Разработка и изучение эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новрожденных поросят

Махмутов, Айдар Фаритович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка и изучение эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новрожденных поросят
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка и изучение эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новрожденных поросят"

МАХМУТОВ АЙДАР ФАРИТОВИЧ

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ РОТА-, КОРОНАВИРУСНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА И ЭШЕРИХИОЗНОЙ ДИАРЕИ НОВОРОЖДЕННЫХ ПОРОСЯТ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 Фїій іиї2

Казань-2012

005009945

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности” (г. Казань)

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук

Спиридонов Г.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Филимонова М.Н. кандидат ветеринарных наук

Уїчни ТЇ А

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО «Чувашская государственная

сельскохозяйственная академия»

Защита состоится 2012 г. вз^^часов на заседании

диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ “Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности” (420075, г. Казань, Научный городок-2, ФГБУ “ФЦТРБ-ВНИВИ”)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ “ФЦТРБ-ВНИВИ” (г. Казань)

Автореферат разослан “[)£' 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного уу

совета, кандидат ветеринарных наук ' ^ в.И. Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Практика работы свиноводческих комплексов как в нашей стране, так и за её пределами показывает, что большой экономический ущерб хозяйствам наносят болезни желудочно-кишечного тракта новорожденных поросят, которые обусловлены нарушениями параметров микроклимата в помещениях, нерациональным кормлением и содержанием супоросных свиноматок, а также возбудителями различных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы (Иванов А.В., Юсупов Р.Х., 2006; Thomson J.R., 2006).

Установлено, что важную этиологическую роль в возникновении желудочно-кишечных болезней поросят играют рота-, коронавирусы и эшерихии коли (Аноятбеков М., 1997; Рахманов А.М. и соавт., 2002; Каврук Л.С., 2009; Прудников С.И., 2010; DeGregorio R.M., 1992; Dewey C. et al., 2003). При этом у поросят часто заболевание протекает в смешанной форме с явлениями дегидратации и смертельным исходом. По литературным данным и практическим наблюдениям заболеваемость поросят составляет бсшее 50%, а отход достигает 80 - 90% от числа заболевших. В настоящее время главным направлением борьбы с указанными болезнями является активная иммунизация свиноматок, с молозивом и молоком от которых специфические антитела поступают в организм новорожденных поросят и обеспечивают их защиту. С этой целью разработаны различные моновалентные и ассоциированные вакцины, которые с успехом применяются в различных регионах РФ (Федоров Ю.Н. и соавт., 1997; Гаффаров Х.З. и соавт., 1999; Байбиков Т.З. и соавт., 2002; Орлянкин Б.Г. и соавт., 2001; Алипер Т.И. и соавт., 2002; Русалиев B.C. и соавт., 2005; Сисягин П.Н. и соавт., 2005; Спиридонов Г.Н., 2010). Антитела, полученные с молозивом матери, обеспечивают защиту поросят от заболевания до тех пор, пока у них не выработаются собственные механизмы иммунитета. По различным причинам некоторые животные после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением иммуноглобулинов с молозивом матери, несвоевременным и недостаточным получением молозива или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных (Брылин А.П., 2006). В животноводческих хозяйствах, в которых нарушаются правила приема родов и скармливания материнского молозива, вакцинация маток в период беременности для профилактики желудочно-кишечных и некоторых респираторных болезней неэффективна по той причине, что новорожденные не получают специфических антител с молозивом и, находясь в состоянии иммунодефицита, остаются чувствительными к патогенному воздействию возбудителей (Сидоров М.А. и соавт., 2006; Иванов A.B. и соавт., 2011). В настоящее время биопредприятиями РФ выпускаются несколько видов гипериммунных сывороток для специфической профилактики и лечения желудочно-

кишечных заболеваний животных (Достоевский П.П., 1986; Каталог лекарственных средств для животных, Торговый дом «Биопром», 2005/2006).

Основным недостатком этих сывороток является то, что в их составе отсутствуют специфические антитела против ротавируса и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Кроме того, сыворотки, полученные на волах-продуцентах, часто ■ вызывают осложнение у поросят после её введения в виде анафилактического шока. Все это значительно снижает их лечебно-профилактическую эффективность при смешанных формах инфекционной диареи поросят. В этой связи разработка полиспецифической лечебно-профилактической гипериммунной сыворотки против основных возбудителей жепудочно-улшечных болезней поросят является весьма актуальной.

12 Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований является изучение этиологической структуры желудочно-кишечных заболеваний поросят и разработка технологии изготовления полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят на свиньях-продуцентах.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить этиологическую структуру желудочно-кишечных заболеваний новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;

2. Разработать технологию изготовления полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят на свиньях-продуцентах;

3. Изучить эффективность полиспецифической сыворотки в лабораторных и производственных условиях;

4. Разработать НТД на биопрепарат и предложить его для рассмотрения и внедрения в ветеринарную практику РФ.

13 Научная новизна работы. На основе результатов клинико-эггазоотологического мониторинга инфекционных заболеваний поросят в ряде свиноводческих комплексах Среднего Поволжья и Предуралья, бактериологических и вирусологических исследований показано преимущественное распространение и циркуляция среди поголовья свиней возбудителей ротавирусной болезни, трансмиссивного гастроэнтерита свиней и эшерихиоза, проявляющихся чаще в виде смешанной формы инфекции.

Впервые разработана рациональная схема изготовления полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят на свиньях-продуцентах.

Установлена высокая бактерицидная и иммуногснная активность полиспецифической гипериммунной сыворотки в лабораторнопроизводственных условиях.

Определена оптимальная доза и изучена лечебно-профилактическая эффективность полиспецифической сыворотки при смешанных желудочнокишечных болезнях новорожденных поросят вирусно-бактериальной этиологии.

Новизна исследований подтверждена положительным решением ФИПС

о выдаче патента РФ на изобретение по заявке №2010151702 от 15.12.2010.

1.4 Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований для внедрения в ветеринарную практику предложена «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят». Установлено, что она обладает выраженными защитными свойствами. Применение ее в стационарно неблагополучных пунктах позволяет значительно снизить заболеваемость и гибель новорожденных поросят, тем самым повышая их сохранность.

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: ежегодных научных сессиях Ученого совета Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») по итогам НИР за 2008-2011 гг.; XVII международной научно-практической конференции по свиноводству «Современные проблемы интенсификации производства свинины в странах СНГ» (Ульяновск, 2010); международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири» (Краснообск, 2010); международной научно-практической конференции молодых ученых ФГУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2010); международной научной конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество)» (Москва, 2011); всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2011); международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки, приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» (Харьков, 2011).

1.6 Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также получено положительное решение ФИПС о выдаче патента РФ «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» по заявке №2010151702 от 15.12.2010 г.

1.7 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Этиологическая структура желудочно-кишечных заболеваний новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;

2. Технология изготовления полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят;

3. Иммунобиологические показатели полиспецифической гипериммунной сыворотки: бактерицидные и превентивные свойства, содержание специфических антител, иммуногенная активность.

4. Лечебно-профилактическая эффективность полиспецифической гипериммунной сыворотки в производственных условиях.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 171 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы, состоящий из 272 источников, в том числе 124 иностранных авторов и приложение. Диссертация содержит 18 таблиц и иллюстрирована 13 рисунками.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2008-2011 г.г. в лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в соответствии с гос. заданием по НИР №01200202602.

Клинико-эпизоотологическому. обследованию было подвергнуто поголовье свиней в 23 сельскохозяйственных предприятиях, расположенных в регионах Среднего Поволжья и Предуралья, из них 18 - в Республике Татарстан, 1 - в Республике Башкортостан, 1 - в Республике Марий Эл, 2 - в Чувашской Республике, 1 - в Нижегородской области, неблагополучных по инфекционным заболеваниям новорожденных поросят. Анализ эпизоотической ситуации в неблагополучных хозяйствах проводили согласно рекомендациям, разработанными Бакуловым И.А. и соавт. (1975) и методами эпизоотологического исследования, предложенными Джупиной С.И. (1991).

Бактериологически исследовано 777 проб клинического и патологического материала, полученных от больных, павших и вынужденно убитых поросят. Объектами исследований служили паренхиматозные органы (кусочки печени, селезёнки, лёгкого, почки), участки желудка, тонкого и толстого отделов кишечника с содержимым, брыжеечные лимфатические узлы, пробы фекалий и сыворотки крови больных поросят.

Выделение и изучение биологических свойств культур E.coli проводилось в соответствии с «Методическими указаниями по бактериальной диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденными ГУВ МСХ СССР 12.01.91. и «Временными наставлениями

по применению агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий К88, К99, 987Р, F41 и А20», утверждёнными ГУВ Госагропрома СССР 21.02.1989 г. Серогрупповая принадлежность эшерихий определялась только у культур, отнесённых по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам к роду эшерихий, с использованием агглютинирующих О-колисывороток согласно наставлению по ее применению, утверждённому Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 19.05.1998 г.

Культуры Е.соП с типичными культурально-морфологическими и биологическими свойствами, продуцирующие адгезивные антигены (К88, К99,987Р) были изучены на токсикогенные свойства путем внутрнбрюшшшого заражения белых мышей.

Диагностика рота-, коронавирусного гастроэнтерита поросят проводилась с применением «Набора для выявления антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и ротавируса свиней (РВС) методом иммуноферментного анализа (ИФА)» согласно инструкции по его применению, утвержденного Россельхознадзором РФ 29.06.2006 г.

С целью приготовления полиантигена, предназначенного для гипериммунизации свиней-продуцентов, использовали следующие штаммы возбудителей: штамм «Пугачёвский-92» ротавируса свиней; штамм

«ВГНКИ-5» вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней; энтеротоксигенные штаммы E.coli'. «ПЛ-6» - синтезирующий адгезивный антиген К88, «КВ-1» - синтезирующий адгезивный антиген К99, «УК-2» -синтезирующий адгезивный антиген 987Р. ^

В экспериментах использовали: 1784 поросят, массой 1-5 кг; 7 кроликов, массой 2,0-2,5 кг; 316 белых мышей, массой 14-16 гр; 90 свиней-продуцентов, массой 110-120 кг. „ т

Опыты по получению сыворотки проводили в одном из хозяйств РТ. Свиней, предназначенных для гипериммуцизации, карантинировали и подвергали исследованию и необходимой обработке против инфекционных болезней согласно действующей инструкции о порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов. К эксплуатации допускали животных 10-месячного возраста с живой массой 110-120 кг. Гипериммунизацию животных проводили смесью рота-, коронавирусных антигенов внутримышечно в нарастающих дозах в область шеи с одной стороны, эшерихиозным антигеном внутримышечно с

другой стороны шеи.

От подопытных животных до иммунизации и перед каждым новым введением антигенов отбирали пробы крови для изучения динамики нарастания антител к вирусам и эшерихиям. Титры антител к E.coli определяли в реакции агглютинации (РА), к TJ1-, ТС-токсинам E.coli - в реакции диффузной преципитации (РДП), к рота-, коронавирусам - методом иммуноферментного анализа (ИФА). Динамику нарастания антител к коронавирусу определяли с применением «Набора реагентов для выявления

антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом «ТГС-СЕРОТЕСТ», согласно наставлению по ее применению, утвержденного Россельхознадзором РФ 21.05.2009. Производственное взятие крови осуществляли при наличии антител в сыворотке крови продуцентов к рота-, коронавирусам в титрах не менее 1:12800 в ИФА, к эшерихиям, продуцирующим адгезивные антигены К88, К99, 987Р - не менее 1:3200 в РА, к термостабильному и термолабильному анатоксину E.coli - не менее 1:4 в РДП и при условии, если общая температура тела животных не превышала 39°С. Перед взятием крови животных выдерживали на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном водопое.

Кровь у свиней-продуцентов брали в убойном цехе мясокомбината при помощи закрытой системы, исключающей контакт крови с атмосферным воздухом. Взятие крови у животных производили непосредственно из сердца. Отстой сыворотки в бутылях осуществляли в течение 48-72 часов. Сыворотку из бутылей отсасывали в стерильных условиях при помощи изогнутой стеклянной трубки длиной 45-50 см, диаметром 1 см, соединенной посредством силиконового шланга с емкостью, в которую собирали сыворотку. В емкости для сбора сыворотки создавали отрицательное давление отсасывающим компрессором. Собранную сыворотку сначала пропускали через глубинные фильтры EKS, консервировали 5%-ым раствором фенола до концентрации его в общем объеме сыворотки 0,5%. После этого сыворотку перекачивали в отстойник и выдерживали 2-2,5 месяца при 2-4 С. Затем сыворотку пропускали через мембранные миллипоровые фильтры с убывающим размером пор (от 1,2 до 0,22 мкм) и разливали в стеклянные флаконы по 100 - 200 см3, закрывали резиновыми пробками, обкатывали алюминиевыми колпачками, этикетировали.

Определение стерильности сыворотки проводили в соответствии ГОСТом 28085 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности».

Определение безвредности препарата проводили по ГОСТу 938006700008064 путем парентерального введения его белым мышам и поросятам.

Активность сыворотки проверяли на 40 белых мышах массой 15-18 г, из которых 20 животным вводили подкожно в области спины 0,5 см3 препарата, а другие 20 мышей служили контролем. Через 24 ч после введения сыворотки всех животных заражали внутрибрюшинно подтитрованной смертельной дозой культур вирусов и эшерихий.

Для определения контаминации сыворотки эшерихиями и вирусами использовали смесь сывороток из трех флаконов, объединенных в стерильных условиях по 10 см3 из каждого флакона в отдельную стерильную колбу. Сыворотку разводили физиологическим раствором в соотношении 1:10 и мерной пипеткой 0,5 см3 вносили на поверхность чашек Петри с МПА. Посев инкубировали в термостате при 37°С в течение 24-72 часов. Оставшуюся часть разведенной в соотношении 1:10 сыворотки в объеме I

см3 мерной пипеткой вносили в 5 флаконов с культурами клеток СПЭВ и ППК, выдерживали в течение 1,5-2,0 ч при 37°С, а по 5 флаконов с указанными культурами оставляли в качестве контроля. После адсорбции инокулят сливали, во флаконы с культурами клеток СПЭВ и ППК вносили поддерживающую среду и инкубировали в термостате при 37°С в течение 5-7 дней. Все флаконы периодически просматривали под микроскопом с целью обнаружения ЦПД рота-, коронавируса. Затем флаконы с культурами клеток подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию. Полученные культуральные суспензии использовали для последующих двух слепых пассажей.

Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) определяли фотоэлектрокалориметрическим методом по методике О.В. Смирновой и Г. А. Кузьминой (1966).

Содержание общего белка и белковых фракций в сыворотках крови определяли по общепринятым методам (Кондрахин И.П., 2004).

Производственное испытание экспериментальных серий полиспецифической гипериммунной сыворотки и оценку её лечебнопрофилактической эффективности проводили в 3 свиноводческих хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят, на основании сравнения фактических данных по заболеваемости до и после применения биопрепарата, i

Экономический эффект от применения полиспецифической гипериммунной сыворотки определяли совместно с профессором кафедры организации и экономики ветеринарного дела ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» А.И. Акмуллиным.

Отдельные этапы работы были выполнены с участием главного ветеринарного врача ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу» Шарифуллина А.А., с.н.с., к.б.н. Гурьянова Н.И., которым выражаю искреннюю признательность.

Выражаю глубокую благодарность профессору Макаеву Х.Н. за оказание научно-методической помощи при выполнении и оформлении данной работы.

Статистическую обработку результатов исследований проводили методом вариационной статистики с применением критериев достоверности по Стьюденту с использованием программы «Microsoft Office Excel».

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение этиологической структуры и клинико-эпизоотологических аспектов желудочно-кишечных болезней новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья

Клинико-эпизоотологическим обследованием поголовья свиней в 23-х сельскохозяйственных предприятиях, расположенных в регионах Среднего Поволжья и Предуралья, показано широкое распространение болезней

желудочно-кишечного тракта у новорожденных поросят, вызванных возбудителями вирусной и бактериальной природы. Из бактериальных агентов в 91,3% случаях выделены патогенные штаммы Esherichia coli, в 39,1% случаях - бактерии Clostridium perfringens, в 34,8% случаях - Proteus vulgaris, в 21,7% случаях - бактерии Diplococcus и в 17,4% случаях -бактерии Streptococcus. Кроме бактерий, в 47,8% случаях обнаружены ротавирусы и в 60,9% случаях - вирус трансмиссивного гастроэнтерита. Во многих хозяйствах причиной заболевания животных явилась смешанная инфекция, вызванная бактериями и вирусами. Рота-, коронавирусная инфекция у поросят часто протекала в смешанной форме с колидиареей. При этом наступала тяжёлая болезнь с явлениями дегидратации и смертельным исходом через 12 - 24 часа. При сочетанном течении трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной болезни свиней и эшерихиоза часто наблюдалось изменение клиники основного заболевания: отмечалось острое начало болезни, увеличение длительности и усиление диареи, а также нарастание частоты и длительности вирусо-бактерионосительсгва. Возникновению и распространению указанных заболеваний способствовали нарушения параметров микроклимата в помещениях, нерациональное кормление и содержание супоросных свиноматок.

Смешанные формы желудочно-кишечных заболеваний поросят, вызванные ротавирусом и эшерихиями, были установлены в 2 хозяйствах (ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу» и ООО «Маяк» РТ), коронавирусом и эшерихиями - в 4 хозяйствах (ООО «Алга», ООО «Сосна», ООО «Новая жизнь» РТ и СПК «Шимкусский» 4P). Массовые заболевания желудочнокишечного тракта новорожденных поросят, вызванных рота-, коронавирусами и эшерихиями, регистрировали в 9 хозяйствах (СХПК «Кама», СХПК «Татарстан», СХПК «Труд», ООО им. «Тимирязева» и ООО «Яна Тормыш», СХПК «Урал» РТ, ГУ СП совхоз «Рощинский» РБ, совхоз «Звениговский» РМЭ ц ОАО «Рассвет» 4P). _

3.2 Разработка полиспецифической лечебно-профилактической сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят

3.2.1 Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации свиней-продуцентов рота-, коронавирусными и эшерихиозными антигенами для получения лечебно-профилактической сыворотки

Опыты по отработке оптимальной схемы гипериммунизации проводили в условиях ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу» РТ. Свиней, предназначенных для этих целей, карантинировали и подвергали исследованию и необходимой обработке против инфекционных болезней согласно действующей инструкции о порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов. С целью отработки оптимальной схемы гипериммунизации были сформированы 2 группы свиней. При этом животных 1-ой группы иммунизировали четырехкратно с интервалом 14 дней «Набором вакцин против ТГС и ротавирусной болезни

свиней - ТР-1» (НПО «НАРВАК») и вакциной «Коли-Вак» (Армавирская биофабрика) в нарастающих дозах; животных 2-ой группы -концентрированными суспензиями рота-, коронавирусов и эшерихий коли в нарастающих дозах.

У животных 2-ой группы, иммунизированных концентрированными рота-, коронавирусными и эшерихиозными антигенами, титры специфических антител в сыворотке крови были выше, чем у животных 1-ой группы, иммунизированных вакцинными препаратами. Исходя из этого, в последующих опытах по получению гипериммунной полиспецифической сыворотки мы использовали инактивированные концентрированные антигены рота-, коронавирусов и эшерихий.

Для дальнейшей отработки схемы гипериммунизации были сформированы 3 группы свиней по 10 голов в каждой. Гипериммунизацию животных проводили согласно схемам, указанным в таблице 1. При этом смесь рота-, коронавирусных антигенов вводили внутримышечно в область шеи с одной стороны, эшерихиозный антиген внутримышечно с другой стороны шеи.

Таблица 1 - Схемы гипериммунизации свиней-продуцентов рота-, коронавирусными и эшерихиозными антигенами

Дни инъекции антигенов Схема иммунизации

1 2 3

дозы антигенов, см1 дозы антигенов, см1* дозы антигенов, cmj

вирус- ного эшери- хиоз- ного вирус- ного эшери- хиоз- ного вирус- ного эшери- хиоз- ного

1 3 4,5 4 6 6 9

14 ■й 4 6 6 9 8 12

28 6 9 8 12 10 15

42 8 12 10 15 12 18

Для гипериммунизации использовали следующие инактивированные рота-, коронавирусные антигены в культуральной среде, антигены E.coli, содержащие соматические и адгезивные антигены (К88, К99, 987Р) в физиологическом растворе, ТЛ-, ТС-анатоксины Ecoli в среде культивирования (бульон Хотгингера) при следующем соотношении их компонентов в двух различных иммуногенах (в 1 л антигена):

1. Вирусный антиген:

- антиген ротавируса свиней с содержанием специфического белка 10-12 мг/см3, см3 - 490,0 - 500,0;

- антиген коронавируса (ТГС) свиней с содержанием специфического белка 10-12 мг/см3, см3 - 490,0 - 500,0;

- формалин, см3 - 4,0 - 5,0.

2. Эшерихизный антиген:

- соматический и адгезивный антиген К88 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3-230,0-250,0;

- соматический и адгезивный антиген К99 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в

1 см3, см3-230,0-250,0;

- соматический и адгезивный антиген 987Р с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3, см3 - 230,0 - 250,0;

- формалин, см3 - 4,0 - 5,0

- ТС- и TJI-анатоксины штаммов Ecoli К88, К99 и 987Р в соотношении 1:1:1 соответственно в культуральной среде с титрами в РДП 1:8 —1:16, л — до 1.

По результатам определения специфической активности сыворотки установлено, что наиболее оптимальной является 2-ая схема гипериммунизации свиней-продуцентов, которая позволяет получить лечебно-профилактическую сыворотку с наиболее высокими титрами специфических антител: к ротавирусу -13,64 log2, коронавирусу -13,64 log2, Ecoli К88 -12,64 log* E.coli К99 -11,64 logz, Ecoli 987P -11,64 log2 и к ТЛ-, ТС-токсинам E. coli - 3,0 log2- Предлагаемые наборы антигенов в дозах, указанных во второй схеме гипериммунизации, позволяют получить высокоэффективную лечебно-профилактическую сыворотку с широким спектром действия (против рота-, коронавирусов и эшерихий коли).

С использованием разработанной схемы гипериммунизации были изготовлены 3 серии полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят.

322 Оценка безвредности, стерильности и специфической активности гипериммунной сыворотки

Контроль качества сыворотки осуществляли согласно ГОСТ Р 52683.

В результате проведенных исследований установлено, что во всех случаях испытуемая серия сыворотки была стерильна, безвредна и обладала высркой активностью.

Проводилось определение массовой доли фенола в каждой серии сыворотки. При этом установлено, что она не превышает 0,5%.

Определение контаминации сыворотки эшерихиями и вирусами проводили путем нанесения сыворотки на поверхность чашек Петри с МПА и во флаконы с культурами клеток СПЭВ и ППК. При этом установлено, что сыворотка не контаминирована эшерихиями и вирусами, так как на поверхности чашек Петри с МПА не обнаруживали характерные для E.coli колонии и в перевиваемых культурах клеток СПЭВ и ППК на третьем пассаже не выявляли ЦПД рота-, коронавирусов.

Исследованиями установлено, что после каждого этапа гипериммунизации у свиней-продуцентов происходило повышение бактерицидной активности сыворотки крови. Так, в первой группе животных от начала и до конца гипериммунизации происходило увеличение БАСК в

1,97 раза, во второй - в 2,05 раза и в третьей - в 2,19 раза, соответственно. Анализируя данные проведенных исследований можно констатировать, что

гипериммунная сыворотка обладает относительно высокой бактерицидной активностью.

В процессе гипериммунизации у свиней-продуцентов наблюдается также увеличение концентрации общего белка в сыворотке крови. При этом темпы роста анализируемого показателя во 2-ой и 3-ей группах были несколько выше, чем в 1-ой группе животных. Содержание общего белка в сыворотке крови после 4-го этапа гипериммунизации повысилось по сравнению с аналогичным показателем до иммунизации у животных 1-ой группы на 5,66 г/л, у 2-ой группы - на 5,87 г/л и у третей группы - на 5,82 г/л.

Качественное и количественное изменение иммуноглобулинового профиля сывороток крови свиней-продуцентов, подвергнутых гипериммунизации с целью создания лечебно-профилактических препаратов, служит одним из основных критериев оценки иммунобиологической реактивности организма на воздействие антигенных раздражителей. В связи с чем, мы провели изучение динамики изменения процентного соотношения иммуноглобулинов и альбуминов в сыворотках крови свиней-продуцентов по группам. Также изучили в процессе гипериммунизации изменения процентного соотношения а-, Р- и 7-глобулинов.

Установлено, что содержание глобулиновых фракций сывороток крови свиней-продуцентов повышается в ходе гипериммунизации на 1,24; 1,97; 2,25% по группам, соответственно. При этом во всех группах наблюдается увеличение доли глобулиновых фракций за счет снижения доли альбуминов. Содержание глобулинов в сыворотке крови в процессе гипериммунизации постоянно растет и к 4-му этапу оно достигает максимальных значений. При этом накопление глобулинов в сыворотке крови у животных третьей группы происходило интенсивнее.

Установлено также, что у свиней-продуцентов в процессе гипериммунизации происходит изменение в сыворотке крови процентного соотношения глобулиновых фракций. Происходит заметное повышение доли у-глобулинов при одновременном снижении доли а- и р-глобулинов. При этом концентрация р-глобулинов уменьшалась больше, чем концентрация а-глобулинов, так в первой группе в 3,22 раза, во второй в 1,54 раза и в третьей в 2,34 раза (табл. 2). Повышение уровня 7-глобулинов указывает на высокое содержание специфических иммунокомпетентных биомолекул в сыворотке крови свиней-продуцентов.

Таблица 2 - Содержание альбуминов и глобулинов в сыворотке крови свиней-продуцентов в процессе гипериммунизации (М+т, п=10, р<0,05)

Группа животных Показатель, % До иммунизации 1-ый этап 2-ой этап 3-ий этап 4-ый этап

1-я Альбумины 44,24+0,19 44,01+0,19 43,72+0,21 43,40+0,23 43,00±0,26

Глобулины, в т.н.: 55,76+0,19 55,99+0,19 56,28±0,21 56,61+0,23 57,00+0,26

а-глобулины 16,70+0,18 16,63+0,19 16,41+0,18 16,11+0,19 15,77+0,23

3-глобулины 19,83+0,34 19,52+0,36 18,79±0,31 17,83+0,26 16,84+0,25

7-глобулины 19,23+0,30 19,84+0,36 21,08+0,39 22,67±0,42 24,39+0,53

2-я. Альбумины 43,86±0,18 43,44±0,18 43,05±0,15 42,50+0,14 41,89±0,17

Глобулины, в т.ч.: 56,14+0,18 56,56+0,18 56,96+0,15 57,50+0,14 58,11+0,17

а-глобулины 17,30±0,12 17,08±0,14 16,78+0,16 16,28+0,14 15,58+0,21

3-глобулины 18,53+0,22 18,07±0,24 17,35+0,22 16,55+0,17 15,89+0,14

7-глобулины 20,31+0,28 21,41+0,26 22,83+0,28 24,67+0,24 26,64+0,30

3-я Альбумины 43,26+0,21 42,84±0,24 42,36+0,23 41,63+0,21 41,01+0,20

Глобулины, в т.ч.: 56,74+0,21 57,16±0,24 57,64+0,23 58,37+0,21 58,99+0,20

а-глобулины 16,96+0,13 16,75±0,11 16,40+0,09 15,90+0,15 15,46+0,18

3-глобулины 19,58±0,23 19,10±0,23 18,21±0,22 17,07±0,18 16,08+0,15

у-глобулины 20,20+0,23 21,31+0,29 23,03+0,27 25,40±0,31 27,45+0.30

3.2.3 Определение оптимальной лечебно-профилактической дозы полиспецифической сыворотки при рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят в условиях неблагополучных хозяйств

3.23.1 Определение оптимальной лечебной дозы полиспецифической сыворотки

Эксперименты проводили в одном из хозяйств Республики Татарстан, стационарно неблагополучном по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят.

Для определения оптимальной прививной дозы полиспецифической сыворотки с лечебной целью были сформированы 4 группы новорожденных поросят по 12 голов в каждой. Животным опытных групп вводили гипериммунную сыворотку с лечебной целью в дозах 10, 15 и 20 см3. Животным контрольной группы в качестве лечебных средств применяли антибиотики и противоэшерихиозную сыворотку. При этом установлено, что полиспецифическая гипериммунная сыворотка оказывает выраженное лечебное действие при смешанных вирусно-бактериальных инфекциях. Применение ее в дозах 15 и 20 см3 позволило вылечить 91,7% больных поросят, тогда как в контрольной группе сохранность поросят составила лишь 58,3%, что в 1,57 раза ниже, чем в опытной группе. Отмечено также, что при применении сыворотки в дозе 20 см3 у некоторых поросят через 3040 мин после введения препарата наблюдалось побочное действие, которое выражалось возбуждением, дрожью, рвотой. Следовательно, оптимальной лечебной дозой сыворотки для новорожденных поросят является 15 см .

3.23.2 Определение оптимальной профилактической дозы полиспецифической сыворотки

Для экспериментов по отработке оптимальной профилактической дозы полиспецифической гипериммунной сыворотки в условиях неблагополучного хозяйства были сформированы 5 групп новорожденных поросят по 12 голов в каждой. Животным опытных групп вводили гипериммунную сыворотку с профилактической целью в дозах: 3, 5, 7, 10 см3. Поросятам контрольной группы сыворотку не вводили. При этом установлено, что наиболее оптимальной дозой сыворотки для профилактики рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят является 7 см3. При увеличении ее дозы до 10 см3 достоверного повышения эффективности сыворотки не наблюдается, а при дозе 3 см — желаемый эффект не достигается.

3.2.4 Испытание лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки в условиях хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям поросят

Производственное испытание опытных серий полиспецифической гипериммунной сыворотки проводили в 3-х свиноводческих хозяйствах Республики Татарстан (ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу», ООО «Сосна» и СХПК «Кама»), неблагополучных по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят.

Гипериммунную сыворотку новорожденным поросят вводили внутримышечно в область бедра с внутренней стороны с профилактической целью в дозе 5-7 см3, с лечебной целью в зависимости от тяжести болезни в дозе 10-15 см3 при соблюдение правил асептики. При этом суточную дозу сыворотки вводили дробно 2 раза с интервалом 5-6 часов. Всего за период проведения испытаний было иммунизировано 1754 новорожденных поросят, из них в свиноферме ООО «Сосна» - 320, в свинокомплексе ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу» - 660 и в свиноферме СХПК «Кама» - 774.

Результаты производственного испытания сыворотки по двум хозяйствам представлены в таблицах 3 и 4, из которых следует, что полиспецифическая гипериммунная сыворотка обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами. Так, например, в группе поросят, обработанной полиспецифической сывороткой, заболевало всего 22,49%, пало 5,67% поросят, тогда как в контрольной (иптактной) группе эти показатели составляли 82,56% и 31,19%, соответственно. При этом сохранность поросят в опытной группе составляла 94,33% против 68,81% в контрольной группе. Применение сыворотки в лечебных дозах позволяло вылечить 87,6% больных поросят, тогда как в контрольной группе, где применялось симптоматическое лечение, сохранность поросят составила лишь 67,56%, что в 1,30 раза ниже, чем в опытной группе.

В свиноферме СХПК «Кама» оценка эффективности применения полиспецифической гипериммунной сыворотки с лечебно-профилактической целью проводилась путем сравнения данных сохранности новорожденных поросят до и после начала применения сыворотки, результаты которых приведены в таблице 5.

Применение полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи с лечебнопрофилактической целью позволило в данном стационарно неблагополучном хозяйстве сократить гибель новорожденных поросят в 3,3 раза и тем самым повысить их сохранность на 12,9%.

Одновременно в этих свиноводческих хозяйствах проводились организационно-хозяйственные мероприятия по улучшению кормления, условий содержания супоросных свиноматок и поросят.

Положительные результаты производственного испытания полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят позволяют рекомендовать ее к внедрению в ветеринарную практику с лечебно-профилактической целью при трансмиссивном гастроэнтерите, ротавирусной болезни свиней и эшерихиозной диареи новорожденных поросят.

Таблица 3 - Результаты производственного испытания профилактической эффективности сыворотки

Название хозяйства Опытная группа Контрольная группа

Всего ж-х не заболело заболело пало Всего ж-х не заболело заболело пало

кол- во % кол- во % кол- во % кол- во % кол- во % кол- во %

- Агрофирма «Вамин-Аксу» 307 212 69,06 95 30,94 24 7,82 89 19 21,34 70 78,65 18 23,59

ООО «Сосна» 240 212 88,4 28 11,6 7 2,9 20 0 0 20 100 16 80

Итого: 547 424 77,51 123 22,49 31 5,67 109 19 17,43 90 82,56 34 31,19

Таблица 4 - Результаты производственного испытания лечебной эффективности сыворотки

Название хозяйства Опытная группа Контрольная группа

Всего ж-х выздоровело пало Всего ж-х ВЫЗД01 эовело пало

кол-во % кол-во % кол-во % кол-во %

Агрофирма «Вамин- Аксу» 210 190 90,48 20 9,52 54 42 77,77 12 22,22

ООО «Сосна» 40 29 72,5 11 27,5 20 8 40 12 60

Итого: 250 219 87,6 "~1 31 12,4 74 50 67,56 24 32,43

Таблица 5 - Результаты сравнительного изучения лечебно-

профилактической эффективности полиспецифической сыворотки в СХПК «Кама» РТ

Год Получено поросят Сохранность Падеж

кол-во % кол-во %

Р [о применения полиспецифической сыворотки

2010 1800 1483 82,4 317 17,6

2011 (январь-май) 986 787 79,8 199 20,2

Всего 2786 2270 81,5 516 18,5

После применения полиспецифической сыворотки

2011 (июнь-октябрь) 774 731 94,4 43 5,6

3.2.5 Экономическая эффективность применения полиспецифической гипериммунной сыворотки при инфекционных диареях новорожденных поросят

Использование полиспецифической гипериммунной сыворотки с профилактической целью в расчете на 100 голов позволяет предотвратить потери продукции на сумму более 25 тыс. рублей, при этом получить экономический эффект около 24 тыс. рублей. Экономический эффект достигается за счет предотвращения потерь от падежа животных, во много раз превышающих затраты, связанные с использованием лечебнопрофилактической сыворотки. При затратах сыворотки на одного поросенка 10 руб., экономический эффект от применения сыворотки на 100 голов составляет 23962 рублей.

Экономическую эффективность применения полиспецифической гипериммунной сыворотки с лечебной целью оценивали с показателями контрольной группы, где использовалось симптоматическое лечение. В качестве симптоматического лечения применяли эшерихиозную сыворотку в сочетании с антибиотиками. При этом в опытной группе, где для лечения использовали гипериммунную сыворотку, сохранность поросят составила 87,6%, а в контрольной, где применяли симптоматическое лечение, сохранность составила лишь 67,56%. При этом затраты на лечение больных поросят полиспецифической гипериммунной сывороткой в расчете на 100 голов составили 3000 рублей, а при симптоматическом лечении — 6070 рублей, что в 2,03 раза дороже.

Использование биопрепарата для лечения больных животных с признаками инфекционной диареи позволяет предотвратить потери продукции в расчете на 100 голов на сумму 55,8 тыс. рублей и получить экономический эффект более 52 тыс. рублей. Затраты на лечение одного поросенка с использованием гипериммунной сыворотки составляют 30 рублей, с использованием симптоматического лечения - 60,7 рублей, что в

2,1 раза превышает стоимость лечения с использованием гипериммунной сыворотки.

Таким образом, использование полиспецифической гипериммунной сыворотки в производственных условиях позволяет добиваться высокой экономической эффективности при лечении и профилактике смешанной рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят.

4 ВЫВОДЫ

1. Установлено, что основными этиологическими агентами, вызывающими диарею новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья, являются рота-, коронавирусы, бактерии эшерихии коли, стрептококки, диплококки, клостридии, протей.

2. В более 80% случаях желудочно-кишечные заболевания проявляются в виде смешанной инфекции, которая в 8,7% случаях обусловлена ротавирусом и эшерихиями коли, в 17,4% случаях -коронавирусом и эшерихиями коли, в 39,1% случаях — рота-, коронавирусами и эшерихиями коли, в 30,4% случаях — эшерихиями коли и клостридиями.

3. Научно обоснована перспективность и целесообразность получения полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи на свиньях-продуцентах, предназначенной для иммунопрофилактики и иммунотерапии смешанных форм желудочно-кишечных болезней новорожденных поросят.

4. Изыскана оптимальная схема иммунизации свиней-продуцентов полиантигеном, состоящим из рота-, коронавирусов и E.coli, позволяющая получить гипериммунную сыворотку с титрами специфических антител к рота-, коронавирусам 13,64 log2, к эшерихиям К88 - 12,64 Iog2, К99 и 987Р -

11,64 log2 и к ТЛ-, ТС-токсинам E.coli - 3,0 log2.

5. Разработан технологический регламент производства, контроля и применения полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят.

6. Применение полиспецифической гипериммунной сыворотки с профилактической целью в стационарно неблагополучных хозяйствах по желудочно-кишечным болезням новорожденных поросят обеспечивает сохранность животных в опытных группах до 94,3%, против 68,8% в контрольной группе. Лечебная эффективность сыворотки составила 87,6%, тогда как в контрольной группе, где применялось симптоматическое лечение, этот показатель не превышал. 67,5%.

7. Экономическая эффективность применения полиспецифической гипериммунной сыворотки при профилактической обработке на 1 рубль затрат составляет 21,1 рублей, а при лечебной —16,5 рублей.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основе проведенных исследований предложена для внедрения в ветеринарную практику «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка

против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят».

2. Разработаны нормативно-технические документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данного биопрепарата, в частности:

- Технические условия на «Полиспецифическую гипериммунную сыворотку против рога-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят», ТУ 9389-013-00492374-2011 (утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы с ГУВ КМ РТ);

- Инструкция по применению «Полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласована с ГУВ КМ РТ);

- Инструкция по изготовлению и контролю «Полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»).

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Махмугов А.Ф. Эффективность полиспецифической гипериммунной сыворотки при смешанных вирусно-бактериальных гастроэнтеритах новорожденных поросят / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев // Веткорм. - 2010. - №6. - С. 56-57.

2. Махмутов А.Ф. Специфическая профилактика и лечение смешанных вирусно-бактериальных гастроэнтеритов новорожденных поросят / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов, Х.Н. Макаев // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: Матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Краснообск, 2010. - С. 127-131.

3. Спиридонов Г.Н. Гипериммунная лечебно-профилактическая сыворотка против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов, Х.Н. Макаев // Современные проблемы интенсификации производства свинины в странах СНГ: Сб. науч. трудов XVII Междунар. науч.-практ. конф. по свиноводству. - Ульяновск, 2010. -С. 361-365.

4. Махмутов А.Ф. Мониторинг инфекционных желудочнокишечных заболеваний новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов, Р.Н. Аглямов // Ветеринарный врач. - 2011. - №5. - С. 25-28.

5. Махмутов А.Ф. Полиспецифическая сыворотка как средство экстренной профилактики и лечения рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят / А.Ф. Махмутов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -Т. 206.-Казань, 2011,-С. 147-151.

6. Махмутов А.Ф. Проблемы желудочно-кишечных заболеваний новорожденных поросят и пути их решения / А.Ф. Махмутов, Г.Н. Спиридонов // Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество): Тезисы докл. Междунар. науч. конф. - М., 2011. - С. 63-65.

7. Спиридонов А.Г. Этиология инфекционных диарей новорожденных поросят и телят / А.Г. Спиридонов, А.Ф. Махмутов // Ветеринарная медицина: Межведомственный темат. науч. сб. — Харьков, 2011. - Вып. 95. - С. 264-265.

8. Спиридонов ГЛ. Лечение и профилактика смешанных форм инфекционной диареи новорожденных поросят / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов // Ветеринарная медицина: Межведомственный темат. науч. сб. - Харьков, 2011. - Вып. 95. - С. 265-267.

Подписано в печать 31.01.12 г. Печать ризографическая Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л. 1,32. Тираж 100. Заказ № 3101/2. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.)

420101, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Махмутов, Айдар Фаритович, Казань

61 12-3/614

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИОБИОЛОГИЧЕСКОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

(ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

МАХМУТОВ АЙДАР ФАРИТОВИ ,

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ POTA-, КОРОНАВИРУСНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА И ЭШЕРИХИОЗНОЙ ДИАРЕИ НОВОРОЖДЕННЫХ ПОРОСЯТ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

микология с микотоксикологиеи и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,

старшии научный сотрудник

Спиридонов Г.Н.

Казань - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ........................................................................ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................ 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.................................... 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................... 11

1.1 Иммунобиологические особенности новорожденных поросят............ 11

1.2 Ротавирусная диарея поросят..................................................... 17

1.3 Трансмиссивный гастроэнтерит свиней....................................... 25

1.4 Эшерихиозная диарея поросят....................................................35

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................... 49

2.1. Материалы и методы исследований............................................ 49

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............. 62

3.1. Изучение этиологической структуры и клинико-эпизоотологических аспектов инфекционной диареи новорожденных поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья.................................................... 62

3.2. Разработка полиспецифической лечебно-профилактической сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят..................................................................................... 72

3.2.1. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации свиней-продуцентов рота-, коронавирусными и эшерихиозными антигенами для получения лечебно-профилактической сыворотки............................ 72

3.2.2. Оценка безвредности, стерильности и специфической активности гипериммунной сыворотки............................................................. 77

3.2.3. Определение оптимальной лечебно-профилактической дозы полиспецифической сыворотки и испытание ее эффективности при экспериментальной рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят........................................................................................................ 85

3.2.3.1. Определение оптимальной лечебной дозы полиспецифической сыворотки при экспериментальной рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят........................................................................... 86

3.2.3.2. Определение оптимальной профилактической дозы полиспецифической сыворотки при экспериментальной рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят.............................. 88

3.2.4. Определение оптимальной лечебно-профилактической дозы полиспецифической сыворотки при рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят в условиях неблагополучных хозяйств........................ 91

3.2.5. Испытание лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки в условиях хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным инфекциям поросят.............. 94

3.2.6. Экономическая эффективность применения полиспецифической гипериммунной сыворотки при инфекционных диареях новорожденных поросят..................................................................................... 98

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ................ 103

ВЫВОДЫ...............................................................................114

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................... 116

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................ 117

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................... 147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А/ф - агрофирма

БАСК - бактерицидная активность сыворотки крови

ВИГС - вирус инфекционного гастроэнтерита свиней

ВТГС - вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней

ГЛА - гидролизат лактоальбумина

ЕД - единица действия

ИФА - иммуноферментный анализ

м.к. - микробные клетки

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон

ППК - культура клеток почки эмбриона свиньи линии ПИК

РА - реакция агглютинации

РБ - Республика Башкортостан

РВИС - ротавирусная инфекция свиней

РВС - ротавирус свиней

РДП - реакция диффузной преципитации

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РКВС - респираторный коронавирус свиней

РМЭ - Республика Марий Эл

РН - реакция нейтрализации

РТ - Республика Татарстан

РФ - Российская Федерация

СПЭВ - культура клеток почки эмбриона свиньи линии СПЭВ

ТГС - трансмиссивный гастроэнтерит свиней

ТЛ - термолабильный

ТС - термостабильный

ЦПД - цитопатическое действие

ЧР - Чувашская Республика

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Практика работы свиноводческих комплексов, как в нашей стране, так и за её пределами показывает, что большой экономический ущерб хозяйствам наносят болезни желудочно-кишечного тракта новорожденных поросят, которые обусловлены нарушениями параметров микроклимата в помещениях, нерациональным кормлением и содержанием супоросных свиноматок, а также возбудителями различных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы (Иванов A.B., Юсупов Р.Х., 2006; Thomson J.R., 2006).

Установлено, что важную этиологическую роль в возникновении диареи

поросят играют рота-, коронавирусы и эшерихии коли (Прискока A.A., 1990;

Спиридонов Г.Н. и соавт., 1995; Аноятбеков М., 1997; Рахманов A.M. и

соавт., 2002; Каврук JI.C., 2009; Прудников С.И. и соавт., 2010; DeGregorio

R.M., 1992; Dewey С. et al., 2003). Рота-, коронавирусная инфекция у поросят

часто протекает в смешанной форме с колидиареей. При этом наступает

тяжёлая болезнь с явлениями дегидратации и смертельным исходом. По

литературным данным и практическим наблюдениям заболеваемость поросят

составляет более 50%, а отход достигает 80 - 90% от числа заболевших

(Аноятбеков М. и соавт., 1991). В настоящее время главным направлением

борьбы с указанными болезнями является активная иммунизация

свиноматок, с молозивом и молоком от которых специфические антитела

поступают в организм новорожденных поросят и обеспечивают их защиту. С

этой целью разработаны различные моновалентные и ассоциированные

вакцины, которые с успехом применяются в различных регионах РФ

(Ястребов A.C. и соавт., 1993; Федоров Ю.Н. и соавт., 1997; Гаффаров Х.З. и

соавт. 1999-патент РФ; Байбиков Т.З. и соавт., 2002; Орлянкин Б.Г. и соавт.,

2001; Алипер Т.П. и соавт., 2002; Русалиев B.C. и соавт., 2005; Сисягин П.Н.

и соавт., 2005; Спиридонов Г.Н., 2010). Антитела, полученные с молозивом

матери, обеспечивают защиту поросят от заболевания до тех пор, пока у них

не выработаются собственные механизмы иммунитета. По различным

причинам некоторые животные после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением иммуноглобулинов с молозивом матери, несвоевременным и недостаточным получением молозива или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных (Брылин А.П. и соавт., 2006). В животноводческих хозяйствах, в которых нарушаются правила приема родов и скармливания материнского молозива, вакцинация маток в период беременности для профилактики желудочно-кишечных и некоторых респираторных болезней неэффективна по той причине, что новорожденные не получают специфических антител с молозивом и, находясь в состоянии иммунодефицита, остаются чувствительными к патогенному воздействию возбудителей (Сидоров М.А. и соавт., 2006). В настоящее время биопредприятиями РФ выпускаются несколько видов гипериммунных сывороток для специфической профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных: «Сыворотка адгезивная и антитоксическая против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», «Поливалентная антитоксическая сыворотка против паратифа и колибактериоза телят, ягнят, овец и птиц» и др. (Достоевский П.П. и соавт., 1986; Каталог лекарственных средств для животных, Торговый дом «Биопром», 2005/2006).

Основным недостатком этих сывороток является то, что в их составе отсутствуют специфические антитела против ротавируса и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Кроме того, сыворотки, полученные на волах-продуцентах, часто вызывают осложнение у поросят после её введения в виде анафилактического шока. Все это значительно снижает их лечебно-профилактическую эффективность при смешанных формах инфекционной диареи поросят. В этой связи разработка полиспецифической лечебно-профилактической гипериммунной сыворотки против основных возбудителей желудочно-кишечных болезней поросят является весьма актуальной.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований является изучение этиологической структуры желудочно-кишечных заболеваний поросят и разработка технологии изготовления полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят на свиньях-продуцентах.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

3. Изучить эффективность полиспецифической сыворотки в лабораторных и производственных условиях;

4. Разработать НТД на биопрепарат и предложить его для рассмотрения и внедрения в ветеринарную практику РФ.

Научная новизна работы. На основе результатов клинико-эпизоотологичского мониторинга инфекционных заболеваний поросят в ряде свиноводческих комплексах Среднего Поволжья и Предуралья, бактериологических и вирусологических исследований показано преимущественное распространение и циркуляция среди поголовья свиней возбудителей ротавирусной болезни, трансмессивного гастроэнтерита свиней и эшерихиоза, проявляющихся чаще в виде смешанной формы инфекции.

Установлена высокая бактерицидная и иммуногенная активность полиспецифической гипериммунной сыворотки в лабораторно-производственных условиях.

Определена оптимальная доза и изучена лечебно-профилактическая эффективность полиспецифической сыворотки при смешанных желудочно-кишечных болезнях новорожденных поросят вирусно-бактериальной этиологии.

Новизна исследований подтверждена положительным решением ФИПС о выдаче патента РФ на изобретение по заявке №2010151702 от 15.12.2010.

Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований для внедрения в ветеринарную практику предложена «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи поросят». Установлено, что она обладает выраженными защитными свойствами. Применение ее в стационарно неблагополучных пунктах позволяет значительно снизить заболеваемость и гибель новорожденных поросят, тем самым повышая их сохранность.

Разработаны нормативно-технические документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение данного биопрепарата, в частности:

- технические условия на «Полиспецифическую гипериммунную сыворотку против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят», ТУ 9389-013-00492374-2011 (утверждены директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласованы с ГУВ КМ РТ);

- инструкция по применению «Полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», согласована с ГУВ КМ РТ);

- инструкция по изготовлению и контролю «Полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- Ежегодных научных сессиях Ученого совета Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») по итогам НИР за 2008-2011 гг.;

XVII международной научно-практической конференции по свиноводству «Современные проблемы интенсификации производства свинины в странах СНГ» (Ульяновск, 2010);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири» (Краснообск, 2010);

- Международной научно-практической конференции молодых ученых ФГУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2010);

- Международной научной конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество)» (Москва, 2011);

Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2011);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки, приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» (Харьков, 2011).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также получено положительное решение ФИПС о выдаче патента РФ «Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят» по заявке №2010151702 от 15.12.2010 г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 171 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы, состоящий из 272 источников, в том числе 124 иностранных авторов и приложение. Диссертация содержит 18 таблиц и иллюстрирована 13 рисунками.

Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований и их научно-практическую ценность.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Иммунобиологические особенности новорожденных поросят

Одна из важных проблем современного свиноводства - повышение выживаемости поросят в подсосный период. Естественно, что гибель новорожденных животных наносит значительный экономический ущерб свиноводству. Основные причины гибели поросят в первые дни жизни заключается в воздействии на их организм патогенной и условно патогенной микрофлоры (Шахов А.Г. и соавт., 2001; Субботин В.В., 2005; Шахов А. и соавт., 2005; Гречухин А.Н., 2006; Шульга Н., 2009; Thomson J.R., 2006). Статистика свидетельствует, что основной падеж в свиноводстве приходится на молодняк - это 90% от общего количества павших животных (Елисеева Е., 2008). Примерно 70 - 80% гибели молодняка сельскохозяйственных животных приходится на первые 2-3 недели жизни, а общие потери по причине желудочно-кишечных болезней, сопровождающихся диареей, в течение многих лет составляют около 50 % от общего падежа молодняка.

Для сохранения здоровья чрезвычайно важны первые часы, и даже минуты после появления новорожденных на свет, что связано с рядом физиологических особенностей данной возрастной группы (Субботин В.В., Сидоров М.А., 2004).

В процессе эволюции у разных видов животных образовались плаценты

разных типов, морфологическая структура которых оказывает решающее

влияние на иммунологический и физиологический статус плодов и

новорожденных (Сидоров М.А. и соавт., 2006; Петрянкин Ф.П., 2008).

Анатомо-физиологическое строение эпителиохориальной плаценты

свиноматки, овцематки, коров препятствует поступлению антител от матери

к плоду во внутриутробный период развития. Поэтому они рождаются без

иммуноглобулинов в крови и оказываются иммунологически

незащищенными от генетичес

Информация о работе