Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Фармако-токсикологические параметры комплексного антибактериального препарата фенитил и его эффективность при колибактериозе поросят

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологические параметры комплексного антибактериального препарата фенитил и его эффективность при колибактериозе поросят"

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОМПЛЕКСНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ФЕНИТИЛ И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ ЭШЕРИХИОЗЕ ПОРОСЯТ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

г 8 НОЯ 2013

Воронеж - 2013

005541512

Работа выполнена в отделе фармакологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Беляев Василий Иванович

Официальные оппоненты: Бригадиров Юрий Николаевич

доктор ветеринарних наук, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии, заведующий лабораторией диагностического мониторинга Мартынова Алла Витальевна кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», ассистент кафедры физиологии животных и человека

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Белгородская государственная

сельскохозяйственная академия им. В.Я. Горина»

Защита состоится 20 декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИВИПФиТ РАСХН) по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии.

Автореферат размещен на официальном сайте ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии - http://www.nivipat.ru и официальном сайте ВАК РФ — http://vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан «19» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

1. Общая характеристика работы Актуальность темы. В связи с реализацией национального проекта «Развития АПК», ведется активная работа по созданию крупных свиноводческих комплексов с высокой плотностью животных. Скученное содержание и нарушения в кормлении ведут к снижению иммунного статуса животных и развитию так называемых «факторных» инфекций (Шахов А.Г., 2002; Джупина С.Н., 2005). При этом желудочно-кишечные болезни поражают до 75% поросят. Среди них у 12,7%, от всех павших от инфекционных болезней поросят, выделена E.coli (Кукушкин С.А. с соавт., 2001, Байбиков Т.З. с соавт., 2003). Эшерихиозом чаще поражаются поросята первых дней жизни, заболеваемость при этом достигает 80100%, а летальность до 50% (Терехов В.И., 2000; Щербаков П. с соавт., 2002; Гусев В.В. с соавт., 2004; Романова А Я., Рубинский И.А., 2005).

Основным направлением в борьбе с данной патологией является вакцино-профилактика и антибиотикотерапия, но многообразие антигенного состава и факторов патогенности возбудителя, массовое распространение иммунодефеци-тиов среди животных, быстро приобретаемая эшерихиями лекарственная устойчивость, снижают эффективность специфических средств профилактики и антибиотиков (Терехов В .И., 2000; Гафаров Х.З. с соавт., 2003, Федоров Ю.Н. с соавт., 2006; Ануфриев А.И. с соавт., 2007).

Так как заболевания редко протекают в виде моноинфекций, а чаще в ассоциациях, необходимы комплексные препараты широкого спектра действия, одновременно действующие на нескольких возбудителей (Шабунин C.B., 1999; Шахов А.Г., 2008).

Антибактериальные вещества, обладающие синергидным эффектом, входящие в состав комплексных препаратов, позволяют снизить дозу лекарственного средства, а значит и риски возникновения побочных эффектов.

В связи с этим перспективным является разработка нового комплексного антибактериального препарата на основе флорфеникола и тилозина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка и изучение фармакотоксикологических свойств и терапевтической эффективности препарата фенитил при эшерихиозе поросят.

Для разрешения данной цели были поставлены следующие задачи:

> разработать рецептуру фенитала и изучить его специфическую активность;

> определить токсикометрические параметры фенитила;

> изучить фармакокинетику препарата и установить сроки его выведения из организма поросят;

> определить оптимальную лечебную дозу фенитила при эшерихиозе поросят;

> изучить терапевтическую и определить экономическую эффективность препарата при лечении эшерихиоза поросят.

Научная новизна результатов работы. Впервые научно обоснован состав и рецептура нового комплексного препарата фенитил. Проведена его фармако-токсикологическая оценка. Научно аргументирована, экспериментально и клинически доказана перспективность использования нового комплексного антибактериального препарата фенитил в ветеринарной практике.

Практическая значимость. В практику ветеринарии предложен новый антибактериальный препарат фенитил для лечения эшерихиоза поросят, определены оптимальные дозы и схема его применения. Экспериментально установлен срок выведения остаточных количеств препарата из организма поросят после его применения. Дана экономическая и терапевтическая оценка лечебного действия препарата фенитил при эшерихиозе поросят. Материалы диссертации вошли в проект нормативно-технической документации на препарат.

Апробация. Основные положения и результаты исследования представлены, доложены и одобрены на: годовых отчетах по НИР Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2011-2013); на Международных и Всероссийских научно-практических конференциях: «Современные проблемы, перспективы и инновационные тенденции развития аграрной науки» (Махачкала, 2010); «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011); «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2012); «Проблемы ветеринарной медицины и зооэкологии российского и азиатско-тихоокеанского регионов» (Благовещенск, 2012); «Аграрная наука: современные проблемы и перспективы развития» (Махачкала, 2012); «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных» (Воронеж, 2012); «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2012); 4-м съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Москва, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 статей, из них 5 в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Ученые записки Казанской ГАВМ», «Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», «Ветеринария», «Вестник РАСХН»).

Основные положения, выносимые на защиту:

- специфическая активность фенитила;

- фармакотоксикологические свойства фенитила;

- фармакокинетика и сроки выведения остаточных количеств фенитила из организма поросят;

- терапевтическая и экономическая эффективность фенитила при эшерихиозе поросят.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 131 странице компьютерного текста, содержит 33 таблицы, 13 рисунков, включает в себя введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы и практические предложения, приложения. Список литературы содержит 244 источников, из них 69 зарубежных авторов.

2. Материал и методы исследований

Работа выполнена в отделе фармакологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии в период с 2008-2013 гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданию 08.04.01. «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у

молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. per. 15070.3666026906.06.8.001.2), программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации Россельхозакадемии на 2008-2013 гг.

Проведение научно-производственных и экспериментальных опытов осуществлялось в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, а также соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных во время проведения работы и учета результатов. Перед проведением экспериментов животные выдерживались на карантине в течение 2 недель. Доступ к воде и корму был свободным, световой режим естественным.

Эксперименты проведены на лабораторных животных, разводимых в виварии Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии. Животные содержались при 20-22 °С и влажности 40-60%. Содержание, кормление и манипуляции над ними проводили в соответствии с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в эксперименте (Страсбург, 1986) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 2003 года).

Лабораторные и опытные образцы препарата фенитил изготовлены в отделе фармакологии ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии. При выполнении работы проводили фармакологические, токсикологические, физико-химические, гематологические, биохимические, гистологические исследования с применением современных методов исследования.

В опытах было использовано следующее количество животных: беспородные белые мыши обоего пола массой 18-22 г (288 гол.); беспородные белые крысы обоего пола массой 160-230 г (370 гол.); морские свинки обоего пола массой 270-310 г белого цвета или имеющих крупные белые пятна на боках туловища (24 гол.); кролики массой 2-2,5 кг (18 гол.); поросята (119 гол.). Клинические испытания препарата в производственных условиях проведены на поросятах 2-7-дневного возраста (77 гол.).

Изучение антимикробной активности и оптимального соотношения компонентов (флорфеникола и тилозина) в препарате фенитил проводили in vitro методом серийных разведений в соответствии с «Методическими указаниями по отбору, испытаниям и оценке антивирусных и антибактериальных препаратов среди соединений различных химических классов» (Лагуткин H.A. и др., 2004).

В опытах in vivo определяли антимикробную активность флорфеникола и тилозина в различных соотношениях на модельных опытах при экспериментальном заражении белых мышей в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Фи-сенко В.П. и др., 2000).

Острую, подострую и субхроническую токсичность, эмриотоксичность и тератогенность, аллергенную активность и раздражающее действие оценивали в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У. и др., 2005).

Эксперименты по определению острой токсичности проведены на половозрелых конвенциональных нелинейных разнополых белых мышах (160 гол.) и белых крысах (140 гол.) при однократном пероральном и подкожном введении фе-нитила. Наблюдение за животными проводили непрерывно на протяжении первого дня после введения препарата. В последующем состояние животных отмечали дважды в сутки в течение 14 дней. Регистрировали общий статус и поведение животных, состояние нервно-мышечных и вегетативных функций, шерстного покрова, поедание корма, потребление воды. Особое внимание уделяли развитию признаков токсикоза, оценивали их тяжесть, продолжительность, время выздоровления или гибели животных. Павших животных и особей с признаками отравления препаратом, подвергали патологоанатомическому вскрытию.

Изучение безвредности (переносимости) препарата фенитил проведено на 24 здоровых поросятах, 5-7 дневного возраста. Животные были разделены на 4 группы по б в каждой. Поросятам первой группы препарат не вводили (контроль), второй - применяли внутримышечно фенитил в дозе 0,1 мл/кг, третья - 0,5 мл/кг (пятикратная терапевтическая доза), четвертая - 1,0 мл/кг (десятикратная терапевтическая доза) однократно. Токсическое действие препарата при его внутримышечном введении оценивали по клиническому состоянию животных, морфологическим и биохимическим показателям крови. Кровь для исследования брали у поросят из хвостовой вены утром до кормления через 7 и 14 суток после однократного внутримышечного введения фенитила.

Изучение подострой токсичности препарата проводили на 120 белых крысах-самцах с массой тела 160-180 г и 80 белых мышах-самцах с массой тела 19-21 г при подкожном введении препарата в течение 14 дней. Крысы были разделены на 4 группы по 30 животных в каждой. Животным первой группы вводили фенитил в дозе 135,0 мг/кг (1/50 ЛД50), второй - 337,0 мг/кг (1/20 ЛД50), третьей - 674,0 мг/кг (1/10 ЛД50). Мыши были разделены на 4 группы по 20 животных в каждой. Животным первой группы вводили фенитил в дозе 161,0 мг/кг (1/50 ЛД50), второй - 402,0 мг/кг (1/20 ЛД50), третьей - 804,0 мг/кг (1/10 ЛД50). Животные четвертой группы служили контролем. Общетоксическое действие препарата на крыс оценивали по динамике массы тела животных при взвешивании 1 раз в неделю, гематологическим показателям — при исследовании крови у крыс через 7 дней после введения фенитила, состоянию системы гемостаза - по окончании курса инъекций и через 10 дней после отмены препарата (восстановительный период). Токсическое действие на мышей - по гематологическим показателям по окончании курса инъекций и через 10 дней после отмены препарата.

При изучении подострой токсичности также было проведено исследование влияния фенитила на поведение в тесте «открытое поле» и выносливость при эмоционально-физической нагрузке. Для оценки влияния фенитила на поведение опыты проводили на 7-14-24 сутки после применения препарата по этологиче-ским тестам в установке «Открытое поле» (Буреш Я., 1991).

В опытах использовали контрольные группу животных той же численности и состава, что и подопытные. Контрольным животным вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия.

Мышей подвергали эмоционально-физической нагрузке на 14 и 24 день исследования. Влияние фенитила на физическую работоспособность мышей в условиях нормотермии оценивали по тесту предельного времени плавания в воде при температуре 27±0,5°С и грузом 5% от массы животного (Рылова М.Л., 1964; Бобков Ю.Г. и соавт., 1984).

Изучение кумулятивной способности препарата проводили по методу Lima (1961). Для изучения кумулятивных свойств фенитила были подобраны две группы белых крыс: 1-я - контрольная (10 крыс), которым подкожно вводили стерильный физиологический раствор; 2-я - опытная (10 крыс), которым подкожно вводили фенитил дробно в возрастающих дозах.

Влияние препарата на моторно-эвакуаторную функцию желудка и кишечника изучено на 48 белых мышах массой 20-22 г методом «меток» (Масловский Л.В., 2008). В первой серии опытов фенитил вводили однократно за 2 ч до введения активированного угля, подкожно в дозах 0,1 мл/кг, 0,3 мл/кг и 0,5 мл/кг (терапевтическая доза, в 3 и 5 раз ее превышающие). Во второй серии опытов препарат вводили трехкратно с интервалом 48 часов в тех же дозах, через 2 ч после последней инъекции фенитила животным интрагастралыю через зонд вводили активированный уголь.

Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия фенитила проведено по методике А.П. Шицковой с соавт. (1977) на 90 самках белых крыс массой 180,0±15,0 г. Фазу полового цикла устанавливали путем исследования вагинального содержимого. Первым днем беременности считали день обнаружения спер-миев после подсадки самцов к самкам. Животные были разделены на три группы: контрольную и две опытные. Крысам первой опытной группы - на 5-й день беременности (период имплантации) и второй опытной группы - на 15-й день беременности (период органогенеза), вводили фенитил в дозе 337,0 мг/кг массы тела (с учетом плотности раствора 0,3 мл/кг) подкожно. Для выявления повреждающего действия препарата на плод половину самок убивали на 19-20 день беременности. Проводили осмотр матки, плацент и плодов, подсчитывали количество желтых тел беременности, оценивали равномерность расположения плодов в рогах матки. Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность, выживаемость подсчитывали по формулам, предложенным A.M. Малашенко и И.К. Егоровым (1977). В целях выявления патологии внутренних органов эмбрионов, материал фиксировали в жидкости Боуэна и 70° спирте. Аномалии скелета выявляли по методу Даусона (1984).

Критериями оценки эмбриотоксического и тератогенного действия препарата служили показатели: гибель зародышей на пред- и постимплантационных стадиях развития (эмбриональный эффект), наличие аномалий развития внутренних органов и скелета (тератогенный эффект), а также уровень плодовитости крыс, масса зародышей.

/ Опыты по изучению раздражающего действия на кожу были проведены на кроликах с массой тела 2,0-2,2 кг. Количество животных в опытных и контрольных группах составляло по 6 особей разных полов. Исследуемый препарат наносили в чистом виде. Площадь нанесения составляла 80-82 см2 (5% от общей поверхности тела животных). За два дня до эксперимента тщательно выстригали

шерсть на спине, избегая механических повреждений кожных покровов. Препарат равномерно распределяли по поверхности участка тела в дозах от 0,02-0,12 мл/см2. Экспозиция 4 часа, после чего кожу аккуратно протирали ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой. Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения, учитывая, что функциональные нарушения кожи характеризуются появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры.

Аллергенное действие фенитила на слизистые изучено с помощью коньюк-тивальной пробы (п=12) (по Г.П. Трубецкой, 1976) и отеку лап (п=12) на морских свинках. Морским свинкам однократно вводили внутрикожно в правую ушную раковину по 0,05 мл фенитила. Через 12 дней в конъюнктивальный мешок закапывали по 1 капле фенитила. Через 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 и 24 часа после инсталляции препарата учитывалось клиническое состояние животных (температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений), в том числе изменение кровенаполнения конъюнктивы, состояние век и роговицы, наличие выделений. Оценку проводили в баллах согласно таблице 1.

Таблица 1

Оценка степени раздражающего действия на конъюнктиву_

Интенсивность реакции Оценка в баллах Раздражающий эффект

Отсутствие реакции 0 Отсутствует

Слабая гиперемия 2 Слабый

Выраженная гиперемия 4 Слабо выраженный

Наличие лакримации 6 Умеренный

Наличие выделений 8 Выраженный

Отек век 10 Сильно выраженный

Отек лап оценивали на морских свинках после разрешающей инъекции фенитила субплантарно в дозе 0,1 мл в правую ногу, для сравнения в левую ногу вводили физраствор.

Субхроническая токсичность изучена на 15 клинически здоровых поросятах в возрасте 15-20 дней средней массой тела 4 кг, которые были разделены на три группы по 5 поросят в каждой. Первая группа — контрольная. Второй группе животных вводили фенитил в дозе 0,1 мл/кг, третьей - 0,3 мл/кг в течение 14 дней с интервалом 48 часов.

Влияние препарата на качество мясопродуктов изучено с использованием слепого метода по 9-ти бальной шкале для органолептической оценки качества вареного мяса и бульона разработанного ВНИИМП (1985), на двух группах кроликов-аналогов, со средней массой тела 2,4 кг по три животных в каждой. Кролики первой группы препарат не получали - контрольная группа. Животным второй группы фенитил вводили в дозе 0,1 мл/кг массы тела двукратно с интервалом 48 часов. Через одни сутки после окончания применения фенитила кроликов забивали и проводили комиссионную органолептическую оценку вареного мяса и бульона.

Фармакокинетику фенитила в крови изучали после однократного внутримышечного введения препарата поросятам (п=15) в дозе 0,1 мл/кг массы тела по показателям концентрации действующих веществ через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 36 и 48 часов после введения препарата.

Определение сроков выведения остаточных количеств флорфеникола, его основного метаболита флорфениколамина и тилозина из организма поросят после курсового применения антибактериального препарата фенитил проводили на 15 поросятах массой 3-5 кг, которым вводили фенитил в дозе 0,1 мл/кг двукратно с интервалом 48 часов. Через 1, 5, 9 и 14 суток после окончания применения препарата убивали по 3 поросенка и определяли содержание флорфеникола, флорфениколамина и тилозина в печени, почках, мышцах, коже и жире методом ВЭЖХ. Метод основан на извлечении флорфеникола, флорфениколамина и тилозина жидкостной и твердофазной экстракцией с последующим хроматографическим разделением с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обра-щенно-фазном варианте. Длина УФ - волны детектирования для флорфеникола и флорфениколамина составила 230 нм, для тилозина - 282 нм. Предел количественного определения флорфеникола и флорфениколамина составил 0,05 мкг/мл/г (кровь и мышцы), 0,1 мкг/г (печень и почки) й 0,15 мкг/г (кожа+жир). Значения пределов количественного определения тилозина в экстрактах составил 0,05 мкг/мл/г.

Определение оптимальной терапевтической дозы препарата фенитил проводили на поросятах, больных колибактериозом, разделенных на 3 группы по принципу аналогов. Животным первой группы для лечения применяли фенитил в дозе 0,75 мл/10 кг (п=17), животным второй группы применяли фенитил в дозе 1,0 мл/10 кг (п=17), животным третьей группы - 1,25 мл/10 кг (п=16) двукратно с интервалом 48 часов. Оптимальную дозу препарата определяли с учетом терапевтической эффективности и срокам выздоровления животных.

Опыты по изучению терапевтической эффективности фенитила при эшери-хиозе проведен в двух опытах на поросятах 2-7-дневного возраста. Первый опыт проведен в ОАО Агрофирма «Ливенское мясо» Ливенского района Орловской области, второй - в ЗАО «Юдановские просторы» Бобровского района Воронежской области.

Диагноз на заболевание устанавливали комплексно на основании данных клинического обследования животных, лабораторных исследований, патолого-анатомического вскрытия, с учетом эпизоотической ситуации в хозяйстве.

С целью характеристики общего состояния животных при проведении модельных опытов общепринятыми методами, описанными в соответствующих руководствах (И.П. Кондрахин с соавт., 2004) в крови определяли количество эритроцитов, гемоглобина, СОЭ, лейкоцитов. Фракции белка определяли электрофорезом в агарозном геле, концентрацию общего белка, липидов и билирубина наборами фирмы «Vital Diagnostics», концентрацию мочевины, фосфора, холестерина, глюкозы, креатинина, кальция, активность аспартат- и аланинаминотрасфераз (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы и у-глутамилтрансферазы - на биохимическом анализаторе «Hitachi-902».

Экономическую эффективность применения препарата определяли согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (1997).

Статистическая обработка результатов проведена с пользованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel», «Statistica 5,0» на PC «Pentium III». Достоверность отличий оценивали методом нарных сравнений, используя t-критерий Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1990).

3. Результаты собственных исследований 3.1. Фармакотоксикология препарата фенитил 3.1.1. Обоснование состава фенитила в опытах in vitro

Изучение антимикробной активности и оптимального соотношения флор-феникола и тилозина в препарате проводилось в опытах in vitro методом серийных разведений. Было изучено 5 композиций препарата в сравнении с флорфени-колом и тилозином.

Из 5 изученных композиций наиболее активными оказались композиции с соотношение флорфеникола и тилозина (в мас.%) 17,5:12,5 (№4) и 20,0:10,0 (№5). Антимикробная активность их в отношении эшерихий увеличилась по сравнению с флорфениколом соответственно в 2-4 раза, а по сравнению с тилозином у композиции 4 активность не изменилась, у композиции 5 возросла в 2 раза.

Все 5 изученных композиций проявляют высокую антимикробную активность в отношении сальмонелл, но, все-таки, у композиций 4 и 5 в сравнении с тилозином она была выше в 4 и 8 раз соответственно. В сравнении с флорфениколом активность композиции 4 не изменилась, а у композиции 5 возросла в 2 раза.

Таким образом, совместное применение флорфеникола и тилозина в различных соотношениях позволило снизить минимальную бактериостатическую концентрацию препарата в отношении изученных культур, что свидетельствует о синергическом действии составляющих компонентов. Но наиболее эффект синергизма проявился в композиции 5. Так антимикробная активность флорфеникола в препарате в отношении эшерихий возросла в 6 раз, сальмонелл — в 3 раза. Антимикробная активность тилозина в препарате в отношении эшерихий возросла в 6 раз, сальмонелл — 24 раза.

3.1.2 Обоснование состава препарата в опытах in vivo

Изучение специфической активности различных соотношений флорфеникола и тилозина in vivo проведено на моделях моноинфекций, вызванных штаммами Salmonella cholerae suis и Escherihia coli 57/538.

Было изучено 2 наиболее активные композиции препарата по результатам опытов in vitro (№4 и №5) в сравнении с животными контрольной группы.

В результате проведенных исследований установлено, что испытанные композиции препарата обладают высокой терапевтической эффективностью и увеличивают продолжительность жизни мышей. Терапевтическая эффективность композиции №4 при эшерихиозной инфекции составила 87,5%, композиции №5 -93,8%, а при сальмонеллезной соответственно - 75,0% и 81,3% при 100%-ной смертности животных в контрольных группах. Начало гибели мышей при эшери-хизной инфекции в контрольной группе было отмечено с первого дня после зара-

жения и все животные контрольной группы пали в течение пяти суток. В тоже время начало гибели мышей в опытных группах по сравнению с контролем отмечали в более отдалённые сроки (3 сутки). При этом гибель животных в группе, которой применяли композицию №4, составила 12,5%, а композицию №5 - 6,2%. При сальмонеллезной инфекции начало гибели мышей в контрольной группе также было отмечено с первого дня после заражения, но все животные контрольной группы пали в течение семи суток. Как и при эшерихиозной инфекции, начало гибели мышей при сальмонеллезной инфекции в опытных группах отмечали на 3 сутки. При этом процент гибели животных в группе, которой применяли композицию №4, составил 25,0%, а композицию №5 - 18,7%.

3.1.3 Антимикробная активность фенитила Исходя из данных, полученных в опытах in vivo, была изучена более детально антимикробная активность препарата фенитил.

Было установлено, что фенитил обладает широким спектром антимикробного действия в отношении всех испытанных культур микроорганизмов.

Активность препарата в отношении музейных штаммов сальмонелл составила 1,95-3,9 мкг/мл, полевых - 3,9-15,6 мкг/мл. В отношении как музейных штаммов эшерихий, так и полевых МБсК составила - 3,9-15,6 мкг/мл. Бактерио-статическая концентрация для кокковой микрофлоры - 1,95-7,8 мкг/мл.

Бактерицидная концентрация фенитила превышала бактериостатическую в отношении изученных культур в 2 раза.

3.2 Токсикологические параметры фенитила 3.2.1 Острая токсичность фенитила На основании результатов первичных токсикометрических исследований были получены данные, которые позволили определить параметры острой токсичности препарата при однократном внутрижелудочном и подкожном введении (табл. 2).

Таблица 2

Параметры острой токсичности фенитила для лабораторных животных при _однократном внутрижелудочном и подкожном введении (мг/кг)

Вид животных

Параметры токсичности

МПД

LD,

LD

50

LD84

LD,

sld5,

внутрижелудочное введение

белые мыши 11750,0 12457,9 13559,7 (13100-14000) 14686,0 15243,1 ±210,3

белые крысы 12000,0 13047,5 14464,6 (13500-15200) 15881,8 16590,3 ±410,9

подкожное введение

белые мыши 6000,0 6356,6 8035,8 (7390-8680) 9633,3 10452,5 ±319,3

белые крысы 5000,0 5318,1 6743,2 (6340-7210) 8168,3 8800,8 ±217,6

Исходя из полученных данных, препарат фенитил по степени токсичности

относится к IV классу опасности - вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76).

Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента не выявило нарушений в структурной организации внутренних органов, как при пероральном, так и подкожном способе введения препарата.

При изучении безвредности (переносимости) фенитила на поросятах, было установлено, что препарат в терапевтической дозе (0,1 мл/кг массы тела), 5-ти и 10-ти кратно ее превышающих, не влияет отрицательно на клинический и биохимический статус, морфологические показатели крови поросят. Исходя из этого, можно считать, что препарат хорошо переносится животными даже в дозах в 10 раз превышающих терапевтическую.

3.2.2. Подострая токсичность фенитила и кумулятивные свойства 3.2.2.1. Подострая токсичность фенитила и кумулятивные свойства

на белых крысах

Проведенными исследованиями установлено, что многократное подкожное введение фенитила в дозе 135,0 мг/кг, 337,0 мг/кг и 674,0 мг/кг не вызывает существенных изменений в клиническом состоянии животных. Поведение, аппетит, частота дыхания у всех животных опытных групп, как в период применения препарата, так и в течение 10 дней после окончания применения фенитила оставались в пределах нормы. За период наблюдения у животных опытных групп не было отмечено нарушений функций пищеварения и мочеотделения. Лишь в конце опыта у животных третьей опытной группы (1/10 ЬО50) регистрировалось размягчение каловых масс, которое проходило после отмены препарата.

Динамика роста крыс опытных групп существенно не отличалась от динамики роста крыс контрольной группы. Среднесуточный прирост массы тела за весь период наблюдения (24 дня) при применении препарата в дозе 135,0 мг/кг составил 117,3%, 337,0 мг/кг - 101,8%, 674,0 мг/кг массы тела -101,7%.

При исследовании крови животных, получавших препарат в дозах 135,0 и 337,0 мг/кг массы тела в течение 7 дней, не отмечено достоверных изменений в морфологическом составе крови, биохимических показателях по сравнению с показателями в крови животных контрольной группы.

При применении препарата в дозе 674,0 мг/кг изменений морфологической картины не выявлено, при изучении биохимических показателей отмечено достоверное увеличение содержания мочевины на 25,6%, креатинина - на 23,6%, активности АлАТ - на 30,6%, АсАТ - на 37%, 1ДФ - на 26,2%, ГТТ - в 2,8 раза, что свидетельствует об увеличении нагрузки на почки и печень.

Аналогичная картина крови наблюдалась и через 14 дней применения фенитила. Введение фенитила в различных дозах не оказывает отрицательного воздействия на морфологические показатели животных всех опытных групп. В дозе 135,0 мг/кг изменения биохимических показателей крови были не достоверны, в дозе 337,0 мг/кг возросло содержание мочевины на 27,2%.

При анализе данных биохимических исследований крови крыс, которым применяли фенитил в дозе 674,0 мг/кг, отмечено более напряженное функционирование мочевыделительной системы организма крыс, что выразилось в увеличении количества мочевины (на 29%), креатинина (на 38,6%) и незначительное

снижение напряженности функционирования гепатобиллиарной системы по сравнению с 7 днем опыта (АлAT - на 3,4%; АсАТ - на 23,0%; ЩФ - на 7,0%; ГГТ- в 1,8 раза).

Также было отмечено повышение содержания альбуминов - на 14,0% и снижение уровня холестерола на 14,8%, 0- и у-глобулинов - на 26,1% и 25,7% соответственно. Тем не менее, колебание величин этих показателей оставались в пределах физиологической нормы для крыс на протяжении всего опыта.

Анализируя полученные в ходе эксперимента данные клинического статуса, морфологических и биохимических показателей крови белых крыс при подкожном введении фенитила в течение 14 дней, можно констатировать, что препарат в дозах 135,0 и 337,0 мг/кг массы тела не оказывает отрицательного воздействия на их организм. Изменения, которые вызывает препарат в дозе 674,0 мг/кг (1/10 от ЛД50), обратимы, так как в течение 10 дней после отмены препарата морфологические и биохимические показатели у опытных животных восстанавливались.

При изучении кумулятивных свойств фенитила по методу Lima (1961) было установлено, что дробное введение фенитила белым крысам в возрастающих дозах в течение трех периодов незначительно влияло на прирост массы тела животных по сравнению с контрольной группой. Значительное уменьшение прироста массы тела белых крыс по сравнению с контролем произошло с начала четвертого периода (0,34 ЛД50).

Суммарная доза, при которой было отмечено начало падежа животных, составила 28596,0 мг/кг массы тела. При дальнейшем введении препарата гибель белых крыс продолжалась до 24 дня от начала опыта. На 24 день отмечена 100% гибель опытных животных.

Исходя из данных LD50, полученных в остром й хроническом опытах, коэффициент кумуляции фенитила составил 5,74 и, следовательно, препарат может быть отнесен к слабо кумулирующим веществам (классификация Ю.С. Кагана). Об этом также свидетельствует и относительно большая продолжительность жизни животных при повторном введении препарата.

3.2.2.2. Структура поведения лабораторных крыс при подострой интоксикации препаратом фенитил

При оценке действия токсических веществ на состояние организма важнейшим интегральным показателем является поведение животных. Регистрацию поведения крыс оценивали по широко используемому тесту «Открытое поле», позволяющему изучать ориентировочно-исследовательское и эмоциональное поведение.

При тестировании животных в «открытом поле» до и после введения фенитила в различных дозах был установлен у них преимущественно уравновешенный тип поведения, с умеренной локомоторной и поисковой активностью без проявления ярко выраженных признаков тревожности.

3.2.2.3. Подострая токсичность фенитила на белых мышах

Проведенными исследованиями установлено, что ежедневное подкожное введение фенитила белым мышам на протяжении 14 дней в дозах 161,0 мг/кг (1/50 LD50), 402,0 мг/кг (1/20 LD50), а также в дозе 804,0 мг/кг (1/10 LDS0) не вызывало случаев гибели и видимых изменений вегетативных функций, поведения, двига-

тельной активности, нервно-мышечной координации, болевой чувствительности и эмоциональной реактивности подопытных животных. Аппетит, частота дыхания у всех животных опытных групп, как в период применения препарата, так и в течение 10 дней после окончания применения фенитила оставались в пределах нормы. За период наблюдения у животных опытных групп не было отмечено нарушений функций пищеварения и мочеотделения. Как и в опыте на крысах в конце опыта у животных третьей опытной группы (1/10 ЬБ50) регистрировалось небольшое размягчение каловых масс, которое проходило после отмены препарата.

Еженедельное определение массы тела у подопытных мышей, которым вводили фенитил в изучаемых дозах, не выявили статистически достоверных отклонений прироста массы тела по сравнению с контролем. При термометрии мышей статистически значимых различий между контролем и опытом не было выявлено.

Результаты исследования влияния фенитила на гематологические показатели периферической крови мышей в дозах 161,0 и 402,0 мг/кг значимо не отличались от контроля. При исследовании гематологических показателей крови мышей, получавших фенитил в течении 14 дней в дозе - 804,0 мг/кг, установлено увеличение количества лейкоцитов на 28,4%. Через 10 дней после восстановительного периода количество эритроцитов, лейкоцитов и лейкограмма в испытуемом диа-позоне доз существенно не изменялись и колебались в пределах контрольных величин.

3.2.3. Влияние препарата фенитил на желудочно-кишечный тракт лабораторных животных

Проведенными исследованиями, установлено, что фенитил при однократном подкожном введении в дозах 0,1; 0,3 и 0,5 мл/кг (терапевтической, трех- и пятикратно се превышающей) не влияет на моторно-эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта.

При трехкратном подкожном введении фенитил обладает незначительным послабляющим эффектом, причем размягчение стула более выражено при увеличении дозы. Так доза 0,1 мл/кг ускоряла эвакуаторную активность кишечника мышей на 1,5 %; доза 0,3 мл/кг на 4,7%; доза препарата 0,5 мл/кг на 7,0 % по сравнению с контрольными животными.

3.2.4. Эмбриотоксические и тератогенные свойства препарата

При изучении эмбриотоксического и тератогенного действия препарата существенных различий в плодовитости крыс опытных и контрольной групп не установлено. Среднее количество плодов на самку в контрольной группе составило 12,1±0,76, а у крыс, получавших фенитил в дозе 0,3 мл/кг массы тела на 5 и 10 дни беременности 12,0±0,81 и 12,1±0,77 соответственно.

Крысята, рожденные от самок опытных групп, не отличались от крысят контрольных самок. Проведенные морфологические исследования показали отсутствие аномалий развития внутренних органов и скелета плодов, рожденных от крыс опытных групп.

Таким образом, фенитил в дозе 0,3 мл/кг массы тела не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия.

3.2.5. Раздражающее и аллергенное действие фенитила

Согласно полученным данным при однократной аппликации на кожные по-

кровы кроликам при плотности нанесения от 0,020 до 0,12 мл/см2, фенитил не вызывает повреждение кожи в виде эритемы или ее отеков.

В связи с отсутствием раздражающего действия у фенитила испытание аллергенных свойств выполняли путем выявления зуда и отека у сенсибилизированных этим препаратом животных (морские свинки). В результате проведенных исследований не выявлено аллергенных свойств у фенитила.

3.2.6. Субхроническая токсичность в опытах на поросятах

Определение субхронической токсичности фенитила проводили на 15 поросятах в возрасте 15-20 дней, средней массой 3,5-4 кг, разделенных по принципу парных аналогов на 3 группы, по 5 животных в каждой и находившихся в одинаковых условиях содержания и кормления. Поросятам первой группы препарат не вводили, они служили контролем, животным второй группы вводили внутримышечно фенитил в дозе 0,1 мл/кг, третьей - 0,3 мл/кг в течение 14 дней с интервалом 48 часов.

Общетоксическое действие препарата оценивали по клиническому состоянию животных, по динамике массы тела поросят, гематологическим и биохимическим показателям крови. Многократное внутримышечное введение фенитила в дозах 0,1 мл/кг и 0,3 мл/кг не вызывает существенных изменений в клиническом статусе поросят. Все животные контрольной и опытных групп были подвижными, без клинических признаков заболевания и имели хороший аппетит, на протяжении всего опыта. После последней инъекции фенитила в дозе 0,3 мл/кг наблюдалось незначительное размягчение каловых масс у животных, которое проходило самостоятельно после отмены препарата. Нарушении функции мочеотделения не установлено.

Фенитил в дозе 0,1 мл/кг массы тела отрицательно не влияет на рост поросят. Животные хорошо переносят препарат, осложнений после применения не отмечено. При введении фенитила в дозах 0,1 и 0,3 мл/кг в течение 14 дней с интервалом 48 часов достоверных изменений в гематологических и биохимических показателях крови поросят не обнаружено. Колебания значений данных показателей находились в пределах физиологической нормы для данного вида животных.

Отмечена лишь тенденция к увеличению содержания мочевины (на 14,0%), креатинина (на 8,4%), активности АлАТ (на 18,3%) и АсАТ (на 8,7%). Колебания значений данных показателей были недостоверны и находились в пределах физиологической нормы для данного вида животных.

Таким образом, фенитил в опыте по изучению субхронической токсичности не оказывает отрицательного воздействия на белковый, углеводный и липидный обмены в терапевтической дозе и 3-х кратно ее превышающей.

3.2.7. Влияние фенитила на качество мясопродуктов

В опыте по изучению влияния фенитила на качество мясопродуктов не было установлено существенных различий между качеством проб мяса и бульона кроликов контрольной и опытных групп. Пробы мяса имели хороший, свойственный продукту цвет и вид на разрезе, ароматный запах, приятный вкус, нежную консистенцию и достаточную сочность. Бульоны были прозрачные, слегка золотистого цвета с капельками жира, приятные на вкус и достаточно ароматные. Общая орга-нолептическая оценка проб мяса и бульона - хорошая.

3.3. Фармакокинетика препарата фенитил

Фармакокинетические исследования показали, что уже через 30 минут после введения препарата как флорфеникол, так и тилозин обнаруживаются в крови поросят в концентрациях практически в 1,8 раза превышающих минимальную бактериостатическую концентрацию для эшерихий.

Как видно из фармакокинетического профиля препарата фенитил (рис. 1), флорфеникол при внутримышечном введении достигает максимальной концентрации в крови 7,07±0,11 мкг/мл через 2,9 часа после введения, а тилозин - через 3,05 часа (4,03±0,27 мкг/мл), тогда как уровень минимальной бактериостатиче-ской концентрации для флорфеникола для эшерихий составляет 1,7 мкг/мл, а для тилозина - 0,85 мкг/мл. После чего их концентрация начинает плавно снижаться, но при этом продолжает оставаться к 48 часам на уровне, который выше минимальной бактериостатической концентрации на 10,0%.

Период полуабсорбции (полурезорбции) флорфеникола и тилозина составил в среднем 68,7 и 77,2 минуты соответственно. Таким образом, оба компонента характеризуются достаточно длительной фазой всасывания, которая сменялась также достаточно длительной фазой элиминации. Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что флорфеникол и тилозин достаточно медленно выводится из организма животных, на что указывает период полувыведения, который составил для флорфеникола 19,8 часа, для тилозина - 20,3 часа соответственно.

-А- флорфеникол —»—тилозин

Рис. 1. Фармакокинетика флорфеникола и тилозина в сыворотке крови поросят после внутримышечного введения препарата фенитил

Таким образом, результаты изучения фармакокинетики препарата фенитил позволяют рекомендовать его в дозе ОД мл/кг массы тела двукратно с интервалом между введениями 48 часов.

3.4. Изучение сроков выведения остаточных количеств фенитила из организма поросят В опыте было установлено, что через 24 часа после последнего применения фенитила остаточные количества флорфеникола и его основного метаболита флорфениколамина определяются во всех изученных органах. Наибольшее их ко-

личество обнаружено в этот период в печени (4,18±0,66 и 1,21±0,39 мкг/г) и почках (2,35±0,39 и 0,90±0,25 мкг/г), в меньшей степени в коже и жире (0,89±0,09 и 0,28±0,06 мкг/г), а также в мышцах (0,09±0,02 и 0,04±0,02 мкг/г). В дальнейшем после курсового введения препарата содержание флорфеникола и флорфеникола-мина начинает снижаться и к 9 суткам они регистрируются в печени (0,99±0,26 и 0,36±0,04 мкг/г), почках (0,19±0,03 и 0,07±0,03 мкг/г), коже и жире (0,26±0,05 и 0,17±0,02 мкг/г). На 14-е сутки исследования флорфеникол обнаруживался только в почках (0,12±0,01 мкг/г), в коже и жире (0,19±0,02 мкг/г) поросят, в печени -ниже предела количественного определения, в мышцах не обнаруживался. Флор-фениколамин в этот же срок детектировался только у одного животного из трех в жире и коже на уровне предела количественного определения (0,15 мкг/г).

В эти же сроки определяли содержание тилозина в биологическом материале. Через сутки после последнего введения фенитила остаточные количества тилозина определяются во всех объектах исследования. Однако на основании полученных результатов установлено, что тилозин также как и флорфеникол, не аккумулируется в органах и тканях свиней и достаточно быстро выводится из организма.

Через сутки наибольшее его количество обнаружено в почках (10,21±1,42 мкг/г), печени (5,17±0,63 мкг/г) и в месте инъекции (5,12±1,61 мкг/г), в меньшей степени в коже и жире (0,88±0,17 мкг/г), а также в мышцах (1,25±0,38 мкг/г). В дальнейшем содержание тилозина начинает снижаться и к 9 суткам он регистрируется в почках (0,40±0,08 мкг/г) и в месте инъекции (0,12±0,05 мкг/г). В печени содержание тилозина у двух животных было ниже уровня предела количественного определения, а у одного — 0,06 мкг/г. На 14-е сутки исследования антибиотик не обнаруживался во всех объектах исследования.

Таким образом, при изучении сроков выведения остаточных количеств тилозина, флорфеникола и флорфениколамина было установлено, что их содержание было ниже максимально допустимых уровней. Следовательно, с учетом литературных данных, дополнения №21 к Сан ПиН 2.3.2.1078-01» (зарегистрировано в Минюсте России 21.12.2010, регистрационный номер 19298), решения Комиссии Таможенного союза от 07.04.2011 №622 и полученных экспериментальных данных убой животных может быть разрешен через 14 суток после последнего введения препарата.

3.5. Определение оптимальной терапевтической дозы препарата фенитил для лечения больных колибактериозом поросят

Для определения оптимальной терапевтической дозы препарата фенитил животные с признаками эшерихиоза были разделены на 3 группы. Животным первой группы для лечения применяли фенитил в дозе 0,75 мл/10 кг (п=17), животным второй группы применяли фенитил в дозе 1,0 мл/10 кг (п=17), животным третьей группы — 1,25 мл/10 кг (п=16) двукратно с интервалом 48 часов.

Терапевтическая эффективность фенитила во второй опытной группе (доза - 1,0 мл/10 кг) составила 94,1%, что на 5,9% выше, чем в первой группе (0,75 мл/10 кг). Падежа животных во всех опытных группах не было. Сроки выздоровления поросят во второй группе составили 1,8 дня, что на 0,3 короче, чем в первой опытной группе. При повышении дозы препарата с 1,0 до 1,25 мл/10 кг достовер-

ных различий (Р>0,05) в таких показателях, как терапевтическая эффективность и сроки выздоровления, не наблюдалось. Так как эффективность препарата фенитил в дозах 1,0 и 1,25 мл/10 кг практически была одинаковой, то с экономической точки зрения более целесообразно применение антибактериального препарата фенитил в дозе 1,0 мл/10 кг массы тела.

Таким образом, исходя из результатов исследований, для лечения больных колибактериозом поросят, предложена доза фенитила 1,0 мл/10кг.

3.6. Производственная апробация терапевтической эффективности

фенитила

При анализе результатов исследования в данном опыте установлено, что препарат проявляет высокое лечебное действие при эшерихиозе поросят (табл. 3). Эффективность применения фенитила для лечения больных колибактериозом поросят после однократного введения составила 94,4-90,9%, что превосходит препарат сравнения на 12,0-10,9%. Двукратное применение фенитила обеспечило выздоровление 100,0-95,5% животных, что превышало препарат сравнения на 5,9-5,5%.

Таблица 3

Лечебная эффективность препарата фенитил при эшерихиозе поросят

Показатели ОАО Агрофирма «Ливенское мясо» ЗАО «Юдановские просторы»

Амоксоил Ретард Фенитил Флорокс Фенитил

Количество поросят 17 18 20 22

Выздоровело поросят, после однократного введения, % 14 (82,4) 17(94,4) 16 (80,0) 20 (90,9)

Выздоровело поросят, после двукратного введения, % 16(94,1) 18(100,0) 18(90,0) 21 (95,5)

3.7. Экономическая эффективность применения фенитила при лечении поросят больных колибактериозом

Лечение больных колибактериозом поросят антибактериальным препаратом фенитил является экономически выгодным: на каждый затраченный рубль хозяйство сохраняет 6,3 рубля.

4. Выводы

1. Комплексный антибактериальный препарат на пролонгирующей основе, действующими веществами которого являются флорфеникол и тилозин в мас.% соотношении 20:10, обладает широким спектром антимикробной активности. Активность препарата в отношении музейных штаммов сальмонелл составляет 1,953,9 мкг/мл, полевых - 3,9-15,6 мкг/мл. В отношении как музейных, так и полевых штаммов эшерихий - 3,9-15,6 мкг/мл. Бактериостатическая концентрация для кокковой микрофлоры - 1,95-7,8 мкг/мл. Бактерицидная концентрация фенитила превышает бактериостатическую в отношении изученных культур в 2 раза.

2. Компоненты фенитила - флорфеникол и тилозин обладают взаимоусили-вающим антимикробным действием в отношении эшерихий и сальмонелл. Антимикробная активность флорфеникола и тилозина в препарате в отношении эшерихий повышается в 6 раз, а в отношении сальмонелл соответственно — в 3 и 24 раза.

3. Фенитил является малотоксичным препаратом, 4 класс опасности (ГОСТ 12.1.007-76). ЛД50 фенитила при внутрижелудочном введении для белых мышей составляет 13559,7 мг/кг, для белых крыс - 14464,6 мг/кг; при подкожном введении для белых мышей - 8035,8 мг/кг, для белых крыс - 6743,2 мг/кг.

4. При многократном (14 дней) подкожном введении фенитила белым крысам в дозах 1/50 от ЛД50 (135,0 мг/кг) и 1/20 от ЛД50 (337,0 мг/кг) не выявлено функциональных изменений в организме животных. Изменения биохимических показателей крови крыс, получавших препарат в дозе 1/10 (674,0 мг/кг) от ЛД50, были недостоверны и носили обратимый характер.

5. Препарат не влияет на интегральные показатели жизнедеятельности организма животных: поведения и систем - пищеварения, мочевыделительной и гепа-тобиллиарной.

6. Фенитил не обладает раздражающим действием. У препарата отсутствуют кумулятивные, аллергенные, эмбриотоксические и тератогенные свойства.

7. При внутримышечном введении в дозе 0,1 мл/кг (терапевтическая доза) в течение 14 дней с интервалом 48 часов клинически здоровым поросятам фенитил не оказывает существенного влияния на их клинический статус, скорость роста, поведение и аппетит. Многократное применение препарата в терапевтической дозе существенно не влияет на морфологические и биохимические показатели крови поросят.

8. При внутримышечном введении фенитила в дозе 0,1 мл/кг содержание флорфеникола и тилозина в крови поросят, превышающее минимальную бакте-риостатическую концентрацию для эшерихий в 1,8 раза, наблюдается через 30 минут, достигая максимума к 3 часам. Флорфеникол и тилозин сохраняются в крови до 48 часов на уровне, превышающем на 10,0% минимальную бактериоста-тическую концентрацию для возбудителя колибактериоза.

9. Терапевтическая эффективность препарата фенитил в дозе 0,1 мл/кг двукратно с интервалом 48 часов при лечении больных колибактериозом поросят составляет 95,5-100,0%. Экономическая эффективность на рубль затрат при применении фенитила составляет 6,3 руб.

10. Препарат не оказывает отрицательного влияния на качество мяса и бульона, срок возможного использования продуктов убоя составляет - 14 дней после окончания применения препарата.

5. Практические предложения

1. Для лечения больных колибактериозом поросят рекомендуется применять фенитил в дозе 0,1 мл/кг массы тела двукратно с интервалом 48 часов.

2. Основные научные положения работы и ее практические результаты рекомендуется использовать в производственных условиях ветеринарными специалистами, а также в учебном процессе студентами, аспирантами и научными работниками ветеринарного профиля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, включенные в перечень научных изданий ВАК для опубликования результатов исследований

1. Жукова C.B. Экспериментальное исследование безвредности комплексного антибактериального препарата ФК-1 / C.B. Жукова, Г.А. Востроилова, Л.В. Ческидова, И.В. Брюхова, В.И. Беляев, В.И. Шушлебин // Ученые записки Казанской Государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -2012.-Т. 211. - С. 66-71.

2. Жукова C.B. Антимикробная активность и клиническая эффективность нового комплексного антибактериального препарата при колибактериозе телят / C.B. Жукова, Т.А. Панина, Г.А. Востроилова, Т.Н. Ермакова // Ученые записки Казанской Государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -2012.-Т. 211.-С. 71-75.

3. Востроилова Г.А. Острая токсичность и эффективность при эшерихиозе поросят препарата на основе флорфеникола / Г.А. Востроилова, В.И. Беляев, Ю.Н. Алёхин, C.B. Жукова // Российский журнал Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - 2012. - №1(7). - С 85-87.

4. Шабунин C.B. Терапевтическая эффективность нового комплексного антибактериального препарата фенитил при желудочно-кишечных болезнях телят и поросят / C.B. Шабунин, Г.А. Востроилова, В.И. Беляев, C.B. Михайлова, Т.И. Ермакова // Ветеринария. — 2013. - №7. - С. 21-23.

5. Шабунин C.B. Токсико-фармакологические параметры антибактериального препарата фенитил / C.B. Шабунин, Г.А. Востроилова, В.И. Беляев, C.B. Михайлова, Т.Е. Лободина // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - №5 (сентябрь-октябрь). - С. 65-66.

Статьи, опубликованные в журналах, материалах и сборниках конференций

6. Жукова C.B. Параметры острой токсичности препарата ФК-1 на белых мышах / C.B. Жукова, Л.В. Ческидова // Современные проблемы, перспективы и инновационные тенденции развития аграрной науки: Матер, междунар. науч,-практ. конф., посвящ. 85-летию со дня рожд. чл.-корр. РАСХН, д.в.н., проф. М.М. Джамбулатова. - Махачкала, 2010. - С. 167-170.

7. Жукова C.B. Аллегренные свойства комплексного антимикробного препарата на основе флорфеникола / C.B. Жукова // От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: Матер, междунар. науч,-практ. конф.- Саратов: ГНУ СНИВИ РАСХН. / ИП Моисеева Е.В, 2011. - С. 8385.

8. Жукова C.B. Эффективность нового комплексного препарата ФК-1 при дизентерии поросят / C.B. Жукова, В.И. Беляев, Н.М. Федорова. / Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Матер. XI Сиб. вет. конф., / Новосиб. гос. аграр. ун-т.-Новосибирск, 2012-С.91-92. . • ,

9. Жукова C.B. Клинико-физиологические показатели лабораторных животных при применении комплексного препарата ФК-1 / C.B. Жукова //Материалы первой международной научно-практической конференции. - Благовещенск, 2012. - С. 37-39.

10. Жукова C.B. Влияние комплексного препарата ФК-1 на клинико-физиологические показатели лабораторных животных / C.B. Жукова // Аграрная наука: современные проблемы и перспективы развития: Матер, междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию со дня образования Дагестанского государственного аграрного университета им. М.М. Джамбулатова. - Махачкала, 2012. - С. 225.

11. Михайлова C.B. Разработка оптимального соотношения компонентов препарата / C.B. Михайлова, JI.B. Ческидова, Т.А. Панина // Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных: Матер, междунар. науч.-практ. конфер., посвящ. 85-летию со дня рождения профессора Г.А. Черемисинова и 50-летию создания Воронежской школы ветеринарных акушеров. - Воронеж, 2012. - С. 549-551.

12. Михайлова C.B. Применение липотона с комплексным антибактериальным препаратом для лечения ассоциативных инфекций поросят / C.B. Михайлова C.B., Л.В. Ческидова JT.B. // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: Матер, науч.-практ. конфер. к 100-летию СГАУ имени Н.И. Вавилова. - Саратов, 2012. - С. 88-89.

13. Беляев В.И. Оценка эмбриотоксичности и тератогенности комплексного антибактериального препарата фенитил / В.И. Беляев, Г.А. Востроилова, C.B. Михайлова // Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации: Матер. IV съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. - Воронеж: Изд-во «Истоки», 2013. - С.87-89.

Подписано в печать 15.11.2013 г. Формат 60x80/16 Гарнитура "Times New Roman" Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 425.

Отпечатано с готового оригинал-макета

в ООО "Цифровая полиграфия" 394036 г. Воронеж, ул. Ф.Энгельса, 52

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Михайлова, Светлана Владимировна, Воронеж

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ ПАТОЛОГИИ, ФАРМАКОЛОГИИ И

ТЕРАПИИ

0420145 5363 на правах рукописи

МИХАЙЛОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КОМПЛЕКСНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ФЕНИТИЛ И ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ

ПОРОСЯТ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.И. Беляев

Воронеж - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................7

1.1. Степень распространения и характеристика колибактериоза поросят........................................................................................................................................................................7

1.2. Роль предрасполагающих и этиологических факторов развития эшерихиоза поросят............................................................................................................................10

1.3. Методы и средства профилактики и лечения колибактериоза поросят........................................................................................................................................................................14

1.3.1. Зоогигиенические методы и специфические средства профилактики

и лечения......................................................................................................................................................14

1.3.2. Неспецифические пути профилактики и терапии..................................................15

1.3.3. Макролиды и применение их в медицине и ветеринарии..............................22

1.3.4. Флорфеникол и его применение в ветеринарии......................................................30

1.4. Заключение................................................................................................................................................35

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................................36

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................44

3.1. Фармакотоксикология препарата фенитил....................................................................44

3.1.1. Обоснование состава фенитила в опытах in vitro....................................................44

3.1.2. Обоснование состава препарата в опытах in vivo....................................................46

3.1.3. Антимикробная активность фенитила..............................................................................49

3.2. Токсикологические параметры фенитила......................................................................50

3.2.1. Острая токсичность фенитила..................................................................................................50

3.2.2. Подострая токсичность фенитила и его кумулятивные свойства............54

3.2.2.1 Подострая токсичность фенитила и его кумулятивные свойства на

белых крысах............................................................................................................................................54

3.2.2.2. Структура поведения лабораторных крыс при подострой

интоксикации препаратом фенитил....................................................................................63

3.2.2.3 Подострая токсичность фенитила на белых мышах..............................................68

3.2.2.4. Влияние токсических доз фенитила на белых мышей в тесте прину-

дительного плавания..........................................................................................................................70

3.2.3. Влияние препарата фенитил на желудочно-кишечный тракт лабораторных животных..................................................................71

3.2.4. Эмбриотоксические и тератогенные свойства препарата................................72

3.2.5. Раздражающее действие фенитила......................................................................................73

3.2.6. Аллергенные свойства препарата..........................................................................................74

3.2.7. Субхроническая токсичность в опытах на поросятах..........................................75

3.2.8. Влияние фенитила на качество мясопродуктов........................................................78

3.3. Фармакокинетика препарата фенитил..............................................................................80

3.4. Изучение остаточных количеств фенитила в организме поросят............82

3.5. Определение оптимальной терапевтической дозы препарата фенитил для лечения колибактериоза поросят........................................................................86

3.6. Производственная апробация терапевтической эффективности фенитила..............................................................................................................................................................87

3.7. Экономическая эффективность применения фенитила при лечении поросят, больных колибактериозом....................................................................................89

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................92

5 ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................101

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................................................103

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................................................................130

ПРИЛОЖЕНИЕ (АКТЫ)......................................................................................................................................131

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В связи с реализацией национального проекта «Развития АПК», ведется активная работа по созданию крупных свиноводческих комплексов с высокой плотностью животных. Скученное содержание и нарушения в кормлении ведут к снижению иммунного статуса животных и развитию так называемых «факторных» инфекций (Шахов А.Г., 2002; Джупина С.Н., 2005). При этом желудочно-кишечные болезни поражают до 75% поросят. Среди них у 12,7%, от всех павших от инфекционных болезней поросят, выделена E.coli (Кукушкин С.А. с соавт., 2001, Байбиков Т.З. с соавт., 2003). Эшерихиозом чаще поражаются поросята первых дней жизни, заболеваемость при этом достигает 80100%, а летальность до 50% (Терехов В.И., 2000; Щербаков П. с соавт., 2002; Гусев В.В. с соавт., 2004; Романова А .Я., Рубинский И.А., 2005).

Основным направлением в борьбе с данной патологией является вакцино-профилактика и антибиотикотерапия, но многообразие антигенного состава и факторов патогенности возбудителя; массовое распространение иммунодефеци-тиов среди животных; быстро приобретаемая эшерихиями лекарственная устойчивость, снижают эффективность специфических средств профилактики и антибиотиков (Терехов В.И., 2000; Гафаров Х.З. с соавт., 2003, Федоров Ю.Н. с соавт., 2006; Ануфриев А.И. с соавт., 2007).

Так как заболевания редко протекают в виде моноинфекций, а чаще в ассоциациях, необходимы комплексные препараты широкого спектра действия, одновременно действующих на нескольких возбудителей (Шабунин C.B., 1999; Шахов А.Г., 2008).

Антибактериальные вещества, обладающие синергидным эффектом, входящие в состав комплексных препаратов, позволяют снизить дозу лекарственного средства, а значит и риски возникновения побочных эффектов.

В связи с этим перспективным является разработка нового комплексного антибактериального препарата на основе флорфеникола и тилозина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка и изучение фармакотоксикологических свойств и терапевтической эффективности препарата фенитил при эшерихиозе поросят.

Для разрешения данной цели были поставлены следующие задачи:

> разработать рецептуру фенитила и изучить его специфическую активность;

> определить токсикометрические параметры фенитила;

> изучить фармакокинетику препарата и установить сроки его выведения из организма поросят;

> определить оптимальную лечебную дозу фенитила при эшерихиозе поросят;

> изучить терапевтическую и определить экономическую эффективность препарата при лечении эшерихиоза поросят.

Научная новизна результатов работы. Впервые научно обоснован состав и рецептура нового комплексного препарата фенитил. Проведена его фармако-токсикологическая оценка. Научно аргументирована, экспериментально и клинически доказана перспективность использования нового комплексного антибактериального препарата фенитил в ветеринарной практике.

Практическая значимость. В практику ветеринарии предложен новый антибактериальный препарат фенитил для лечения эшерихиоза поросят, определены оптимальные дозы и схема его применения. Экспериментально установлен срок выведения остаточных количеств препарата из организма поросят после его применения. Дана экономическая и терапевтическая оценка лечебного действия препарата фенитил при эшерихиозе поросят. Материалы диссертации вошли в проект нормативно-технической документации на препарат.

Апробация. Основные положения и результаты исследования доложены и одобрены на: годовых отчетах по НИР Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2011-2013); на Международных и Всероссийских научно-практических конференциях: «Современные проблемы, перспективы и инновационные тенденции развития аграрной науки» (Махачкала, 2010); «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011); «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск,

2012); «Проблемы ветеринарной медицины и зооэкологии российского и азиатско-тихоокеанского регионов» (Благовещенск, 2012); «Аграрная наука: современные проблемы и перспективы развития» (Махачкала, 2012); «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных» (Воронеж, 2012); «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (Саратов, 2012); 4-м съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Москва,

2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 статей, из них 5 в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Ученые записки Казанской ГАВМ», «Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», «Ветеринария»).

Основные положения, выносимые на защиту:

- специфическая активность фенитила;

- фармакотоксикологические свойства фенитила;

- фармакокинетика и сроки выведения остаточных количеств фенитила из организма поросят;

- терапевтическая и экономическая эффективность фенитила при эшери-хиозе поросят.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 33 таблицы, 13 рисунков, включает в себя введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложение. Список литературы содержит 244 источников, из них 69 зарубежных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Степень распространения и характеристика колибактериоза поросят

Интенсивное развитие сельского хозяйства нашей стране в последние годы предусматривает производство достаточного количества высококачественной продукции животноводства за счёт сокращения потерь от заболеваемости, смертности, вынужденного убоя животных, затрат, связанных с мерами борьбы и ликвидацией последствий переболевания, а также получении и выращивании здорового поголовья. Приоритетный национальный проект по развитию АПК имеет свои специфические особенности: это и группирование ферм животными, привезенными из различных регионов, как Российской Федерации, так и зарубежья, и новые методы ведения животноводства, и специфика технологии содержания и кормления животных. Все эти особенности изменяют среду обитания животных, тем самым многие условно-патогенные микроорганизмы приобретают статус патогенных и вызывают развитие тех или иных форм заболеваний (Кабицкий С.Н., 2009).

Болезни молодняка, из которых наиболее широко распространенными являются желудочно-кишечные, продолжают оставаться одной из серьезнейших причин, сдерживающих развитие животноводства и наносящих ему значительный экономический ущерб (В.И. Раицкая с соавт., 2000; В.В. Субботин, М.А. Сидоров, 2001; П.Н. Щербаков, А.Г. Гусев, 2002; С.И. Джупина, 2002; А.Г. Шахов, 2002; 2003; А. Шахов, А. Ануфриев, П. Ануфриев, 2004 и др.). Несмотря на то, что значительную часть болезней органов пищеварения молодняка (более 85%) официальная статистика относит к незаразной этиологии, многочисленными исследованиями в России и зарубежом доказано, что на фоне неблагоприятного воздействия на животных различных предрасполагающих факторов, снижающих общую неспецифическую резистентность организма, они имеют инфекционную природу (А.Г. Шахов, 2003; И.А. Шкуратова с соавт., 2007).

По данным различных авторов в среднем по РФ на долю желудочно-кишечной патологии от общей заболеваемости приходится от 25 до 98,9%, а летальность составляет 30-37% от общего количества заболевших животных. Наи-

более высокая заболеваемость и отход поросят регистрируется в хозяйствах на 54 тыс. и особенно на 108 тыс. голов (В.И. Раицкая с соавт., 2000; М. Мильков, 2001; В.И. Терехов, 2003; А.Г. Шахов, 2003; 2008; В.И. Дедяев с соавт., 2006; И.И. Валковой с соавт., 2008).

Из всех желудочно-кишечных заболеваний молодняка эшерихиоз поросят остается одной из главных проблем, как в нашей стране, так и во всем мире.

Актуальность колибактериоза значительно возрастает при работе с импортным поголовьем, что обусловлено сравнительно широким распространением этой болезни зарубежом.

Ежегодно в США желудочно-кишечные болезни поросят наносят огромный экономический ущерб, потери составляют от 150 до 250 млн. долларов из них больше половины приходится на колибактериоз (R.W. Philips, 1982).

В Китае заболеваемость желудочно-кишечными болезнями у новорожденных и молодых поросят достигала 95% при 40%-й смертности (Hanchun Yang et co-authors, 2004).

В Австралии - заболеваемость поросят раннего возраста диареей составила 44%, а смертность их до отъема достигала 15-20% (W. Webster, 1999).

Несмотря на многочисленные исследования, посвященных колибактериоз), эта проблема не теряет своей остроты (С.И. Джупина, 2002; В.В. Субботин с соавт., 2006; Н. Esaki et al, 2004).

Колибактериоз (эшерихиоз) - это остропротекающая инфекционная болезнь, имеющая несколько форм: энтеритную, энтеротоксемическую и энтероге-моррагическую.

При специальных обследованиях пометов поросят, возбудители колибактериоза были обнаружены примерно в 80-85% случаев, а смертность от этой инфекции достигала почти 50% (Терехов В.И., 2002; Щербаков с соавт., 2003; Гусев В.В. с соавт., 2004; Романова А.Я., Рубинский И.А., 2005).

Источником возбудителя являются больные и переболевшие животные, матери-носители патогенных вариантов E.coli. А основными факторами передачи возбудителя - инфицированные окружающие предметы, молозиво, посуда, а так-

же мышевидные грызуны, являющиеся постоянными обитателями животноводческих помещений. Заражение осуществляется алиментарным путем, реже аэрогенное, но возможно и внутриутробное заражение на стадии эмбрионов.

Эшерихиоз у поросят может протекать в трех формах: энтеритной (энтерит-ная форма), энтеротоксемичной или отечной (энтеротоксимичная форма) и септической или энтерогеморрагической (септическая форма).

Энтеритная форма характеризуется тем, что у больных поросят отмечают профузный понос, вялость, угнетение, невысокую смертность. Течение болезни может быть подострым или хроническим. В результате развития патогена поражаются желудочно-кишечный тракт, брыжеечные лимфоузлы, характерен понос, без признаков общего токсикоза. Характерными симптомами колибактериоза являются токсические явления и коллапс у поросят-сосунов и отек у поросят-отъемышей.

Энтеротоксимичная или отечная форма характеризуется коротким, от 3 до

12 часов, инкубационным периодом. Ею, как правило, заболевают хорошо упи-

*

танные поросята с признаками отказа от корма, повышенной возбудимостью, шаткой походкой, подергивания головой и конечностями, а также синюшности кожи ушей, пятачка, живота и конечностей. Болезнь в этой форме протекает остро и большинство заболевших животных погибает.

Септическая форма характерна для новорожденных поросят и поросят-сосунов. Течение - сверхострое или острое, сопровождается высокой температурой тела, отказом от корма, угнетением, нарушением координации движений, иногда - диареей, развитием септических процессов и высокой летальностью.

Диагноз на колибактериоз устанавливают комплексно на основании эпизо-отологических, клинических и патологоанатомических данных и результатов лабораторного и, в частности, бактериологического исследования. Лечение и профилактика эшерихиоза осложняются широкой вариабельностью свойств и множественной устойчивостью возбудителя к различным антибактериальным препаратам.

Таким образом, проявление эпизоотического процесса колибактериоза обусловлено не только возбудителем, как при классических инфекционных болезнях, но и изменениями факторов внешей среды. Для эшерихиоза, как и для других факторных инфекций, характерно отсутствие цикличности, но интенсивность проявления этого процесса меняется ежегодно (С.И. Джупина, 2002).

1.2. Роль предрасполагающих и этиологических факторов в развитии

эшерихиоза поросят

Распространение и возникновение колибактериоза у поросят обусловлено воздействием многих этиологических факторов.

Большая роль в возникновении заболевания у поросят отводится влиянию факторов внешней среды и состоянию общей неспецифической резистентности организма животных (A.C. Орешкин, В.В. Пономарев, 2000).

На большинстве ферм регистрируется большая ску�