgrad med. J., 1979, v. 55, p. 135-142.

24. Dourmashkin R. R., Davies H.A., Smith H. et al. Are Coronavirus -ike particles seen in diarrhea stools really viruses? Lancet, 1980,2, p.971-972.

25. Eichhorn W., Czerny C.-P. Enteric coronaviruses in Primates. J. et. Med., 1988, v. 35, p.709-712.

26. I jaz M.K., Brunner A. H., Sattar S.A. et al. Survival characterises of airborne human Coronavirus 229E. J. Gen. virology, 1985, v.6, p. 2743-2748.

27. Jouvenne P., Richardson C.D. Shreiber S.S et al. Sequence analysis >f the membrane protein gene of human Coronavirus 229E. Virology, 990, v. 174, p. 608-612.

28. Kamahora T., Soe L.H., Lai M.M.C. Sequence analysis of nucleocap-sid gene and leader RNA of human Coronavirus OC 43. Virus research,1989, v. 12, N1, p. 1-9.

29. Kapikian A.Z., James H.D., Kelly S.J., Vaughn A.L. Detection of

30. Coronavirus strain 692 by immune electron microscopy. Infect and Immun., 1973, v. 7, N1, p. 111-116.

31. Kern P., Muller G., Schmits H. et al. Detection of coronavirus-like particles in homosexual men with acquired immunodeficiency and related lymfadenopathy syndrome. Klin. Wochenschr., 1985, v. 63, p. d8-72.

32. Kjeldsberg E. Demonstration of 7-nm projections of human and avian 3oronaviruses. Ultrastructural pathology, 1984, v. 7, p. 201-205.

33. Laporte J., Bubelesco R., Rossi F. Une lignee cellulaire particulièrement sensible a la replication du Coronavirus enteritique bovin: Les cellules HRT-18. C. R. Acad. Sc. Paris, 1980, v. 290, p. 623-626.

34. Lushbaugh C., Humason G., Clapp N. Histology of colitis: Saguinus >edipus oedipus and other marmosets Dig. Dis Sei., 1985, New Series, r. 30, N12, p. 45S-51S.

35. Macnaughton M.R., Davies H. Human enteric coronaviruses. Arch. rirol., 1981, v. 70, N4, p. 301-313.

36. Mathan M., Mathan V.l., Swaminathan S.P. et si. Pleomorphic virus-ike particles inhuman feces. Lancet, 1975, v. 1, p. 1068-1069.

37. Mortensen M.l. Ray S. G., Payne C.M et al. Coronavirus like ■articles in human gastrointestinal disease. A.J.dis.chil., 1985, v. 39, N9, p. 928-934.

38. Myint S., Siddell S., Tyrrell D. The use of nucleic acid hybridi-■ation to detect human Coronaviruses. Arch, virol., 1989, v. 104, p. 35-337.

39. Patterson S., Macnaughton M.R. Replication of human respiratory oronavirus strain 229E in human macrophages. J gen. virol., 1982, v. 0, N2, p. 307-314.

40. Raabe T., Siddell S. Nucleotide sequence of the human Coronavirus :CV 229E mRNA4 and mRNA5 unique regions, Nucl. acid res., 1989, v. 17, '15, p. 6387.

41. Raabe T., Siddell S. Nucleotide sequence of gene, encoding the ¡embrane protein of human Coronavirus 229E. Arch virol., 1989, v. 107, . 323-328.

42. Resta S., Luby J.P., Rosenfeld C.R., Siegel J.D. Isolation and ropagation of a human enteric coronaviruses. Science, 1985, v. 229, '4717, p. 978-981.

43. Rettig P.J., Altshuler G.P. Fatal gastroenteritis associated with oronavinis-like particles. A.J.dis.chil., 1985, v. 139, N3, p. 24548.

44. Russell R.G., Brian D.A., Lennard H. et al. Coronavirus-like par-icles and Campylobacter in Marmosets with diarrhea and colitis. Dig. .is.sei., 1985, New Series, v. 30, N12, p. 72S-77S.

45. Sanchez C.M., Jimenez G., Laviada M.D. et al. Antigenic Homology mong coronaviruses related to transmissible gastroenteritis virus, irol., 1990, v. 174, p. 410-417.

46. Sohnagl R.D., Brookes S., Medvedec S., Morey P. Characteristics of .ustralian human enteric coronavirus-like particles: comparison with .uman Coronavirus 229E and duodenal brush border vesicles. Arch, viol., 1987, v. 97, p. 309-323.

47. Schmidt O.W., Cooney M.K., Kenny G.E. Plaque assay and improved leid of human coronaviruses in a human rabdomiosarcoma cell line. J. ■f clin. microbiol.,v 1979, v. 9 N6, p. 722-728.

48. Schmidt O.W., Kenny G.E. Polypeptides and functions of antigens rom human Coronavirus 229E and 00 43. Infect, and Immun., 1982, v. 5,N2, p. 515-522.

49. Schmidt O.W., Allan I.D.,Cooney M.K.et al. Rises in titers of intibody to human Coronavirus 00 43 and 229E in Seattle families du-»ing 1975-1979. Am. J epidemiol., 1986, v. 123, N5, p. 862-868.

50. Schreiber S.S., Kamahora T., Lai M.M.C. Sequence analysis of the lucleocapsid protein gene of human Coronavirus 229E. Virology, 1989, r. 1b9, p. 142-151.

51. Siddell S.G., Andersen R., Cavanagh D. et al. Coronaviridae., jitervilogy, 1983, v. 20, N4, p. 181-189.

52. JO. Vaucher Y.E., Ray S.G., Minnich L.L. et al. Pleomorphic, enveloped 7irus-like particles associated with gastrointestinal illness in neo-lates. J. Infect. Dis., 1982, v. 145, p. 27-36.

53. H . Wege H., Siddell S.G., ter Meulen N. The biology and pathogenesis Df coronaviruses. In: Current topics microbiol. immunol., Bd 99, Berlin, 1982, p. 165-200.

54. J2. Weiss M., Steck P., Horzinec M.C. Purification and partial characterisation of a new enveloped RNA virus (Berne virus). J. gen. virol., 1983, v. 64, p. 1849-1858.

55. Woode G.N., Reed D.E., Runnels P.L. et al. Identification of coronaviruses in faeces. Yet. microbiol., 1982, v. 7, p. 221-240.