Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Разработка новых средств специфической профилактики и лечения эшерихиозов телят и поросят

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых средств специфической профилактики и лечения эшерихиозов телят и поросят"

На правах рукописи

СЕТДЕКОВ РШ1АТ ЛБДУЛХАКОВИЧ

РАЗРАБОТКА НОВЬГС СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

2015

Казань - 2015

005561774

005561774

Работа выполнена в отделе биологической безопасности Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГЪУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») (г. Казань)

Научный консультант: Юсупов Расых Халиуллович -

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ и РТ

Официальные оппоненты: . ...

Сочнев Василий Васильевич, доктор ветеринарных наук, член-корреспондент РАН, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой эпизоотологии и инфекционных болезней ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия»

Петрянкин Федор Петрович, доктор ветеринарных наук, профессор, старший научный сотрудник лаборатории бионанотехнологии ФГБОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»

Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина»

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны Российской Федерации» (ГНУ НИВИ НЗ РФ), г. Нижний Новгород

Защита состоится «23» октября 2015 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.01 при федеральном государственного бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» (420074, г. Казань, Сибирский тракт, 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://www.ksavm.senet.ru/ федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Автореферат разослан « »_2015г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета /¡Ш^ Трофимова Елена Николаевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одной из сложнейших проблем, стоящих перед ветеринарной наукой и практикой, являются желудочно-кишёчные болезни новорожденных телят и поросят инфекционной природы, которые имеют широкое распространение, сопровождаются высокой смертностью и наносят значительный экономический ущерб.

Установлено, что ведущее место в этиологии инфекционной диареи телят и поросят принадлежит энтеропатогенным штаммам Escherichia coli, обладающих широким набором серовариантов, продуцирующим адгезивные антигены К99, К88, F41, 987Р, А20, которым и принадлежит ведущая роль в развитии эшерихиозов (Гаффаров Х.З. и др., 2002; Зароза В.Г., 1991; Иванов A.B. и др., 2006; Попов Е.М. и др., 1991; Светоч Е.А. и др., 1997; Тугаринов O.A. и др., 1991; Шахов А.Г., 2003; Т. Asai, 2011). Немаловажное значение в развитии эшерихиозов среди молодняка играют комплекс предрасполагающих и сопутствующих факторов которым относят: нарушения обмена веществ, низкий уровень естественной резистентности и иммунологической реактивности у коров и свиноматок вследствие дисбаланса питательных веществ в рационах, содержание животных при неудовлетворительных параметрах микроклимата, нарушение гигиены проведения отелов и опросов, послеродовая патология у маточного поголовья, несвоевременная выпойка молозива новорожденным телятам, гипогалактия у свиноматок (Джупина С.И., 2001; Мищенко В.А., 2005; Папуниди К.Х., 2000; Петрянкин Ф.П., 2008; Сисягина Е.П., 2010; Смирнов A.M., 2010).

В настоящее время главным направлением борьбы с эшерихиозами является активная иммунизация стельных коров и супоросных свиноматок, с молозивом и молоком от которых специфические антитела поступают в организм новорожденных. Для этих целей разработаны и используются противоэшерихиозные вакцины (Дворкин Г.Л. и др., 1985; Иванов A.A. и др;, 2012; Лавровская В.М. и др., 1993; Малахов Ю.А. и др., 1993; Новак Д.Д. и др., 1996; Пирожков М.К. и др., 1994; Спиридонов Г.Н. и др., 2011).

Следует отметить, что иммунизация стельных коров и супоросных свиноматок существующими вакцинами в ряде случаев не обеспечивает выраженный колостральный иммунитет у нарождающего молодняка (Сидоров М.А. и др., 2008). Это по мнению ряда авторов (Гаффаров Х.З. и др., 2002; Зароза В.Г., 1991; Шахов А.Г. и др., 1995) связано с наличием у больных телят и поросят широкого набора серовариантов возбудителя Е. coli. Например, у больных телят обнаружены более 165 вариантов О-антигена, 55 Н-антигена и 90 вариантов K-антигена (Гаффаров Х.З. и др., 2002; Зароза В.Г., 1991). При типизации возбудителя колибактериоза выделенных от больных диареей поросят чаще всего обнаруживали эшерихии следующих серовариантов: Ol, 02, 04, 08, 015, 026, 078, 0103, Ol 19, 0126, 0137, 0138, Ol39, 0141, 0147, 0149, а также А20, К99, К88, 987Р, F41 (Шахов А.Г. и др., 1995). В связи с этим для противоинфекционной защиты новорожденных телят

и поросят проводят пассивную иммунизацию путем парентерального и орального введения им специфических гипериммунных сывороток, иммуноглобулинов (Гайзатуллин P.P., 2012; Гаффаров, Х.З. и др., 1996; Малахов, Ю.А. и др., 1993; Сисягин, П.Н. и др., 2001; Федоров Ю.Н. и др., 2009). Следует однако отметить, что в лечебных сывороток биофабричного изготовления в ряде случаев наблюдается низкий титр антител, особенно к адгезивным антигенам К88, К99, 987Р и F41, а также TJI- и ТС-энтеротоксинам. Поэтому имеется необходимость усовершенствования существующих и создания нового поколения вакцин против эшерихиозов, а также лечебных средств на основе современных достижений биотехнологии и иммунологии. При этом получение и очистка специфических и иммуногенных белков из Е. coli и изыскание средств и способов повышения их антигенной активности, позволяющих увеличить продолжительность и напряженность колострального иммунитета у телят и поросят, является весьма актуальной.

Степень разработанности темы. Значительным достижением в области изучения антигенной структуры Е. coli стало обнаружение у микроба образований, играющих роль органа адгезии бактерии к клеткам макроорганизма, названными адгезивными фимбриями или пили (Jann К. et al., 1987; Jsaacson R„ 1986; Kuzuya M„ 1988; Nataro J.P. et al., 1987).

Применение вакцины против колибактериоза из очищенных пилей типа 1, содержащей антигены К88, К99 и 987Р приводило к существенному снижению смертности от эшерихиоза поросят и телят (То S.C. е.а., 1983; 1984).

Однако опыт создания и использования субъединичных вакцин против эшерихиоза в нашей стране небольшой, что диктует необходимость разработки и всесторонней оценки эффективности таких вакцин (Светоч Е.А и др., 1997).

С целью повышения эффективности вакцинопрофилактики и лечебных средств ряд исследователей рекомендуют применять их в комбинации с продуктами пчеловодства (Андреева A.B., 2003; Иемапиюв A.M. и др., 2000; Кивалкина В.П., 1948; Кивалкина В.П., 1948; Кивалкина В.П. и др., 1991; Маннапова Р.Т. и др., 2000; Панин А.Н. и др., 2000; Тетерев И.И., 1998).

Как видно проблема поиска новых, высокоэффективных средств и способов повышения антигенной активности вакцины против эшерихий, а также изучение иммуностимулирующих и иммуномодулирующих свойств апипрепаратов в сочетании с вакцинными и лечебными средствами является весьма актуальной.

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований по разработке композиционного препарата, включающего глобулины, продукты пчеловодства, продукты метаболизма пробиотических микроорганизмов и природные адсорбенты, а также полиантигенного комплекса на основе пилезных (фимбриальных) антигенов в сочетании с продуктами пчеловодства и высокодисперсным природным адсорбентом.

Цель и задачи. Целью исследований явилось разработка технологии получения новых средств специфической профилактики и лечения телят и поросят от эшерихиоза.

Для выполнения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:

- провести эпизоотологический мониторинг болезней свиней и крупного рогатого скота в Нижегородской области;

- теоретически обосновать возможность и необходимость получения лечебно-профилактических средств нового поколения;

т разработать полиантигенный комплекс на основе пилезных антигенов и иммуномодуляторов для профилактики эшерихиоза телят и поросят;

- разработать иммунотерапевтический композиционный препарат на основе иммуноглобулинов, апифитопродуктов и минеральных сорбентов;

: - определить токсичность и безвредность полученных лечебно-профилактических средств на лабораторных животных;

провести оценку лечебно-профилактической эффективности разработанных средств на лабораторных и сельскохозяйственных животных;

- изучить формирование противоэшерихиозной защиты животных на фоне применения разработанных лечебно-профилактических средств;

- разработать наборы препаратов и инструкции по их применению для выявления антител к бактериям Е. coli методом иммуноферментного анализа, реакции непрямой гемагглютинации и реакции бентонитовой флокуляции.

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения противоэшерихиозной субъединичной вакцины на основе пилезных антигенов К88, К99, 987Р и F41, выделенных из энтеротоксигенных штаммов Е. coli методом афинной хроматографии. Однократное подкожное введение субъединичной четырехпилезной вакцины стельным коровам и супоросным свиноматкам индуцирует в их организме выработку специфических антител с последующей передачей специфических антител молозивом новорожденным телятам и поросятам. Колостральный иммунитет обеспечивает сохранность телят и поросят в 90-92,8% случаях в очаге колибактериоза. С учетом патогенеза эшерихиозной инфекции разработан лечебно-профилактический препарат «Пабисорб» на основе специфических глобулинов, бифидогенных и сорбционно-детоксикационных средств. Показано, что лечебно-профилактическое действие «Пабисорба» реализуется путем гемо- и миелопротекторного действия иммуноглобулинов, а также антиоксидантного и антибактериального действия апипродуктов, бифидогенного и детоксицирующего действия микрочастиц природного минерала-монтмориллонита.

Разработаны наборы препаратов для выявления антител в сыворотке крови к бактериям Е. coli методом иммуноферментного анализа (ИФА), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции бентонитовой флокуляции. По результатам исследований подана заявка на изобретение №2014118171 от 5 мая 2014 года. •

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные указывают на фундаментальное значение антигенной структуры возбудителя эшерихиоза, в которой ключевую роль играют пилезные антигены, обеспечивающие в оптимальных количественных соотношениях в полиантигенном комплексе индуцировать выработку специфических антител в организме стельных коров и супоросных свиноматок с последующей передачей их молозивом новорожденным телятам и поросятам. Установленная возможность получения полиантигенного комплекса с иммуномодулятором нового поколения - природным биополимером - апизаном открывает перспективу использования последнего в качестве иммуностимулирующего, но и активатора иммунофармакологического действия композиционного противоэшёрйхиозного лечебного препарата.

На основании собственных исследований разработаны:

1. Методические указания по диагностике, профилактике и лечению колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнологии (в порядке производственного испытания). Утв. академик - секретарем Отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук, академиком РАСХН A.M. Смирновым 17.10.2013г.

2. Инструкция по применению субъединичной вакцины против колибактериоза телят и поросят (в порядке производственного опыта). Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором A.B. Ивановым и согласована начальником ГУВ Кабинета Министров" Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым.

3. Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом иммуноферментного анализа». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором A.B. Ивановым и согласована начальником ГУВ Кабинета Министров Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым.

4. Технические условия на набор препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом иммуноферментного анализа (в порядке производственного испытания) Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором A.B. Ивановым и согласована начальником ГУВ Кабинета Министров Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым.

5. Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом реакции непрямой гемагглютинации». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором A.B. Ивановым.

6. Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом реакции бентонитовой

флокуляции». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором А.В. Ивановым.

Методология и методы исследований. Методологической основой проведенных исследований явилось обоснование конструирования вакцинного полиантигенного комплекса на основе пилезных антигенов и иммуномодуляторов для профилактики эшерихиоза телят и поросят, иммунотерапевтического композиционного препарата на основе иммуноглобулинов, апифитопродуктов и минеральных сорбентов.

Объектом исследований являлись крупный рогатый скот и свиньи различного возраста (в том числе новорожденные телята и поросята), кровь, внутренние органы мышей, белых крыс, кроликов, а также микроорганизмы и первичные культуры лимфоцитов.

Исследования проводились с использованием следующих методических подходов:

1. Выделение и очистка пилезных антигенов из токсигенных Е. coli методом афинной хроматографии.

2. Микроскопические - определение с использованием светового микроскопа тинкториальных и морфологических свойств бактерий в мазках отпечатках из проб органов и культур бактерий.

3. Бактериологические - изучение культуральных характеристик бактерий с использованием методов выделения чистых культур.

4. Биологические - иммунизация разработанными комплексными антигенами и заражение референтными штаммами Е. coli лабораторных животных и изучение иммунологических показателей у иммунизированных сельскохозяйственных животных.

5. Серологические - разработка и постановка ИФА, РНГА, реакции бентонитовой флокуляции и РА, а также выделение гисто- и сывороточных иммуноглобулинов в соответствии с общепринятыми в иммунологии методами.

6. Токсикологические - в процессе составления многокомпонентных вакцинных и лечебных препаратов определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакцинно-сывороточном деле методами.

7. Статистические - обработку экспериментально полученного цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту на персональном компьютере с использованием программного пакета «Microsoft Excel 2007», «Microsoft Word 2007».

Положения, выносимые на защиту:

- Субъединичная противоэшерихиозная вакцина разработанная на основе пилезных антигенов К88, К99, 987Р, F41, аписогенного иммуностимулятора и

минерального иммуносорбента индуцирует выработку специфических антител в организме стельных коров и супоросных свиноматок.

- Колостральный иммунитет обеспечивает сохранность телят и поросят в 90-91,8% случаях в очаге колибактериоза.

Композиционный-1 инъекционный препарат «Пабисорб» сконструированный с использованием специфического иммуноглобулина, этанолового экстракта биологически активный кормовой добавки «Вита-Форце М», метаболизма B.bifidum и микрочастицы минерального иммуносорбента - монтмориллонита является нетоксичным и безвредным.

Однократное подкожное введение инъекционного препарата «Пабисорб» в дозах 1,0-1,5 см3 оказывает выраженное профилактическое действие при колибактериозе телят, предохраняя от заболевания 60-80% животных.

- Разработаны и утверждены методические указания по диагностике, профилактике колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнологии, диагностические наборы для выявления специфических антител к Е. coli в сыворотке крови животных методом ИФА, РИГА и реакции бентонитовой флокуляции (РБФ).

Степень достоверности и апробация материалов диссертации. Исследования выполнены на большом поголовье лабораторных и сельскохозяйственных животных. Проведен статистический анализ полученного материала с использованием компьютерных программ. Научные выводы и практические предложения теоретически и экспериментально обоснованы, что подтверждается фактическими данными. Они логически вытекают из содержания работы, согласуются с поставленными целью и задачами.

Основные результаты исследований доложены, обсуждены и одобрены на отчетных сессиях ученого Совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по рассмотрению отчетов НИР (Казань, 2008-2014), на Международных и Всероссийских научно-практических конференциях (Казань, 2011, 2012, 2013,2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК России, 5 нормативных документа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 313 страницах, состоит из введения, обзора литературы, основной части, заключения, списка сокращенных терминов, списка использованной литературы и 8 приложений.

Работа иллюстрирована 44 таблицами. Список литературы включает 392 источника, в том числе 88 на иностранных языках.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Материалы и методы исследования

Работа выполнялась в 2007-2014 гг. в отделе биобезопасности ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической

безопасности» по заданию «Эпизоотический мониторинг» № госрегистрации 01200202602, 01200202604, а также в ветеринарных лабораториях области, в условиях хозяйств Краснооктябрьского, Сеченовского районов и непосредственно в личных хозяйствах граждан Краснооктябрьского района Нижегородской области.

Отдельные этапы работы были выполнены с участием профессора Низамова Р.Н., кандидатов наук Спиридонова Г.Н., Евстифеева В.В., Гумерова В.Г., которым выражаю искреннюю признательность.

2.1.1 Материалы

Подопытные животные. В опытах было использовано 1438 животных, в том числе 355 белых мышей, 75 белых крыс, 47 кроликов, 634 новорожденных поросят, 90 новорожденных телят, 60 телят 2-4 мес. возраста, 155 свиноматок, 72 гол. взрослого крупного рогатого скота.

Штаммы микроорганизмов: производственные штаммы Е. coli «ПЛ-6» № 1154115 -эшерихиозной диареи поросят; 3 эпизоотических штамма Е. coli «УК-2» № 1153/15 - возбудитель диареи поросят; штамм «КВ-1» № 1156/15 -возбудитель эшерихиоза поросят; штамм «ПЗ-З» № 378 - возбудитель эшерихиоза телят, полученные из коллекции штаммов лаборатории по изучению возбудителей особо опасных болезней ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»; коммерческие производственные штаммы В. subtilis (шт. 3) и В. bifidum (шт. 1). Для определения колициногенности производственного и штаммов-изолятов использовали индикаторные штаммы Е. coli К-12, Ж-116, для определения лизоцимной активности использовали стандартную культуру M. lysoidecticus.

Антигены: субъединичные антигены К88, К99, 987Р и F41, выделенные из культур Е. coli, эндо- и энтеротоксин Е. coli, вакцины против рота-коронавирусного энтерита (TTC) и эшерихиозной диареи поросят инактивированная гидроокисьалюминиевая, формолвакцина поливалентная гидроокисьалюминиевая (ФВ ПВ ГОА).

Сыворотки и антисыворотки: антиадгезивные, антитоксические, агглютинирующие, коммерческие диагностические наборы сывороток к антигенам Е. coli, моновалентная антиколибациллезная, бивалентная колипаратифозная сыворотка, антисыворотка к ассоциированному полиантигенному комплексу вакцины против рота-коронавирусного энтерита и эшерихиозной диареи поросят, 12 видов элюатов из органов и тканей, подвергнутых эшерихиозной интоксикации животных.

Кроме того, в качестве одного из новых иммуномодуляторов мы использовали апизан (пчелозан) из подмора пчел полученный в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Апизан представляет собой природный биополимер - ]Ч-ацетил-2-амино-2-диокси-0-глюкозамин, лиофшгазированный порошок светло-коричневого цвета, растворимый в кислой среде при pH 5,5, влажность - 8-10%, содержание золы - 1-2%, протеина 1-2%, вязкость - 5-10сП5.

2.1.2 Методы исследований

Исходными материалами служили результаты собственных исследований и данные ветеринарной отчетности. При этом учитывали распространение болезни, заболеваемость, смертность, летальность, возрастные особенности и сезонную динамику, бактерионосительство и экономический ущерб, наносимый колибактериозом. Основные эпизоотологические показатели определяли по методике И.А. Бакулова с соавт. (1975). Распространение болезни, сроки заболевания, сезонную динамику регистрировали в каждом хозяйстве с учетом условий содержания и выращивания поросят и телят.

Характер проявления и клиническое течете колибактериоза поросят и телят наблюдали у 233 больных животных различных возрастов.

Патологоанатомические изменения изучали при вскрытии 153 трупов поросят и телят, в условиях санитарной бойни хозяйства по общепринятой методике.

Диагноз на колибактериоз устанавливали на основании данных эпизоотологического обследования, клинических признаков, патологоанатомических изменений с проведением бактериологического исследования, материалом для которого служили трупы павших и вынужденно убитых поросят и телят.

Бактериологические исследования патологического материала проводили согласно «Методическим указаниям по бактериологической диагностике кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробакгериями» (1991). Видовую принадлежность микроорганизмов определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в определителе зоопатогенных микроорганизмов.

Выделение культур кишечной палочки из патологического материала от поросят и телят, павших от колибактериоза проводили по методике М.Н. Еремеева (1965). При этом содержимое кишечника, мезентериальных лимфатических узлов (посмертно), фекалии (прижизненно) суспендировали в физиологическом растворе и засевали на среду Эндо, а затем выросшие колонии Е.соН - в кровяной агар и бульон. По окраске (кровяно-лаковый цвет) бульонной культуры определяли гемолитические свойства изучаемого штамма. Посевы кишечного содержимого первоначально засевали на среду Эндо с последующим пересевом изолированных колоний в бульон с кровью.

У выделенных штаммов кишечной палочки определяли морфологические, культур альные, биохимические, гемолитические, серологические и патогенные свойства. Культур альные свойства гемолитических штаммов кишечной палочки изучали по результатам роста на МПБ, МП А, ПЖА (рН=7,2-7,4) и агаре Эндо после инкубирования посевов в термостате в течение 18-24 ч при температуре 37°С. Тинкториальные и морфологические свойства выделенных культур устанавливали путем микроскопирования мазков из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму. Морфологию полученных колоний изучали микроскопией в косопадающем свете. Для этого

исследуемые культуры засевали по методу Дрегальского на поверхность 1,5%-ного просветленного МПА.

Для изучения серологических свойств кишечной палочки использовали стандартные наборы агглютинирующих О-коли сывороток, выпускаемых Армавирской биофабрикой, состоящих из 4 поливалентных и 30 моновалентных сывороток к серовариантам 01, 02, 04, 08, 09, 015, 018, 020, 026, 033,035, 041, 055, 078, 086, 0101,0103, 0111, 0115, 0117,0119,0126,0127, 0137, 0138, 0139, 0141, 0142, 0147, 0149. Реакцию агглютинации ставили согласно наставлению по их применению.

Патогенность культур кишечной палочки с определением LD» устанавливали на белых мышах живой массой 14-16 г путем внутрибрюшинного введения смыва суточной агаровой культуры. Культуры считались патогенными в случае гибели одной или более мышей в первые 4 суток после заражения.

Для определения LD50 готовили последовательные десятикратные разведения из 500 млн микробной взвеси, из каждого разведения по 0,5 мл взвеси вводили внутрибрюшинно 6 мышам. Результаты учитывали в течение 7 дней. Для расчета LD50 использовали метод Рида-Менча.

Изолирование и очистку адгезивных антигенов осуществляли согласно методике, разработанной Kuzuya M. et al. (1988).

В состав вакцины кроме адгезивных антигенов (пили) вводили иммуномодуляторы (Т-активин, а также апизан, полученный из подмора пчел). Методы и способы получения вакцины и специфических иммуноглобулинов, схемы их применения изложены в разделе «Результаты исследований».

При изучении возможности усиления терапевтической эффективности испытуемых средств, с целью составления многокомпонентных смесей и композиций на основе веществ фито-зоо-микробного и минерального происхождения, определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства, эмбриотоксичность и тератогенность в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакцинно-сывороточном деле сертифицированными методиками.

Гематологические и биохимические исследования крови проводили на анализаторе «Express Plus».

Содержание иммуноглобулинов A, M и G в крови животных и их концентрацию в молозиве коров и свиноматок определяли с помощью иммуноферментного анализатора «Униплан».

Количество Т-лимфацитов в крови определяли методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, В-лимфоцитов - методом комплементарного розеткообразования с использованием стандартного кроличьего гемолизина в качестве комплемента - свежей сыворотки коров.

Бактерицидную активность сыворотки крови определяли по О.В. Смирновой и Т.А. Кузминой (1966), лизоцимную - по методу В.Г. Дорофейчук (1968), фагоцитарный индекс и число - по И.П. Кондрахину (1985).

Полученный в ходе экспериментов цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых параметрических методов, степень достоверности различий между сравнительными показателями определяли по критерию Стьюдента с применениями программ Microsoft Excel, Word 2007.

2.2 Состояние и тенденции развития животноводства в Нижегородской области РФ

Результаты изучения состояния и тенденции развития животноводства в Нижегородской области РФ в динамике показало, что Нижегородская область является одним из крупных составных частей РФ как в плане производства продуктов растениеводства, так и животноводства. Здесь сохраняются основные традиционные отрасли животноводства: молочное скотоводство, свиноводство, развиваются птицеводство и овцеводство. Впервые за многие годы изменилась тенденция к росту численности овцепоголовья в области. Однако по состоянию на 01.01.2013 г. в области не преодолена тенденция снижения численности поголовья крупного рогатого скота и свиней, что обобщены в табл. 1.

Таблица 1 - Поголовье крупного рогатого скота и свиней в сельскохозяйственных организациях Нижегородской области в динамике_

Наименование видов животных Годы

2009 2010 2011 . 2012 2013 2013 в % к 2012

Крупный рогатый скот

(тыс. голов) 266,4 244,5 239,8 234,3 227,2 97,0

в т.ч. коров (тыс. голов) 106,1 100,1 100,3 99,6 97,8 98,2

свиньи (тыс. голов) 176,5 196,3 192,6 73,3 67,6 92,1

Приведенные данные в табл. 1 убеждают, что животноводство Нижегородской области, несмотря на реструктуризацию и определенную депрессию в своем развитии, продолжает оставаться важным сектором экономики, влияющим на социальные, экономические, трудовые и производственные ресурсы. Такие выводы в развитии животноводства в Нижегородской области весьма активно поддерживают в своих исследованиях Е.А. Колобов (2013), Л.В. Шилкина (2014), проводимых под руководством член-корреспондента РАН, профессора В.В. Сочнева.

2.3 Эпизоотологический мониторинг болезней свиней в Нижегородской области

Анализ падежа среди свинопоголовья осуществляли по отчетам государственных ветеринарных управлений районов области. По данным отчетов изучали причины падежа свиней от незаразных болезней. Анализ же падежа свиней от болезней инфекционного характера проводили на основании

годовых отчетов межрайонных ветеринарных лабораторий и годовых отчетов ГУНО «Областная ветеринарная лаборатория». Учитывали данные ветеринарной и лабораторной отчетности за последние пять лет, то есть за 2006-2010 годы. Данные обобщены в табл. 2.

Таблица 2 - Структура падежа свиней в общественном секторе Нижегородской области ____

Годы Пало всего Инфекционные болезни Болезни органов пищеварения Болезни органов дыхания Болезни нарушения обмена веществ Другие незаразные болезни

зсего молод. всего молод. всего молод. всего молод. всего молод. всего молод.

2006 130803 130400 10606 10594 53884 53632 24565 24542 34668 34633 7080 6999

2007 171934 170877 12854 12845 64802 64317 36966 36908 44945 44735 12367 12072

2008 168042 166487 13020 12993 71972 70918 35206 35136 32473 32332 15371 15108

2009 135270 133943 9231 9225 61978 61399 25849 25348 25714 25655 12498 12316

2010 134289 132259 16438 16424 61248 60143 23144 22785 16336 16318 17123 16589

Анализ и математические расчеты данных в табл. 2 показали, что большая часть заболевания и падежа свиней в Нижегородской области приходится на болезни органов пищеварения (37,7-45,8%), дыхания (17,2-21,5%) и нарушения обмена веществ (12,1-26,5%), реже от других незаразных болезней. Падеж в основном, происходит среди молодняка. На долю падежа свиней от инфекционных заболеваний приходится 6,8-12,2% от общего количества павших животных. В этом случае больший падеж также происходит среди молодняка (99,9%).

Сведения о количестве неблагополучных пунктов с 2006 по 2010 годы приведены в табл. 3.

Таблица 3 - Количество неблагополучных пунктов по инфекционным болезням свиней. _ •___

№№ п/п Болезни _____ 2006 2007 2008 2009 2010

1 Колибактериоз 18 14 10 3 6

2 Сальмонеллез 2 4 3

3 Гемофилезный полисерозит 1 1 1 1

4 Отечная болезнь 3 6 2 3

5 Пастереллез 1 2

6 Рожа 1 1

7 Псевдомоноз 1 1 1

8 Дизентерия 6 1 2 1

9 ТГС 1 2

10 Стафилококкоз 1

11 Парвовирусная инфекция 1

12 Ротавирусная инфекция 1 1

13 РРСС ,1

Как видно из табл. 3, наибольшее количество неблагополучных пунктов было зарегистрировано по колибактериозу и отечной болезни, чуть меньше сальмонеллезу и дизентерии. Больше всех неблагополучных пунктов при этом было в Арзамасском (10), Починковском (10), Ковернинском (8), Богородском (8), Выксунском (6), Борском (6), Воротынском (5), Володарском (5), Лысковском, Болыпемурашкинском, Уренском, Шахунском районах (по 4). В других районах - Бутурлинском, Дальнеконстантиновском, Семеновском, Кстовском, Пильнинском, Спасском, Павловском, Городецком, Дзержинском, Краснооктябрьском от 1-го до 3-х неблагополучных пунктов.

Для уточнения диагноза мы проводили микробиологические исследования патологического материала от павших поросят в хозяйствах разных форм собственности Красноокгябрьского и Болыпеболдинского районов Нижегородской области.

Всего было исследовано 88 проб патологического материала от поросят с подозрением на колибактериоз. При этом в 56-и случаях была выделена культура кишечной палочки различных штаммов, а именно 08 - в 13-и, 026 - в 9-и, 0101 и 0115 - в 7-и, 020 - в 6-и, 0139 и 078 - в 4-х, 0140 и 0137 в 3-х случаях и 0111 в 1-ом случае. Кроме кишечной палочки в пробах патологического материала была обнаружена другая микрофлора. Так в 14-и случаях из 56-и (25%) выделялись кокки. В частности, в 5-и случаях выделялся Staphilococcus epidermidis, по 1-му случаю Staphylococcus aureus и Streptococcus suis. В остальных 7-и случаях идентификация кокковой микрофлоры не проводилась. Кроме кокков в исследуемых материалах также выделялась Pasteurella haemolitica - 3 случая, Citrobacter freundii - 2 случая, в одном случае выделен Proteus vulgaris. Данные микробы выделялись как отдельно друг от друга, так и в ассоциации. При этом как правило было присутствие в исследуемом материале того или иного штамма кишечной палочки. По нашему мнению, выделенная секундарная микрофлора не вызывала самостоятельного заболевания, а лишь осложняла основное заболевание - колибактериоз.

Нами еще в 2003 году была предпринята попытка лечения отечной болезни поросят бактериофагами и антибактериальными препаратами.

Исследования проводились на неблагополучных по отечной болезни сельхозпредприятиях и личных подворьях граждан Красноокгябрьского района и в одном из сельхозпредприятий Болыпеболдинского района Нижегородской области. Для изучения профилактической эффективности отобрали левомицетина сукцинат натрия, неомицина сульфат и фуразолидон с сульфадимезином. Поросята послеотъемного возраста в количестве 167 голов были разделены на три опытные группы (95, 34 и 38 голов соответственно). Для сравнения использовали три контрольные группы по 50 поросят в каждой. Животным первой опытной группы вводили левомицетина сукцинат натрия внутримышечно 20 мг на 1 кг живой массы в течение 5 дней. Вторая группа поросят получала неомицина сульфат внутримышечно в дозе 10 тыс. ед. на 1

кг массы тела в течение 5 дней. Поросята третьей группы в течение 7 дней ежедневно с кормом получали 0,3 г фуразолидона и 0,5г сульфадимезина. Изучение терапевтической эффективности антибактериальных препаратов проводили во время энзотии отечной болезни поросят на свинохозяйствах двух сельхозпредприятий Краснооктябрьского района. Для этого отобрали гентамицин, левомицетина сукцинат натрия и сульфадимезин с фуразолидоном. Для опыта создали три группы поросят отъемного возраста (210,118 и 64 головы соответственно), группу в 10 голов использовали как контрольную. Поросятам первой группы ежедневно вводили гентамицин внутримышечно в дозе 1 мг на 1 кг массы животного до полного выздоровления. Сто восемнадцати поросятам (вторая группа) вводили левомицетина сукцинат натрия в дозе 20 мг на 1кг массы тела внутримышечно 2 раза в день. Третьей группе поросят (64 головы) фуразолидон 0,3 г и сульфадимезин 0,5 г на голову давали с кормом в течение 7 дней. Животные контрольной группы антибактериальных препаратов не получали. "'

Для лечения и профилактики отечной болезни применяли также поливалентный бактериофаг (полифаг) - смесь фагов против колибактериоза, сальмонеллеза, пастереллеза, стафилококкоза, клебсиеллеза, 1 протея и различных серологических вариантов гемолитической кишечной палочки. Полифаг был сконструирован и изготовлен в научно-производственной лаборатории «Вак-ФАГ» Ульяновской сельскохозяйственной академии. Исследования по применению полифага проводились в СПК «Черновское» Большеболдинского района Нижегородской области -.стационарно неблагополучном по отечной болезни. Вначале бактериофаг испытывали на новорожденных поросятах. Для этого было сформировано три группы поросят 10-15 дневного возраста по 100 голов в каждой, где третья группа служила контролем. Поросята первой группы получали полифаг внутрь в дозе 10 мл один раз в день три дня подряд, животные второй группы - внутримышечно в дозе 5 мл один раз в день в течение трех дней. Поросята третьей (контрольной) группы полифага не получали. Далее полифагом обрабатывали супоросных свиноматок и учитывали сохранность полученных от них поросят к десятому дню жизни и к моменту отъема. Для этого создали две группы свиноматок по 25 голов в каждой (первая - опытная, вторая - контрольная). Животным первой группы полифаг вводили внутримышечно в дозе 15 - 30 мл на голову 3 дня подряд. Свиноматки второй группы полифага не получали.

Терапевтическую эффективность поливалентного бактериофага испытывали на поросятах 50 - 60 дневного возраста в количестве 180 голов, сравнивая результаты с контрольной группой.

За животными опытных и контрольных групп вели постоянное наблюдение. Павших животных подвергали патологоанатомическому вскрытию для окончательной постановки диагноза. Среди поросят, где с профилактической целью применяли левомицетина сукцинат натрия сохранность составила 93,4 %, неомицина сульфат - 83 % и фуразолидон с сульфадимезином - 84,1 % при контроле 82 %. При лечении поросят, больных

отечной болезнью, гентамнцином сохранность составила 82 %, при лечении левомицетином сукцинат натрия - 80,5 %, при лечении сульфадимезином с фуразолидоном - 73,5 % при контроле 60 %. Проведенные многочисленные исследования и наблюдения позволяют сделать вывод, что лечение поросят при отечной болезни эффективно только в начальной стадии заболевания, а профилактика антибактериальными препаратами дает незначительный эффект. При пероральном применении полифага для профилактики отечной болезни сохранность среди поросят 10-12 дневного возраста составила 91 %, при внутримышечном применении полифага - 97 % при контроле 84 %. Сохранность поросят, полученных от свиноматок, обработанных полифагом, составила к десятому дню 97 %, к моменту отъема - 90,8 % при контроле 92 и 76,6 % к десятому дню жизни и к моменту отьема соответственно. Следует отметить, что полифаг дает хороший профилактический эффект как при пероральном, так и при внутримышечном применении, хотя пероральное применение дало несколько меньший эффект, а обработка полифагом супоросных свиноматок оказывает существенное положительное влияние на сохранность поросят.

2.4 Эпизоотологический и иммунологический мониторинг крупного рогатого скота в отдельных хозяйствах Нижегородской области

Опыты проводили в условиях трех животноводческих хозяйств Краснооктябрьского района (ООО «Развитие», ООО «Трехозерское» и СПК «Пошатовский», а также в Областной ветеринарной лаборатории, Сергачской межрайонной ветеринарной лаборатории. Данные по поголовью и падежу скота в вышеперечисленных хозяйствах приведены в табл. 4.

Как видно из данных таблицы, наибольший падеж за три года происходил в ООО «Развитие». При этом гибель во всех хозяйствах наблюдалась как среди молодняка, так и среди взрослого поголовья. Условия содержания во всех 3-х хозяйствах примерно одинаковые: скот содержится в типовых коровниках. Полы в стойлах деревянные, в навозных и кормовых проходах бетонные. Освещение искусственное "и естественное. Навоз убирается при помощи скребковых транспортеров. Содержание - привязное.

Таблица 4 - Поголовье и количество падежа скота в некоторых хозяйствах Краснооктябрьского района_

Название хозяйства 2009 2010 2011

Поголовье Пало всего В т.ч. молодняк Поголовье Пало всего В т.ч. молодняк Поголовье Пало всего В т.ч. молодняк

ООО «Развитие» 550 18 2 471 59 25 508 5 3

ООО «Трехозерское» 468 16 - 415 34 32 300 10 4

СПК «Пошатовский» 500 1 - 503 3 2 446 27 15

Анализ имеющейся ветеринарной документации показал, что падеж в хозяйствах происходил на фоне нарушений условий содержания и кормления: высокая скученность, совместное содержание животных различных половозрастных групп, загазованность и недостаточная освещенность помещений, отсутствие активного моциона в зимне-стойловый период, а также не сбалансированность рациона кормления по питательным веществам, микро- и макроэлементам, кормление недоброкачественными кормами. Например, при исследовании зернофуража из ООО «Развитие» Сергачская межрайонная ветлаборатория неоднократно выявляла рост грибов из род Mucor и Aspergillus. При исследовании силоса из этого же хозяйства отмечали повышенное содержание масляной и пониженное содержание молочной кислот.

При патологоанатомическом вскрытии павших взрослых животных выявляли цирроз печени, геморрагическое воспаление слизистой оболочки сычуга, тонкого и толстого отделов кишечника, поражение легких и атрофию селезенки. При вскрытии павших телят в основном выявляли поражение желудочно-кишечного тракта. При бактериологическом исследовании патологического материала в разное время выделялись в основном Е. coli диплококки, стрептококки и стафилококки. Выделенные бактерии были чувствительны к антибиотикам пенициллинового и тетрациклинового ряда.

Принимая во внимание роль и значение возникновения эшерихиозов, мы проводили исследования по определению показателей естественной резистентности у новорожденных телят. Для исследований в СПК «Пошатовский» подобрали 10 новорожденных телят 2-4 - дневного возраста без признаков заболевания желудочно-кишечного тракта, а также 10 голов телят того же возраста, но у них были признаки желудочно-кишечной болезни.

Для проведения исследований использовали цельную кровь й сыворотку крови подопытных животных. Результаты исследований показали, что абсолютное количество лейкоцитов было снижено у больных телят на 17,6%, лимфоцитов — на 32,7%, относительное количество Т-лимфоцитов - на 25,5% и В-лимфоцитов - на 51,0%, уровень IgG - на 24,5%, IgM - на 59,2% ниже среднего значения физиологической нормы. Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов были ниже среднего показателя физиологической нормы на 16,8%, бактерицидной активности сыворотки крови - на 21,2%, а лизоцимной активности - на 59,7%.

При этом следует отметить, что у здоровых телят все эти же показатели были на нижней границе физиологической нормы.

Таким образом, клеточные и гуморальные факторы естественной резистентности новорожденных телят с желудочно-кишечными болезнями бактериальной этиологии, характеризуются снижением их содержания по сравнению с физиологической нормой. Учитывая, что характер и интенсивность иммунологических процессов могут быть модулированы с применением фармакологических и биологических препаратов мы изучали влияние ксимедона на иммунологический статус новорожденных телят.

Опыты проводили в условиях С ПК «Пошатовский» на 20 новорожденных телятах с начальными признаками желудочно-кишечной болезни. Животных разделили на две группы по 10 гол.

Телятам первой группы на 2 и 4-й день после рождения вводили ксимедон из расчета 30 мг/кг живой массы. Предварительно готовили стерильный раствор ксимедона на фосфатном буфере MIS pH 7-7,4 в объеме 2 мл на каждое введение. Контрольной группе телят вводили фосфатный буфер в объеме 2 мл.

Для проведения исследований использовали цельную кровь и сыворотку крови подопытных животных.

Исследования на наличие инфекций (вирусных и бактериальных) в хозяйстве проводили в районной и областной ветеринарной лаборатории. При бактериологическом исследовании проб фекалий (ф) от 10 здоровых, 15 больных телят и из патологического материала (п/м) от 5 павших телят были выделены изоляты микобактерий (Proteus vulgaris - в 8,0% случаях (ф) и 20,0% (п/м), Clostridium perfringens - в 4,0% случаях, Stahylococcus aureus - в 8,0% (ф). E.coli выделены в 60,0% случаях (ф) и 40,0% (п/м) исследуемых проб, их культуры были типированы как группа 1, серотипы 022,082. Установлено, что к «бензилпенициллину», «неомицину» и «гентамицину» чувствительны стафилококки и эшерихии. К окситетрациклину и тиумулину чувствительны стафилококки, эшерихии, клостридии и протеи. В результате исследования патологического материала у 5 павших телят на наличие рота-, короновирусной инфекции методом иммуноферменгаого анализа получены отрицательные результаты.

Для оценки естественной резистентности, клеточного и гуморального иммунитета выбирали 20 клинически здоровых телят 4-6-дневного возраста, из которых 10 телятам вводили ксимедон.

Установлено, что у новорожденных телят с признаками колибактериоза наблюдается снижение показателя естественной резистентности. У таких животных снижено абсолютное количество лейкоцитов, лизоцимная активность, содержание иммуноглобулинов IgG, IgM по сравнению физиологической нормы. Двукратное введение телятам ксимедона из расчета 30 мг/кг живой массы способствует восстановлению изученных показателей. При этом заметно повышается бактерицидная и лизоцимная активность, фагоцитарная активность лейкоцитов, содержание общего белка и его фракций, что указывает на стимулирующую роль ксимедона на иммунобиологическую реактивность организма.

Результаты исследований представлены в табл. 5.

Таблица 5 - Показатели иммунного статуса новорожденных телят 4-6-

дневного возраста (М±т; п=10; р<0,05) _

I Группы животных

Показатели Контрольная группа Группа обработанная ксимедоном Физиологическая норма на 5-6 день жизни (цитируемая по А.Ю.Кассич, 1985)

1 2 3 4

Бактерицидная активность, % 33,6±3,40 36,8±0,7 30,0-36,0, сред.=4,0

Лйзоцимная активность, % 2,2±0,22 4,5±0,1 3,5-4,5, сред.=4,0

Фагоцитарная активность лейкоцитов, % ■ 11,7±1,34 16,7+1,68 10,5-12,8, сред. =11,7

Фагоцитарное число, (м.т.) 5,8±0,55 7,9+0,65 5,5-6,8, сред.=6,15

Лейкоциты, 10у/л 6,1±0,11 8,5±0,27 7,5-8,2, сред.=7,85

1 2 . 3 4 ■

Лимфоциты, % , : 40,1 ±1,90 43,3±1,27 36,5-44,5, сред.=40,5

Т-лимфоциты, % 27,9±2,84 29,7± 1,77 27,5-29,5, сред.=28,5

В-лимфоциты, % 4,5±0,22 5,5±0,64 4,5-5,5, сред.=5,0

^С, г/л 13,7±0,56 18,4±1,7 14,2-17,1, сред.=15,8

1яМ, г/л 2,0±0,01 2,8±0,3 2,2-2,8, сред.=2,5

Общий белок, г/л 52,2±0,96 62,1 ±0,2 52,0-64,0, сред.=58

Для изучения передачи специфических антител от матери телятам опыты проводились в условиях хозяйств Краснооктябрьского района Нижегородской области: ООО «Трехозерское» и СПК им. 1 мая. В каждом хозяйстве в опыт были взяты по 3 коровы, иммунизированные против ПГ-3, ИРТ и ВД-БС. Вакцина изготовлена в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». От каждой группы опытных коров были получены новорожденные телята. При этом для исследования сывороток крови у телят кровь брали до и после получения ими молозива. Сыворотки крови коров-матерей и новорожденных телят исследовали на наличие антител к вирусам парагриппа-З (ПГ-3) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи болезни слизистых (ВД-БС) в иммуно ферментном анализе в условиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» совместно с ведущим научным сотрудником, к.в.н. Гумеровым В.Г.

Установлено, что в сыворотках крови коров-матерей антитела обнаруживались в различных титрах (табл. 6).

Анализ результатов исследований сывороток крови телят, до и после получения ими молозива от своих вакцинированных коров-матерей показал значительно отличающиеся данные.

Так, у новорожденных телят в ООО «Трехозерское» у двух телят до выпойки им молозива антитела отсутствовали, а после выпойки им молозива у

двух антитела выявлены на уровне антител у матерей 1:160 и 1:400 к вирусам ПГ-3 и ВД-БС, а к возбудителю ИРТ они отсутствовали.

Таблица 6 - Результаты исследований сывороток крови коров-матерей на наличие антител __^_

Наименование хозяйства № жив. Титр антител

ПГ-3 ИРТ ВД-БС

ООО «Трехозерское» 1 1 160 1 400 1 400

2 1 160 1 160 1 800

3 1 160 1 400 1 400

СПК им. 1 мая 1 1 320 1 800 1 400

2 1 160 1 800 1 400

3 1 320 1 800 1 400

Приведенные данные подчеркивают справедливость мнения А.Г. Шахова (2001) о необходимости дальнейших, углубленных исследований по установлению прямой зависимости между уровнем неспецифической и специфической резистентности организма коров и внутриутробным развитием плода, состоянием здоровья новорожденных телят.

3 Теоретическое обоснование создания препаратов нового поколения для профилактики и лечения телят и поросят при колибактериозе

В настоящее время в нашей стране и за рубежом производят большое количество вакцин против эшерихиоза, содержащих от 2 до 6 антигенов (цельноклеточные, ослабленные, инактивированные), приготовленные как из местных, так и из широкораспространенных штаммов; токсоиды (анатоксины); субъединичные - из пили, выделенные из штаммов - продуцинтов указанных вакцин.

Для профилактики колибактериоза в США использовали трехвалентный бактерии, приготовленный из инактивированных энтеротоксигенных штаммов Е. coli, способных продуцировать К88, К99 и 987Р антигены. Смертность в вакцинированной группе была в 8 раз меньше, чем в контроле (То S. е.а., 1983). В ФРГ для профилактики эшерихиоза поросят применяли вакцину, содержащую 4 штамма с антигенами К88, К99, 987Р и F41, которая снижала процент больных диареей с 70 и 90 до 0 и 6 соответственно (Cieslidn М., 1989). При вакцинации бактерин-токсоидом новорожденных поросят наблюдали стимуляцию продукции антител против наиболее важных пилезных антигенов (К88, К99, 987Р и F41) Е. coli (Huebert М. е.а., 1989). Применение вакцины против колибактериоза из очищенных пилей типа 1 и цельноклеточной вакцины, содержащей антигены К88, К99 и 987Р, а также пили типа 1, приводило к существенному снижению смертности от эшерихиоза поросят (То S. е.а., 1983).

Первая коммерческая вакцина из антигенов - пили была получена в Нидерландах в 1979 г. начали выпускать вакцину против диареи поросят, содержащую К88аб, К88ас и TJI-токсин. В 1983 г. в США методом генной

инженерии была получена новая вакцина «Ecogen» против эшерихиоза поросят, содержащая пили трех штаммов Е. coli - К88, К99, 987Р. Использование указанных вакцин обеспечивало снижение смертности от колидиареи с 61% до 5%.

В связи с открытием нового, четвертого антигена пилей энтеротоксигенных Е. coli, близкородственного или идентичного антигену F41, возникла необходимость выяснения возможности существования бактеринов, обеспечивающих защиту поросят против несущего такой антиген энтеротоксигенного Е. coli свиного происхождения. У супоросных свиноматок, вакцинированных 4-пили бактерином (К88, К99, 987Р и F41) отмечено появление существенно более высоких уровней сывороточных и колостральных антител, чем у свиноматок, вакцинированных 3-пили бактерином энтеротоксигенных Е. coli, содержащим 3 антигена пилей: К88, К99 и 987Р (Попов Е.М., 1991).

Следовательно, благодаря достижениям в области иммуногенетики и генной инженерии, в последние годы получены новые данные об эшерихиозе. Установлены факторы патогенности Е. coli, вызывающей диарею поросят, пили - антигены и энтеротоксины. Эти новые сведения о возбудителе болезни позволяют раскрыть механизмы патогенеза и создать более совершенные субъединичные вакцины. .

Однако существующие способы специфической профилактики и лечения эшерихиоза все еще несовершенны, когда часто отмечается недостаточная напряженность иммунитета, связанная с множеством серотипов Е. coli, вызывающие диарею телят и поросят. Ценность химио- и антибиотикотерапии для телят и поросят также часто сошштельна. Обеспечить защиту от заболевания молодняка в первые дни их жизни можно лишь путем пассивной иммунизации, применяя гипериммунные сыворотки или гомологичные иммуноглобулины в первые дни жизни, трансфузия крови от матери или иммунизированной коровы, а также терапевтическое и профилактическое применение специфических гипериммунных сывороток.

Отечественной биологической промышленностью выпускаются «Поливалентная антитоксическая сыворотка против паратифа и колибациллеза телят, ягнят, овец и птиц». Основными недостатками указанных лечебно-профилактических сывороток являются низкий титр антител или полное отсутствие их к адгезивным антигенам К88, К99, 987Р и F41, а также TJI- и ТС-энтеротоксинам (Малахов ЮЛ. и др., 1993).

Однако наличие большого множества серотипов, сложная антигенная структура возбудителя эшерихиоза, несмотря на определенные успехи в борьбе с колидиареей молодняка сельскохозяйственных животных, до настоящего времени вопросы специфической профилактики и лечения данной патологии остаются несовершенными.

Анализ литературы показывает, что для конструирования антиэшерихиозного профилактического (вакцинного) препарата является использование не цельноклеточных, а субъединичных вакцин на основе

адгезивных антигенов, полученных из очищенных пилий (фимбрий) из наиболее важных штаммов К88, К99, 987Р и F41. При этом, с учетом литературных данных о том, что сочетание антигенов с иммуномодуляторами ведет к существенному повышению иммунного ответа, мы поставили перед собой задачу получения комплексных антигенов на основе пилезных антигенов и продуктов пчеловодства, как одного из эффективных иммуномодуляторов, а в качестве депонирующих агентов -субъединичные фракции природных адсорбентов - монтмориллонитов.

Следовательно, разработка композиционного полиглобулинового комплекса, включающего глобулины, продукты пчеловодства, продукты метаболизма пробиотических микроорганизмов и природные адсорбенты, а также полиантигенного комплекса на основе антиадгезивных пилезных (фимбриальных) антигенов в сочетании хитин-хитозансодержащими (продукты пчеловодства) и высокодисперсными депонирующими агентами природными адсорбентами (класс монтмориллонитов), представляется вполне реальной и перспективной, что и явилось предметом наших исследований, результаты которых приведены в последующих разделах диссертации и автореферата.

3.1 Изготовление полиантигенного комплекса на основе пилезных антигенов и иммуномодуляторов

В качестве продуцентов адгезивных антигенов (пилий) использовали референтные энтеротоксигенные штаммы Е. coli: «ПЛ-6» - синтезирующий адгезивный антиген К88, «КВ-1» - синтезирующий адгезивный антиген К99, «УК-2» - синтезирующий адгезивный антиген 987Р и «ПЗ-З» - синтезирующий адгезивный антиген F41, выделенные из организма больных эшерихиозной диареей поросят и телят, хранящиеся в лаборатории коллекции микроорганизмов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Изолирование и очистку пили осуществляли согласно методике, разработанной Kuzuya М. et al. (1988).

В результате проведенных исследований на этом этапе работы нами были получены 4 пили - антигены Е. coli (К88, К99, 987Р и F41), которые стандартизировали по белку до 10%-ной концентрации и оставляли на хранение для конструирования комплексной субъединичной (пилезной) вакцины.

Учитывая, что в настоящее время в ветеринарной и медицинской практике широко применяются иммуномодуляторы различного происхождения для повышения иммунного ответа организма на введение любого антигена, в следующей серии опытов проводили исследования по отбору оптимальных модулирующих препаратов, которые были бы более активными по сравнению с известными и не оказывали бы инактивирующего воздействия на серологическую (антигенную) активность полученных пили антигенов.

С учетом сообщений ряда авторов о том, что совместное применение Т-активина и инактивироваиной вакцины против колибактериоза приводит к

повышению иммунного ответа организма (Гаффаров Х.З. и др., 2002), в качестве одного из испытуемых иммуномодуляторов мы выбрали препарат Т-активин.Как известно Т-активин представляет собой препарат полипеггтидной природы, получаемый из вилочковой железы (тимуса) крупного рогатого скота. Кроме того в опытах использовали новый препарат апизан, полученный в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

По данным литературы апизан способен прочно удерживать в своей структуре растворитель, а также растворенные и взвешенные в нем вещества, поэтому апизан обладает более выраженными сорбционными свойствами в растворенном виде, способен связывать (адсорбировать) большое количество органических нерастворимых веществ, в том числе бактериальные клетки, антигены, токсины, а также токсины, образующиеся в тонком и толстом отделе кишечника.

Вышеперечисленные уникальные свойства хитозана (апизана) послужили основанием для использования его в качестве одного из потенциальных адъювантов (иммуномодуляторов и иммуностимуляторов) при конструировании антиэшерихиозных лечебно-профилактических препаратов.

Для конструирования субъединичных противоэшерихиозных 4-пили вакцин, 0,1%-ные пили-антигены в равных объемах смешивали друг с другом и добавляли к СМеси антигенов равные объемы ■ соответствующих иммуномодуляторов (0,01%-ные растворы тимогена, Т-активИна и апизана), а в качестве депонирующих иммуносорбентов - (гидросиликаты алюминия и мошмориллонитовую высокодисперсную фракцию природного минерала -бентонита.

В результате исследований нами были сконструированы пять вариантов субъединичных противоэшерихиозных вакцинных препаратов. При этом экспериментальный образец вакцины.№ 1 представляет собой полиантиген, содержащий в 1 мл (по 1 мг каждого) пилезные антигены К88, К99, 987Р и Б41 и 1 мг адьюванта тимогена. Состав вакцины № 2 аналогичен, но с той разницей, что в качестве адьюванта содержит 1 мг Т-активина. Вакцина № Зимеет тот же антигенный состав, но включающий в качестве адьюванта биополимер - апизан в количестве 1 мг/мл и 1 мг высокодисперсной фракции бентонита; состав вакцины № 4 аналогичен предыдущим, но с той разницей, что в качестве адьюванта содержит 1 мг гидроокиси алюминия (ГОА) и состав вакцины № 5 аналогичен предыдущим, но с той разницей, что в качестве адьюванта содержит 1 мг высокодисперсной фракции монтмориллонита.

Полученные на предыдущем этапе работы антигенные комплексы на основе пили - антигенов и адъювантов, были использованы в качестве иммунизирующих средств с целью получения лечебных антиэшерихиозных сывороток. Основанием для проведения этих исследований явилось то, что результаты изучения антигенности и иммуногенности полученных антигенных комплексов показали, что они, будучи введенными в организм, способны индуцировать синтез антител с различной иммунологической компетентностью, обладающие поликлональными свойствами, осуществляя

поликлональную активацию В-лимфоцитов и осуществить синтез специфических аитиэшерихиозных антител (P.P. Гайзатуллин, 2012).

С учетом изложенного и с целью получения экспериментальных образцов поликлональных антител, обладающих лечебно-профилактическими свойствами при изучаемой патологии (эшерихиозной интоксикации), опыты проводили на 20 кроликах.

В результате проведенных исследований были получены 12 образцов кроличьих антисывороток и 7 образцов элюатов из органов животных -реконвалесцентов.

Из гипериммунных сывороток и элюатов из органов выделяли глобулины методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Полученные сывороточные и тканевые иммуноглобулины, после скрининговых исследований, были использованы в качестве основных компонентов при конструировании противоэшерихиозных лечебных препаратов.

3.1.1 Первичная оценка эффективности потенциальных иммунопрофилактических препаратов в модельной in vitro тест-системе

Перед- началом основных опытов по оценке иммунопрофилактической эффективности испытуемых экспериментальных образцов субъединичных противоэшерихиозных пили антигенов Е. coli, изучали чувствительность культуры клеток (лимфоцитов) к патогенному агенту - эшерихиозному эндотоксину, полученному из энтеротоксигенного штамма Е. coli «КВ1». При этом исходили из того, что летальная доза (ЛДюо) эшерихиозного эндотоксина, полученного из указанного вирулентного штамма кишечной палочки, для белых мышей составляла 7,9 мг (39,5 мг/кг), в модельных опытах на культуре клеток испытывали различные концентрации токсина в диапазоне доз от 1 до 100 мкг/мл с шагом 10 мкг (P.P. Гайзатуллин, 2012).

Для определения летальных доз эндотоксина Е. coli для тест-культур клеток, испытуемые концентрации эндотоксина и лимфоциты инкубировали в стандартной питательной среде при 37°С в течение 24 ч, затем во флаконы с культивируемыми клетками вносили испытуемые концентрации энтеротоксина Е. coli и вновь инкубировали в течение 24 ч при указанной температуре.

В качестве критерия оценки жизнеспособности клеток на фоне воздействия на них испытуемого энтеротоксина использовали выживаемость и гибель иммуноцитов, выражая конечный эффект в количестве или процентах погибших или выживших лимфоцитов.

Результаты цитометрирования окрашенных эритрозином мазков культур клеток показали, что внесение в инкубационную среду энтеротоксина Е. coli «КВ1» в концентрации 42,59 мкг/мл последовало полное (99,07%) ингибирование роста культуры клеток (лимфоцитов). Поэтому при моделировании поражения клеток эндотоксином Е. coli использовали концентрацию токсина 42,6 мкг/мл.

Исследования показали, что гибель клеток тест-культуры наступает при внесении в суспензию клеток лимфоцитов эшерихиозного энтеротоксина в концентрации 42,6 мкг/мл.

Параллельно изучали влияние испытуемых иммунопротекторов -субъединичных вакцинных препаратов - пили антигенов К88, К99, 897Р и F41 на жизнеспособность культуры клеток - лимфоцитов при совместном культивировании иммуногенов и испытуемых препаратов. Результата исследований показали, что внесение в инкубационную среду с лимфоцитами испытуемых антигенов в концентрациях от 1 до 1000 мкг/мл токсического действия не оказывало - в окрашенных эритрозином мазках увеличения количества окрашенных (нежизнеспособных) клеток по сравнению с контролем не происходило. С учетом полученных результатов концентрации вносимых в инкубационные среды испытуемых субъединичных антигенов, в зависимости от состава испытуемых вакцинных препаратов, составляли от 10 до 50 мкг/мл.

Полученные в предварительных опытах данные по определению летальных доз эшерихиозного эндотоксина для клеток in vitro тест-системы (лимфоцитов) и оптимально переносимые дозы испытуемых антигенов на культивируемые клетки послужили основанием для проведения скрининговых исследований по определению протективной активности антигенов.

Для этой цели в культивируемую лимфоциты среду вносили различные концентрации (10, 20, 30, 40, 50 мкг/мл) антигенов, затем инкубировали лимфоциты в течение 4 ч и по истечении указанной экспозиции в эти же среды вносили по 42,6 мкг/мл эшерихиозного энтеротоксина, лимфоциты повторно инкубировали в течение 4, 24 и 48 ч в присутствии энтеротоксина. По истечении указанных экспозиций оценивали защитный эффект испытуемых антигенов путем подсчета живых (неокрашенных) и нежизнеспособных (окрашенных) клеток по сравнению с контролем.

Результаты микроцитометрического анализа мазков показали, что предварительное внесение в инкубационную среду испытуемых антигенов за 4, 24 и 48 ч до поступления в питательную среду поражающего агента (энтеротоксина Е. coli) и последующая инкубация обработанных испытуемыми протекторами (субъединичными антигенами) оказывала защитный эффект, который зависел от состава испытуемого антигенного препарата.

Установлено, что наиболее высокой протективной активностью из испытанных вариантов экспериментальных образцов вакцин обладали субъединичная 4-пшга вакцина № 3, изготовленная путем смешивания равных объемов 0,1%-ных растворов антигенов К88, К99, 987Р и F41 + 0,1%-ный апизан + 0,1%-ная высокодисперсная фракция монтмориллонита (0,6%-ный раствор антигенов, иммуномодулятора и иммуносорбента), которая обеспечивала защиту от эшерихиозной гибели 75,6% лимфоцитов.

В другой серии опытов проводили первичную оценку иммунотерапевтической активности сывороточных и тканевых глобулинов.

Для первичной оценки лечебной эффективности полученных в предыдущей серии экспериментов сывороточных и тканевых глобулинов, во второй серии опытов использовали ту же in vitro модель - клеточную культуру лимфоцитов.

Для моделирования поражения иммуноцитов эндотоксином, в инкубационную среду с лимфоцитами вносили эндотоксин Е. coli в концентрации 42,6 мкг/мл (ЛД70), затем инкубировали лимфоциты в течение 30 мин и по истечении указанной экспозиции вносили испытуемые лечебные препараты (сывороточные и тканевые - гисто глобулины) в количестве от 0,010 до 0,020 мг/мл, инкубировали в течение 4,24 и 48 часов.

Установлено, что из испытанных иммуноглобулинов, наиболее высокой иммунопротекторной активностью обладала антисыворотка, полученная на 30 сут опыта от выживших после экспериментального заражения возбудителем эшерихиоза животных, которая обеспечивала выживаемость 85,9% пораженных энтеротоксином Е. coli лимфоцитов при совместном культивировании подвергнутых токсическому воздействию клеток с испытуемыми глобулинами.

В результате проведенных афининговых исследований установлено, что из испытанных 20 потенциальных иммунотерапевтических препаратов (сывороточных и тканевых глобулинов), в модельной in vitro тест-системе обладали наиболее высоким иммунотерапевтическим потенциалом три препарата: 1) антисыворотка, полученная от переболевших и выживших после экспериментального заражения возбудителем эшерихиоза животных — реконвалесцентов; 2) антисыворотка, полученная от 1-кратно иммунизированных 4-пили антигеном (субъединичной 4-пили вакциной) животных и 3) гистоглобулины, полученные из элюатов печени (или почек, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга, скелетных мышц) выживших после экспериментального эшерихиоза животных — реконвалесцентов.

В целом препараты при совместном постинкубационном культивировании лимфоцитов обеспечивали 79,3-85,9%-ную выживаемость пораженных энтеротоксином Е. coli иммуноцитов. Поэтому указанные глобулины были отобраны в качестве основных компонентов для конструирования антиэшерихиозных лечебных препаратов.

В результате проведенных на этом этапе исследований, целью которых являлось изучение возможности повышения биологической активности антиэшерихиозных полиглобулинов путем использования биологически активных веществ - усилителей зоогенного, фигогенного, микробного и минерального происхождения, установлено, что добавление в определенных соотношениях к базовому препарату — полиглобулинам на основе иммунных антиэшерихиозных сывороток экстракта из натуральной биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце М» (аписоген), продукта метаболизма бифидобактерий (бифидоген), природного сорбционно-детоксицирующего агента монтмориллонита, оказывало усиливающее действие на базовый компонент (полиглобулины), повышая выживаемость

пораженных эшерихнозным энтеротокснном лимфоцитов при постинкубационном культивировании их с полученной многокомпонентной композицией.

Таким образом, стандартизированный окончательный вариант комплексного полиглобулино-аписогенного, бифидогенного и минералосорбционного препарата, который сокращено назван «Пабисорб» (полнглобулиновый, аписогенный, бифидогенный и сорбционный), представляет собой 10%-ный раствор, содержащий в 100 мл 6800 мг полиглобулинов, 1200 мг сухих экстрактивных веществ препарата «Вита-Форце М», 200 мг продуктов метаболизма В. ЫАёиш и 1800 мг высокодисперсной фракции монтмориллонита.

3.2 Изучение влияния композиционного препарата «Пабисорб» на организм интактных животных

3.2.1 Изучение токсичности и безвредности препарата «Пабисорб» на организм

Для изучения острой токсичности использовали 10%-ный раствор инъекционной формы препарата, содержащего 10,0 мг/мл активно действующего вещества (АДВ). Исследования проводили в условиях областной ветеринарной лаборатории.

Опыты проводили на 50 белых мышах массой 18-20 г обоего пола, разделенных на 10 групп по 5 животных в каждой. Мышам 1-й группы препарат вводили перорально в дозе 500 мг/кг (10 мг на мышь), 2-й - 1000,3-й - 1500, 4-й - 2000, 5-й - 2500, 6-й - 3000, 7-й - 3500, 8-й - 4000, 9-й - 4500 мг/кг, 10-я группа животных служила контролем. Препарат давали внутрь в объеме от 0,1 до 0,9 мг. Установлено, что в первых 5 группах мышей, получавших 2500 мг/кг препарата, наблюдали гибель двух из 5 использованных животных. Расчеты ЛД50, проведенные по Г.Н. Першину (1971) показали, что ЛД50 для белых мышей при пероральном поступлении составляла 3047 мг/кг.

Во втором варианте опытов изучали токсичность препарата при парентеральном (подкожном) введении его белым мышам (50 животных) с использованием тех же доз испытуемого препарата. Установлено, что при однократном подкожном введении препарата ЛД50 для белых мышей составила 2635 мг/кг. Полученные данные свидетельствуют о низкой токсичности препарата «Пабисорб» и согласно ГОСТу 12.1.007-76 соответствует IV классу опасности.

Поскольку порошковая форма препарата предполагает длительное использование его в виде кормовой добавки, в следующей серии опытов изучали влияние препарата «Пабисорб» при длительном пероральном поступлении в организм. Для этой цели опыты проводили на 20 крысятах -отъемышах, исходной живой массой 43+2 г и разделенных на 2 группы по 10 животных в каждой. Крысята 1-й группы получали препарат ПАББ из расчета 100 мг/кг корма, животные 2-й группы получали обычный рацион без кормовой добавки. Препарат скармливали в течение 30 суток.

Динамические наблюдения за животными показали, что крысята опытной группы с охотой принимали корм с добавкой, проявляли повышенный аппетит, были более активными, имели более опрятный внешний вид, темпы роста у получавших кормовую добавку крысят были выше, чем у контрольных животных (табл. 7).

Таблица 7 - Росто-весовые показатели крысят на фоне кормления их апифитопрепаратом «Пабисорб» __■

Срок исследования, сут Группа животных

контрольная опытная

масса, г привес, г масса, г привес, г

Исход 44,8+0,17 - 45,0+0,11 -

3 56,5±1,9 13,0 55,9±0,33 12,1

7 77,1 ±0,7 31,1 .71,5*1,5 28,7

10 97,9±2,1 52,3 89,7±2,7 44,9

14 112,3±2,9 67,1 109,3±1,8 64,3

21 152,9±3,7 106,3 143,9±2,5 98,9

30 183,1+2,3 136,1 161,9+2,1 116,7

Из представленных в таблице материалов видно, что у крысят, подучавших препарат «Пабисорб» в течение месяца, наблюдалось увеличение общей живой массы на 21,2 г (11,3%), а привесов - на 19,4 г (11,7%), чем у крысят, получавших обычный рацион (контроль).

Таблица 8 - Влияние препарата «Пабисорб» на систему крови крысят при длительном (30 сут) поступлении его в организм в составе рациона_

Показатель Группа крысят

контрольная опытная

1 2 3

Гемоглобин, г/л 139,1 ±0,3 145,8±0,5

Гематокрит 32,9±0,7 37,0±0,3

Общий белок, г/л 59,8±0,1 67,9±0,7

Лейкоциты, 107л 13,3±0,3 13,5±0,1

Эритроциты, 10|2/л 6,9±0,1 6,5±0,5

Базофилы, % 0 0

Эозинофилы, % 1,8±0,05 1,9±0,1

Нейтрофилы:

Юные, % 0 0

Палочкоядерные, % 2,5 2,8

Сегментоядерные, % 19,7±1,5 20,1+1,1

Лимфоциты, % 67,1±1,7 67,5±2,1

Моноциты,% 4,8±1,9 5,1±1,5

Результаты параллельных гематологических исследований крысят, получавших в составе рациона испытуемый препарат, показали, что

длительное скармливание (в течение 30 сут) крысятам глобулино-апифитопрепарата гематоксического действия на систему гемопоэза не оказывало (табл. 8).

С целью изучения характера патоморфологических изменений в органах и тканях животных на фоне длительного кормления их препаратом ПАББ, по окончании срока кормления (через 30 сут после начала опытов), животные опытной и контрольной групп были убиты и извлечены внутренние органы (тимус, селезенка, надпочечники) для определения их развития.

Результаты исследований показали, что длительное поступление изучаемого препарата в организм морфологических изменений не вызывало. Результаты определения развития (коэффициента) внутренних органов показали, что длительное поступление испытуемого препарата в составе рациона сопровождалось более интенсивным увеличением массы, тимусного, селезеночного и надпочечного индексов крысят.

3.2.2 Оценка влияния препарата «Пабисорб» на факторы неспецифической резистентности организма

Опыты проводили на 20 белых крысах массой 170-200 г, разделенных на 2 группы по 10 животных в каждой. Животным опытной группы испытуемый препарат вводили внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг в виде 0,5%-ного экстракта в течение 10 суток. Через 10, 20 и 30 сут после введения препарата брали пробы крови и изучали функциональную активность перитониальных макрофагов и нейтрофилов, лизоцимную, общую бактерицидную активность сыворотки крови, а также определяли содержание общего белка, альбуминов, а-, р-, у-глобулинов.Результаты проведенных исследований приведены в таблице 9.

Из представленных в таблице материалов видно, что внутрижелудочное поступление препарата «Пабисорб» в организм белых крыс в дозе 25 мг/кг в течение 10 дней оказывало стимулирующее влияние на факторы неспецифической защиты, увеличивая содержание общего белка в 1,15 раза, альбуминов - в 1,08, а-глобулинов -1,11, Р-глобулинов - 1,24, у-глобулинов -1,21, бактерицидной активности - 1,04, лизоцимной - 1,14, ФАН - 1,05, ФЧ -1,05 и ФИ-1,03 раза.

Таблица 9 - Влияние препарата «Пабисорб» на показатели неспецифической резистентности организма (НРО) белых крыс_п=20

Показатель НРО Стат. Срок исследования, сут

показа 10 20 30

тель опыт контроль опыт контроль опыт контроль

1 2 3 4 5 6 7 8

Общий белок, г/л М+ ш 5,92* 0,009 5,51 0,03 6,18* 0,01 5,51 0,03 6,38* 0,005 5,53 0,01

Альбумины, г/л м+ ш 2,34* 0,08 2,1 0,009 2,39* 0,01 2,0 0,008 2,38* 0,02 2,2 0,01

а-глобули-ны, г/л м+ т 1,61 0,01 1,49 0,02 1,65 0,05 1,5 0,03 1,68 0,01 1,51 0,03

1 2 3 4 5 6 7 8

р-глобули-ны, г/л м+ ш 1,15 0,07 0,96 0,009 1,18 0,08 0,95 0,007 1,2 0,09 0,97 0,008

7-глобули- . ны, г/л м+ т 1,06 0,08 0,96 0,03 1,09 0,05 0,98 0,01 1,15 0,05 0,95 0,01

БАСК, % м+ ш 50,4 0,37 48,7 0,21 51,9 1,81 49,0 0,95 51,11 1,07 49,1 0,97

Лизоцимная активность, % мц т 15,5 0,98 14,1 0,91 15,9 1,01 14,3 1,31 16,15 0,98 14,5 1,97

ФАН, ед м+ т 60,3 0,75 58,8 0,85 60,5 0,35 59,0 0,63 61,09 0,81 59,0 0,61

ФЧ, ед м+ ш" 2,25 0,006 2,18 0,01 2,26 0,008 2,20 0,03 2,29 0,009 2,19 0,003

ФИ, ед М+ т1 3,75 0,05 3,68 0,03 3,77 0,01 3,63 0,08 3,79 0,06 3,69 0,05

* - Р<0,05

Для объективной оценки воздействия на организм (особенно, на растущий)" фармакологических средств, нами были проведены опыты по изучению влияния разработанного композиционного препарата на систему иммуногемопоэза, принимающую активное участие в ответной адаптационной реакции на стрессирующее воздействие биологических агентов.

3.23 Влияние препарата «Пабисорб» на систему иммуногемопоэза

Опыты по оценке влияния препарата на иммуногематологаческие показатели организма проводили на 20 крысятах-отъемышах, разделенных на 2 группы по 10 животных в каждой. Крысята 1-й группы получали ежедневно в течение 10 дней перорально жидкую форму препарата «Пабисорб» в дозе 25 мг/кг. Крысята 2-й группы препарат не получали — они служили контролем.

Для изучения иммуноморфологического состава крови у животных в динамике (исход, через 5 и 10 дней) брали пробы крови из хвостовой вены и определяли содержание эритроцитов, лейкоцитов путем подсчета их количества в камере Горяева и качественной характеристики клеток путем анализа окрашенных по Романовскому-Гимза мазков.

Результаты гематологических исследований приведены в таблице 10.

Таблица 10 - Результаты изучения влияния препарата «Пабисорб» на систему крови крысят__"

Показатель Срок исследования, сут

исход через 5 сут через 10 сут

Эритроциты, Ю'"Ул 6,09±0,35 6,01+0,3 6,17±0,01

Гемоглобин, г/л . 92,9±0,5 95,1+0,1 104,8+1,8

Цветной показатель 0,74±0,3 0,65+0,8 0,57±0,5

Лейкоциты, 109/л 14,7±0,1 15,3±0,5 15,8±0,3

Лимфоциты, % ■ 69,1±0,3 70,0±1,1 72,5±0,1

1 2 3 4

Палочкоядерные нейтрофилы 5,2±0,5 6,5±1,3 7,3±1,5

Сегментоядерные нейтрофилы 20,9+1,7 18,9±2,1 17,3±1,8

Юные нейтрофилы 1,1±0,1 0,8±0,3 0,6±0,1

Эозинофилы, % 1,3±0,5 1,1±0,1 0,7±0,09

Базофилы, % 0,1±0,03 - -

Моноциты,% 0,7+0,1 1,2+0,3 2,0±0,1

Из данных таблицы видно, что поступление в организм крысят препарата «Пабисорб» оказывало положительное влияние на гематологические показатели, вызывая увеличение содержания в крови эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, лимфоцитов и уменьшение юных форм нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, которые приближались к таковому у здоровых взрослых животных. Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии использованного препарата на систему гемопоэза у растущих животных.

Результаты изучения влияния экспериментального , образца многокомпонентного композиционного препарата «Пабисорб». на организм интактных (здоровых) животных показали, что он является малотоксичным (IV класс опасности), оказывает стимулирующее влияние на факторы неспецифической резистентности организма, которые в совокупности могут обеспечить эффективную защиту организма в условиях воздействия на негр инфекционных агентов.

3.3 Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для телят

Производственное комиссионное испытание эффективности разработанной нами субъединичной вакцины против колибактериоза, проводили в условиях СПК им. 1 Мая Краснооктябрьского района Нижегородской области, неблагополучного по колибактериозу телят.

Предварительно испытанием в условиях областной ветеринарной лаборатории было установлено, что испытуемая вакцина безвредна, стерильна, обладает антигенной активностью в ИФА. Под опытом находилось 30 стельных коров черно-пестрой породы, разделенных на 3 группы. Коров (10 гол.) 1-й группы иммунизировали подкожно субъединичной 4-пили вакциной в дозе 5 мл за 6 недель до отела в соответствии с «Методическими указаниями по диагностике, профилактике и лечению колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнолопш», утвержденными Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии РФ 07.10.2013 года. Коровам 2-й группы (10 гол.) аналогичного срока стельности вводили внутримышечно, двукратно с интервалом в 14 дней в дозе по 15 мл на каждое введение формолвакцину поливалентную гидроокисьалюминиевую (ФВ ПВ ГОА) против колибактериоза (эшерихиоза) телят и ягнят согласно действующей инструкции. Коров 3-й группы не иммунизировали и они служили контролем.

У вакцинированных и контрольных коров до и после иммунизации в динамике в сыворотке крови определяли уровень антител в ИФА тест-системе. Параллельно до и после отела в молочной сыворотке и сыворотке крови телят, полученных от иммунизированных двумя различными вакцинами коров, определяли уровень антител к К88, К99, 987Р и Б41 - антигену в ИФА тест-системе.

За народившимися телятами вели клиническое наблюдение, регистрируя число заболевших и павших от диареи животных.

Таблица 11 - Содержание специфических антител в сыворотке 1фови в ИФА вакцинированных и не вакцинированных коров_

Группа животных Титр антител, 1о£2 (М±т, п=10), через дней после вакцинации

до вакцинации 15 30

Вакцинированные субъединичной вакциной 2,53±0,21 7,65±0,33 9,83±0,41

Вакцинированные ФВ ПВ ГОА 2,49±0,19 5,18±0,25 6,17±0,27

Невакцинированные (контроль) 2,51±0,17 2,53±0,35 2,50+0,31

Таблица 12 - Содержание антител в сыворотках молозива коров и крови телят

; Группа животных Титр антител,

в сыворотке молозива в сыворотке крови

Вакцинированные субъединичной вакциной 8,57±0,17 7,71 ±0,22

Вакцинированные ФВ ПВ ГОА 5,78±0,21 4,05+0,13

Невакцинированные (контроль) 2,31+0,25 0

Из материалов табл. 11 видно, что оба использованных варианта противоэшерихиозных вакцин индуцировали в организме коров синтез специфических антител, уровень которых зависел от состава использованных препаратов. Так, если у иммунизированных регламентированной антиэшерихиозной вакциной титры специфических антител в сыворотке крови на 15-й день после введения вакцины повышались в 2,08 раза (Р<0,01), то после применения субъединичной вакцины титры антител превышали контрольный уровень в 3,02 раза (Р<0,001), а уровень сравниваемой вакцины -в 1,48 раза (Р<0,05).

Результаты параллельных серологических исследований проб сывороток молозива вакцинированных и невакцинированных коров, а также сывороток крови полученных от них телят показали достоверную разницу титров антител, полученных от иммунизированных и неиммунизированных животных. При этом установлено, что сыворотка молозива коров и сыворотка

крови телят, полученных от иммунизированных коров, содержали достоверно высокий уровень специфических антител.

Как видно из табл. 12, сыворотка молозива иммунизированных регламентированной при эшерихиозе ФВ ГТВ ГОА коров титр антител в ИФА тест-системе составил 5,78 а применение субъединичной 4-пили вакцины оказывало на иммунную систему более высокое антигенное воздействие -уровень специфических антител в сыворотке молозива составил 8,57 1о§2.

Результаты изучения сохранности, народившихся от иммунизированных 2 видами вакцин и невакцинированных коров, представлены в табл. 13.

Из данных таблицы видно, что в контрольной группе телят (от невакцинированных коров) из 10 народившихся телят 7 заболело диареей и пало 4 в течение 24-72 часов. Из 10 телят, полученных от коров, иммунизированных субъединичной 4-пили вакциной (СП4ПВ), заболело 3 гол. (в т.ч. 2 в легкой форме), а один теленок пал с признаками колибактериоза. Из 10 телят, полученных от коров, иммунизированных двукратно с интервалом в 14 дней внутримышечно ФВ ПВ ГОА заболело 6 и пало 2 животных в течение 24-72 часов. Сохранность составила 80%.

Таблица 13 - Эффективность иммунизации коров различными вакцинами для профилактики эшерихиоза телят ___"

Группа Вакцина, использованная для иммунизации коров, метод введения, доза Число народившихся телят Заболело Пало % выживших

Первая Однократная подкожная иммунизация 10 коров субъединичной вакциной в дозе 5 мл 10 3 1 90

Вторая Двукратное с интервалом 14 дней внутримышечное введение формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой (ФВ ПВ ГОА) 10 коровам в дозе по 15 мл на каждое введение 10 6 2 80

Третья Контрольная (неиммунизированные коровы) 10 7 4 60

Таким образом, испытание субъединичной вакцины против колибактерилза телят и поросят в производственных условиях на крупном рогатом скоте показало, что вакцина безвредна, ареактогенна и обеспечивает напряженный иммунный ответ после однократной иммунизации и обеспечивает сохранность 90% телят в очаге колибактериоза, а биофабричная вакцина в тех же условиях обеспечила сохранность 80% телят.

3.4 Изучение профилактической эффективности субъединичной вакцины СП4ПВ для поросят

Производственное комиссионное испытание эффективности субъединичной вакцины для защиты поросят проводили в условиях СТФ ООО «Авангард» Лукояновского района Нижегородской области, неблагополучного по эшерихиозу.

Предварительно испытанием в областной ветеринарной лаборатории было установлено, что испытуемая вакцина безвредна, стерильна, обладает антигенной активностью в ИФА.

Вакцину применяли в соответствии с «Методическими указаниями по диагностике, профилактике и лечению колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнологии», утвержденными Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии РФ 07.10.2013 года.

Для этой цели использовали 36 супоросных свиноматок, разделенных на 3 группы по принципу аналога по 12 голов. Животных 1-й группы за 5-6 недель до опороса однократно подкожно иммунизировали субъединичной (4 пилезной) вакциной (СП4ПВ) в дозе 5 Мл. Животных 2-й группы двукратно с интервалом в 14 дней внутримышечно иммунизировали формолвакциной поливалентной гидроокисьалюминиевой (ФВ ПВТОА) против колибактериоза (эшерихиоза) поросят согласно действующей, инструкции в дозе по 5 мл на первое и 6 мл на второе введение. Супоросных свиноматок 3-й группы не иммунизировали, и они служили контролем.

У вакцинированных ясИвотных до и после иммунизации в динамике в сыворотке крови определяли уровень специфических антител, а также до и после опороса в молочной сыворотке, иммунизированных различными вакцинами свиноматок, определяли уровень специфических антител к поли -К88, К99,987Р и Б41 - антигену в ИФА тест-системе.

За народившимися поросятами вели клиническое наблюдение, регистрируя число заболевших и павших от диареи животных.

В группах поросят, полученных от свиноматок, иммунизированных субъединичной и фабричной вакцинами число случаев заболевания колибактериозной диареей было незначительно (табл. 14).

Как видно из данных табл. 14 в группе поросят, матери которых были иммунизированы субъединичной вакциной из 98 народившихся заболело с признаками колибактериоза 9 гол. и 8 поросенка пали, в то время как во второй группе поросят, полученных от свиноматок, вакцинированных биофабричной вакциной заболело 37 гол., сохранность составила 78,1%. В контрольной группе поросят, матери которых не были вакцинированы, заболели с признаками колибактериоза 67 и пало 54 гол, т.е. выживаемость в очаге колибактериоза составила 41,9%. Эти данные были подтверждены и при исследовании сывороток крови свиней.

Таблица 14 - Результаты изучения эффективности иммунизации свиноматок различными вакцинами для профилактики эшерихиозной диареи поросят_____

Группа Вакцина, использованная для иммунизации коров, метод введения, доза Число народив -шихся телят Заболело Пало % выживших

Первая Однократная подкожная иммунизация 12 супоросных свиноматок субъединичной 4 пилезной вакциной СП4ПВ в дозе 5 мл 98 9 8 91,8

Вторая Двукратное с интервалом в 14 дней внутримышечное введение формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой (ФВ ПВ ГОА) в дозе по 5 и 6 мл на первое и второе введение соответственно 96 37 21 78,1

Третья Контрольная (неиммунизированная) 93 67 54 41,9

Таблица 15 - Содержание специфических антител в сыворотке крови свиноматок в ИФА вакцинированных и невакцинированных свиноматок_

Группа животных Титр антител, 1о£2 (М±ш, п=12), через дней после вакцинации

до , вакцинации 15 30

Вакцинированные СП4ПВ 1,50±0,25 7,92±0,55 10,13±0,21

Вакцинированные ФВ ПВ ГОА 1,50±0,25 5,08+0,27 ' 6,01±0,32

Невакцинированные (контроль) 1,51 ±0,43 1,50±0,29 " 1,52±0,51

Таблица 16 - Содержание антител в сыворотке молозива свиноматок и

крови поросят

Группа животных Титр антител в РБФ, 1ой2 ;> г'

в сыворотке молозива в сыворотке крови,,.

Вакцинированные СП4ПВ (1-я) 7,98±0,27 6,89+0,35 ,

Вакцинированные ФВ ПВ ГОА (2-я) 4,57±0,19 3,89±0,25

Невакцинированные (контроль) 1,25+0,33 1,03+0,21

Как видно из данных таблиц 15 и 16 у вакцинированных субъединичной вакциной и ФВ ПВ ГОА свиноматок и родившихся от них поросят выявлены специфические антитела против 4 адгезивных антигенов. Однако синтез антител в ответ на введение субъединичной вакцины был более интенсивным - титры антител в сыворотке крови в ИФА тест-системе у свиноматок 1-й группы на 15-й день после иммунизации составлял 7,92 1о§2. Применение регламентированной вакцины ФВ ПВ ГОА было менее эффективным - титр антител при этом составлял 5,081о£2.

Таким образом, введение субъединичной вакцины свиноматкам в дозе 5 мл за 5-6 недель., до опороса обеспечивает выживаемость 91,8% новорожденных поросят в неблагополучном по колибактериозу хозяйстве, а иммунизация свиноматок биофабричной вакциной ВФ ПВ ГОА согласно действующей инструкции обеспечивала сохранность 78,1% поросят.

3.5 Определение оптимальной лечебной дозы препарата «Пабисорб» для поросят и телят

Перед проведением производственных испытаний по оценке терапевтической эффективности экспериментального образца препарата «Пабисорб», предварительно проводили определение его оптимальной лечебной дозы.

Эксперименты проводили в одном из хозяйств Нижегородской области, стационарно неблагополучном по эшерихиозной диарее поросят. Для определения оптимальной лечебной дозы испытуемого препарата на основе полиглобулинов, экстракта апифитопрепарата, продуктов метаболизма В.ЫП(1ит и природного минерального сорбента, было сформировано 6 групп новорожденных поросят живой массой 1,0-1,2 кг по 12 голов в каждой. Животным опытных групп однократно подкожно вводили композиционный препарат в дозах 1,0; 3,0; 5,0; 7,0 и 10 см3. При этом исходный препарат, имеющий концентрацию сухого вещества (активно действующего вещества -АДВ) 100 мг/см3 (10%-ный раствор глобулинов и апипрепарата), разводили в 10 раз, создавая концентрацию действующего вещества 10 мг/см3. Таким образом, животные 1-й группы получали испытуемый препарат 10 мг/кг, 2-й -15 мг/кг, 3-й - 25 мг/кг, 4-й - 35 мг/кг и 5-й - 50 мг/кг. Животным 6-й группы в качестве лечебных средств применяли антибиотики и противоэшерихиозную сыворотку.

Результаты титрации (определения) терапевтической дозы полиглобулинового препарата на поросятах представлены в табл. 17.

Таблица 17 - Терапевтическая эффективность препарата «Пабисорб» для новорожденных поросят в зависимости от вводимой дозы __

Группа живота ых Доза препарата, мг/кг Вводимый объем препарата, см3 Количество животных в опыте Пало Выжил о % сохранности

1 2 3 4 5 6 7

1 10 1,0 12 5 7 58,3

2 15 3,0 12 4 8 66,6

1 2 3 4 5 6 7

3 25 5,0 12 3 9 75,0

4 35 7,0 12 2 10 83,3

5 50 10,0 12 2 10 83,3

6 50 15,0 12 5 7 58,3

Из данных таблицы видно, что однократное применение препарата «Пабисорб» в дозах 5 и 7 см3 (25 и 35 мг/кг) оказывало выраженное лечебное действие при колибактериозе поросят, обеспечивая 75-83,3%-нуго выживаемость больных животных. Параллельное применение регламентированных при колибактериозе поросят средств -противоэшерихиозной сыворотки и антибиотиков позволило защитить лишь 58,3% больных эшерихиозом поросят, что в 1,57 раза ниже, чем в 4-й группе, получавшей подкожно испытуемый препарат «Пабисорб» в дозе 35 мг/кг. Применение испытуемого препарата в дозе 50 мг/кг (15 см3) также обеспечивало 83,3%-ную выживаемость больных диареей поросят, однако увеличение дозы композиционного препарата нецелесообразно, поскольку, несмотря на увеличение его дозы повышения лечебного эффекта не последовало. Следовательно, оптимальной лечебной дозой препарата «Пабисорб» для новорожденных поросят является 7,0 см3 (35 мг/кг живой массы). Полученные данные по титрации оптимальной лечебной дозы испытуемого препарата послужили основанием для продолжения опытов по определению оптимальной лечебной дозы препарата «Пабисорб» на другом виде сельскохозяйственных животных — телятах.

Эксперименты проводили в ООО «Развитие» Нижегородской области, стационарно неблагополучном по эшерихиозной диарее телят. Для экспериментов по отработке оптимальной лечебной дозы полиглобулиново-апипрепарата в условиях неблагополучного хозяйства были сформированы 5 групп (по 5 голов в каждой) телят черно-пестрой породы 5-7 дневного возраста с массой тела 35-40 кг. Животным 1-й группы однократно подкожно вводили 10%-ный раствор препарата «Пабисорб» в дозе 0,5 см3 (50 мг на 1 голову), телятам второй группы - 1,0 см3 (100 мг), третьей - 1,5 см3 (150 мг), четвертой - 2,0 см3 (200 мг на 1 голову). Телятам 5-й группы внутримышечно вводили поливалентную противоэшерихиозную сыворотку в дозе 15 см3 (750 мг на 1 голову). Наблюдение за животными вели в течение 14 сут, учитывая заболеваемость, день начала болезни, длительность болезни, количество павших и выживших, а также среднесуточный прирост живой массы телят за 1-й месяц. Результаты определения оптимальной терапевтической дозы композиционного препарата на телятах представлены в табл. 18.

Таблица 18 — Терапевтическая эффективность препарата «Пабисорб» для новорожденных телят в зависимости от вводимой дозы

Группа Доза препарата, мг/кг Объем вводимого препарата, см3 Количество животных в группе Заболело, гол. Пало, гол. % выживших

1-я 16,6 0,5 5 4 3 40

2-я 33,2 1,0 5 3 2 60

3-я 55,5 1,5 5 2 1 80

4-я 66,4 2,0 5 2 1 80

5-я 50,0 15,0 5 4 3 40

Таким образом, однократное подкожное введение инъекционного препарата «Пабисорб» в дозах 1,0-1,5 см3 (33,2-55,5, средняя 44,3 мг/кг) оказывало выраженное профилактическое действие при колибактериозе телят, предохраняя от заболевания 60-80% животных против 50%-ной защиты при применении регламентированной при колибактериозе поливалентной противоэшерихиозной сыворотки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненные исследования по разработке эффективных средств и способов профилактики и лечения эшерихиозов телят и поросят путем создания композиционных препаратов, включающих глобулины, продукты пчеловодства, продукты метобализма пробиотических микроорганизмов и природных адсорбентов, а также полиантигенного комплекса на основе пилезных (фимбриальных) антигенов и анализ полученных результатов обосновывают следующие выводы:

1. Из энтротоксигенных штаммов Е. coli с помощью метода Kuzuya выделены адгезивные антигены К88, К99, 987Р и F41 (фимбрии или пили), играющие ключевую роль как в развитии эшерихиозов, так и в формировании противоэшерихиозного иммунитета.

2. Впервые разработана субъединичная противоэшерихиозная вакцина на основе пили - антигенов Е. coli, аписогенного иммуностимулятора - апизана и минерального иммуносорбента - монтмориллонита.

3. Комплексный субъединичный полиантиген представляет собой 0,6%-ный раствор, содержащий в 1 мл препарата 6 мг антигенного вещества, из которых на долю К88 пили - антигена приходится 1 мг, К99 - 1 мг, 987Р - 1 мг, F41 - 1 мг, апизана - 1 мг и высокодисперсной фракции монтмориллонита (размеры частиц 60-90 мкм) - 1 мг при объемном соотношении компонентов 1:1.

4. Одно- и многократное (до 4 раз) подкожное и внутрибрюшинное введение полиантигенного комплекса лабораторным животным (белые мыши, белые крысы, кролики), изменений общего состояния организма и патологических изменений тканей на месте инъекции (абсцессы, некрозы, гранулемы) не вызывало, что свидетельствует об отсутствии токсичности и реактогенности препарата.

5. Однократное подкожное введение субъединичной вакцины в дозе 5 мл за 6 недель до отела коров и 5-6 недель! до опороса свиноматок обеспечивало в неблагополучных по колибактериозу хозяйствах выживаемость новорожденных телят и поросят соответственно 90% и 91,8% благодаря колостральному иммунитету.

6. Для профилактики эшерихиозов изготовлена экспериментальная серия субъединичной 4-пили вакцины в количестве 10000 доз (50 л).

Для получения 10000 доз вакцины необходимо приготовить 4000 мг пили антигенов. На выделение 1 мг антигенов расходуется 10 мл бакмассы E.coli (1:10) с содержанием 2-Ю10 м.к/мл.

7. Сконструирован композиционный противоэшерихиозный лечебно-профилактический препарат «Пабисорб», базовыми составляющими которого являются полиглобулины сыворотки крови иммунизированных 4-пилезной субъединичной вакциной (компонент I) и этаноловый экстракт биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце М» (компонент II), в которых растворены порошки из продуктов метаболизма В. bifidum и микрочастицы минергшьного иммуносорбента - монтмориллонита.

8. В состав композиционного инъекционного' препарата «Пабисорб» входят базовые компоненты (Андреева A.B., 2003; Кивалкина В.П., 1948) в следующих объемных и количественных соотношениях: 0,7 объема глобулинов из сыворотки иммунизированных субъединичной 4-пили вакциной животных (компонент I), 0,3 объема 4%-ного апифитоэкстракта «Вита-Форце М» (компонент II), в которых растворены порошки из продуктов метаболизма В. bifidum (0,2%) (компонент III) и микрочастицы монтмориллонита в количестве 2% от общего объема препарата (компонент IV).

9. Однократное подкожное введение инъекционного препарата «Пабисорб» в дозах 1,0-1,5 см3 оказывало выраженное профилактическое действие при колибактериозе телят, предохраняя от заболевания 60-80% животных.

10. Однократное пероральное применение препарата «Пабисорб» в дозах 25,35 и 50 мг/кг обеспечивало сохранность поросят в 85%. В группе поросят, которым вводили антибиотики и противоэшерихиозную биофабричную сыворотку, сохранность составила 58,3%.

11. На основе комплексного субъединичного антигена разработаны тест-системы для выявления специфических антител к E.coli в сыворотке крови КРС и свиней методами ИФА, РБФ и РНГА. Лабораторные и производственные испытания доказали специфичность компонентов тест-системы и их высокую активность и рекомендуются в качестве средств серологического мониторинга КРС и свиней в отношении эшерихиозов.

12. Механизм формирования антиэшерихиозного иммунитета при применении субъединичной 4-пилезной вакцины реализуется путем синтеза антиадгезивных (анти К88, К99, 987Р и F41) антител. Пили - антигены вакцины, адсорбируясь на микрочастицах иммуносорбента (монтмориллонита), доставляются иммунокомпетентным B-клеткам, минуя стадию захвата и переваривания антигена макрофагами. Иммуносорбент (монтмориллонит), десорбируя антигены, одновременно, отдавая микро- и макроэлементы, адсорбирует токсические продукты метаболизма и выводится через желудочно-кишечный тракт из организма животного.

Обобщая результаты наших исследований, анализируя сведения, имеющиеся в литературе можно отметить, что перспективным направлением научных исследований является разработка полупромышленных и промышленных технологий изготовления субъединичных вакцин и лечебных средств для профилактики эшерихиозов молодняка различных видов сельскохозяйственных животных. Другим современным направлением

является разработка новых иммуномодуляторов для предупреждения у новорожденных телят и поросят первичных иммунодефицитов, пробиотиков для борьбы с условно-патогенной микрофлорой, гипериммунных сывороток, иммуноглобулинов для повышения резистентности животных.

Достижения генной инженерии и биотехнологии создают принципиальную возможность для совершенствования вакцин против эшерихиозов и других инфекций, которые будут обладать целым рядом преимуществ перед традиционными вакцинами. Внедрение таких биопрепаратов в ветеринарную практику в будущем может иметь чрезвычайно важную роль в профилактике и защите поголовья скота от наиболее распространенных инфекций.

Рекомендации производству

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для внедрения в ветеринарную практику субъединичная вакцина, методы серологической диагностики на применении которых составлены следующие НТД:

1. Методические указания по диагностике, профилактике и лечению колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнологии (в порядке производственного испытания) //Утв. академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины, академиком РАСХН Смирновым А.М. 17.10.2013. Тираж 100 экз.

2. Инструкция по применению субъединичной вакцины против колибактериоза телят и поросят (в порядке производственного опыта) //Утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ, член-корр. РАН, профессором Ивановым A.B., согласовано нач. ГУВ КМ РТ Хисамутдиновым А.Г.

3. Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом иммуноферментного анализа» (в порядке производственного испытания) / //Утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ, член-корр. РАН, профессором Ивановым A.B., согласовано нач. ГУВ КМ РТ Хисамутдиновым А.Г.

4. Технические условия на «Набор препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом иммуноферментного анализа» //Утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ, член-корр. РАН, профессором Ивановым A.B., согласовано нач. ГУВ КМ РТ Хисамутдиновым А.Г.

5. Инструкция по применению «Набора препаратов для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом реакции непрямой гемагглютинации». Утв. директором ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором A.B. Ивановым.

6. Инструкция по применению «Набора препаратов на основе бентонитового диагноста кума для выявления антител к бактериям Echerichia coli методом реакции бентонитовой флокуляции». Утв. директором ФГБУ

«Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», член-корр. РАН, профессором A.B. Ивановым.

Список использованной литературы

1. Андреева, A.B. Влияние сочетанного применения иммуностимуляторов на показатели бактерицидной, лизоцимной активности сыворотки крови и фагоцитарной активности лейкоцитов /A.B. Андреева // Ветеринарная патология. - 2003. - № 3(7). - С.35-37.

2. Гайзатуллин, P.P. Модифицирующее действие композиционного препарата «Полиаписоген» на течение комбинированного радиационного биологического поражения /P.P. Гайзатуллин //Ветеринарный врач. - 2012. -№2. -С.5-6.

3. Гаффаров, Х.З. Полиспецифическая сыворотка как средство экстренной профилактики и лечения рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят /Х.З. Гаффаров, Г.Н. Спиридонов, М.З. Абдеева и др. // Науч. основы технологии производства вет. биол. препаратов. -Щелково, 1996. - С.84-85.

4. Гаффаров, Х.З. Моно-смешанные инфекционные диареи новорожденных телят и поросят: монография / Х.З. Гаффаров, A.B. Иванов, Е.А. Непоклонов, А.З. Равилов // Казань: изд-во «Фэн», 2002. - 590с.

5. Дворкин, Г.Л. Динамика иммунологических изменений в организме коров, привитых поливалентной гидроокись-алюминиевой формолтиомерсаловой вакциной против колибактериоза (эшерихиоза) телят / Г.Л. Дворкин, В.А. Ленькова // Проблемы ветеринарной иммунологии: науч.тр: -М„ 1985.-С.108-112.

6. Джупина, С.И. Факторные инфекционные болезни /С.И. Джупина // Ветеринария. - 2001. - № 1. - С.6-9.

7. Зароза, В.Г. Эшерихиоз телят / В.Г. Зароза - М.: Агропромиздат, 1991.-239 с.

8. Иванов, A.A. Результаты испытания вакцины ассоциированной против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят на лабораторных животных /A.A. Иванов, Г.Н. Спиридонов и др. //Ветеринарный врач. - 2012.-№ 2. - С. 10-12.

9. Иванов, A.B. Инфекционные болезни свиней (этиология, эпизоотология, диагностика, профилактика) /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов - М.: ФГНУ «Росинформагротех». - 2006. - 108 с.

10. Исмагилов, A.M. Естественный микробиоценоз кишечника при мелофагозе овец, лечении медиатрепсом и иммуностимуляции оксиметилурауилом, эракондом и прополисом / A.M. Исмагилов, Р.Т. Маннапова // Апитерапия сегодня - с биологической аптекой пчел в XXI век: Матер. II Междунар. научно-практ. конф. по апитерапии - Уфа, 2000. - С. 145-152.

11. Кивалкина, В.П. Бактерицидные свойства прополиса / В.П. Кивалкина //Пчеловодство.- 1948.-№ 10.-С.50-51.

12. Кивалкина, В.П. Лекарственные формы прополиса /В.П. Кивалкина, A.A. Барскова // Пчеловодство. - 1991. - №11. - С.36-37.

13. Лавровская, В.М. Вакцина ассоциированная против диареи телят / В.М. Лавровская, Е.С. Воронин, Д.А. Девришев, Н.Ф. Брусничина // Патент РФ.-1993.-№2035916

14. Малахов, Ю.А. Вакцина против колибактериоза телят / Ю.А. Малахов, O.A. Тугаринов и др. - Патент РФ, 1993, № 1149467.

15. Малахов, Ю.А. Способ получения сыворотки адгезивной и антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных / Ю.А. Малахов, O.A. Тугаринов, М.К. Пирожков, B.C. Солодков - Патент РФ. -1993.-№2043772.

16. Маннапова, Р.Т. Влияние прополиса и нового препарата из группы пиримидинов на естественную резистентность / Р.Т. Маннапова, Н.В. Гребенкова, В.П. Кривоногов // Апитерапия сегодня - с биологической аптекой пчел в XXI век: Мат. П-й Междунар. науч.-практич. конф. - Уфа. -2000.-С.304-307.

17. Мищенко, В.А. Экологические особенности заболеваний пищеварительной системы новорожденных телят / В.А. Мищенко, Д.К. Павлов и др. // Ветеринарная патология. - 2005. - № 3. - С.34-37.

18. Новак, Д.Д. Способ получения вакцины против эшерихиоза телят / Д.Д. Новак, В.Т. Вольф - Патент РФ. - 1996. -№ 2070819.

19. Панин, А.Н. Динамика массы, структурных компонентов тимуса, тимического индекса и Т-лимфоцитов телят, полученных от вакцинированных и стимулированных прополисом и оксиметилурацилом коров / А.Н. Панин, А.Г. Маннапов и др. // Апитерапия сегодня - с биологической аптекой пчел в XXI век: Матер. II Междунар. научно-практ. конф. по апитерапии - Уфа, 2000. - С.90-93.

20. Папуниди, К.Х. Технологические загрязнения окружающей среды как фактор заболеваемости животных / К.Х. Папуниди // Ветеринарный врач. -2000.-№ 2. - С.56-58.

21. Петрянкин, Ф.П. Иммунобиология комплекса «мать - плод -новорожденный» у животных: монография / Ф.П. Петрянкин. - Чебоксары, 2008. - 72 с.

22.- Пирожков, М.К. Способ получения вакцины против колибактериоза поросят / М.К. Пирожков, O.A. Тугаринов - Патент РФ. - 1994. - №2022563.

23. Попов, Е.М. Новый антиген адгезии эшерихий - возбудителей колидиареи телят / Е.М. Попов, Е.А. Светоч // Совершенствование методов гос. контроля вет. препаратов: Тезисы докл. Всесоюзной науч. конф. - М., 1991. - С.210-211.

24. Светоч, Е.А. Фено-генотипические свойства штаммов Е. coli, продуцирующих антиген К88 / Е.А. Светоч, Е.М. Попов, В.В. Гусев // Ветеринария. - 1997. - № 11. - С. 19-23.

25. Сидоров, М.А. Основы профилактики желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных / М.А. Сидоров, В.В. Субботин //

Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2008. -№ 3. - С.8-12.

26. Сисягин, П.Н. Лечебно-профилактическое средство для молодняка крупного рогатого скота / П.Н. Сисягин, Р.Е. Ким и др. - Патент РФ. - 2001. -№2169558.

27. Сисягина, Е.П. Разработка средств и способов терапии и профилактики респираторных болезней телят: автореф. дис... д-ра вет. наук: 06.02.02 / Елена Павловна Сисягина. - Нижний Новгород, 2010. - 46с.

28. Смирнов, A.M. Актуальные вопросы ветеринарно-санитарных мероприятий на территориях загрязненных экотоксикантами /A.M. Смирнов,

B.И. Дорожкин, П.Н. Рубченко / под общ. ред. Смирнова A.M. и др. // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии - М„ 2010. - № 2. -

C.7-13.

29. Спиридонов, Г.Н. Вакцина ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиозной диареи телят / Г.Н. Спиридонов, А.А. Иванов и др. - Патент РФ. - 2011. - № 242820.

30. Тетерев, И.И. Прополис в животноводстве и ветеринарии: монография / И.И. Тетеров - Киров. - 1998. - 88 с.

31. Тугаринов, О. А. Факторы вирулентности энтеропатогенных эшерихий и оптимальные среды /О.А. Тугаринов, М.К. Пирожков, Т.И. Исхакова // Профилактика и эффективность специфических средств защиты животных и методы контроля качества биопрепаратов: Сб. науч. тр. - М., 1991 -Т.53. -С.17-24.

32. Федоров, Ю.Н. Этиологическая структура и иммунопрофилактика желудочно-кишечных болезней телят в ранний постнатальный период /Ю.Н. Федоров, А.А. Частов // Мат. междунар. конф., посвящ. 80-летаю Самарской НИВС. - Самара, 2009. - С.506-513.

33. Шахов, А.Г. Профилактика и терапия желудочно-кишечных и респираторных болезней молодняка с применением химических и биологических препаратов / А.Г. Шахов, А.И. Ануфриев, Ю.Н. Бригадиров // Итоги и перспективы науч. иссл. по проблеме патологии животных и различных средств и методов терапии и профилактики: Сб. науч. тр. -Воронеж, 1995. - С.82-89.

34. Шахов, А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят / А.Г. Шахов // Ветеринарная патология. - 2003. - № 2. - С.25-28.

35. Asai, Т. Phylogenetic groups and cephalosporin resistance genes of Escherichia coli from diseased food-producing animals in Japan / T. Asai, K. Masani, C. Sato, et al. // Acta Veterinaria Scandinavica. - 2011. - Vol.53 - p.4-5.

36. Jann, K. Polysaccharide antigens of Escherichia coli / K. Jann, B. Jann // Rev. Infect. Dis. - 1987. - Vol. 9. - P. 517-526.

37. Jsaacson, R. Development of vaccines for bacterial diseases using recombinant DNA technology / R. Jsaacson // Avian Dis., 1986, 30, 1. - P. 28-36.

38. Kuzuya, M. Purification of K88 and K99 pill from porcin enterotocsigenic Escherichia coli by offinity chromatography / M. Kuzuya, H.

Yokoyama, Y. Kodama // Japan. J. Vet. Sc., 1988,50,4. - P. 951-953.

39. Nataro, J.P. Characterization of plasmids encoding the adherence factor of enteropathogenic Escherichia coli / J.P. Nataro, et al. // Infect. Jmmun. - 1987. -Vol. 55. - P.2370-2377.

40. To, S.C. Prevention of colibacillosis in neonatal swine by vaccination / S.C. To, D.B. Porter, B.S. Swites // Mod, Vet. Pract. - 1983, 64-4. - P.39-41.

41. To, S.C. Prevention of colibacillosis in neonatal swine a 4-pilus E. coli bacterin / S.C. To //Mod. Vet. Pract. - 1984,65.1 - P.39-41.

42. To, S.C. Type 1 pili (Fl) of porcine enterotoxigenic E. coli: Vaccine Trial and test for production in the small intestine during disease /S.C. To, H.W. Moon; P.L. Runnels //Infect. Jmmun., 1984. - V.43. — P.l-5.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в Российских рецензируемых научных журналах из Перечня ВАК

1. Сетдеков, Р.А. Сравнительная оценка эффективности поливалентного бактериофага и антибактериальных препаратов при колиэнтеротоксемии (отечной болезни) поросят / Р.А. Сетдеков // Ветеринарный врач. - Казань, 2010. - №6. - С.42-43.

2. Сетдеков, РА. Микрофлора при отечной болезни поросят /Р.А. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, Г.Ф. Кабиров // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2011. — Т.207. - С.406-409.

3. Сетдеков, Р.А. Лечение отечной болезни поросят бактериофагами / Р.А. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, Г.Ф. Кабиров // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2011. - Т.207. - С.409-412.

4. Сетдеков, Р.А. Энзоотии отечной болезни поросят в условиях фермерских и личных хозяйствах граждан Нижегородской области / Р.А. Сетдеков, Г.Ф. Кабиров, Р.Х. Юсупов // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2012. - Т.209. - С.272-277.

5. Сетдеков, Р.А. Изучение влияния ксимедона на иммунологический статус новорожденных телят / Р.А. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, Н.С. Садыков, Х.Н. Макаев, М.Н. Соколов // Ветеринарный врач. - Казань, 2012. - №6. -С. 11-14.

6. Сетдеков, Р.А. Изучение лечебной эффективности препарата «Тиакат» при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят / Р.А. Сетдеков, Г.Р. Юсупова // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2013. - Т.214. - С.376-381.

7. Сетдеков, Р.А. Иммунологические показатели новорожденных телят в неблагополучных по факторным инфекциям хозяйствах / РА. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, Г.Р. Юсупова // Ученые записки Казанской гос.академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2013. - Т.213. - С.251-256.

8. Сетдеков, P.A. Изучение иммунного фона крупного рогатого скота в хозяйствах Нижегородской области / P.A. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, В.Г. Гумеров, Г.Р. Юсупова // Ученые записки Казанской гос.академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2013. - Т.213. - С.256-261.

9. Сетдеков, P.A. Влияние иммуномодуляторов на эффективность вакцинации телят против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-З / P.A. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, В.Г. Гумеров // Ветеринарный врач. - Казань, 2013.-№2.- С.16-18.

10. Сетдеков, P.A. Колибактериоз поросят: вакцинопрофилактика / P.A. Сетдеков, Р.Х. Юсупов, Р.Н. Низамов // Ветеринарный врач. - Казань, 2013. - №5. - С.18-20.

11. Низамов, Р.Н. Использование апизана в качестве иммуномодулятора при стимуляции поствакцинального иммунитета / Р.Н. Низамов, Г.Ф. Кабиров, Р.Х. Юсупов, P.A. Сетдеков, A.A. Иванов, P.P. Юсупов, М.З. Тухфатуллов, Г.Р. Юсупова // Ученые записки Казанской гос.академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2013. - Т.216. - С.235-240.

12. Низамов, Р.Н. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотика на основе В. bifidum, апифитопрепарата «Вита-Форце М» и противорадиационного глобулина при экспеприментальном колибактериозе на фоне радиоиндуцированной иммуносупрессии / Р.Н. Низамов, М.З. Тухфатуллов, P.A. Сетдеков, A.A. Иванов, Р.Х. Юсупов, P.P. Юсупов // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. -2013. - Т.216. - С.240-246.

13. Низамов, Р.Н. Лечебно-профилактическое действие препарата «Пабисорб» при колибактериозе и внешнем у-облучении животных / Р.Н. Низамов, Р.Х. Юсупов, A.A. Иванов, P.A. Сетдеков, P.P. Гайнуллин, P.P. Юсупов // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана.- 2014. - Т.217. - С.193-200.

14. Сетдеков, P.A. Иммуногенная активность противоэшерихиозной вакцины СП4ПВ на лабораторных животных / P.A. Сетдеков, Р.Н. Низамов, Р.Х. Юсупов, A.A. Иванов, Г.Р. Юсупова // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2014. - Т.217. - С.246-251.

15. Низамов, Р.Н. Влияние апифитопрепарата «Вита-Форце М» на систему антиоксидантной защиты в условиях воздействия на организм различных экстремальных факторов / Р.Н. Низамов, Г.Ф. Кабиров, Р.Х. Юсупов, P.A. Сетдеков, A.A. Иванов, М.З. Тухватуллов, Г.Р. Юсупова, P.P. Гайнуллин, К.В. Сычев // Ученые записки Казанской гос. академии вет. медицины им. Н.Э.Баумана. - 2014. - Т.220. - С.171-176.

Публикации в других изданиях

16. Иванов, A.B. Методические указания по диагностике, профилактике и лечению колибактериоза телят и поросят с применением средств, полученных на основе бионанотехнологии (в порядке производственного испытания) /Утв. Академик-секретарем Отделения

ветеринарной медицины Россельхозакадемии /A.B. Иванов, Р.Х. Юсупов, Р.Н. Низамов, A.A. Иванов, P.A. Сетдеков, М.Н. Мукминов, Э.А. Шуралев -Казань: Отпечатано в типографии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». - 2014. - 26с.

17. Сетдеков, P.A. Сравнительная оценка эффективности поливалентного бактериофага и антибактериальных препаратов при колиэнтеротоксемии (отечной болезни) поросят / P.A. Сетдеков // Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность: Сб. матер. Междунар. научно-практ. конф. - Казань, 2010. -С.47.1-474.

18. Хайруллин, И.Н. Методические указания по применению полифага для лечения и профилактики колибактериоза (отечной болезни) поросят / И.Н. Хайруллин, М.А. Сафин, P.A. Сетдеков // Утв. Комитетом госветнадзора Нижегородской области. - 2002. - 7с.

19. Сетдеков, P.A. Эпизоотология и лечебно-профилактические меры при лечебной болезни (колиэнтротоксемия) поросят в Нижегородской области / Сетдеков //дисс...к.в.н.-Казань, 2003. - 132с.

Подписано к печати 25.06.15 Заказ 55 Тираж 100 Бумага офсетная

Формат 60*84/16 Усл. печ. л. 2,8 Печать RISO

Центр информационных технологий КГАВМ 4200029, Казань, Сибирский тракт, 35