Дизайн рекомбинантных антител

Тикунова, Нина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дизайн рекомбинантных антител
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Дизайн рекомбинантных антител"

На правах рукописи

Тикунова Нина Викторовна

ДИЗАЙН РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

03 00 03 - молекулярная биология 03 00 Об - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

иис)иБ5ьОЭ

Кольцове - 2007

003065609

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии я биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный консультант

д б н, профессор Ильичёв Александр Алексеевич

Официальные оппоненты

член-корреспондент РАН, д х н , профессор Габибов Александр Габибович д б н , профессор Гуляева Людмила Федоровна д м н , профессор Игнатьев Георгий Михайлович

Ведущая организация

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита состоится « 09 » ноября 2007 года в Д часов на заседании диссертационного совета Д 208 020 01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан « » августа 2007 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

ЭГ Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Антитела относительно давно стали применять в терапии ряда заболеваний, в том числе и вирусных инфекций, благодаря исключительным свойствам этих природных биомолекул - высокой специфичности, наличию эффекторных функций, способности проникать в ткани и выводиться из организма с помощью естественных механизмов Однако, применение поликлональных антител, выделенных из донорской крови, имеет ряд недостатков (Maynard and Georgiou, 2000), наиболее серьезным из которых является биологический риск, связанный с возможностью инфицирования неидентифицированными патогенами Кроме того, сырьевая база для получения специфических поликлональных антител всегда ограничена, и стандартизовать эти препараты очень трудно из-за различающихся от партии к партии соотношений белок/специфические антитела Серьезной проблемой является и то, что не все антигены можно использовать для иммунизации добровольцев, например, получить человеческие сыворотки против высокопатогенных инфекционных агентов или токсических агентов практически невозможно Использование в терапии моноклональных антител (МКА) также имеет серьезные ограничения Большинство имеющихся МКА производятся гибридомными клетками животных, и введение их в организм человека вызывает развитие нежелательной иммунной реакции, особенно при повторном введении Кроме того, эффекторные функции МКА животных недостаточно активируются в организме человека, у них слишком короткий период полувыведения из организма Получение высокоаффинных МКА человека, стабильно продуцируемых гибридомными клетками, к настоящему времени затруднено из-за отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы (Karpas et al, 2001, Traggiai et al, 2004) Спектр антител, получаемых с помощью гибридомных клеток человека, ограничен так, получить антитела против патогенных и токсичных агентов, а также против собственных белков человека не представляется возможным (Laffly and Sodoyer, 2005) Наконец, не стоит забывать, что гибридомные клетки трансформированы, и, вследствие этого, препараты на их основе потенциально опасны как онкогены

Новые перспективы в этой области открывают ДНК-технологии Одним из направлений в получении МКА человека является создание трансгенных животных, у которых собственные гены, кодирующие иммуноглобулины, заменены на человеческие (Kellermann and Green, 2002, Laffly and Sodoyer, 2005) Однако, не все желаемые антитела можно получать таким образом из-за токсичности ряда антигенов д ля организма животного

Еще одно активно развивающееся направление в разработке рекомбинантных антител основано на направленном дизайне генов, кодирующих иммуноглобулины, методами генетической инженерии Так, к настоящему времени разработаны и используются в медицинской практике так называемые «химерные» антитела, состоящие из вариабельных доменов мышиных антител, обладающих целевыми свойствами, и константных доменов иммуноглобулинов человека Создаются также и «гуманизированные» антитела, в которых только гипервариабельные участки человеческих антител заменены на мышиные

Вместе с тем очевидно, что полностью человеческие рекомбинантные антитела (fully human antibodies) являются наиболее предпочтительными Для их создания объединяют вариабельные домены антител человека, обладающих целевой активностью, с константными доменами иммуноглобулинов человека нужного

изотипа Такие антитела синтезируют в эукариотических клетках, обеспечивающих правильную конформацию и гликозилирование молекул иммуноглобулинов

Ключевой стадией в создании полноразмерных антител человека является получение вариабельных доменов, отвечающих за специфичность антитела, его аффинность и биологические свойства Одним из способов их получения является отбор вариабельных доменов из комбинаторных фаговых библиотек мини-антител Каждый бактериофаг в такой библиотеке экспонирует на своей поверхности только одно антитело уникальной специфичности (фаговое антитело) Репертуар антител в таких библиотеках может достигать 1012 различных мини-антител В ходе процедуры аффинной селекции (biopanning) можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать мини-антитела с нужными свойствами Для получения рекомбинантных антител с заданными свойствами в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fab-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов Е coli

Сами мини-антитела находят применение в терапии некоторых заболеваний Обладая меньшими размерами, они легче проникают в ткани, преодолевают гематоэнцефалический барьер, вызывают меньший неспецифический иммунный ответ (Ewert et al, 2003) На их основе конструируют полифункциональные мини-антитела, иммунотоксины, средства адресной доставки лекарственных средств в организме больного

В настоящее время мини-антитела и рекомбинантные полноразмерные антитела применяют в фундаментальных исследованиях, в биотехнологии, в терапии различных заболеваний, включая вирусные Разработка противовирусных рекомбинантных антител ведется очень широко, однако лишь ограниченное количество работ, посвящено получению рекомбинантных антител, направленных к особо опасным для человека вирусным патогенам

В число основных направлений деятельности ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» входят фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, и разработка средств лечения заболеваний, вызываемых вирусными инфекциями Именно поэтому целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител, направленных к вирусным патогенам и, прежде всего, особо опасным вирусам, патогенным для человека

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи

- создать экспрессионную систему, обеспечивающую высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Е coli, и на примере одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита, исследовать особенности экспрессии целевых генов с использованием созданной конструкции, изучить иммунохимические свойства продуцируемых антител,

отобрать из имеющейся синтетической фаговой библиотеки одноцепочечные антитела человека, направленные к вирусу Эбола и ортопоксвирусам, включая жизнеспособный вирус натуральной оспы (штаммы variola major и variola minor alaslrim), исследовать иммунохимические и биологические свойства отобранных антител,

сконструировать натуральную наивную библиотеку одноцепочечных антител человека и охарактеризовать ее, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела к различным антигенам, включая вирусные, сконструировать натуральную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе генетического материала периферических лимфоцитов доноров, вакцинированных вирусом осповакцины, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела человека, направленные к различным ортопоксвирусам, исследовать их иммунохимические свойства,

выявить одноцепочечные антитела человека, способные ингибировать инфекционность ортопоксвирусов, определить белки-мишени для этих антител, - на основе одноцепочечных антител человека, направленных к вирусу Эбола и к ортопоксвирусам, сконструировать полноразмерные антитела человека и исследовать их иммунохимические свойства Научная новизна результатов исследования

Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека из периферических лимфоцитов доноров, иммунизированных вирусом осповакцины

Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к жизнеспособным ортопоксвирусам - вирусу натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусам осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также к рекомбинантному белку р г A3 OL вируса натуральной оспы

Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы

Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии

Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела человека sb9, slF4, si 16, и s2I19, подтверждена их способность связывать ортопоксвирусы

Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к белкам вируса Эбола, созданы штаммы Escherichia coli HB2151/pHEN-4Dl и Escherichia coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4Dl и s2E3 в растворимой форме

Сконструированы полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам и к вирусу Эбола Показано, что полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам, обладают вируснейтрализующей активностью

Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена

На основе сконструированных векторов созданы штаммы Ecoh, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела к поверхностному гликопротеину Б вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка

Практическая значимость работы

В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках Ecoh Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам

Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами к ортопоксвирусам Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, направленных к ортопоксвирусам, и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем

Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека к широкому спектру антигенов

Получено одноцепочечное антитело человека к фактору некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4х108М Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний

Сконструированы полноразмерные антитела человека к ортопоксвирусам, обладающие вируснейгрализующей активностью Эти антитела являются перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений

Апробация работы Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях VI Всероссийская конференция «Новые направления биотехнологии», 1994, Пущино, «Bayev memorial conference», 1996, Москва, Международная конференция «Tick-borne viral, nckettsial and bacterial infections», 1996, Иркутск, Международный симпозиум "Protein Structure, Stabihty, and Folding Fundamental and Medical Aspecto", 1998, Москва, «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 1998, 2002, 2006, Новосибирск, школы-конференции «5й, б"1, 7Л John Humphrey Advanced Summer Programme m Immunology, 2000, 2002, 2005, Пущино, Россия, «Human Antibodies and Hybridomas» 2001, Prague, Czech Republic, 2002, Beme, Switzerland, XII International Congress of Virology, 2002, París, France, Международный семинар "Basic Science m ISTC Activities", 2001, Новосибирск, Россия, Международная научно-практическая школа-конференция "Цитокины Воспаление Иммунитет" 2002, Санкт-Петербург, Россия, 15й, 16й, 17й, 18ft International Symposium of Antiviral Research, 2002, Prague, Czech Republic, 2003, Savannah, USA, 2004, Tucson, USA, 2005, Barcelona, Spain, VII International Potsdam Symposium on Tick-Borne Diseases, 2003, Berlín, Germany, Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», 2005, Судак, Украина, Международная конференция «Физико-химическая биология» 2006, Новосибирск, International conference "Basic Science for

Biotechnology and Medicine" 2006, Novosibirsk, Russia, VII Межгосударственная научно-практическая конференция 2006, Оболенск, Россия Кроме того, результы докладывались на ежегодных встречах Наблюдательного Комитета ВОЗ по контролю за исследованиями вируса натуральной оспы в 2004, 2005 и 2006 годах

Материалы диссертации изложены в 15 статьях в научных журналах Часть результатов защищена патентами РФ (6 патентов )

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из семи разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» Работа изложена на 287 страницах машинописного текста и включает 90 рисунков, 14 таблиц и список литературы, содержащий 338 ссылок

Работа выполнялась во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора с 1994 по 2006 гг в рамках научных тем организации, по гранту РФФИ (04-360)-а, по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел Защита от патогенов», контракты 43 035 11 1527 и 43 035 11 1529, по гранту Международного научно-технического центра ISTC#1638p «Комбинаторные библиотеки против ортопоксвирусов»

На разных этапах выполнения в работе приняли участие Г Н Николенко, Т А Баталова, В В Морозова, В В Дубровская, Т Э Юн, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ, а также И В Матяш, Е В Жираковская, Е И Бовшик, Е В Протопопова, В Б Локтев, Е Ф Беланов, Н И Бормотов, 3 Ф Киселева, ЛИ Карпенко, Г В Кочнева, Е И Рябчикова, И П Гилева, А В Качко, Н Т Денисова и другие сотрудники ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" - автор приносит им искреннюю благодарность

Особую признательность автор выражает д б н профессору А А Ильичеву, который был инициатором исследований, основанных на методологии фагового дисплея, в дальнейшем уделял много внимания развитию этой работы и сыграл важную роль в представлении ее результатов, а также к х н Л Н Шингаровой, обеспечившей помощь при конструировании полноразмерных антител, и к х н А Г Ламану, кхн ФА Бровко, без помощи которых конструирование натуральных библиотек затянулось бы на годы

Автор также хотел бы выразить признательность академику РАН профессору Л С Сандахчиеву, а также А А Гуськову и Е В Сокуновой, без чьей поддержки и помощи он не смог бы осуществить исследования, связанные с вирусом натуральной оспы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Часть первая «Конструирование одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита, и исследование их свойств» посвящена разработке оригинальных экспрессионных векторов, обеспечивающих высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli

Развитие «инженерии антител» способствовало появлению нового поколения иммунологических препаратов - рекомбинангных антител человека При создании терапевтических антител методами генетической инженерии одной из ключевых стадий является выбор антиген-связывающих доменов антител, обладающих целевыми свойствами Для исследования иммунологических и биологических свойств таких антигенсвязывающих доменов их объединяют в искусственную

молекулу мини-антитела Мини-антитела необходимы не только как промежуточный этап при конструировании полноразмерных антител, но и сами по себе они представляют ценность, поскольку из-за своих небольших размеров легче проникают в ткани и вызывают значительно меньший неспецифический иммунный ответ Кроме того, на их основе возможно конструирование иммунотоксинов Все это говорит о высоком потенциале мини-антител для разработки на их основе препаратов для практической медицины

Одним из вариантов мини-антител являются одноцепочечные антитела (scFv) Молекула scFv представляет собой легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина, объединенные между собой гибким пептидным линкером Это обеспечивает стабильность молекулы независимо от концентраций и слабых нековалентных взаимодействий отдельных Vh- и Vl-доменов Одна из задач нашей работы заключалась в создании векторов для эффективной экспрессии генов одноцепочечных антител, поскольку высокий уровень продукции существенно облегчает очистку scFv для последующего изучения их свойств

Такой вектор создавали на основе одноцепочечных антител, направленных к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) Для разработки вектора на первом этапе был сконструирован базовый ген одноцепочечного антитела на основе Vh- и Vl-генов, кодирующих вариабельные домены МКА мыши к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита МКА Е6В, любезно предоставленное профессором В Б Локтевым, ГНЦ ВБ "Вектор", распознает группоспецифический эпитоп вирусов комплекса КЭ (Гайдамович с соавт, 1990), способно блокировать гемагглютинирующую активность вируса КЭ, нейтрализует инфекционность штамма 205 вируса КЭ (Протопопова с соавт, 1996) МКА Е6В взаимодействует с доменом Е2 гликопротеина Е по классификации Цехановской с соавторами (Tsehanovskaya et al, 1993), играющим основную роль в формировании вируснейтрализующих и протективных антител К МКА Е6В были получены поликлональные и моноклонапьные антиидиотипические антитела Все это и определило использование МКА Е6В в качестве прототипа для конструирования одноцепочечных антител к вирусу КЭ

Vh- и Vl-гены, кодирующие вариабельные домены этого антитела, объединили в единую ДНК-последовательность с помощью фрагмента ДНК, кодирующего линкерный пептид (Gly4Ser)3 На основе полученного scFv-гена с использованием промотора РНК-полимеразы фага Т7 и оригинальной последовательности ДНК, кодирующей лидерный пептид пекгатлиазы В (pelB) Erwinia carotovora, была сконструирована плазмидная ДНК pTLS (рис 1) Фрагмент ДНК, кодирующий лидер pelB, был любезно предоставлен профессором С М Деевым, Институт Молекулярной биологии им В А Энгельгардта, Москва

Для экспрессии сконструированного гена использовали штамм Е coli BJL21(DE3), содержащий в составе бактериальной хромосомы копию гена РНК-полимеразы фага Т7 под индуцибельным lacUV5 промотором При добавлении в культуральную среду индуктора 1ас-оперона ИТОГ в этих штаммах синтезируется РНК-полимераза фага Т7, обеспечивающая высоко эффективную транскрипцию со специфического промотора. При трансформации клеток Ecoli BL21(DE3) плазмидой pTLS в лизатах индуцированных клеток был обнаружен дополнительный белок с молекулярной массой около 26 кДа, соответствующей расчетной молекулярной массе процессированной, т е без лидерного пептида, формы одноцепочечных антител (рис 2) Практически весь белок находился в растворимой

Рис I Схемы структурной организации плазмнд рТ1 .Б и рТБИБ. Обозначены промотор фага Т7, лидер реЩ, тепы, кодирующие УЬ- и \'|-домены МКА Е6В, ген устойчивости к ампициллину, ип репликации. Стрелками указаны иекпторыв сайты рестрикции

форме. В контрольном лизате индуцированных клеток, содержащих исходную векторную гглазмиду рОЕМ 1, этот белок отсутствовал.

Для специфичного и прочного связывания антитела с антигеном необходимо формирование правильной третичной структуры молекулы, обеспечивающей сближение ги и ер вариабельных районов и формирование антигене называющего сайта. Сохранение кон формации антиген связывающего домена сконструированных одно цепочечных антител было подтверждено в экспериментах по их связыванию с политональными анти идиотин ическим и антителами (АИА), которые эффективно распознавали как ндиотип исходных МКА ЕбВ, гак и сконструированные одноцепочечньгс антитела (рис ЗА) Кроме того, специфичность полученных одноцепочечных антител была продемонстрирована методом ИФА и Вестерн-блот аналнза В качестве антигена в этих экспериментах использовался рекомбннантный

Рис. 2. Электрофореграмма в 12% ПЛАГ с ЭПЯ субклеточных фракций клеток Е.соИ В1,21(ОЕЗ)/рТ1^. Окраска Кумасси Я-250. Дорожки- 1 - растворимые цитоплазматические белки (из 30 мкл клеточной культуры), 2 -фракция нерастворимых белков (из Г мл клеточной культуры). 3 белки культуральной жидкости, осажденные 65% сульфатом аммония (из I мл культуральяой жидкости), 4 -ратворимые периплазмэтические белки (из 20 мкл культуры), 5 - суммарный клеточный лизат (из 50 мкл культуры) М - маркер молекулярных масс.

1 2 3 4 5 М кДа

3.0(0

£ 90

I 1500 | 1000 I "»

1 2.500

-Х-1

г 2о о ю ё О

i 80

BL21(DE3)pGEM

■ BL21 (DE3)/pTLS

ooooi-

1\100 1300 гаой 1127CO 110100 1124300 1\7290(

1MO 1\20 1V40 1«0 Ш60 Разведения клеточных лизатов

Рис 3 Связьшание одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов Е coli BL21 (DE3 )/pTLS с АИА (А) и конкурентное связывание одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов и МКА Е6В с рекомбинантным белком Е вируса КЭ (Б) А выявление образцов клеточных лизатов АИА сывороткой (1,2) и нормальной кроличьей сывороткой (3,4) 1,3 - разведения клеточного лизата BL21(DE3)/pTLS, 2,4 - разведения клеточного лизата BL21(DE3)/pGEMl Использовали разведение сывороток 1/200 Б разведение 1\10 соответствует 10 мкп клеточной культуры

белок Е (Нетесова и др , 1999) вируса КЭ, любезно предоставленный Н А Нетесовой, ГНЦ ВБ "Вектор" Рекомбинантный белок Е содержит домены El и Е2 (1-416 ак) гликопротеина Е вируса КЭ, согласно классификации Цехановской, и эффективно связывается исходным МКА Е6В Способность сконструированных одноцепочечных антител связывать рекомбинантный белок Е в иммуноблоте и ИФА подтвердила сохранение специфичности исходных MICA у сконструированных антител

Дополнительно для подтверждения идентичности эпитопа белка Е, распознаваемого исходными МКА Е6В и сконструированными одноцепочечными антителами, показали наличие конкуренции между этими антителами за общий сайт связывания Ингибирование связывания МКА Е6В с антигеном достигало 80%, что подтвердило специфичность связывания рекомбинантных антител с белком Е и продемонстрировало наличие конкуренции между ними за общий сайт связывания (рис ЗБ) Это указывает на идентичность эпитопа белка Е, распознаваемого как МКА Е6В, так и рекомбинантными антителами

Оригинальной особенностью данной работы было введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного нейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs-эпитопа), против которого в ГНЦ ВБ «Вектор» были получены МКА 10F1 Этот эпитоп, содержащий 9 а о, фланкирован остатками цистеина Участие этих остатков, находящихся на разных молекулах scFv, в образовании S-S связей должно приводить к формированию димерных молекул одноцепочечных антител Получение одноцепочечных антител в димерной форме важно в связи с тем, что такие молекулы, как и молекулы IgG, обладают двумя антигенсвязывающими сайтами Это должно приводить к повышению константы связывания с антигеном и может способствовать проявлению вируснейтрализующих свойств, в зависимости от механизма, по которому осуществляется нейтрализация

Важным свойством сконструированных одноцепочечных антител, содержащих на С-конце молекулы HBs-эпитоп, была возможность детекции таких антител при помощи специфических анти-HBs МКА 10F1

Из ДНК плаэмиды рК.НВс-33 (Карпенко с соавт., 2000), любезчс. предоставленной Л.И. Карпенко. ГНЦ НБ "Вектор", был выделен Sau3A/Xhol(po') фрагмент размером 31 и.о., содержащий эцитоп 139-147 Fi Bs-анги ген а. В плазмиду pGEM7zt'(f), гидролизов энную реарихтазачи BcoRI и Smal. был встроен полученной фрагмент я EcoKf/ßgt/i фраглютт ¡и плазшды pTLS, содержащий ген одноцепочечного антитела. С помощью рестрикция иного анализа были отобраны клопы, содержащие необходимые вставки. Таким образом была получена плазм и да p7SHS (pije ]), которая должна была обеспечивать экспрессию одно цепочечных антител с С-кониевыми цисте инзми,

Клетки E.coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой p7SHS, индуцировали ИПТГ в среднелогарифмической стадии роста и культивировали в течение ночи. Лизаты клеток готовили диу^я способами - при температуре 37®С и 95°С. При электрофоре г ячеек ом анализе в лизатах, приготовленных при 3 7°С, было выявлено наличие Дополнительных бел кии е молекулярной массой около 26 кДа и 50 кДа (рис. 4А). В клеточных лнзата\, обработанных при 95°С, димерная форма антител отсутствовала, при этом доля мопомерной формы увеличивалась.

Вестерн-блот анализ клеточных лизатов, приготовленных при различных температурах, с АИА сывороткой против МКА lió В и с МКА 10F1, специфически взаимодействующим с HBs-эпитопом, показал, что и АИЛ сыворотка, и МКА 10F выявляли белки 26 и 50 кДа (рис. 4Б-В) Эти данные подтверждают го, что белки с молекулярной массой 26 и 50 кДа действительно представляют собой мономерную и димерную формы одноцепочечных антител. Взаимодействие н нммуноблоттинге МКЛ 10F1 с белком 50 кДа указывает на то, что, несмотря на образование межмолекулярной связи гю цистеи новым остаткам, iißs-inmoii узнается соответствующим МКА Исследование субклеточной локализации димерных одно цепочечных антител показало, что (фактически все они находится в растворимой форме.

Рис 4 Эяекгорфсрегрямма лизатов клеток В.соН В12ЦОЕЗУрОЕМ7г11+} О) " Ш.соИ вШ л тированных при 95°С (2) и при ЗТС (3). А - окраска кумаееи К.-250; Б -

нммуноблоттинг с АИЛ, В - иммунобиоггинг с МКЛ I (Ж 1 М-маркер молекулярных масс

Для обеспечения эффективной очистки идноцепочечных антител к З'-конец гена, кодирующего однОиепочечыое антитело в составе плазмид pTLS и pVSHS. был встроеEi фрагмент ДНК, кодирующий 6 а.о. гистидина, Полученными нлазмидами pTLSffis и p7SI-ISHis трансформировали клетки E.coli BL21(DE3"i для наработки ь них одноцепочечиых шггитсл и последующей очистки (рис. 5). Мономерные и димерные одно не почечные антитела были получены после такой очистки з концентрации 5 мг/мЛ- Выход однонепочечных антител составлял около 40 мг на литр культуры.

Рис 5. Электрофореграмма фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA-arapo.ie Липатов, содержащих димерные (А) и мономер" f.ic (В) одноцеиочечные антитела Окраска Кумасеи R-250. 1 - осветленный клеточный ли^ат до нанесения на колонку, 2 -иееая"завшиеся белкн, 3 - промывка, 4 - алюат, 5 - маркер молекулярных масс,

Иммунохимические характеристики очищенных мономерных а димерных одноцепочечных антител свидетельствовали о том, что они близки к исходным МКА по эффективности связывания, и по специфичности. Сконструированные одноцепочечные антитела были способны выявлять в ИФА и иммуноблоте как ре комбинат m 1ый белок F вируса Ю, так и сам вирус КЭ (рис. 6-7А). Кроме того, была продемонстрирована конкуренция рскомбинангных и исходных МКА за общий сайт связывания на рекомбинантном белке Е, и на поверхностном гликопротеинс Е в составе вируса КЭ (рис. 7Б).

Для сравнения аффинности мономерных, димерных антител и исходных МКА Е6В было проведено измерение констант диссоциации этих антител Использовааи метод определения константы диссоциации комплекса антиген-антитело в конкурентном ИФА, описанный в работах (l-'riguet et al., 1985; Stevens, 1987). В качестве антигена использовали очищенный рекомбинаитный белок Е. Для каждого варианта антител строили i-рафик зависимости обратного значения относительного изменения оптической плотности, дастш^^а. при n»6aRTvawwn к антителу различных концентраций антигена от обратного значения концентрации добавленного антигена (рис. 8).

кДа

97 66

30 20 14

■ШШ

12 3 4

АУ

кДа

П 68

1 234

Рис. 6. Вестерн-блот анализ рскомбииантного '."км К<: Е (Л) и вируса КЭ (Б) с помощью мономерных (I) и Дн мерных (2) рдноцеШ>чечнш антител, МКА Е6В (3) и нормальной мышиной сыворотки. Указаны размеры маркерои молекулярных масс

I1" \ — 1

5 > ...........

Я 5

ПЭО0 !'•'!» М1ЙСС *иЭОО '4400 и,17«Л

Рис 7. А. Связывание мономерных, лимерныл одн оцеп очечных антител и МКА Е6В с рекомбинантным белком Г; вируса КЭ, сорбированным на пластик в разведениях, начальная концентрация - 2 мг\мл ! - мономеры одноцепочечнътх антител, 2.5хКГ9М, 2 - днмеры одноцепочечных антител, ЗхЮ'М; 3 - МКА £63, 7.5х(0'шМ; 4 — нормальная мышиш сыворотка в разведи гни 1М000. Б: Конкурентное связывание рекомбинаитньа. одно не почечных антител и МКА КбВ с вирусом КЭ. 1 - разведения дин арных одно цепочечных антител, 2 - разведения мономерных одноцепочечных антител, 3 -отрицательный контроль. Исходная концентрация одноцепочечных антител - 25 мг\мл. концентрация МКА Е6Э -05 м.чт'чп.

Значение констант диссоциации вычисляли по формуле А-А;/Л=1+Кв/аи, где А - значение оптической плотности в лунке без добавления антигена, А, - значение апгачеешй плотности, получаемое при добавлении к постоянной концентрации антител концентрации антигена ац, Кд- константа диссоциации. Для бивалентных

а^Ю-8 M

Рис 8 График зависимости оптической плотности образцов (А 492 нм) от концентрации конкурирующего антитела Кривые построены программой MicroMathScientist, версия 3 2 в соответствии с уравнением, описывающим процесс 1 и 2 - мономерные и димерные одноцепочечные антитела, 3 — МКА Е6В

молекул вводили поправку для Ко=ао х (l-f)/f, где f=iÄ-A,/A (Stevens, 1987) Полученные таким образом значения констант диссоциации составили

- для мономерного одноцепочечного антитела - (9,2 ± 0,2) х 10"8 М1,

- для димеркого одноцепочечного антитела - (3,2 * 0,3) х 10"8 М1,

-для МКА Е6В - (1,8 ± 0,2) х 10"8М'

Полученные значения констант диссоциации показали, что по сравнению с исходными МКА аффинность мономерных одноцепочечных антител была примерно в 5 раза ниже, в то время как ковалентные димеры уступали в аффинности исходным МКА лишь в 2 раза

Таким образом, нами была создана оригинальная генетическая конструкция, обеспечивающая высокий уровень продукции в клетках Ecoli одноцепочечных мономерных и димерных антител в растворимой форме Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано при масштабировании наработки одноцепочечных антител Интересной особенностью этой конструкции является наличие на 3'-конце гена, кодирующего одноцепочечное антитело, олигонуклеотида, кодирующего основной поверхностный эпитоп вируса гепатита В Наличие этого эпитопа на С-конце антитела с одной стороны обеспечивает образование ковалентных димеров одноцепочечных антител, константа аффинности которых превышает таковую для мономерных молекул С другой стороны, этот эпитоп одновременно служит иммунохимическим маркером для выявления антител Созданная генетическая конструкция может быть использована для эффективной экспрессии других одноцепочечных антител, в том числе и одноцепочечных антител человека, что было продемонстрировано в дальнейших исследованиях, проводимых во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Часть вторая «Конструирование комбинаторных библиотек одноцепочечных антител человека» посвящена созданию и характеризации двух натуральных комбинаторных библиотек - наивной и иммунной библиотеки против ортопоксвирусов

В настоящее время одним из способов эффективного первичного отбора целевых мини-антител является их селекция из комбинаторных библиотек Большая представительность таких библиотек позволяет рассчитывать на селекцию мини-антител с заданными свойствами Синтетические комбинаторные библиотеки, обладая большими размерами по сравнению с натуральными, не всегда обеспечивают отбор антител, обладающих биологической активностью Возможно, это объясняется присутствием в их структуре искусственных гипервариабельных районов Натуральные библиотеки содержат мини-антитела, полученные при объединении природных вариабельных доменов, конформация которых точнее «подогнана» к вероятным антигенам в ходе эволюции

Поскольку в цели данной работы входило получение рекомбинанхных антител, обладающих биологической активностью, в частности, противовирусной, мы сконструировали натуральные библиотеки - иммунную и неиммунную (наивную) В качестве источника генетического материала для конструирования иммунной библиотеки была использована мРНК из периферических лимфоцитов четырех доноров, недавно вакцинированных вирусом осповакцины (ВОВ) В сыворотках каждого донора до вакцинации, а также после вакцинации с интервалами в 3-4 дня определяли титр антител против ВОВ Забор крови проводили при явном проявлении у донора гуморального иммунного ответа Наивная библиотека была создана на основе РНК периферических лимфоцитов здоровых людей Эти эксперименты проводились в ходе совместных исследований с сотрудниками Филиала Института биоорганической химии им ММ Шемякина и АЮ Овчинникова, г Пущино, Московская обл

Выбор олигонуклеотидов для амплификации V-генов, кодирующих легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, был обусловлен первичной структурой этих доменов Ввиду относительно высокой консервативности участка FR1 и J-сегментов соответствующие им олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации кДНК В-лимфоцитов Вместе с тем, существует несколько различных J-генов, как минимум 7 семейств Vh-генов, а также несколько типов Vl-генов каппа- и лямбда-семейств, причем последовательности FR1 у них несколько различаются Поэтому, как правило, приходится использовать достаточно широкие наборы праймеров

В данной работе праймеры были выбраны из набора, представленного в работе (Marks et al, 1991) Этот набор был ограничен в пользу олигонуклеотидов, позволяющих амплифицировать гены вариабельных доменов тех семейств, которые наиболее широко представлены в организме человека (DeWildt et al, 1999, Knappik et al, 2000) Для вариабельных доменов тяжелых цепей это были семейства 1, 3 и 5, для вариабельных доменов легких к или X цепей — 1, 2 и 3 семейства Кроме того, Vh и VI домены выбранных структурных семейств в составе одноцепочечных антител должны были обладать большей термодинамической стабильностью по сравнению с остальными и способностью эффективно продуцироваться в различных прокариотических и эукариотических системах (Ewert et al, 2003) Этим мы рассчитывали увеличить содержание в конструируемой библиотеке стабильных антител, которые преобладают по сравнению с остальными типами антител у человека

Объединение ДНК фрагментов вариабельных доменов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов в последовательности, кодирующие одноцепочечные антитела человека, проводили с использованием линкерного олигонуклеотида, содержащего

сайт для эддонуклеазы рестрикции ÂpaLÏ (рис 9), Сайт рестрикции был введен в но следов ательность линкерного праймера для повышения выхода в процессе спорки scFv-генов При этом, из-за наеденного сайта рестрикции соответствующая аминокислотная последовательность линкера. S{Gj(S)îARGSv<S, изменилась но сравнению с традиционно используемой (G4S)„. Однако, как было показано ранее (Tang et al., 1996; Turner et al., 1997), незначительные изменения линкерной последовательности существенно не влияют на взаимодействие между VI) и V¡ доменами, обеспечивающее формирование антиген связывающего сайта.

При конструировании обеих библиотек гены, кодирующие одпоцепочечные антитела, были встроены в векторную фагмиду pHEN2 (рис. 10). Эта фа™ и да может реплицироваться как обычная плазмида, а, благодаря наличию orí фага М13 и в случае ко-трансфекцин клеток E.coli фагом-помощником M ! ЗК07, может упаковываться в фаговые частицы

Между последовательностями, кодирующими встраиваемое одноцепочечиос антитело и белок pill бактериофага М13, находится стоп-кОдов TAG, который в supK штаммах E.coli :ранслируется как остаток глутаминовой кислоты Фагмида pHEN2 обеспечивает в supE штаммах E.coli довольно высоки)! уровень экспрессии генов одноцепочечных антител о составе слитого белка с оболочечным белком рШ бактериофага М13. При комплементации в отсутствие фага-помощника одна копия рехомбинантного белка будет включаться в состав фаговой частицы, что не сказывается на инфекционности последней. Кроме того, при трансформации несу) ¡ре ссор пых штаммов E.coli данная фагмида позволяет получеть «третируемые антитела в виде индивндульньгх молекул, не сам чан пых с оболочечным белком

LirrkdpaLI

i .¿pal-

No fi

SCFv-ген

* ГИДООЯИЗ, АУГ. :

* Лигироианис

* Амплификации

ApaLI

Nofl

Рис 9 Схема конструирования генов, кодирующих одпоцепочечные антитела человека. На схеме показаны Vfi- и VT-гены; сайты для задонухлеаз рестрикции ApaLI, Sfilt и Not!, линкер

М11 orí

J PI.cZ

Mfntfll

; "" % Hl!.|jg ^Amber TAG

Дряи

ÉeoR!

Рис 10. Схема фагмиды nKEN2-scFv, содержащей ген однопепочечного антитела Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции № nil II, S/il, Apal.I, Noil и FeaRl; промотор лактозного опсрона lJ lacZ. место посадки рибосом (RBS); Vh- и Vl-гсиы, су премируемый стон-коло к TAG. фрагмент гена белка рШ, orí репликации Со!Е I, orí фага М13; Ар1- ген устойчивости к

ампициллину.

Полученный репертуар фагмид использовали для трансформации клето-к супрсссорнсн о штамма Е. cali TGI Трансформанты высевали па агаризовасшуто среду Для определения размера библиотеки высевали десятикратные разведения суспензий трансформированных клеток и подсчитывали количество выросших клонов. Размеры сконструированных иммунной и наивной библиотек составили 3x107 и 2xlÜl независимых трат [с формантов, соответственно

К настоящему времени созданы комбинаторные библиотеки размером более К)11 клонов Однако полагают, что для воссоздания исходного разнообразия ннтител в комбинаторной библиотеке из неиммуннных В-лимфоцитов, используемых в качестве источника РНК. достаточно содержаться К)" индивидуальных независимых рехомбннанюн (Gavilando, 2000). Размер иммунных библиотек обычно меньше, но они создаются для отбора антител определенной специфичности, и, даже обладая меньшим размером, они достаточно представительны для отбора целевых атггител.

Для оценки фу! [к цио] сального размера сконструированных библиотек фагмидные ДНК из десятков случайно выбранных клонов из обеих библиотек использовали и качестве матрицы для амплификации scFv-генив. Было показано, что фагмидные ДНК из подавляющего большинства клонов обеих библиотек содержали вставки, по размеру совпадающие с scFv-генами Разнообразие представленных шгигел оценивали методом полиморфизма дайн рестрвддншшых фрагментов (ТТДРФ-анализ) scFv-гснов из этих случайно выбранных клонов. Для каждого из них наблюдали уникальную картину рестрикции.

Для того, чтобы иметь возможное! ь отбирать из библиотеки антитела к антигенам различной природы. необходимо оценить функциональную представительность этой библиотеки. Для этого можно нровесги аффинное обогащение библиотеки клонами, продуцирующими антитела, направленные к различным антигенам, и по полученным результатам оценить, является ли

функциональная представительность сконструированной библиотеки достаточной дан проведения дальнейших Экспериментов,

Для подтверждения функциональной представите л ьмирзи сконструированной наивной библиотеки была проведена селекция из этой библиотеки фаговых антител, направленных к различным по своей природе антигенам; фактору некроза опухоли человека (ФНО-а, любезно предоставлен к.х н Л.H Шингаровой, Институт tîHOOpraiiH ческой химии, Москва), вирусоподобным частицам, образованным коровы м белком вируса гепатита В (НВс-антиген, любезно предоставлен к.б.н Л.И. Карпенко}, и к инфекционному вирусу осповакщшы (рис 11 ).

кДа M ВОВ

1П S —*JjB.f|Sf§ и й -мкМК

54 ¿—toe ■ 66 ■ gjg

45 24

('не И, A_ Эдехтрофореграмма в 12% I1AAT с SDS белков вируса осповакинны, штамм Л-ИВП К. Электронная микрофотография частиц НВе-антигена. Негативное контрастирование ураиил ацетатом, приводится по (Карпенко с соавт, 2000). Б Электрофоре грамма а 13% ПААГ с SDS рекомбннантнога белка ФИО-a. M - маркер молекулярных масс.

Аффинное обогащение библиотеки (биовдннинг) проводили с использованием стандартных методов с нашими модификациями. 11ронедура биогоннияга представляла собой мшубшшю фаговой библиотеки антител с соответствующим антигеном с последующей отмывкой не с вязавшихся и элюциеЙ связавшихся с антигеном бактериофагов, несущих на себе одно цепочечные антитела (рис 12). В качестве эдюентов использовали либо триэтиламмн, либо сам антиген. Элюированные бактериофаги, экспонирующие одно цепочечные антитела, нарабатывали в клетках E.coli и использовали для следующих раундов бноголнинга иди для скрининга. Условия проведения аффинного обогащения библиотеки клонами, продуцирующими одноцепочечные антитела к ФИО-u, НВ с-- антигену и ВОВ суммированы в таблице 1

TaO.jHiia I.

Условия проведения биопэннингов _ __

АГ Кол-во раундов Концентрации ЛГ Способ блокировки Элюент

ФНО-а 2 25, 12.5 мкг/мл 0,2% Тнин-20-ФСБР ФНО-а, 25 мкг/мл

НВс-антиген 2 20, 20 мкг/мл 0,2% Тиин-20-ФСБР НВс-аитнгсн, 20 мкг/мл

ВОВ 3 50, 20, 20 мкг/мл У/о БСА 100 мМ триэт-шгаммн

Обогащение специфическими

фагое&ыи эктшепами

Сорбированный антиген

Рис 12. Схема проведеиия бнопэннинга.

Поликлональные фаговые популяции, полученные в результате первого, второго и третьего раундов селекции, а также исходную фаговую библиотеку тестировали с помощью И ФЛ для оценки изменения связывания с соответствующим антигеном. I Доведенное тестирование показало значительное превышение сигнала ггр» связывании соответствующего антигена популяцией после 2-го или 3-го раунда селекция над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой. Это указывало на то, что во весх случаях прайм ¡я/го обогащение исходной библиотеки клонами, продуцирующими фаговые антитела к соответствующему антигену.

Из обогащенных специфическими антителами к ФНО-а, НВс-аншгену и ВОВ библиотек независимые клоны были протестированы методом ИФА на наличие фаговых антител, связывающих соответствующий антиген Чтобы оценить разнообразие отобранных антител, кодирующие их гены были проанализированы с помощью I [ДРФ-анализа. Для этого, ПЦР-фрагменты, содержащие scFv-reIfы: были обработаны эндонуклоазами рестрикции НаеШ. Количество протее гировштых клонов, процент положителышх из них и количество уникальных клонов Представлены в таблице 2.

Для проверки специфичности отобранных антител все антитела, связывающие

Таб.шца 2.

Суммарные результаты скрннннга клонов

А Г, мг/мл

Ксш-яо протееггиро ванных клонов

Кол-во клонов, п роду цнрующнх специфические антитела

позитивных клонов

Кол-во уникальных клонов, продуцирующих специфические антитела

ФНО-ц, 0.5 мг/мл

НВе-антиген. I мг/мл

_15 8

51,7

33,3

ВОВ, 3 мг/мл

_45,8

ФНО-а человека, ВОВ и вирусоподобные частицы, образованные коровым белком вируса гепатита В, были протестированы в реакциях перекрестного связывания В результате проведенных экспериментов было показано, что все фаговые антитела, отобранные к ФНО-а, взаимодействовали только с ФНО-а и не связывались с ВОВ и коровым белком вируса гепатита В (рис 13) Антитела, отобранные к ВОВ, взаимодействовали только с ВОВ, но не связывались с другими использованными антигенами, и т д

А Б

Рис 13 Перекрестное связывание фаговых антител, специфичных к ВОВ (А), НВс-антигену (Б) и ФНО-а человека (В), с НВс-антигеном в составе вирусоподобных частиц, ВОВ, и ФНО-а

Кроме того, была протестирована способность отобранных антител связывать соответствующие антигены с помощью Вестерн-блот анализа Все антигены фракционировали электрофоретически в денатурирующих условиях в 14% ПААГ и переносили на нитроцешполозную мембрану Антигены выявляли с помощью соответствующих отобранных фаговых антител В качестве контроля неспецифического связывания использовали бактериофаг, экспонирующий на своей поверхности антитело М13С, не связывающее ни один из целевых антигенов

Было показано, что все фаговые антитела, отобранные по связыванию с вирусоподобными частицами, образованными коровым белком вируса гепатита В, выявляли белок 24 кДа, соответствующий размерам коревого белка вируса гепатита В Кроме того, 2 фаговых антитела, отобранных по связыванию с ФНО-а человека, выявляли белок с молекулярным весом около 17 кДа, соответствующий молекулярному весу рекомбинантного ФНО-а человека Два антитела из шести, отобранных по связыванию с ВОВ, взаимодействовали с белком 27 кДа ВОВ, а одно антитело - с белком размером около 54-56 кДа ВОВ Остальные фаговые антитела, отобранные по связыванию с ВОВ и ФНО-а, белков в иммуноблоте не выявляли

Вероятно, они направлены к конформационным эпигонам, которые разрушались при проведении электрофореза в денатурирующих условиях

Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили возможность отбора из сконструированной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека, специфичных к различным по своей природе антигенам Следовательно, представительность сконструированной библиотеки достаточна для отбора из нее антител, направленных к широкому спектру антигенов, в том числе антигенов, наличие которых в сыворотках доноров не удается обнаружить обычными методами Возможность такого отбора предопределена как резервами иммунной системы, на основе которой и сконструирована используемая библиотека, так и дополнительной рекомбинацией вариабельных доменов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, происходящей при конструировании комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител

Среди отобранных из наивной библиотеки специфичных антител наибольший интерес с нашей точки зрения представляют фаговые антитела против ФНО-а Этот цитокин является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты (Blam et al, 2001, Mease, 2002, Schroder et al, 2004) При тяжелых инфекциях, в частности, при вирусных геморрагических лихорадках, ФНО-а, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления Для коррекции подобных состояний можно применять антагонисты некоторых цитокинов, включая антитела человека против ФНО-а (Knight et al, 1993, Moreland et al, 1997, Kempeni et al, 1999)

Принимая это во внимание, отобранные из наивной библиотеки антитела против ФНО-а были исследованы более детально С помощью ИФА исследовали связывание их последовательных разведений с ФНО-а В результате было показано достоверное превышение значения оптической плотности над контрольной при разведении фаговых антител до 4х109 БОЕ/мл (рис 14) Фаговое антитело М13С, использованное в качестве контроля неспецифического связывания, не связывало ФНО-а человека (рис 14) Поскольку только 10% бактериофагов несут scFvs на своей поверхности (Griffiths et al, 1998), следовательно, в лунке находилось только 4х107 фаговых антител, что соответствует приблизительно 1,7х10"16 М scFv

Дополнительно было проведено исследование связывания этих антител еще с тремя различными белками - бычьим сывороточным альбумином (БСА), овальбумином (ОВА) и убиквитином (УБИ) Альбумин - это основная фракция белков крови, а убиквитин - фермент, ответственный за, так называемое, «убиквитин-опосредованное» расщепление внутриклеточных белков Поэтому, исследование

взаимодействия отобранных одпоцепочечных антител с данными белками сразу же позволило бы исключить неперспскТВЕШДе для дальнейших исследований антитела. В результате, одно фаговое антитело из шести продемонстрировало высокий сигнал при связывании овальбумива, что свидетельствовало о его недостаточной специфичности (рис. 15).

Рис 15. Связывание фаговых антител, отобранных против ФНО-а, ó БСА, ORA и УБИ и ИФА

Для оценки аффинности отобранных антител два антитела — Al и ВЗ были переведены в формат индивидуальных одноцепочечных антител в растворимой форме Для продукции таких антител был использован несупрессорный штамм E.coli. НВ2151, транслирующий кодон I AG. находящийся в структуре антитела перед белком pill б актер и оф ai а как стоп-кодон (рис 10), что приводит к экспрессия только гена, кодирующего одно цепочечное антитело.

При трансформации клеток E.coli. НВ2151 фагмидами pf-lKN-Al и pHEN-ВЗ были получены штаммы E.coli HB2151/pHüN-sAl и E.coli HB2l51/pHEN-sB3, продуцирующие одно цепочечные антитела sA I и sB3 к ФНО-а с уровнем продукции около 1% суммарного клеточного белка

Антитела sM и зЁЗ очищали vvi нериплаамэтических фракции с помощью набора «Ni-NTA Q i agen» Фракции, полученные при хроматофафии, анализировали злекфофоретическн (рис. 16) Уровень очистки для обоих одноцепочечных антител

Рис. 16. Электр о форе i р ам м а в 14% SDS-11ААГ (А) и Всстсрн-блот анализ с анти c-myc МКА (Б) фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA-агарозс лизатов E.coli, содержащих sAl 1 — лизат клеток Е. coli НВ2151/pHEN-Al, 2 - периплазма клеток Е. coli НВ2151/рНЕК-А1 до нанесения на колонку, 3 - несвязавшаяся периплаэмгггическая фракция клеток Е, coli HB2151/pHEN-Al после нанесения на колонку, 4-5 — фракции g j промывок, 6-7 - фракции элюата. М -стандарты молекулярных масс.

ffillffí'

i ", уЙ

'»sSfiji ■>

a» fill __

/''' Щс И| ■

í 2 34567M12 345

составил приблизительно 50% Учитывая степень очистки, концентрация вА1 составляла 45 мкг/мл, а концентрация вВЗ - 35 мкг/мл Выход одноцепочечных антител вА1 и бВЗ составлял 270 и 210 мкг на литр культуры, соответственно

Способность очищенных антител связывать ФНО-а была продемонстрирована с помощью ИФА и Вестерн-блот анализа Это подтвердило сохранение специфичности очищенных одноцепочечных антител эА1 и вВЗ по сравнению с исходными фаговыми антителами Гены, кодирующие вА1 и бВЗ, были секвенированы

Определение констант аффинности антител эА1 и вВЗ проводили в экспериментах с использованием параллельного титрования антител с известной начальной концентрацией, составляющей для антител 0,225 мкг/мл, на антигене в непрямом ИФА Расчет констант ассоциации проводили с использованием программы «Огщц1 7 0» Графики изменения ОР приведены на рис 17 Константа аффинности для антитела эА1 составила Кафф= (4 ± 0,5) х 108М"', для антитела вВЗ - Кафф = (7,3 ± 0,5) х Ю'М"1

Как правило, антитела, отобранные из фагмидных библиотек размером 107 - 108 рекомбинантных клонов, обладают высокой специфичностью, но низкой аффинностью порядка 106М"' (Marks et al, 1991, de Kruif et al, 1995, Ламан с соавт, 2002) Нами были получены антитела с Кафф Ю'М"1, что может быть объяснено использованием наших модификаций при проведении аффинной селекции Следовательно, даже в библиотеке scFvs средней представительности присутствуют среднеаффинные антитела, однако для их отбора необходима оптимизация методов отбора клонов

Полученные одноцепочечные антитела человека, направленные к ФНО-а, с аффинностью около 108 М"1 в дальнейшем могут быть использованы для конструирования полноразмерных антител человека Такие полноразмерные антитела, в случае наличия у них нейтрализующей ФНО-а активности, могли бы представлять большой интерес в терапии ряда заболеваний, в частности, для лечения вирусных гемморрагических лихорадок и аутоиммунных заболеваний

Таким образом, нами была доказана возможность отбора из сконструированной натуральной библиотеки антител против широкого спектра антигенов

Часть третья «Получение рекомбинантных антител человека, направленных к вирусу Эбола. и исследование их свойств» описывает отбор одноцепочечных антител из комбинаторных библиотек и конструирование полноразмерного антитела человека к вирусу Эбола

Рис 17 Определение констант аффинности одноцепочечных

антител эА1 и вВЗ с использованием непрямого иммуноферментного анализа.

О 1 -

10"* 10* Концентрация антител М

Так как была доказана возможность отбора из сконструированной нами натуральной библиотеки антител к широкому спектру антигенов, эта библиотека и переданная нам ранее синтетическая библиотека Griffin 1, MRC, Великобритания (Nissim et al, 1994), были использованы для отбора из них одноцепочечных антител человека, направленных к вирусу Эбола.

Вирус Эбола (ВЭ) является одним из самых опасных для человека вирусов Сочетание высокой контагиозности, летальности, отсутствие средств профилактики и лечения однозначно определяют его в четвертую - группу по классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) вирусов В настоящее время отсутствуют действенные средства борьбы с филовирусными инфекциями вакцины находятся в стадии разработки, нет эффективных средств терапии Вместе с тем, получены МКА мыши, способные обеспечивать протекцию модельных животных от летальных доз ВЭ (Wilson et al, 2000) Однако гетерологичность таких иммуноглобулинов не позволяет использовать их для терапии филовирусных лихорадок человека Именно поэтому получение рекомбинантных полноразмерных антител человека против ВЭ представляет существенный интерес

В данной работе в качестве антигена использовали лизированный препарат вируса Эбола Заир, штамм Mayinga, любезно предоставленный профессором А А Чепурновым, ГНЦ ВБ «Вектор» Инактивацию проводили кипячением в SDS, следовательно, использованный антиген содержал только линейные эпитопы

Аффинную селекцию специфичных антител из обеих библиотек проводили по методам, описанным ранее (Nissim et al, 1994) с нашими модификациями Условия проведения аффинного обогащения библиотек и отбора клонов, продуцирующих одноцепочечные антитела против ВЭ, суммированы в таблице 3 Для всех отобранных одноцепочечных антител были определены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов,

Поскольку селекцию антител проводили с использованием инактивированного ВЭ, отобранные фаговые антитела были проанализированы с помощью ИФА на способность связывать инфекционный вирус Эбола (табл 4) Было показано, что все антитела, отобранные из наивной библиотеки, и 8 антител, отобранных из синтетической библиотеки, за исключением одного антитела, способны связывать инфекционный ВЭ Это свидетельствует о том, что выявляемые эпитопы присутствуют в составе белков и нативных, и инактивированных вирионов

Таблица 3.

Условия селекции фаговых антител против вируса Эбола

из синтетической и натуральной библиотек__

Библиотека Кол-во раундов Концентра ции АГ, мкг/мл Способ блокировки Элюент Кол-во тестиро ванных клонов Кол-во уникальных клонов, продуцирующих специфические антитела

Синтети ческая 3 70,50,25 3%БСА 100 мМ триэтиламин 80 9

Натуральная 2 5,0 8 0Д% Твин-20-ФСБР ВЭ, 0 8 мкг/мл 60 8

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» были получены МКА мыши, направленные к инактивированному вирусу Эбола, и было показано, что некоторые из них способны связывать и инактивированный вирус Марбурга (ВМ) (Казачинская с соавт, 2000) Поэтому отобранные нами антитела также были протестированы на способность к перекрестному связыванию с ВМ Результаты показали, что все антитела, отобранные из наивной библиотеки, и большинство антител, отобранных из синтетической библиотеки, являлись специфично направленными только к ВЭ (табл 4)

Таблица 4.

Иммунологические свойства фаговых антител против вируса Эбола

Клон Титр фаговых антител в ИФА Концентрация вируса Эбола в Связывание Связывание антител с антител с Белки-мишени

(БОЕ/мл)* ИФА ,нг\мл живым ВЭ инактивиро-ванным ВМ

Фаговые антитела, отобранные из синтетической библиотеки

1Е2 Ю10 20 + VP24

1G4 10" 60 + VP40

2ЕЗ 2 Я О11 60 + NP

2G2 2*0" 60 + + VP40, VP24

4D1 109 20 + NP

5А2 16Í09 20 + NP

5D1 16 i О9 50 + NP

5D3 ю10 20 NP

5F4 3 2 Í07 20 + NP

Фаговые антитела, отобранные из натуральной библиотеки

Al 4*08 5 + VP40

В2 25Я011 80 + NP, VP40

СЗ 4 Я О8 5 + VP40

Н4 2 síO11 80 + NP, VP40

А5 2 Я О9 20 + VP40

D6 4 áO8 5 + VP40

F6 8 Я О7 5 + VP40

В7 4 ЯО8 5 + VP40

* Минимальная концентрация фаговых антител, при которой положительный сигнал в ИФА выше отрицательного контроля в 3 раза Количество антигена - 80 нг/лунка **Наименьшее количество антигена, выявляемое 10 "фаговых частиц

При определении белков-мишеней для отобранных антител было показано, что антитела связывали нуклеопротеин (NP) и белки оболочки VP40, VP24, причем некоторые антитела выявляли в иммуноблоте более одного вирусного белка (табл 4) Следует отметить, что в коллекции полученных ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» MICA

мыши, направленных к инактивированному ВМ, также присутствовали МКА, выявлявшие в иммуноблоте более одного бежа ВМ (Разумов с соавт, 1998)

Из шести одноцепочечных антител, отобранных из синтетической библиотеки, специфичных к NP ВЭ, четыре антитела (4D1, 5А2, 5D1, 5F4) имели не только идентичные Vl-домены, но и похожие последовательности Vh-доменов (табл 7), различающиеся лишь единичными заменами в каркасных или гипервариабельных регионах CDR1 или CDR2 Третий гипервариабельный регион (CDR3) Vh-домена, играющий наиболее важную роль в специфичности и аффинности антитела, являлся у этих четырех антител идентичным Поэтому можно предположить, что антитела 4D1, 5А2, 5D1,5F4 связывали один и тот же эпитоп NP ВЭ

Для того, чтобы определить константы аффинности отобранных антител, два из них были переведены в форму растворимых одноцепочечных антител без последовательности фагового белка рЗ на С-конце молекулы Для этого клетки Е coli НВ2151 независимо трансформировали фагмидными ДНК pHEN-4Dl и pHEN-2E3 Уровень продукции одноцепочечных антител человека s4Dl и s2E3 в растворимой форме клетками Е coli HB2151/pHEN-4Dl и Е coli НВ215 l/pHEN-2E3достигал 5% от суммарного клеточного белка

Очистку каждого антитела проводили из объединенных периплазматической и цитоплазматической фракций с помощью набора «Ni-NTA Qiagen» Константы аффинности очищенных одноцепочечных антител s4Dl и s2E3 определяли с использованием титрования антител с известной начальной концентрацией, на антигене в непрямом ИФА Расчет констант аффинности проводили с использованием программы «Ongm 7 0» Расчетная величина константы аффинности для антитела s4Dl составила (1,7 ± 0,3) х 107М"', а для антитела s2E3 - (6,8 ± 0,8) х 106M"'

На основе вариабельных доменов одноцепочечного антитела 4D1, направленного к NP вируса Эбола, было сконструировано полноразмерное антитело человека Для этого к генам, кодирующим Vh- и Vl-домены 4D1, были соответственно присоединены гены, кодирующие лидерные пептиды тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (Radko et al, 2002) и константные домены €н1- Сн2- СцЗ- тяжелой цепи IgGl человека и каппа-домен легкой цепи антитела человека (Aliev et al, 2002) Эти эксперименты проводили в рамках совместного проекта с сотрудниками лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им ММ ШемякинаиЮ А Овчинникова

Сконструированные гены, кодирующие тяжелую цепь IgGl и легкую каппа-цепь антител человека, были независимо встроены в экспрессионную плазмиду pcDNA3 1(+) (рис 18) Результирующие плазмиды рСН1 и pCLl использовали для ко-трансфекции эукариотических клеток линии НЕК293Т

Транзиентная экспрессия сконструированных генов, кодирующих тяжелую и легкую цепи полноразмерного человеческого антитела, обеспечила биосинтез полипептидов со свойствами легкой и тяжелой цепей антитела человека, которые объединяются в антитело класса IgGl (рис 19)

Специфичность очищенного полноразмерного антитела fh4Dl подтверждали методом Вестерн-блот анализа Было показано, что fh4Dl, как и исходное фаговое антитело 4D1, выявляло NP вируса Эбола и не выявляло белки вируса Марбург, связывание с которыми рассматривали в качестве отрицательного контроля (рис 20)

Bjrí]l(12> ВгЛ1(12)

Рис Ifc. Фтоичесхие *apvu -г.лазшш pCLI и fCHt. Уклэдны сайты 1ндонуклеаэ ресгриющи-lJcmv - цитомегаловирусный промотор; S - сигнальная последовательность; VI, к -вариабельный и константный участки гена легкой цепи рекомбинантиого антитела: Vh, const. - вариабельный и константный участки гена тяжелой цепи рекомбинантного антитела; ВПНрЛ - сапт пояяадеяияироваиия бычьего гормона роста.

Рис. i 9. Элсктрофореграмма очнщенною целепого белка в денатурирующем 13% ПААГ Дорожки: I - маркер молекулярных масс, 2 - даевой Senos, обработанный 2-меркалтоэтаналом, 3 - пеленой белок, не обработанный 2-меркаптоэтаноиом. Очистку рекомбинантиых антител из культу рал ьной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein ti Sepharoüe

205

97 S4 М

Рис 20. Белки ВЭ (I) и ВМ (2), выявленные антителом fh4Dl (А) & A иммуноблоте и окрашенные

Кумаеси K-2ÍÜ (Б).

А Ь

¡2 J 2 М

Константу связывания &401 определяли с использованием метода твердофазного ИФА (рис 21) Величину константы связывания рассчитывали, используя формулу

х + Я+ 1/к-/(х + Л + 1/к/ - 4Ях

Ой405 = А---------------------------------------------(Варфоломеев и Гуревич, 1999), где

2Я

х - концентрация антител в растворе, Я - концентрация сорбированного антигена, к -константа аффинности, А - нормировочный множитель Величина константы аффинности &4Б1 составила (7,7 ± 1,5) х 107М"' Эта величина лежит в пределах, характерных для ряда моноклональных антител

Рис 21 Определение константы аффинности полноразмерного антитела человека с

использованием непрямого ИФА

концентрация атятеда, М

Таким образом, на примере антитела :М01 нами был отработан способ создания полноразмерного антитела человека на основе вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, отобранных из комбинаторной библиотеки В дальнейшем возможно использование сконструированного антитела &401 для специфической детекции ВЭ

Часть четвертая «Конструирование рекомбинантных антител человека. направленных к ортопоксвирусам. и исследование их свойств» описывает получение на основе технологии фагового дисплея рекомбинантных вируснейгрализующих антител человека к ортопоксвирусам

В настоящее время существуют причины, по которым ортопоксвирусы продолжают оставаться источником биологической опасности для людей распространяется новое генерализованное заболевание человека, вызываемое вирусом оспы обезьян, возможно использование вируса натуральной оспы из неофициальных коллекций в террористических целях Однако, в связи с ликвидацией вируса натуральной оспы массовая вакцинация была прекращена во второй половине 70-х годов прошлого века, и в настоящее время большинство населения иммунитета к ортопоксвирусным инфекциям не имеет Специфические средства лечения ортопоксвирусных инфекций очень ограничены Прививка осповакцины дает достаточно надежную защиту, но нередко сопровождается серьезными поствакцинальными осложнениями, вероятность возникновения которых особенно велика для лиц со сниженным иммунным статусом Для профилактики и лечения

некоторых осложнений, возникающих после оспопрививания, применяют человеческий вакцинный иммуноглобулин (VIG), но поскольку он обладает всеми недостатками препарата, полученного из донорской крови, предпочтительнее было бы использование специфичных к ортопоксвирусам антител человека, созданных с помощью рекомбинантных технологий

На первом этапе мы провели отбор одноцепочечных антител человека к ортопоксвирусам из синтетической библиотеки Griffin 1, MRC, Великобритания (Nissim et al, 1994) и иммунной библиотеки, сконструированной в ходе выполнения данной работы

В качестве антигенов для аффинного обогащения библиотек использовали вирус осповакцины (ВОВ), штамм Листер, вариант Л-ИВП, вирус оспы коров (ВОК), штамм Гришак, вирус эктромелии (ВЭМ), штамм К2, а также вирус натуральной оспы (ВНО), штаммы Ind3a и Butler, относящиеся к variola major и variola minor, группа штаммов alastrim, соответственно Следует отметить, что для максимального сохранения антигенных профилей ортопоксвирусов в работе использовали жизнеспособные вирусы, так как известно, что инактивация, как правило, разрушает конформационные эпитопы вирусных белков Все эксперименты с жизнеспособными ВНО, то есть аффинное обогащение библиотеки, отбор и исследование отобранных фаговых антител, проводили в лаборатории со степенью защиты BSL 3-4, сертифицированной ВОЗ и Министерством здравоохранения РФ

Для того чтобы избежать отбора антител к содержащимся в вирусных препаратах белкам тканевого или клеточного происхождения, в ходе аффинной селекции использовали вирусы, наработанные на различных объектах Например, для первого и второго раунда аффинного обогащения библиотеки антителами, специфичными к ВНО, использовали вирус, выделенный из ХАО РКЭ, а третий раунд обогащения проводился с использованием вируса, наработанного на культуре клеток VeroEö

Кроме ортопоксвирусов для обогащения иммунной библиотеки использовали рекомбинантный белок ргАЗОЬ (Разумов и др, 2005), любезно предоставленный к б н И П Гилевой, ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора Рекомбинантный белок prA30L является аналогом поверхностного белка слияния ВНО (штамм Ind3a), кодируемым ОРТ A30L Этот белок гомологичен белку слияния ВОВ массой 14 кДа, который кодируется ОРТ A27L

В ходе экспериментов было независимо проведено аффинное обогащение синтетической библиотеки клонами, продуцирующими антитела, направленные к двум штаммам ВНО - Ind3А и Butler, и клонами, продуцирующими антитела к ВОВ Иммунная библиотека обогащалась клонами, продуцирующими антитела к ВОВ и ВОК Дополнительно из обеих библиотек отбирали антитела к ВЭМ Примеры результатов биопэннинга и тестирования вируснейтрализующей активности популяций, обогащенных антителами против ВОК и рекомбинантного белка ргАЗОЬ приведены на рис 21 и 22-23

Всего было протестировано 1062 клона из синтетической библиотеки и 948 - из иммунной Гены, кодирующие антитела, продуцируемые позитивными клонами, подвергали ПДРФ-анализу и секвенированию В результате из синтетической библиотеки отобрали 24 уникальных антитела, из иммунной - 42 Результаты селекции антител против ортопоксвирусов суммированы в таблице 5

Анализ аминокислотных последовательностей отобранных антител показал, что Vh-домены большинства антител, отобранных из обеих библиотек, относятся к Vhl-

Рис 21 Связывание популяций фаговых антител с ВОК (А) и рекомбинантным белком ВНО prA30L (Б) в ИФА

Рис 22 Нейтрализация инфекционности ВОК популяцией фаговых антител, обогащенной антителами против ВОК (1), и исходной комбинаторной библиотекой (2) в культуре клеток Vero Е6 3 - контроль неспецифической нейтрализации ВОК (anti-Thy антитело) Титр ВОК 320 БОЕ/мл

Рис 23 Нейтрализация инфекционности ВОВ популяцией фаговых антител, обогащенной антитепами против белка prA30L (1), и исходной комбинаторной библиотекой (2) в культуре клеток Vero Е6 3 - контроль неспецифической нейтрализации BOB (anti-Thy антитело) Тигр ВОВ - 250 БОЕ/мл

и УЬЗ-семействам Отбор Vh-доменов, принадлежащих именно к этим двум семействам, из иммунной библиотеки может быть связан с тем, что эти семейства Vh-доменов представлены в человеческом организме в наибольшей степени и максимальном разнообразии по сравнению с остальными семействами (Hoogenboom et al, 1992) Кроме того, Vhl- и УЬЗ-домены одноцепочечных антител обладают максимальной термодинамической стабильностью по сравнению с остальными и способны принимать правильную конформацию т vivo (Ewert et al, 2003), что может быть причиной отбора таких Vh-доменов из синтетической библиотеки

Все отобранные уникальные фаговые антитела исследовали в реакциях перекрестного связывания с ВОК, ВОВ и ВЭМ По результатам проведенных экспериментов антитела разделились на две группы Большинство вошло в первую группу, и каждое из них выявляло приблизительно равные концентрации разных ортопоксвирусов (табл 6) Вероятно, эти антитела являются родоспецифическими Во вторую группу вошли антитела 2VC3, 2VD10, 2VA8, 9G2, 20А5, 1F4 и 2В2, связывающие разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью (табл 6) При этом антитела 2VC3 и 2VD10 связывали ВОВ и ВЭМ эффективнее, чем ВОК,

Таблица 5.

Суммарные результаты отбора клонов

Кол-во Кол-во

Вирус Кол-во Конц-ции АГ, тестиро- Кол-во (%) уникаль-

раундов MKg/ml ванных позитивных ных

клонов клонов клонов

Синтетическая библиотека

BHO,Ind3a 3 100,100,20 261 12(4 6%) 8

ВНО, Butler 3 100,100, 20 165 10 (6 1%) 7

ВОВ 3 50,20,20 458 15 (3 3%) 7

ВЭМ 178 5 (8 9%) 2

Итого: 1062 42(4%) 24

Иммунная библиотека

ВОВ 3 50,20,20 368 97 (25%) 8

ВЭМ 3 96 10(104%) 0

ВОК 2 100, 100 92 15 (16%) 14

prA27L 3 25, 20,10 250* 12 (5%)* 8*

+ 142 + 45(31%) + 13

Итого- 948 179 (17.6%) 42

а антитело 2VA8 не связывало ВЭМ Это антитело является строго группоспецифическим, вероятно, эпитоп, узнаваемый этим антителом, отсутствует на поверхности ВЭМ

Антигенная структура ортопоксвирусов являлась предметом исследований многих авторов, пытавшихся выяснить причины такого серологического сходства при столь сильно отличающихся биологических свойствах этих вирусов (Ichihashi, 1988, Czerny, 1990, Demcovicz et al,1992 и др) Считается, что иммунологический профиль отдельных видов ортопоксвирусов складывается из набора видоспецифических эпитопов (Esposito et al, 1977, Gispen et al, 1974) и из композиции эпигопов, складывающихся для каждого вида в определенную мозаику (Ichihashi, 1988), причем эта мозаичная композиция вносит существенный вклад в формирование разнообразия ортопоксвирусов (Ichihashi, 1988, Demcovicz et al, 1992)

В нашей работе были отобраны фаговые антитела, связывающие разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью Ряд МКА грызунов, полученных ранее (Ichihashi et al, 1988, Разумов и др, 2005), также обладал подобными свойствами Существование антител, связывающих разные виды ортопоксвирусов с различной эффективностью, свидетельствует о том, что наряду с видоспецифическими эпитопами существуют общие для разных видов эпитопы, конформации которых имеют определенные различия у разных видов ортопоксвирусов Видимо, эпитопы, узнаваемые антителами 1F4, 9G2, 20А5, 2VC3 и 2VD10, присутствуют на всех исследованных вирусах, но обладают межвидовыми конформационными отличиями Мы полагаем, что подобные эпитопы также вносят определенный вклад в разнообразие иммунологических профилей различных ортопоксвирусов, наряду с видоспецифическими эпитопами и с мозаичной композицией видоспецифичных эпитопов, уникальной для каждого вида

В данной работе впервые была сделана попытка обнаружить штаммоспецифические эпитопы ВНО и определить, связаны ли они с вирулентностью этого патогена Известно, что штаммы ВНО различаются по степени тяжести заболевания, которое они вызывают, и по уровню смертности К variola

Таблица б

Свойства отобранных одноцепочечных антител против ортопоксвирусов_

AT Концентрация ортопоксвирусов в ИФА (нг/лунка) Вируснейтрализующая активность Белок-мишень

Штаммы ВНО ВОВ вок ВЭМ ВОВ ВОК ВЭМ BOO

Ind3a Соп2 Kuw-5 Butler Brazil 131

Антитела, отобранные из синтетической библиотеки

114 9,4 94 9,4 9,4 9,4 12,5 12,5 12,5 - - - н/о -

116 9,4 9,4 9,4 94 9,4 12,5 125 12,5 - - - н/о 54-56 кДа

213 9,4 9,4 9,4 9,4 94 12 5 12,5 12,5 - - - н/о -

2119 9,4 37,5 9,4 37,5 37,5 12,5 12,5 0,8 - - - н/о 27 кДа

2146 23 23 2,3 2,3 2,3 12,5 12,5 12,5 - - - н/о -

313 150 150 37,5 150 150 50 50 12,5 - - - н/о -

315 37,5 37 5 37 5 37,5 37 5 125 12,5 3 1 - - - н/о -

317 37 5 37,5 37,5 37,5 37 5 12 5 12,5 12,5 - - - н/о -

2В2 150 37,5 150 0,6 0,6 50 50 3,1 - - н/о 35 кДа

2ВЗ 37,5 37,5 37,5 37 5 37,5 50 50 50 - - - н/о -

2В20 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 50 50 50 - - - н/о -

2В25 9,4 9,4 9,4 9,4 9,4 12 5 125 12,5 - - - н/о -

2В28 9,4 9,4 9,4 2,3 2,3 12,5 12,5 12,5 - - - н/о -

2В34 94 94 9,4 9,4 94 12 5 12,5 50 - - - н/о -

2В36 37,5 37 5 37,5 37,5 37,5 50 50 3,1 - - - н/о -

1F4 37,5 9,4 9,4 9,4 9,4 12,5 50 1,0 - - - н/о 27 кДа

8С5 37,5 94 9,4 9,4 9,4 12,5 200 50 - - - н/о -

8G4 37,5 9,4 9,4 9,4 94 12,5 50 50 - - - н/о -

9G2 150 150 150 9,4 9,4 12,5 200 3,1 - - - н/о 35 кДа

10ЕЗ 37,5 37,5 37,5 37,5 37,5 50 50 50 - - - н/о -

10Н2 37,5 37,5 37,5 9,4 9,4 200 200 50 + - - н/о -

15G1 9,4 9,4 9,4 94 94 50 50 200 - - - н/о -

16H3 23 23 2,3 2,3 2,3 50 50 50 + - н/о

20А5 37 5 37,5 37,5 9,4 9,4 0,8 200 0,8 - - - н/о -

Антитела, отоб ранные из иммунной библиотеки

2VC3 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 200 3,1 + - + н/о 35 кДа

2VD10 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 50 3,1 + - + н/о 35 кДа

3VA10 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 3,1 3 1 + + + + 35 кДа

4VC1 н/о н/о н/о н/о н/о 3,1 3,1 3,1 + + н/о н/о 35 кДа

2VA8 н/о н/о н/о н/о н/о 12,5 3,1 - +/- +/- - - .

3VB7 н/о н/о Hfo в/о н/о 50 50 50 - - - -

3VG8 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - - -

3VF11 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - - .

а4 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + н/о н/о 35 кДа

Ь9 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + + + 35кДа

fll н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + н/о н/о 35 кДа

с4 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о н/о 35 кДа

02 н/о н/о н/о н/о н/о 40 40 40 + + +/- + 35 кДа

е7 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о + 35 кДа

е8 н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о н/о 35 кДа

hi н/о н/о н/о н/о н/о 8 40 40 + + н/о н/о 35 кДа

f6 н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 + + н/о н/о -

(51 н/о н/о н/о н/о н/о 50 200 50 +/- +/- н/о н/о -

Ь6 н/о н/о н/о н/о н/о 50 50 50 - - - н/о -

g4 н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 + + н/о н/о -

gll н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 - - - н/о

elO н/о н/о н/о н/о н/о 200 200 200 +/- +/- н/о н/о -

4 1 н/о н/о н/о н/о н/о 50 н/о н/о + + н/о н/о 14 кДа

d4 н/о н/о н/о н/о н/о 200 н/о н/о + + н/о н/о 14 кДа

н/о - не определяли,

Н- - ингкоирование бляшкообразования < 30%, но < 50%

major относят возбудителей, вызывавших классическое заболевание, приводившее к летальному исходу у 10 - 40% невакцинированых пациентов, тогда как смертность при заболевании, вызванном variola minor, составляла менее 1% (Esposito et al, 1977) Variola minor была эндемична в Африке и Южной Америке наряду со штаммами variola major, причем исследования возбудителей variola minor показали наличие определенных биологических различий у вирусов, выделенных в Африке и в Южной Америке (Fenner, 1989) Для южноамериканских штаммов variola minor предложено использовать термин alastrim (Fenner, 1989)

Поиск пггамм-специфических эпитопов проводили с помощью фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки В работе использовали штаммы ВНО, относящиеся к группам штаммов как variola major (штаммы Ind-За, Соп-9, Kuw-5), так и variola minor alastrim (Butler, Brazil 131) (рис 24) Результаты экспериментов показали, что большинство фаговых антител отличались между собой по интенсивности сигнала в ИФА при связывании исследуемых штаммов вируса натуральной оспы, но каждое из них выявляло приблизительно равные концентрации разных представителей данного вида (табл 6) Исключение составили антитела 2В2 и 9G2 (табл 6) Оба этих фаговых антитела эффективнее связывали штаммы группы alastrim, чем штаммы variola major Вероятно, эпитоп, узнаваемый фаговыми антителами 2В2 и 9G2, обладает межвидовыми, а в случае вируса натуральной оспы и межштаммовыми конформационными отличиями Таким образом, в результате проведенных экспериментов нам не удалось выявить строго штаммоспепифические антитела, но были получены два фаговых антитела, которые выявляли низковирулентные (alastrim) штаммы эффективнее, чем остальные штаммы ВНО Следовательно, штаммы вируса натуральной оспы также могут иметь различия в иммунологических профилях за счет конформационных отличий в аналогичных эпитопах

Все отобранные фаговые антитела были протестированы на наличие вируснейтрализующих свойств Было показано, что 14 антител, отобранных из иммунной библиотеки по связыванию с ортопоксвирусами (рис 25), и два антитела,

3 4 М 5 6 _ кДа

trm, 205

mm тя ШЖШж ~*<lliii

aiassise*

не 97 84

66 6$

ЩШШШШ^ъ'" 46

Рис 24 Электрофореграмма белков -ортопоксвирусов в 15% SDS-ПААГ

Окраска кумасси R-250 Дорожки 1 - ВНО, "******-

Brazil 131,2-ВНО, штамм Butler, 3-ВНО, " ' I л 20

Kuv-5, 4 - ВНО, Соп-9, 5 - ВОВ, Листер, ,

вариант Л-ИВП , 6 - ВНО, Ind-За М - # 14,2

маркер молекулярных масс » ,

отобранные из этой же библиотеки но связыванию е рекомбинантным белком ВОВ ргЛ301. (рис 26), были способны нейтрализовать инфекционность ортопоксвирусов на культуре клеток УегоЕб. Часть фаговых антител, отобранных из нммушгой библиотеки, продемонстрировала способность нейтрализовать вирус оспы обезьян (ВСЮ) (рис 27, табл. 6).

Рис 25 Нейтрализация ВОК фаговыми антителами в культуре клеток Vern 1-6. Титр фаговых антител - 101= БОШмл, титр ВОК - 320 БОП/МЛ.

(И I

ill ö.0 м ä iL

U i-2 5-3 6.3 в-2 10.2

Рис. 26. Нейтрализация BOB фаговыми одноцепочечными антн-ргАЗО!.. антителами в культуре клеток Vero Нб. Тнтр фаговых антител 10й БОЕ/мл, титр BOR - 250 ЕОЕ/мЯ,

Все антитела, отобранные из синтетической библиотеки, были Протестированы па способность нейтрализовать инфекционность ВНО, штаммы India и Butter Антител, способных ингибировать инфекционность ВПО, обнаружено не было Два антитела, отобранные та синтетической библиотеки но связыванию с ВОВ, обладали йфускейтраяйзующими свойствами в отношении этого труса

Определение ортопоксвирусных белков-мишеней для фаговых антител, отобранных из иммунной и синтетической библиотек, осуществляли методом Вестерн-блот анализа. Было показано, что ттз 24 фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки, только пять антител выявляли бедки ортопокс виру со я в Весгерн-блот анализе. Антитела 2119 и 116, отобранные но связыванию с В110, Ind3a, выявляли белки с молекулярной массой около 27 кДа и 54-56 кДа, соответственно. Антитело 1F4, отобранное по связыванию с ВОВ, выявляло белок с Молекулярным весом около 27 кДа ( табл. 6). Антитела 9G2 (отобрано против ВЭМ) в 2В2 (отобрано Против ВПО, Butler) взаимодействовали с белками BOß и ВПО, Butler, молекулярный вес которых был около 35 кДа (табл. 6) Из 18 вирус нейтрализующих антител 12 выявляли в иммуиоблоте белок ортопоксвируеом с молекулярной массой 35 кДа (табл. 6, рис. 28).

Способность антител, отобранных по связыванию с рекомбинантным белком prAlQL, так'<к» исследовали с домощыо Вестерн-блот анализа. Ныло показано, что ЛТ

Рис 27 Нейтрализация ВОК (А), ВОВ (Б) и BOO (В) фаговыми одноцепочечными антителами Ь9 (1) и 3VA10 (2) в культуре клеток Vera Е6 3 — контроль неспецифической нейтрализации (anti-Thy антитело) Титр ВОК - 320 БОЕ/мл, титр ВОВ - 250 БОЕ/мл, BOO - 480 БОЕ/мл

4 1 и d4, выявляли рекомбинантный белок, перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану Остальные 18 отобранных антител не выявляли ргАЗОЬ, перенесенный на нгароцеллюлозную мембрану, и, вероятно, направлены к конформационным эпитопам рекомбинантного белка ргАЗОЬ

Большинство фаговых антител, отобранных из обеих библиотек, не выявляли какого-либо ортопоксвирусного белка в иммуноблоттинге Вероятно, эти антитела взаимодействовали с конформационными эпитопами, которые разрушались при проведении электрофореза в восстановительных условиях

Следует отметить, что 11 вируснейтрализующих антител, специфичных к белку р35, имели в структуре CDR3 Vh-домена, играющего ключевую роль в специфичности антитела, четко выраженный мотив

.S..V..HG____

xRIAAxRRHAFDx

Это позволяет предположить, что эти 11 вируснейтрализующих антител направлены к одному линейному эпитопу, представленному на белке р35

Кроме того, было показано, что иммунная библиотека после обогащения также способна выявлять ортопоксвирусный белок с молекулярной массой около 35 кДа (рис 28) Этот же белок выявлялся сыворотками доноров, вакцинированных ВОВ (рис 28)

Среди структурных белков ортопоксвирусов известны два иммунодоминантных мембранных белка - H3L (р35) и D8L с близкой молекулярной массой, индуцирующих образование вируснейтрализующих антител (Маренникова и Щелкунов, 1998) Мы предположили, что белок, с которым связывается большинство вируснейтрализующих антител, является продуктом ОРТ H3L вируса осповакцины

М V 1 2 34 Mv ai Ь9 Л1 с4 «12 e7 eö MI iE g1 h6 M V 1 2 3 4 5

94 —

6? ¿j

31 —

20 х» 14

Рис 28 Вестерн-блот анализ пел ков [ЮВ с популяциями фаговых антител (А), с фаговыми антителами (Е) и е сыворотками доноров (В) М - маркеры молекулярных масс, v - белки DOB, перенесенное на ?лем6рану, Проявление - Л: 1 - исходная библиотека, .1. > библиотека, обогащенная в результате 1-го и 2-го раунда онопэпнинга, соответственно, 4 анти-Thy антитело, ü - приведены названия фаговых антител; В: 1, 2, 3, 4 - сыворотки Доноров, вакцинированных ВОВ, 5 - сыворотка не вакцинировано ото ВОВ донора

U3L - вируса оспы коров). Дли проверки это™ предположения был сконструирован штамм Escherichia coli - продуцент ре комбинацию го белка ВОК pr,13L В качестве экс пресс ир угощего вектора использовали плаэмиду pUR291. При использовании этого аектора 5'-концевая область мРНК прокариогического гена сохраняется Штивкой, и поэтому оптимальна для инициации трансляции, Кроме того, гибридный Белок в меньшей степени, чем «чистый», подвергается п роте о лиги ческой деградации. Целевой полипептид в составе такого гибридного белка, как правило, продуцируется в виде отдельного домена, сохраняя свою ферментативную активность и антигенные свойства (Петренко и др., 1988. Маши и др., 1990).

Ген. кодирующий белок J3L ВОК (штамм Гришак), встраивали в полилинкер гтлазмйДЫ pUR291, находящийся на 3'-конце гена, кодирующего р-галактоз идазу. Результирующей ллазмидой pUR-J3L (рис. 29) трансформировали клетки E.coli DH5uF\ которые выращивали на среде с ампициллином в присут ствии X-gal и Ml ПТ Оценку продукции гибридного белка проводили с помощью э лекгро форети ч е с ко го анализа клеточного дизата в [0% ПААГ с SDS (рис. 30). Выло показано, что после индукции ИГГГГ лизат клеток E.coli, фан сформированных ллазмидой pUR-J3L, содержит белок, масса которого со ответствует расчетной молекула pi го й .массе гибридного рекомбипантного белка fi-галактоз и даза-ЛЬ (prJ3L) - около 150 кДа В лизагге клеток E.coli, трансформированных исходной плазмидой pUR291, после индукции ИГ1ТГ гтрисутстовала только ß-галатсгозидаза, молекулярная масса которой - около 116 кДа (рис. 30А).

Лича™ клеток £,C£n'i/pUR--J3Li и E.coli/pVR29\ анализировали с помощью Вестерн-блат анализа с использованием сыворотки ре вакцинирован кого донора и

■ Щл

Г -1

J)UR291-HL 44ÛL+

Рис 29. Схема пяазмвды содержащей ген кодирующий р35

белок ВОК. Указаны сайты для эндонуклеазы рестрикции Вш»Н1, промотор лаюознога опсрона Р сел кодирующий р-галактозидазу Е.соН, Ар'- ген устойчивости к ампициллину

контрольной сыворотки от донора, никогда не ззхцшшрояанною ВОВ Было показало, что антитела из сыворотки рс вакцинирован! го го человека выявляют рекомбикантный белок, в то время как антитела из сыворотки не вакцинированное человека не взаимодействуют с рекомбинантным белком (рис. ЗОВ). Это подтвердило сохранение у рекомйинантного белка pr/3L элитоттов, присутствующих в его природном аналоге в составе вирионов

prJ3L --

-205

- н&

-97 -84

-66

- 55 -45

20597 -

В4 -

29 24

M xl ] 2

** Ж г

- .

г Ш

-prJ3L

M i! 1 !

го5-

97 -RI -

29 24

Рис 30 А: Эдсктрофоре!рамма белков клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pUR-J3L (1) и плазмидой pUR29] (2) в 10% ПЛАГ о SDS. М — стандарты молекулярных масс белков &-В Иммуноблотннг белков клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pUR-J3L (Б), и плазмндой pUR291 (В) с сывороткой человека, вакиннроваиного BOB (I) и сывороткой неиммунного к ВОВ человека (2). к1 ий- соответствующие белковые профили. М - стандарты мол^хулярных масс белков.

Всстерн-блот aiMiu этих же лизатов с использованием вирусиейтралгоукшщх фаговых антител, отобранных m иммунной библиотеки, подтверди, что белком-мишенью лля этих антител действительно является белок J3L, или, в случае ВОВ — продукт ОРТ H3L (рис. 31а). Кроме того, было показано, что иммунная библиотека после обогащения также способна выявлять рекомбинантный белок prJ3L (pue-, 316). Эта же обогащенная библиотека выявляла ортопоксвирусный белок с молекулярной массой около 35 кДа (рис 2SA)- Следовательно, н результат процедуры аффинного обогащения, имигируюшей in vitro развитие гуморального ответа в организме, в библиотеке преобладают антитела, связывающие белок, закодированный OFT J3L ВОК, и перекрестно реагирующие с белками р35 ВОВ и ВЭ. Можно сделать вывод, "что в ходе иммунного ответа на ортопоксвирусьг, одним из основных им м уно домина-

M к] aJb'jJI I ill n2 aJ b*)fllc4 d2 eTej hi x2

205 46 07

24 20

pUR-J 3L

PUR29!

M sll I ! й ni \ T Ъ vi

305-Ufi-41 -34 -

29 24

- I

ШШ I

il_:-iL-

PUR-J3L pUR291

РнС. 3]. Иммуноблстннг белков клеток E. coli, трансформированных плазмидой pUR-J3L (кО. h pUR291 (кЗ), С фаговыми в прус нейтрализующими антителами (А); с исходной популяцией фаговых антител (1В) й популяциями фатоиых антител, полученных после первого (2Б) и второго (ЗБ) раунда аффинного обогащения библиотеки, против виру» оспы коров; и anti-Thy антителом (к2). М - маркер молекулярных масс белков.

нтных белков, к которому в основном нарабатываются вируснейтрализующие антитела в организме человека, является белок р35, ОРТ H3L ВОВ

Этот результат является независимым подтверждением высказанного ранее предположения о важной роли белка р35 в развитии иммунного ответа на ортопоксвирусы в организме человека (Zmoviev et al, 1994, Davies D, et al, 2005)

Для оценки аффинности одноцепочечных антител к ортопоксвирусам, отобранных из обеих библиотек, некоторые антитела были получены в форме отдельных молекул, не слитых с оболочечным белком бактериофага Были созданы штаммы Escherichia coll, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела slF4, sII6, s2I19, отобранные из синтетической библиотеки, и одноцепочечное антитело sb9, отобранное из иммунной библиотеки Одноцепочечные антитела s3I7, sd2 и s3VA10 продуцировались в клетках Б coll в нерастворимой форме Для растворимых одноцепочечных антител были определены константы аффинности (рис 32), которые составили slF4 - (1,6± 0,3) хЮ7 М"1, S1I6 - (1,5± 0,3) хЮ7 М"1, s2I19 - (9,1± 4,7) хЮ6 М"1, sb9 - (3,1* 0,5) хЮ8 М"! Видно, что константа аффинности одноцепочечного антитела, отобранного из иммунной библиотеки (размер библиотеки ЗхЮ7) на порядок выше констант аффинности одноцепочечных антител, отобранных из синтетической библиотеки (размер библиотеки > 108)

На основе вариабельных доменов одноцепочечных антител slF4, slI6, s2I19 и sb9 были сконструированы полноразмерные антитела человека fhlF4, fhlI6, fh2I19 и fhb9 Эти эксперименты проводились в ходе совместных исследований с Институтом биоорганической химии им М М Шемякина и А Ю Овчинникова Схема получения этих антител была такой же, как и для полноразмерного антитела, направленного к вирусу Эбола

1Е-10 1Е9 1Е-8 1Е7 1Е6 1Е-5

концентрация антитела, М

Рис 32 Определение констант аффинности одноцепочечных антител с использованием непрямого ИФА

Сконструированные антитела продуцировались в клетках человека HRK.293T в результате трашиентной экспрессии соответствующих нар плазмид, несущих гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи этих антител. Очистку рекомбинатиык антител из культуральной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein О -Sepharose 4 Fast Plow.

Специфичность пол нор аз мерных антител подтверждали с помощью иммуноблот-анализа белков ВОВ, ВОК и ВНО, Вгаг 131 (рис. 33). Результаты подтвердили сохранение специфичности сконструированных йолноразмерных антител по сравнению со специфичностью исходных одно цепочечных антител.

Рис 33 Вестерп-блот анализ белков ортонокевирусов: 1,2,3 - связывание антитела fhlM с ВОВ, ВОК и ВНО-Brazil 131, соответственно, 4, 5, 6 - связывание антитела fhlI6 с ВОВ, ВОК и ВНО-Brazit 131, соответственно, 7,8,9 - связывание антитела (hi 16 с ВОВ, ВОК н ВНО-Brazil 131, соответственно, 10 - контроль коныогата, 11 - связывание МКА 2D 5 с ВОВ, 12 - ВОЙ, М - маркер молекулярных масс

Для всех сконструированных полноразмерных антител с использованием ИФА были определены константы аффинности (рис. 34).

кшщентрация антитела, 'Л

Рис 34 Определение констант аффинности сконструированных полноразмерных антител человека с использованием не; [римого ИФА.

i а 4 4 6 i_а о m II 12 ¡з

Щ М

■i t»

1Н

Константы аффинности этих антител, по нашим оценкам, оказались fhlF4 - (3,5 ±0,4) X 109 М-1, fh 116 - (4 4± 1 9) X 109 М"1, fh2I19- (1 5±0 2)х108 М1, fhb9 - (1 5±0,3)х Ю'М'1 Наличие вируснейтрализующих свойств у полученных полноразмерных рекомбинантных антител человека проверялось в реакции нейтрализации ВОВ в культуре эукариотических клеток Vero Б6 (рис 35) Исследование проводили при постоянном титре ВОВ, 250 БОЕ/мл В качестве положительного контроля использовали МКА мыши 2D5 (Ichihashi and Oie, 1996) Результаты показали, что только антитело fhb9, сконструированное на основе вариабельных доменов, отобранных из иммунной библиотеки, обладало вируснейтрализующей активностью, как и исходное одноцепочечное антитело Ь9

(MF4 fh1l6 fîi2H9 тЬ9 2D5

Рис 35 Нейтрализация инфекционное™ ВОВ полноразмерными рекомбинатными антителами человека против

ортопоксвирусов в культуре клеток Vero Е6 Концентрация антител fhlF4, fhlI6 и fh2I19 -40 мкг/мл, fhb9 - 25 мкг/мл, МКА 2D5 - 0 06 мкг/мл Титр ВОВ-250 БОЕ/мл

Полноразмерные антитела человека £hlF4, fhlló и fh2I19 выраженными вируснейтрализующими свойствами, не обладали Однако наблюдалось достоверное ингибирование бляшкообразования в культуре клеток Vero Е6, приблизительно на 40% для антител fhlF4 и fhlló, а для анитела fh2I19 - на 32% (рис 35) Эти антитела были отобраны из синтетической библиотеки, и исходные одноцепочечные антитела 2119,1F4 и 116 вируснейтрализующими свойствами не обладали

Известно, что добавление неинактивированной сыворотки неиммунного человека усиливает вируснейтрализующие свойства антител Предполагается, что основную роль в этом играют белки комплемента, способствуя нейтрализации вирусов путем разрушения инфицированных клеток или лизиса самих оболочечных вирусов (Weiss, 2002, Zinkernagel, 2002) Поэтому нами была исследована нейтрализация ВОВ при совместной инкубации с антителом fhlF4 и сывороткой невакцинированного против ВОВ донора в разведении 1 100 (рис 36) Было показано, что процент иншбирования бляшкообразования в пробе с добавленной сывороткой увеличился до 53%, по сравнению с пробой, содержащей только полноразмерное антитело Аналогичный эффект был обнаружен в работе (Lustig et al, 2004) на примере поликлональных антител к мембранному белку АЗЗ ВОВ Эти антитела не обладали вируснейтрализующей активностью (Galmiche et al, 1999), однако, добавление к ним комплемента обеспечило лизис вирусной мембраны (Lustig et al, 2004)

äK-ffiB 1

Рис 36. Ингибированне инфекционнисш ВОН попноралмерным антителом человека Ат 1 Т-"4, использованном в концентрации 0.2 МГ/Ш1, совместно С сывороткой невакиипироиашюго против СОВ донора в разведений 5:100 на культуре клеток Уегп Е6 Титр ВОВ - 250 БОЕ/мл, концентрация контрольного МКА 2П5 - 62 нг/мл.

^ / / /У

Изучение механизмов нейтрализации вирусов проводилось рядом исследователей (Dimmock, Burton, 2001; Klasse and Sattentau, 2002; Reading

and Di m mock. 2007). В последнее время сложилось представление о существовании различных механизмов вирусной нейтрализации (рис. 37), опосредуемой антителами (Reading and Dimmock, 2607), При этом различные антитела могут нейтрализовать инфекционность одного и того же вирус;) с помощью различных механизмов (Reading and Dimmock, 2007).

В нр у с нейтрализующие одно цепочечные антитела, обнаруженные в данной работе, не способны осуществлять нейтрализацию путем аггрегации вирионов, поскольку имеют только один аигигенсвязывающий домен, Вместе с тем, мы показали, что большинство из этих вируснейтрализутощнх антител - 3VAI0, Ь9, d2 и Т.д., связывали белок р35 ортоноксвирусов, продукт трансляции ОРТ 11.31. вируса остов акцины. Известно, что белок H3L обладает способностью связываться с поверхностью клетки через гл1 о козами цогликаны клеточной поверхности и, таким образом, задействован в процессе проникновения вируса в клетку (Ichihashi el al, 199$; Hsiao et al,1999) Более того, было показано, что рекомбинангиый белок H3L конкурирует с вирусом основаниииы в процессе присоединения вируса к клетке (Lin et al. 2000). Деления по гену H3L вируса осповакцины приводит к уменьшению размера вирусных бляшек в культуре клеток, понижению в 10 paî тигра 1MV и EF.V и уменьшению инфекционное™ полученных вирионов. Исходя из этих данных, можно

Рис. 37 Схема возможных механизмов вирусной нейтрализации посредством антител.

предположить, что вируснейгрализующие антитела, связывающие белок H3L, ингибируют вирусную инфекционность, блокируя эпитоп H3L, отвечающий за присоединение к специфическим клеточным рецепторам

Известно, что использованное нами в качестве контрольного МКА 2D5 направлено к миристилированному мембранному белку, кодируемому ОРТ L1R ВОВ (Ichichashi et al, 1996) Показано, что белок L1R необходим для протеолитического процессинга коровых белков p4b, р4а, VP8 (Ravanello and Hruby, 1994) и для проникновения вируса в клетку (Ichihashi et al, 1996, Wolffe et al, 1995) Вероятно, МКА 2D5 ингибирует вирусную инфекционность, блокируя эпитоп, отвечающий за присоединение к специфическим клеточным рецепторам, экспонированный на белке L1R Эти факты подтверждают гипотезу о сложном, опосредованном несколькими белками, механизме проникновения ортопоксвирусов в клетку и о наличии нескольких рецепторов к ортопоксвирусам на поверхности клетки

В целом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что нами отработан весь путь получения полноразмерных антител человека, обладающих вируснейтрализующими свойствами в отношении ортопоксвирусов от конструирования комбинаторной библиотеки мини-антител человека до создания на основе вариабельных доменов, отобранных из этой библиотеки, полноразмерных антител Проведение дальнейших исследований, включая доклинические, позволит сделать вывод о применимости сконструированных полноразмерных антител для создания на их основе средств профилактики и лечения поствакцинальных осложнений и ортопоксвирусных инфекций Кроме того, полученные панели мини-антител и полноразмерных антител, направленных к ортопоксвирусам, могут быть использованы в качестве инструмента исследования иммунологического профиля ортопоксвирусов Картирование с их помощью видоспецифических эпитопов и антигенных детерминант, индуцирующих образование вируснейтрализующих антител, позволит лучше понять молекулярные механизмы вирулентности ортопоксвирусов и предоставит необходимую информацию для разработки вакцин нового поколения

ВЫВОДЫ

1 Создана экспериментально-методическая база для получения рекомбинантных антител человека методами фагового дисплея, что позволило впервые получить одноцепочечные антитела человека, направленные к вирусным патогенам, включая особо опасные вирусы

2 Сконструированы две натуральные комбинаторные библиотеки одноцепочечных антител человека наивная библиотека и иммунная библиотека одноцепочечных антител человека к ортопоксвирусам Размер библиотек достигал Зх107и 2х108 независимых трансформантов, соответственно Иммунная библиотека к ортопоксвирусам создана впервые

3 На основе сконструированных нами иммунной и наивной библиотек и имеющейся синтетической библиотеки Griffin-1 проведен комплекс работ по получению и изучению рекомбинантных антител человека, направленных к различным антигенам

В рамках исследования

а) впервые получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека, направленных к инфекционному вирусу натуральной оспы,

штаммы Ind3A (variola major) и Butler (variola minor alastran), и другим ортопоксвирусам, константы аффинности отобранных антител составляли от 106до Ю8М-1,

б) впервые получены одноцепочечные антитела человека, обладающие вируснейтрализующей активностью в отношении вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии,

в) показано, что большая часть вируснейтрализующих одноцепочечных антител связывала продукт открытой рамки считывания ORT H3L, антитела к которому преобладают в сыворотке людей, вакцинированных вирусом осповакцины,

г) впервые выявлены одноцепочечные антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы,

д) на основе одноцепочечных антител человека, направленных к ортопоксвирусов, сконструированы полноразмерные антитела человека fhb9, fhlF4, fhlI6 и fh2I19, константы аффинности которых достигали 108 -109 М"1, показано, что антитело fhb9 способно ингибировать инфекционность ортопоксвирусов,

е) впервые создана и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека к вирусу Эбола, с константами аффинности от 106 до 107 М"1,

ж) сконструировано полноразмерное антитело человека, специфически взаимодействующее с нуклеопротеином вируса Эбола с константой аффинности (7 7±1 5) х Ю М"1,

з) получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека к

ФНОа с константами аффинности от 107 до 10® М"1

4 Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli Введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного линейного эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью моноклональных антител, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена С использованием сконструированных векторов получены мономерные и димерные формы одноцепочечных антител, направленные к гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита, продемонстрирована их способность конкурировать с исходными моноклональными антителами за связывание с вирусом клещевого энцефалита, измерены их константы диссоциации, которые составили (9 2 ± 0 2) х 10"8 М1 и (3 2 ± 0 3) х 10"8 М1, соответственно

5 Созданы и охарактеризованы бактериальные штаммы-продуценты

одноцепочечных антител человека, направленные к вирусу Эбола, к

ортопоксвирусам, включая вирус натуральной оспы и оспы обезьян, к ФНОа, мономерные и димерные одноцепочечные антитела, направленные к

поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита, штамм-

продуцент рекомбинантного белка р35 вируса оспы коров Штаммы депонированы в коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ, ОПУБЛИКОВАННОЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах

1 Дубровская В В , Улитин А Б , Ламан А Г , Гилева И П , Бормотов Н И, Ильичев А А, Бровка Ф А, Щелкунов С Н, Беланов Е Ф, Тикунова Н В Конструирование комбинаторной иммунной клонотеки одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов и селекция из нее антител к рекомбинантному белку ргАЗОЬ вируса натуральной оспы//Мол биол 2007, т 41, № 1, с 173-185

2 Дубровская В В , Тикунова Н В Получение одноцепочечных антител человека к основному иммунодоминантному белку ортопоксвирусов //Вестник НГУ -2007 -Том 5 -выпуск 1 с 100-105

3 Юн Т Э , Тикунова Н В , Шингарова Л Н, Алиев Т К, Болдырева Е Ф , Морозова В В , Швалов А А, Некрасова О В , Полыхалова И В , Панина А А , Ильичев А А , Кирпичников М П, Сандахчиев Л С Полноразмерное рекомбинантное антитело человека против вируса осповакцины //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2007, т 407 №5, с 98-101

4 Баталова Т А, Улитин А Б , Морозова В В , Ламан А Г , Жираковская Е В , Воронина В В, Бровко Ф А, Тикунова Н В Создание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека //Мол Ген Вирусол Имикробиол 2006, №3, с 35-41

5 Тикунова Н В , Баталова Т А, Чепурнов А А Рекомбинантные антитела человека против вируса Эбола селекция и характеризация //Вопр Вирусол 2005, т 50, № 5, с 25-29

6 Тикунова Н В , Бовшик Е И, Юн Т Э , Жираковская Е В , Морозова В В , Батанова Т А, Гуськов А А, Сокунова Е Б, Ильичев А А, Сандахчиев Л С Рекомбинантные антитела человека против вируса натуральной оспы //Вопр Вирусол 2005, т 50, № 6, с 20-25

7 Морозова В В , Тикунова Н В , Батанова Т А, Юн Т Э, Бовшик Е И, Жираковская Е В , Воронина В В , Бобко Д И , Беланов Е Ф, Ильичев А А, Сандахчиев Л С Мини-антитела человека против ортопоксвирусов //Вестник РАМН, 2004, № 8, с 22-27

8 Тикунова Н В , Беланов Е Ф, Морозова В В , Батанова Т А Бормотов Н И, Овечкина Л Г, Ильичев А А, Сандахчиев Л С Фаговые антитела способны нейтрализовать вирусы //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2002, т 382, №1, с 124-126/

9 Николенко Г Н, Протопопова Е В , Ильичев А А, Коновалова С Н , Карпенко Л И, Локтев В Б , Порываева В А , Тикунова Н В Рекомбинантные антитела к вирусу клещевого энцефалита //Вопр Вирусологии, 2002, №5, с 31-36

10 Tikunova N V, Morozova V V , Batanova Т А, Belanov Е F , Bormotov NI, Ilyichev A A Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus //Himan Antibodies, 2001, v 10, p 95-99

11 Тикунова HB, Колокольцов А А, Чепурнов А А Рекомбинантные моноклональные антитела человека против вируса Эбола //ДАН, 2001, т 378, № 4, с 551-554

12 Тикунова Н В , Николенко Г Н, Протопопова Е В , Котелкин А Т, Локтев В Б , Белавин П А, Нетесова Н А, Деев С М, Ильичев А А Получение одноцепочечных антител против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита//Вопр Вирусологии, 1999, №1, с 12-15

13 Ильичев АА, Меламед HB, Тикунова HB Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7 // Биотехн, 1997, №1, с 12-20

14 Николенко Г Н, Головин С Я, Виноградов С М, Ильичев А А, Тикунова Н В Клонирование и секвенирование гена, кодирующего одноцепочечный иммуноглобулин (scFv) на поверхностный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита//Жур Инфекц Патологии, 1996, т 3, № 4, с 47-52

15 Тикунова Н В, Головин С Я, Микрюков Н Н, Хрипин Ю JI, Черненко В Ю , Иванов В Г, Ильичев А А, Петренко В А Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК al -антитрипсина человека //Биоорг Химия, 1991, т 17, № 12, с 1694-1697

Патенты

1 Николенко Г Н, Тикунова Н В , Головин С Я, Протопопова Е В , Локтев В Б , Деев С М, Ильичев А А Рекомбинантная плазмидная ДНК pTLS, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита Патент РФ №-2158309 2000 г

2 Николенко Г Н, Тикунова Н В , Протопопова Е В, Локтев В Б , Карпенко Л И, Коновалова С Н, Ильичев А А Рекомбинантная плазмидная ДНК p7SHSHis для продукции димерных одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia colt - продуцент димерной формы одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита Патент РФ № 2190017 2002 г

3 Шингарова Л Н, Тикунова Н В , Юн Т Э , Баталова Т А, Алиев Т К, Болдырева Е Ф, Некрасова О В , Полыхалова И В , Панина А А, Кирпичников М П, Ильичев А А, Сандахчиев Л С Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLl, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса Эбола, рекомбинантная плазмидная ДНК рСН1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение Патент РФ № 2285043 2006 г

4 Баталова Т А, Тикунова Н В , и Юн Т Э Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-ТАВ, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека, рекомбинангное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека //Заявка на патент РФ, справка о приоритете № 2005129664 от 22 09 05 Решение о выдачи патента от 07 03 07

5 В В Дубровская, Н В Тикунова, В В Морозова, Н И Бормотов, А Г Ламан, А Б Улитин, Ф А Бровко, Е Ф Беланов, А А Ильичев Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против вируса осповакцины, рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-ЗАЮ, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека, способного нейтрализовать ортопоксвирусы, и искусственное одноцепочечное антитело человека ЗА10, способное нейтрализовать ортопоксвирусы// Заявка на патент РФ Справка о приоритете № 2005125994 от 15 08 05 Решение о выдачи патента от 24 05 07

6 Тикунова Н В , Шингарова Л Н, Юн Т Э , Морозова В В , Алиев Т К, Болдырева Е Ф , Некрасова О В , Полыхалова И В , Панина А А, Кирпичников М П, Ильичев А А и Сандахчиев Л С Рекомбинантные плазмидные ДНК рСЬ37 и рСН37, кодирующие полипептиды со свойст-вами легкой и тяжелой цепей антитела человека против вируса осповак-цины, обеспечивающие совместно биосинтез полноразмерных антител человека против вируса осповакцины в клетках млекопитающих, и рекомбинантное полноразмерное антите-ло человека класса взаимодействующее с вирусом осповакцины Заявка на патент РФ Справка о приоритете № 2006100694 от 16 01 06 Решение о выдачи патента от 30 07 07

Опубликовано 38 тезисов и статей в сборниках конференций

Изд Лиц ИД № 04060 от 20 02 2001

Подписано к печати и в свет 28 07 2007 Формат 60x84/16 Бумага № 1 Гарнитура "Times New Roman"

Печать оперативная Печ Л 2,1 Уч-щд Л 2,0 Тираж 150 Заказ 106 Институт неорганической химии им А В Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тикунова, Нина Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммуноглобулины.

1.1.1. Строение антител на примере молекулы IgG.

1.1.2. Строение вариабельных доменов иммуноглобулинов.

1.1.3. Организация генов, кодирующих иммуноглобулины.

1.2. Типы рекомбинантных антител.

1.2.1. Мини-антитела на основе гипервариабельных участков и VHдоменов.

1.2.2. Fab- и Fv-фрагменты.

1.2.3. Одноцепочечные антитела.

1.2.4. Производные одноцепочечных антител и Fab-фрагментов.

1.2.5. Продукция мини-антител в клетках E.coli.

1.2.6. Химерные антитела.

1.2.7. Гуманизированные антитела.

1.2.8. Рекомбинантные полноразмерные антитела человека.

1.2.9. Продукция рекомбинантных полноразмерных антител в эукариотических клетках.

1.3. Получение рекомбинантных антител методом фагового дисплея

1.3.1. Фаговый дисплей: история вопроса.

1.3.2. Строение и жизненный цикл нитчатого бактериофага.

1.3.3. Типы векторных систем на основе нитчатых бактериофагов.

1.3.4. Комбинаторные фаговые библиотеки пептидов.

1.3.5. Комбинаторные фаговые библиотеки антител.

1.3.6. Типы фаговых библиотек антител.

1.3.7. Комбинаторные фаговые библиотеки на основе Fab-фрагментов.

1.3.8. Комбинаторные фаговые библиотеки на основе одноцепочечных антител.

1.3.9. Конструирование наивных библиотек.

1.3.10.Конструирование синтетических библиотек.

1.3.11 .Конструирование иммунных библиотек.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дизайн рекомбинантных антител"

Актуальность проблемы. Антитела относительно давно стали применять в терапии ряда заболеваний, в том числе и вирусных инфекций, благодаря исключительным свойствам этих природных биомолекул - высокой специфичности, наличию эффекторных функций, способности проникать в ткани и выводиться из организма с помощью естественных механизмов. Однако, применение поликлональных антител, выделенных из донорской крови, имеет ряд недостатков (Maynard and Georgiou, 2000), наиболее серьезным из которых является биологический риск, связанный с возможностью инфицирования неидентифицированными патогенами. Кроме того, сырьевая база для получения специфических поликлональных антител всегда ограничена, и стандартизовать эти препараты очень трудно из-за различающихся от партии к партии соотношений белок/специфические антитела. Серьезной проблемой является и то, что не все антигены можно использовать для иммунизации добровольцев, например, получить человеческие сыворотки против высокопатогенных инфекционных агентов или токсических агентов практически невозможно. Использование в терапии моноклональных антител (MICA) также имеет серьезные ограничения. Большинство имеющихся МКА производятся гибридомными клетками животных, и введение их в организм человека вызывает развитие нежелательной иммунной реакции, особенно при повторном введении. Кроме того, эффекторные функции МКА животных недостаточно активируются в организме человека, у них слишком короткий период полувыведения из организма. Получение высокоаффинных МКА человека, стабильно продуцируемых гибридомными клетками, к настоящему времени затруднено из-за отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы (Karpas et al., 2001; Traggiai et al., 2004). Спектр антител, получаемых с помощью гибридомных клеток человека, ограничен: так, получить антитела против патогенных и токсичных агентов, а также против собственных белков человека не представляется возможным (Laffly and Sodoyer, 2005). Наконец, не стоит забывать, что гибридомные клетки трансформированы, и, вследствие этого, препараты на их основе потенциально опасны как онкогены.

Новые перспективы в этой области открывают ДНК-технологии. Одним из направлений в получении МКА человека является создание трансгенных животных, у которых собственные гены, кодирующие иммуноглобулины, заменены на человеческие (Kellermann and Green, 2002; Laffly and Sodoyer, 2005). Однако, не все желаемые антитела можно получать таким образом из-за токсичности ряда антигенов для организма животного.

Еще одно активно развивающееся направление в разработке рекомбинантных антител основано на направленном дизайне генов кодирующих иммуноглобулины методами генетической инженерии. Так, к настоящему времени разработаны и используются в медицинской практике так называемые «химерные» антитела, состоящие из вариабельных доменов мышиных антител, обладающих целевыми свойствами, и константных доменов иммуноглобулинов человека. Создаются также и «гуманизированные» антитела, в которых только гипервариабельные участки человеческих антител заменены на мышиные.

Вместе с тем очевидно, что полностью человеческие рекомбинантные антитела (fully human antibodies) являются наиболее предпочтительными. Для их создания объединяют вариабельные домены антител человека, обладающих целевой активностью, с константными доменами иммуноглобулинов человека нужного изотипа. Такие антитела синтезируют в эукариотических клетках, которые обеспечивают правильную конформацию и гликозилирование молекулы иммуноглобулина.

12 таких библиотеках может достигать 10 различных мини-антител. В ходе процедуры аффинной селекции (biopanning) можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать мини-антитела с нужными свойствами. Для получения рекомбинантных антител с заданными свойствами в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fab-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli.

Сами мини-антитела находят применение в терапии некоторых заболеваний. Обладая меньшими размерами, они легче проникают в ткани, преодолевают гематоэнцефалический барьер, вызывают меньший неспецифический иммунный ответ (Ewert et al., 2003). На их основе конструируют полифункциональные мини-антитела, иммунотоксины, средства адресной доставки лекарственных средств в организме больного.

В настоящее время мини-антитела и рекомбинантные полноразмерные антитела применяют в фундаментальных исследованиях, в биотехнологии, в терапии различных заболеваний, включая вирусные. Разработка противовирусных рекомбинантных антител ведется очень широко, однако лишь ограниченное количество работ, посвящено получению рекомбинантных антител против особо опасных для человека вирусных патогенов.

В число основных направлений деятельности ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» входят фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, и разработка средств лечения заболеваний, вызываемых вирусными инфекциями. Именно поэтому целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител против вирусных патогенов и, прежде всего, против особо опасных вирусов человека.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- создать экспрессионную систему, обеспечивающую высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках E.coli, и на примере одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита исследовать особенности экспрессии целевых генов с использованием созданной конструкции, изучить иммунохимические свойства продуцируемых антител;

- отобрать из имеющейся синтетической фаговой библиотеки одноцепочечные антитела человека против вируса Эбола и против ортопоксвирусов, включая жизнеспособный вирус натуральной оспы (штаммы variola major и variola minor alastrim); исследовать иммунохимические и биологические свойства отобранных антител;

- сконструировать натуральную наивную библиотеку одноцепочечных антител человека и охарактеризовать ее, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела против различных антигенов, включая вирусные;

- сконструировать натуральную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе генетического материала периферических лимфоцитов доноров, вакцинированных вирусом осповакцины, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела человека против различных ортопоксвирусов, исследовать их иммунохимические свойства;

- выявить одноцепочечные антитела человека, способные ингибировать инфекционность ортопоксвирусов, определить белки-мишени для этих антител;

- на основе одноцепочечных антител человека против вируса Эбола и ортопоксвирусов сконструировать полноразмерные антитела человека и исследовать их иммунохимические свойства.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека против жизнеспособных ортопоксвирусов - вируса натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусов осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также против рекомбинантного белка ргАЗОЬ вируса натуральной оспы.

Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы.

Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов осповакцины, оспы коров, оспы обезьян и эктромелии.

Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека против белков вируса Эбола, созданы штаммы Escherichia coli E.coli НВ2151 /pHEN-4D 1 и E.coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4Dl и s2E3 в растворимой форме.

Впервые в нашей стране сконструированы полноразмерные антитела человека против вируса Эбола и ортопоксвирусов. Показано, что полноразмерные антитела человека против ортопоксвирусов обладают вируснейтрализующей активностью.

Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена. На основе сконструированных векторов созданы штаммы E.coli, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка.

Практическая значимость работы.

В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках E.coli. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам.

Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против ортопоксвирусов. Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека против ортопоксвирусов и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем.

Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека против широкого спектра антигенов.

Получено одноцепочечное антитело человека против фактора некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4х108М"\ Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний.

Сконструированы полноразмерные антитела человека против ортопоксвирусов, обладающие вируснейтрализующей активностью. Эти антитела являются перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений.

Работа выполнялась во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора с 1994 по 2006 гг. в рамках научных тем организации, по гранту РФФИ (04-360)-а, по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракты 43.035.11.1527 и 43.035.11.1529, по гранту Международного научно-технического центра ISTC#1638p «Комбинаторные библиотеки против ортопоксвирусов».

На разных этапах выполнения в работе приняли участие Г.Н. Николенко, Т.А. Батанова, В.В. Морозова, В.В. Дубровская, Т.Э. Юн, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: VI Всероссийская конференция «Новые направления биотехнологии», 1994, Пущино; «Bayev memorial conference», 1996, Москва; Международная конференция «Tick-borne viral, rickettsial and bacterial infections», 1996, Иркутск; Международный симпозиум "Protein Structure, Stability, and Folding. Fundamental and Medical Aspects", 1998, Москва; «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего

Востока и Крайнего Севера», 1998, 2002, 2006, Новосибирск; школы-конференции «5th, 6th, 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, 2000, 2002, 2005, Пущино, Россия; «Human Antibodies and Hybridomas» 2001, Prague, Czech Republic, 2002, Berne, Switzerland; XII International Congress of Virology, 2002, Paris, France; Международный семинар "Basic Science in ISTC Activities", 2001, Novosibirsk, Russia; Международная научно-практическая школа-конференция "Цитокины. Воспаление. Иммунитет." 2002, Санкт-Петербург, Россия; 15th, 16th International Symposium of Antiviral Research, 2002, Prague, Czech Republic, 2003, Savannah, USA, 2004, Tucson, USA, 2005, Barcelona, Spain; VII International Potsdam Symposium on Tick-Borne Diseases, 2003, Berlin, Germany; Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», 2005, Судак, Украина; Международная конференция «Физико-химическая биология» 2006, Новосибирск; International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" 2006, Новосибирск, Россия; VII Межгосударственная научно-практическая конференция. 2006, Оболенск, Россия. Кроме того, результы докладывались на ежегодных встречах Наблюдательного Комитета ВОЗ по контролю за исследованиями вируса натуральной оспы в 2004, 2005 и 2006 годах.

Материалы диссертации изложены в 15 статьях в научных журналах. Часть результатов защищена патентами РФ (6 патентов )

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах

1. Дубровская В. В., Улитин А.Б., Ламан А.Г., Гилева И.П., Бормотов Н.И., Ильичев А.А., Бровка Ф.А., Щелкунов С.Н., Беланов Е.Ф., Тикунова Н.В. Конструирование комбинаторной иммунной клонотеки одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов и селекция из нее антител к рекомбинантному белку ргАЗОЬ вируса натуральной оспы.// Мол. биол. 2007, т. 41, № 1, с. 173-185.

2. Дубровская В. В., Тикунова Н. В. Получение одноцепочечных антител человека к основному иммунодоминантному белку ортопоксвирусов. //Вестник НГУ.-2007,-Том 5.-выпуск 1. с. 100-105.

3. Юн Т.Э., Тикунова Н.В., Шингарова Л.Н., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Морозова В.В., Швалов A.A., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина A.A., Ильичев A.A., Кирпичников М.П., Сандахчиев JI.C. Полноразмерное рекомбинантное антитело человека против вируса осповакцины. //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2007, т. 407: №5, с. 98-101.

4. Батанова Т.А., Улитин А.Б., Морозова В.В., Ламан А.Г., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бровко Ф.А., Тикунова Н.В. Создание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека. //Мол. Ген. ВируСол. И микробиол. 2006, № 3, с. 35-41.

5. Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Чепурнов A.A. Рекомбинантные антитела человека против вируса Эбола: селекция и характеризация. //Вопр. Вирусол. 2005, т. 50, № 5, с. 25-29.

6. Тикунова Н.В., Бовшик Е.И., Юн Т.Э., Жираковская Е.В., Морозова В.В., Батанова Т.А., Гуськов A.A., Сокунова Е.Б., Ильичев A.A., Сандахчиев JI.C. Рекомбинантные антитела человека против вируса натуральной оспы. //Вопр. Вирусол. 2005, т. 50, № 6, с. 20-25.

7. Морозова В.В., Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Юн Т.Э., Бовшик Е.И., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бобко Д.И., Беланов Е.Ф., Ильичев A.A., Сандахчиев JI.C. Мини-антитела человека против ортопоксвирусов. //Вестник РАМН, 2004, № 8, с. 22-27.

8. Тикунова Н.В., Беланов Е.Ф., Морозова В.В., Батанова Т.А. Бормотов Н.И., Овечкина Л.Г., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Фаговые антитела способны нейтрализовать вирусы. //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2002, т.382, №1, с. 124-126/

9. Николенко Г.Н., Протопопова Е.В., Ильичев A.A., Коновалова С.Н., Карпенко Л.И., Локтев В.Б., Порываева В.А., Тикунова Н.В. Рекомбинантные антитела к вирусу клещевого энцефалита. //Вопр. Вирусологии, 2002, №5, с. 31-36.

10.Tikunova N.V., Morozova V.V., Batanova Т.A., Belanov E.F., Bormotov N.I., Ilyichev A.A. Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus. //Himan Antibodies, 2001, v. 10, p. 95-99.

П.Тикунова Н.В., Колокольцов А.А., Чепурнов А.А. Рекомбинантные моноклональные антитела человека против вируса Эбола. //ДАН, 2001, т. 378, №4, с. 551-554.

12.Тикунова Н. В., Николенко Г. Н., Протопопова Е. В., Котелкин А. Т., Локтев В. Б., Белавин П. А., Нетесова Н. А., Деев С. М., Ильичев А. А. Получение одноцепочечных антител против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. // Вопр. Вирусологии, 1999, №1, с. 12-15.

13.Ильичев А.А., Меламед Н.В., Тикунова Н.В. Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7. // Биотехн., 1997, № 1, с. 12-20.

14. Николенко Г. Н., Головин С. Я., Виноградов С. М., Ильичев А. А., Тикунова Н. В. Клонирование и секвенирование гена, кодирующего одноцепочечный иммуноглобулин (scFv) на поверхностный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита.// Жур. Инфекц. Патологии, 1996, т. 3, № 4, с. 47-52.

15. Тикунова Н.В., Головин С.Я., Микрюков Н.Н., Хрипин Ю.Л., Черненко В.Ю., Иванов В.Г., Ильичев А.А., Петренко В.А.Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК а 1-антитрипсина человека. //Биоорг. Химия, 1991, т. 17, № 12, с. 1694-1697.

Патенты

1. Николенко Г. Н., Тикунова Н. В., Головин С. Я., Протопопова Е. В., Локтев В. Б., Деев С. М, Ильичев А. А Рекомбинантная плазмидная ДНК pTLS, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Патент РФ №-2158309. 2000 г.

2. Николенко Г. Н., Тикунова Н. В., Протопопова Е. В., Локтев В. Б., Карпенко Л.И., Коновалова С.Н., Ильичев А. А Рекомбинантная плазмидная ДНК p7SHSHis для продукции димерных одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент димерной формы одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Патент РФ № 2190017. 2002 г.

3. Шингарова Л.Н., Тикунова Н.В., Юн Т.Э., Батанова Т.А., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Кирпичников

М.П., Ильичев А.А., Сандахчиев JI.C. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLl, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса Эбола, рекомбинантная плазмидная ДНК рСН1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение. Патент РФ № 2285043. 2006 г.

4. Батанова Т.А., Тикунова Н.В., и Юн Т.Э. Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека. //Заявка на патент РФ, справка о приоритете № 2005129664 от 22.09.05. Решение о выдачи патента от 07.03.07.

5. В. В. Дубровская, Н. В. Тикунова, В. В. Морозова, Н. И. Бормотов, А. Г. Ламан, А. Б. Улитин, Ф. А. Бровко, Е. Ф. Беланов, А. А. Ильичев Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против вируса осповакцины, рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-ЗАЮ, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека, способного нейтрализовать ортопоксвирусы, и искусственное одноцепочечное антитело человека ЗА10, способное нейтрализовать ортопоксвирусы.// Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2005125994 от 15.08.05. Решение о выдачи патента от 24.05.07.

6. Тикунова Н.В., Шингарова JI.H., Юн Т.Э., Морозова В.В., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Кирпичников М.П., Ильичев А.А. и Сандахчиев JI.C. Рекомбинантные плазмидные ДНК pCL37 и рСН37, кодирующие полипептиды со свойст-вами легкой и тяжелой цепей антитела человека против вируса осповак-цины, обеспечивающие совместно биосинтез полноразмерных антител человека против вируса осповакцины в клетках млекопитающих, и рекомбинантное полноразмерное антите-ло человека класса IgGl, взаимодействующее с вирусом осповакцины. Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2006100694 от 16.01.06.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тикунова, Нина Викторовна

выводы

1. Создана экспериментально-методическая база для получения рекомбинантных антител человека методами фагового дисплея, что позволило впервые получить одноцепочечные антитела человека против вирусных патогенов, включая особо опасные вирусы.

2. Созданы две натуральные комбинаторные библиотеки одноцепочечных антител человека: наивная библиотека и иммунная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Размер библиотек

П Й достигал 3x10 и 2x10 независимых трансформантов, соответственно. Иммунная библиотека к ортопоксвирусам создана впервые.

3. На основе созданных нами иммунной и наивной библиотек и синтетической библиотеки Griffin 1 проведен комплекс работ по получению и изучению рекомбинантных антител человека против различных антигенов.

В рамках исследования: а) впервые получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека против жизнеспособных ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, штаммы Ind3A {variola major) и Butler {variola minor alastrim); константы аффинности отобранных антител составляли от 106 до 108 М"1; б) впервые получены одноцепочечные антитела человека, обладающие вируснейтрализующей активностью в отношении вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии; в) показано, что большая часть вируснейтрализующих одноцепочечных антител связывает продукт открытой рамки считывания ОРТ H3L вируса осповакцины; антитела против этого белка преобладают в сыворотке людей, вакцинированных вирусом осповакцины; г) впервые выявлены одноцепочечные антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы; д) на основе одноцепочечных антител человека, направленных к ортопоксвирусов, сконструированы полноразмерные антитела человека fhb9, fhlF4, fhlI6 и fh2119, константы аффинности которых достигали 108 - 109 М"1; антитело fhb9 способно ингибировать инфекционность ортопоксвирусов; е) впервые создана и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител

6 7 человека против вируса Эбола, с константами аффинности от 10 до 10 М"1; ж) сконструировано полноразмерное антитело человека, специфически взаимодействующее с нуклеопротеином вируса Эбола с константой аффинности (7.7±1.5) х 107 М"1; з) получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител

7 8 1 человека против ФНОа, с константами аффинности от 10 до 10 М" .

4. Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного линейного эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью моноклональных антител, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена. С использованием сконструированных векторов получены мономерные и димерные формы одноцепочечных антител, направленные к гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита; продемонстрирована их способность конкурировать с исходными моноклональными антителами за связывание с вирусом клещевого энцефалита; измерены их константы диссоциации, которые составили (9.2 ± 0.2) х КГ'М1 и (3.2 ± 0.3) х 10"8М\ соответственно.

5. Созданы и охарактеризованы бактериальные штаммы-продуценты одноцепочечных антител человека, направленых к вирусу Эбола, к ортопоксвирусам, включая вирус натуральной оспы и оспы обезьян, к ФНОа; мономерных и димерных одноцепочечных антител, направленных к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита; штамм-продуцент рекомбинантного белка р35 вируса оспы коров. Штаммы депонированы в коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа - плод коллективного труда, и автор приносит искреннюю благодарность всем, кто участвовал в ней - И.В. Матяш, Е.В. Жираковской, В.В. Морозовой, Т.Э. Юн, Т.А. Батановой, В.В. Дубровской, Е.И. Бовшику, Г.Н. Николенко, Л.И. Карпенко, Е.В. Протопоповой, Е.Ф. Беланову, З.Ф. Киселевой, Н.И. Бормотову, Е.И. Рябчиковой, Г.В. Кочневой, И.П. Гилевой, A.B. Качко, И.В. Гавриловой, Н.Т. Денисовой, А.Н. Швалову и другим сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор".

Также автор благодарит к.х.н. Л.Н. Шингарову, обеспечившую помощь при конструировании полноразмерных антител и предоставившую рекомбинантный ФНОа, и к.х.н. А.Г. Ламана, к.х.н. Ф.А. Бровко, без помощи которых конструирование библиотек затянулось бы на годы.

Автор искренне признателен своим рецензентам профессору Э.Г. Малыгину и профессору A.A. Гуляевой, чьи замечания существенно помогли при написании данной диссертации, а также профессору В.Б. Локтеву, научные дискуссии с которым способствовали развитию исследований и представлению результатов.

Особую благодарность автор выражает профессору A.A. Ильичеву, который был инициатором проведения в ГНЦ ВБ «Вектор» исследований, основанных на методологии фагового дисплея, в дальнейшем уделял много внимания развитию этой работы и сыграл важную роль в качестве научного консультанта.

Автор хотел бы выразить искреннюю признательность академику РАН профессору Л.С. Сандахчиеву, а также A.A. Гуськову и Е.В. Сокуновой, без чьей поддержки и помощи не смогли бы осуществиться исследования, связанные с использованием вируса натуральной оспы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тикунова, Нина Викторовна, Кольцово

1. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген-антитело. Иммунология. М.: "Мир". 1989. 89 с.

2. Беспалов И. А., Шиянов П. А., Лукашевич Л. В., Лунев В.Е., Трибуш С.С, Гапонова Г.И., Деев С.М. Получение одноцепочечных антител к ферритину человека в клетках Escherichia coli. // Мол. биол. -1995. Т. 27. - С. 451-460.

3. Букреев А. А., Скрипченко А. А., Гусев Ю. М. И др. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург // Вопр. Вирусол. 1995. -Т. 40, №4.-С. 161-165.

4. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.

5. Галактионов В.Г., Иммунология. М.: "РИЦ МКД". 2000. 488 с.

6. Глик Б. и Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: "Мир", 2002. 589 с.

7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: "Мир". 1991.466с.

8. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И. и др. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным чужеродным пептидом в основной белок оболочки // Доклады АН СССР. 1989, - Т. 307, - С.481-483.

9. Ильичев А.А., Меламед Н.В., Тикунова Н.В. Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7. //Биотехнология. 1997. - Т. 1. - С. 12-20.

10. Казачинская Е.И., Перебоев А.В., Чепурнов А.А., Беланов Е.Ф., Разумов И.А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеристика и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург // Вопр. Вирусол. -2000.-Т. 45, №3.-С. 40-45.

11. Льюин Б. Гены. М.: "Мир". 1987, 544 с.

12. Ляшенко В.А., Воробьев A.A. Молекулярные основы иммуногенности антигенов. М.: "Медицина". 1982. С.76-99.

13. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д, Краев A.C., и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: "Наука. Сиб. Отделение", 1990. 248 с.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: "Мир". 1984.

15. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы, M.: "КМК Scientific Press Ltd". 1998. 386 с.

16. Марстон Ф.А.О. Выделение эукариотических пептидов, продуцируемых в клетках E.coli. В кн. Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. М.: "Мир". 1989. 367 с.

17. Миненкова, О.О., Ильичев, A.A., Кищенко, Г.П., Ильичева, Т.Н., Хрипин Ю.Л., Орешкова С.Ф., Петренко В.А. Получение специфического иммуногенеза на основе бактериофага М13. //Мол. Биол. 1993. - Т. 27, - С. 561-568.

18. Некрасов Б.Г., Кувшинов В.Н., Каледин В.И., Николин В.П., Ушакова Т.А., Туманова О.Ю., Ильичев A.A. Использование пептидных фаговых библиотек для получения пептидов, специфичных к аденокарциноме легкого мышей. // Вестник РАМН. 2004. - №8, - С. 35-37.

19. Остерман Л.А. Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: "Наука", 1981.

20. Петренко В.А., Татьков С.И., Семенова Л.Н., Ильичев A.A., Поздняков П.И. Экспрессия в Escherichia coli гена лейкоцитарного интерферона альфа 2, слитого с N-концевым фрагментом бета-галактозидазы. // Мол. ген. микробиол. вирусол., 1988, -С. 37-41.

21. Протопопова Е. В., Хусаинова А. Д., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. 1996. - № 2. - С. 50-53.

22. Разумов И А., Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Казачинская Е.И. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеристика // Вопр. Вирусол. 1998. - Т.43. - № 6. - С. 274-279.

23. Ройт А. Основы иммунологии. М.: "Мир". 1991. 327 с.

24. Туманова О.Ю., Кувшинов В.Н., Ильичев A.A., Иванисенко В.А, Козлов А.П., Сандахчиев Л.С. Локализации конформационного эпитопа гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, узнаваемого моноклональными антителами 2G12.// Мол. биол. -2002, Т. 36. - С. 1-7.

25. Чепурнов A.A., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола // Вопр. вирусол. 1994. - Т. 39, № 6. - С. 254-257.

26. Шингарова JI.H., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства. Биоорганическая химия. 1996. - Т.22 (4). - С. 243-251.

27. Эпштейн О.И., Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M. // Патент РФ №2192888. 2001.

28. Adair J. Engineering antibodies for therapy. //Immunol. Rev. 1992. - V. 130, - P. 5-40.

29. Aliev Т.К., Panina A.A., Petrovskaya L.E., Shingarova L.N., Radko B.V., Nedospasov S.A., Korobko V.G., Zavyalova G.A., Zavyalov V.P. // Clinical Immunology. 2002. - V.103 (3). Part 2. - P. S90.

30. Alfthan K., Takkinen K., Sizmann D., Soderlund H., Terri T.T. Properties of a single-chain antibody containing different linker peptides. // Protein Eng. 1995. - V. 8.-P. 725-731.

31. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

32. Amersdorfer P., Wong C., Smith Т., Chen S., Deshpande S., Sheridan R. and Marks J.D. Genetic and immunological comparison of anti-botulinum type A antibodies from immune and non-immune human phage libraries. // Vaccine. 2002. - V. 20. -P. 1640-1648.

33. Amit A., Mariuzza R., Phillips S., Poljak R. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution.// Science. -1996. -V.233. P.747-753.

34. Baca M., Presta L.G., O'Connor S.J., and Wells J.A. Antibody humanization using monovalent phage display. // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272, - P. 10678-10684.

35. Baert F., Noman M., Vermeire S., Van Assche G., D' Haens G., Carbonez A. and Rutgeerts P. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease. //N. Engl. J. Med. 2003. -V. 348. - P. 601-608.

36. Barbas CF. Ill, Kang A.S., Lerner R.A., Bencovic SJ. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: The gene III site. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.-V. 88,- P. 7978-7982.

37. Barbas C.F., Bain J.D., Hoekstra, DM. and Lerner, R.A. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem. // Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 1992. -V. 89. - P. 4445-4457.

38. Barbie V. and Lefrans M. The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments. //Exp Clin Immunogenet. 1998. - V.15. - P. 171-183.

39. Barbas C.F., Burton D.R. Cold Spring Harbor laboratory courses on Monoclonal antibodies from combinatorial libraries. 1994. 54 p.

40. Batra J.K., FitzGerald D.F., Gately M., Chaudhary V.K., Pastan I. Anti-Tac(Fv)-PE40, a single chain antibody Pseudomonas fusion protein directed at interleukin 2 receptor bearing cells. // J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P. 15198-15202.

41. Beck E. and Zink B. Nucleotide sequence and genome organisation of filamentous bacteriophages fl and fd. // Gene. 1981. - V. 16(1-3). - P. 35-58.

42. Beer B., Kurth R., Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. //Naturwissenschaften. 1999. - V. 86. - P. 8-17.

43. Berger M., Shankar V., and Vafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies. //Am. J. Med. Sci. 2002. - V. 324. - P. 14-30.

44. Bernard O., Gough N. Nucleotide sequence of immunoglobulin heavy chain joining segments between translocated VH and \x constant region genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. USA. 1980. -V. 77. - P. 3630-3634.

45. Better M., Chang C.P., Robinson R.R. and Horwitz A.H. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. // Science. 1988. - V.240. - P. 1041-1043.

46. Better M., Hortwitz A.H. Expression of engineered antibodies and antibody fragments in microorganisms. // Meth. Enzymol. 1989. - V. 178. - P. 476-496.

47. Bianchi A.A. and McGrew J.T. High-level expression of full-length antibodies using trans-complementing expression vectors. //Biotechnol. Bioeng. 2003. - V. 84. - P. 439-444.

48. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Jonson S., Kaufman B.M., Lee S.-M., Lee T., Pope S.H., Riovdan G.S., WhitlowM. Single-chain antigen-binding protein. // Science. 1988. - V. 242. - P. 423-426.

49. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid aikalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - P. 1513-1523.

50. Blam M.E., Stein R.B., Lichtenstein G.R. Integrating anti-tumor necrosis factor therapy in inflammatory bowel disease: current and future perspectives.// Am. J. Gastroenterol. 2001. - V. 96. - P. 1977-1997.

51. Bolivar F., Rodrigues R.L., Green P.J., Betlach M.C. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. // Gene. 1977. - V. 2. - P. 95-99.

52. Bond Ch., Marsters J.C., Sidhu S. Contributions of CDR3 to VHH Domain Stability and Design of Monobody Scaffolds for Naive Antibody Libraries. // J. Mol. Biol. -2003. V.332. - P.643-655.

53. Bowden G., Georgiou G. Folding and aggregation of ^-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli. // J. Biol.Chem. 1990. - V. 265. - P. 16760-16766.

54. Braunagel M. and Little M. Construction of a semisynthetic antibody library using trinucleotide oligos. //Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P.4690-4691.

55. Breedveld F.C. Therapeutic monoclonal antibodies. //Lancet. 2000. - V. 355. -P.735-740.

56. Brinkmann U., Pai L., Fitzgerald D., Willingham M., Pastan I. B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 8616-8620.

57. Bruyns A.M., DeJaeger G., DeNeve M., DeWilde C., VanMontagu M., Depicker A. Bacterial and plant-produced scFv proteins have similar antigen-binding properties. // FEBS Lett. 1996. - V. 386. - P. 5-10.

58. Burton D., Saphire E., Parren P. A model for neutralization of viruses based on antibody coating of the virion surface. // Curr.Topics Microbiol. Immunol. 2001, -V. 260.-P. 109-143.

59. Carlson D.L., Willis M.S., White D.J., et al., Tumor necrosis factor-alpha-induced caspase activation mediates endotoxin-related cardiac dysfunction. //Crit Care Med. -2005.- 33(5).- P. 1021-1028.

60. Carlsson R. and Soderlind E. n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2001. - V.l. - P.102-108.

61. Carter P., Presta L., gorman C.M., Ridway J.B.B., Henner D., Wong W.C.T., Rowland A.M., Koch C., Carver M., Shepard H.M. Humanization of an anti-pi 85HER2 antibody for human cancer therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992.-V. 89.-P. 4285-4289.

62. Chaudhary V.K., Queen C., Junghans R.P., Waldmann T.A., FitzGerald D.J., Pastan I. A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonas exotoxin. //Nature. 1989. - V. 339. - P. 394-397.

63. Chaudhary V.K., Gallo M.G., FitzGerald D.J., Pastan I. A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990a . - V. 87. - P. 9491-9494.

64. Chaudhary V., BatraJ., GalloM., Willingham M., FitzGerald D., Pastan I. A Rapid method of cloning funcnional variable-region antibody genes in E.coli as single-chain immunotoxins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 1066-1070.

65. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. //Nature. 1989. - V. 342. - P. 877-883.

66. Chothia C., Lesk A.M., Gherardi E., Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 799-817.

67. Co M.S., Deschavps M., Whilley R.J., Queen C. Humanized antibodies for antiviral therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 2869-73.

68. Colman P.M., Larer W.G., Varghese J.N., Baker A.T., Tulboch P.A., Air C.M., Webster R.G. Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase. //Nature. 1987. - V. 326. - P. 358-363.

69. Conrath, K.E., Wernery, U., Muyldermans, S., Nguyen, V.K. Emergence and evolution of functional heavy-chain antibodies in Camelidae. //Development and Comparative Immunology. 2003. - V. 27. - P. 87-103.

70. Cox J.P., Tomlinson I.M. and Winter G. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage. // Eur. J. Immunol. 1994. - V.24. - P. 827-836.

71. Czerny P. And Mahnel H. Structural and functional analysis of orthopoxvirus epitops with neutralizing monoclonal antibodies.//J.Gen.Virol. 1990. - V. 71. - P. 2341-2352.

72. Dantas-Barbosa C., Brigido M.M. and Maranhao A.Q. Construction of a human Fab phage display library from antibody repertoires of osteosarcoma patients. // Genet. Mol. Res. 2005. - V.4.- P. 126-140.

73. Davies A., Greene A., Lullau E., and Abbott W.M. Optimisation and evaluation of a high-throughput mammalian protein expression system. //Protein Expr. Purif. 2005. -V. 42.-P. 111-121.

74. Davis C.G., Jia X.C., Feng X., and Haak-Frendscho M. Production of human antibodies from transgenic mice. //Methods Mol. Biol. 2004. - V. 248. - P. 191-200.

75. Dekruif J.M, Logtenberg T. Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from semi-synthetic antibody phage display library. // J. Biol. Chem. -1996.-V. 271.-P. 7630-7635.

76. Demkovicz W., Maa J., Esteban M. Identification and characterization of Vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans.// J. Virol. 1992 - V. 66. - P. 386-398.

77. Desidero, A., Fanconi, R., Lopez, M., E., V., M., Viti, F., Chiaraluce, R. A semisynthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a singleframework scaffold. // J. Mol. Biol. 2001. - V. 310. - P. 603-615.

78. DeSutter K., Feys V., Vande Voorde A., Fiers W. Production of functionally active murine and murine: :human dimeric F(ab')2 fragments in COS-1 cells. // Gene. -1992.-V. 113.-P. 223-230.

79. DeWildt R.M., Hoet R.M., van Venrooij W.J., Tomlinson I.M. and Winter G. Analysis of heavy and light chain pairings indicates that receptor editing shapes the human antibody repertoire. // J. Mol. Biol. 1999. - V.285. - P.895-901.

80. Deyev S.M., Lieber A., Radko B.V., Polanovsky O.L. Expression of immunoglobulin genes tandem in eucariotic cells under control of T7 bacteriophage RNA polymerase. // Appl. Biochem. and Biothechnol. 1994. - V. 47. - P. 143-155.

81. Dimmock N. Neutralization of animal viruses. // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1993.-V. 12.-P. 70-75.

82. Dimmock N. Update on the Neutralization of animal viruses. // Rev. Med. Virol. -1995.-V. 5. P. 165-169.

83. Dorsam H., Rohrbach P., Kurscher T., Kipriyanov S., Renner S., Braunagel M., Welschof M., Little M. Antibodies to steroids from a small human naive IgM library. FEBS Lett.-1997.-V. l.-P. 7-13.

84. Dotto G., Horiuchi K. and Zinder N. The functional origin of bacteriophage fl DNA replication. Its signals and domains. // J. Mol. Biol. 1984. - V. 172. - P. 507-521.

85. Esposito J., Obijeski J.,Nakano J. The virion and soluble antigen proteins of variola, monkeypox and vaccinia virus. // J. Med. Virol. -1977. V. 1. - P. 95-110.

86. Ewert S., Huber T., Honegger A. and Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. // J. Mol. Biol. 2003. - V.325. - P.531-553.

87. Fendly BM., Toy KJ., Creasey AA., Vitt CR., Larrick JW., Yamamoto R., Lin LS. Murine monoclonal antibodies defining neutralizing epitopes on tumor necrosis factor. // Hybridoma. 1987. - V. 6(4). - P. 359-370.

88. Fenner F.,Wittek R., Dumbell K. The Orthopoxviruses. USA. Acad.Press. 1989. p. 432.

89. Fishwild D.M., Hudson D.V., Deshpande U. and Kung,A.H. Differential effects of administration of a human anti-CD4 monoclonal antibody, HM6G, in nonhuman primates. // Clin. Immunol. 1999. - V. 92. - P. 138-152.

90. Franchini M., Rituximab in the treatment of adult acquired hemophilia A: A systematic review. //Crit Rev. Oncol. Hematol. 2007, in press.

91. Friguet B., Chaffote A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.F. Measurement of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzime-linked immunosorbent assay. // J. Immunol. Methods. 1985. - V.77. - P. 305-319.

92. Froehler B.C., Ny P.G. and Mattencci M.D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acids. Res. 1986. - V. 14. - P. 5399-5407.

93. Frost E.H. Investigation of sera reactive to hepatitis C virus by second-generation enzyme immunoassay. // J Clin Microbiol. 1993. - V. 31(1). - P. 163-4.

94. Fuchs P., Breitling F., Dubel S., Seehaus T., Dubel S., Little M. Targeting recombinant antibodies to the surface of Escherichia coli: Fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein. //BioTechnology. 1991. -V. 9. - P. 1369-1372.

95. Galmiche M.C., Goenaga J., Wittek R., Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. // Virology. -1999. V. 254.-P. 71-80.

96. Garrard LJ. and Henner D.J. Selection of an anti-IGF-1 Fab from a Fab phage library created by mutagenesis of multiple CDR loops. // Gene. 1993. - V.128. - P. 103-109.

97. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium. // Biotechniques. 2000. - V.29. - P. 128-138.

98. Geoffroy F., Sodoyer R. and Aujame L. A new phage display system to construct multicombinatorial libraries of very large antibody repertoires. // Gene. 1994.1. V.151. P.109-113.

99. Ghahroudi, A., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., & Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. // FEBS Letters. 1997. - V. 414. - P. 521-526.

100. Gispen R. and Brand-Saathof B. Three specific antigens produced in vaccinia, variola and monkeypox infections. // J. Inf. Dis. 1974. - V. 129. - P. 289-293.

101. Glockshuber R., Nalia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to Stabilize immunoglobulin Fv-fragment. // Biochemistry. 1990. v. 29. p. 1362-1368.

102. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice: production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry and immunology. NY. Acad. Press. 2nd ed. 1986. 315 p.

103. Golomb H., Chamberlin M. Characterisation of T7-specific ribonucleic acid polymerase. // J.Biol.Chem. 1974. - V. 249. - P. 2858-2863.

104. Gotter S., Haas C., Kipriyanov S.M., Dubel S., Breitling F., Khazaie K., Schirmachen V., Little M. A single-chain antibody for tumor cells infected with Newcastle disease virus. // Tumor Targeting. 1995. - V. 1. - P. 107-114.

105. Goyenecha B., Milstein C. Modifying the sequence of an immunoglobulin V-gene alters resulting pattern of hypermutation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93.-P. 13979-13984.

106. Griffiths A.D. and Duncan A.R. Strategies for selection of antibodies by phage display. Curr. Opin. Biotech. 1998. - v. 9. - P. 102-108.

107. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Research 2003a. - Vol. 57. - P. 129-146.

108. Hames-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hames, C., Songa, EB., Bendahman, N., Hames, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. // Nature. 1993. - V. 363. - P. 446-458.

109. Hanes J and Pluckthun A., In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - V. 94. - P. 4937-42.

110. Hasemann C.A., Capra J.D. High-level production of a functional immunoglobulin heterodimer in a baculovirus expression system. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990.-V. 87. P. 3942-6.

111. Hawkins R.E., Russel S.K., Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking naive combinatorial library. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992.-V. 89.-P. 3576-3580.

112. Hiatt A. Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. // Nature. 1989. - V. 342. - P. 76-78.

113. Hirai M., Okamura N., Terano Y., Tsujimoto M., Nakazato H. Production and characterization of monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor. // J Immunol Methods. 1987. - V. 26(1). - P. 57-62.

114. Hoess R.H., Brinkmann U., Handel T., Pastan I. Identification of a peptide which binds to the carbohydrate-specific monoclonal antibody B3. // Gene. 1993. - V. 128.-P. 43-49.

115. Honjo T., Nakai S., Nishida Y., Kataoka T., Yamavaki-Kataoka Y., Takahashi N., Obata M., Shimizu A., Yaoita Y., Nikaido T., Ishida N. Rearrangment of immunoglobulin genes during differentiation and evolution. // Imm. Reviews. -1981.-V. 59.-P. 33-67.

116. Horwitz A.H., Chang P., Better M., Hellstrom K.E., Robinson R.R. Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8678-8682.

117. Hsiao J-C., Chung C., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the absorption of intracellular mature virions to cells. // J.Vrol. -1999. -V. 73. P. 8750-8761.

118. Hsu E. Canonical VH CDR1 nucleotide sequences are conserved in all jawed vertebrates. // Int. Immunol. 1996. - V. 8. - P. 847-854.

119. Huber C., Schable,K.F., Huber,E., Klein,R., Meindl,A., Thiebe,R. Lamm,R. Zachau,H.G The V kappa genes of the L regions and the repertoire of V kappa gene sequences in th human germ line. // Eur J.Immunol. -1993. V. 23 (11). - P. 2868-2875.

120. Huse WD, Iverson SA., Kang AS., Alting-Mees M., Burton DR., Bencovic SJ., Lerner RA. Generation of large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. // Science. 1989. - V. 246. - P. 1275-1281.

121. Huston J.S., Mudgett-Hunter M., Nai M.S., McCartney J., Warren F., Haber E.,

122. Opperman H. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proneins. //Meth. Enzymology. 1990. - V. 203. - P. 46-89.

123. Ichihashi Y., Oie M. Epitope Mosaic on the Surface Proteins of Orthopoxviruses.// Virology. 1988.- V. 163.-P. 133-144.

124. Ichihashi Y. and Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus. // Virology. 1996. - V. 220. - P. 491-494.

125. Ichihashi I. Extracellular enveloped Vaccinia virus escapes neutralization. // Virology. 1996b. - V. 217. - P.478-485.

126. Ignatovich O., Tomlinson I.M., Jones P.T. and Winter G. The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoire. // J. Mol. Biol. 1997. - V.268. - P. 69-77.

127. Ippen-Ihler K., Maneewannekul S. Conjugation among enteric bacteria: Mating systems dependent on expression of pili. In: «Microbial cell-cell interactions». 1991. p. 35-69.

128. Jakobovits A., Production of fully human antibodies by transgenic mice.// Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 561-566.

129. Jang Y.J., Lecerf J.M., Stollar B.D. Heavy chain dominance in the binding of DNA by a lupus mouse monoclonal autoantibody. // Mol. Immunol. 1996 . - V. 33. - P. 197-210.

130. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., Gould E.A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses. // Virology. -1994.-V. 200.-P. 21-28.

131. Johnson G. and Wu T.T. Kabat Database and its applications: future directions. // Nucleic Acids Res. 2001. - V.29. - P.205-206.

132. Jones P.T., Dear P.H., Foote J., Neuberger M.S., Winter G. Replasing the complrmentary-determing region in a human antibody with those from a mouse. // Nature. 1986. - V. 321. - P. 522-525.

133. Karpas A., Dremucheva A. and Czepulkowski B.H. A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 1799-1804.

134. Kawasaki K., Minoshima S., Nakato E., Shibuya K., Shintani A., Schmeits J.L., Wang J. and Shimizu N. One-megabase sequence analysis of the human immunoglobulin lambda gene locus. // Genome Res. 1997. - V.7. - P.250-261.

135. Kay B.K., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. NY.: Academic press. 1996. 306 p.

136. Kieke MC., Cho BK., Boden ET., Kranz DM., Wittrup KD. Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. // Protein Eng. 1997. - V. 10(11). -P. 1303-1310.

137. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. -2002. V.13. - P.593-597.

138. Kempeni J. Preliminary results of early clinical trials with the fully human anti-TNFa monoclonal antibody D2E7. // Ann. Rheum. Dis.- 1999. V.58. - P. 170-172.

139. Khazaeli M.B., Conry R.M., and LoBuglio A.F., Human immune response to monoclonal antibodies. //J. Immunother. 1994. - V. 15. - P. 42-52.

140. Kieke M, Cho B., Boden E., Kranz D., Wittrup K. Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. // Protein Eng. 1997. - V. 10(11). - P. 1303-1310.

141. Kim S.J., Jang M.H., Stapleton J.T, Yoon S.O., Kim K.S., Jeon E.S. and Hong H.J. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display. // Virology. 2004. - V.318. - P.598-607.

142. Kipriyanov S.M., Dubel S., BreitlingF., KontermannR.E., Little M. Recombinant single-chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent and bioninylated miniantibodies. // Mol. Immunol. 1994. - V. 31. -P.1047-1058.

143. Kipriyanov S.M., Breitling F.,Little M.,Dubel S. Single-chain antibody strepnavidin fusion: tetrameric bifunctional scFv-complexes with biotin binding activity and enchanced affinity to antigen. // Hum. Antibod. Hybridomas. 1995a. - V. 6. - P. 93-101.

144. Kipriyanov S.M., Dubel S., Breitling F., Kontermann RE., Heymann S., Little M. Bacterial expression and refolding of single-chain Fv fragments with C-terminal cysteines. // Cell Biophisics. 1995b. - V. 26. - P. 187-204.

145. Kipriyanov S.M., Moldenhauer G., Little M. High level production of soluble single chain antibodies in small-scale Escherichia coli cultures. // J. Immunol. Methods. -1997.-V. 200.-P. 69-77.

146. Kipriyanov S.M. and Little M. Generation of recombinant antibodies. // Mol. Biotechnol. 1999. - V.12. - P.173-201.

147. Klasse P. and Sattentau Q. Occupancy and mechanism in antibody mediated neutralization of animal viruses. // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 2091-2108.

148. Knappik A., Krebber C., Pluckthun A. The effect of folding catalysts on the in vivo folding process of different antibody fragment expressed in Escherichia coli. // Bio/Thecnology. 1993. - V. 11. - P. 77-82.

149. Kohl J., Ruker F., Himmler G., Razazzi E., Katinger H. Cloning and expression of an HIV-1 specific single-chain Fv region fused to Escherichia coli alkaline phosphatase. //Ann. NY. Acad. Sci. 1991. - V. 646. - P. 106-114.

150. Kohler G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975. - V.256. - P.495-497.

151. Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V. Main features of tick-borne encephalitis eco-epidemiology in Russia // Zentralbl Bakteriol 1999 - V. 289. - P. 525-539.

152. Labrijn A.F., Koppelman M.H., Verhagen J., Brouwer M.C., Schuitemaker H., Hack

153. C.E. and Huisman H.G. Novel strategy for the selection of human recombinant Fab fragments to membrane proteins from a phage-display library. // J. Immunol. Methods. 2002. - V. 261. - P. 37-48.

154. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

155. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after . // Hum. Antibodies. 2005. - V. 14. - P. 33-55.

156. Lee C., Sidhu S., Fuh G. Bivalent antibody phage display mimics natural immunoglobulin. J. Immunol. Meth. 2004. - V.284. - P 119-132.

157. Le Hir H., Nott A., Moore M.J. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. //Trends in Biochem. Sci. 2003. - V. 284. - P. 215-220.

158. Liu A.Y., Robinson R.R., Murray E.D., Chang J.C.P., Hellstrom I. Chimeric mouse-human IgGl antibody that can mediate lysis of cancer cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 3439-3443.

159. Lo K.M., Sudo Y., Chen J., Li Y., Lan Y., Kong S.M., Chen L., An Q. and Gillies S.D. High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells. //Protein Eng. 1998. - V. 11. - P. 495-500.

160. Lustig Sh., Fogg Ch., Whitbeck J.C., Moss B. Synergistic neutralizing activities of antibodies to outer membrane proteins of the two infectious forms of vaccinia virus in the presence of complement. // Virology. 2004. - V. 328. - P. 30-35.

161. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., CorteseR. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed library of contrained peptides. // Gene. -1993.-V. 128.-P. 51-57.

162. MacCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. and Chiswell, D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. // Nature 1990. - V. 348. -P. 552-554.

163. Maeda H., Matsushita S., Eda Y., Rimachi K., Tokiuoshi S., Bendig M.M. Construction of reshaped human antibodies with HIV-neutralizing activity. // Hum. Antibodies Hybridomas. 1991. - V. 2. - P. 124-134.

164. Mamula P., Cohen S.A., Ferry G.D., Kirschner B.S., Winter H.S., Innes A., Patel J., Baldassano R.N. CDP571, a humanized anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody in pediatric Crohn's disease.// Inflamm. Bowel Dis. 2004. - V. 10.-P. 723.

165. Manser T., Wysocky L.J., Margolies M.N., Gerter M.L. Evolution of antibody variable region structure during the immune response. // Imm. Reviews. 1997. - V. 96.-P. 141-162.

166. Marks J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert T.P., McCafferty J., Griffiths A.D. and Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. // J. Mol. Biol. 1991. - V. 222. - P. 581-597.

167. Matsuda F. and Honjo T. Organization of the human immunoglobulin heavy-chain locus. // Adv. Immunol. 1996. - V. 62. - P. 1-29.

168. Matsuda F., Ishii,K., Bourvagnet,P., Kuma,K., Hayashida,H., Miyata,T., Honjo,T. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. // J Exp Med. 1998. - V. 7 (188). - P. 2151-2162.

169. Maynard J. and Georgiou G. Antibody engineering. // Annu. Rev. Biomed. Eng.2000. V. 2. - P. 339-376.

170. Mease P.J. Tumour necrosis factor (TNF) in psoriatic arthritis: pathophysiology and treatment with TNF inhibitors. // Ann. Rheum. Dis. 2002. - V. 61. - P. 298-304.

171. Minnencova O.O., Ilyichev A.A., Kishchenko G.P. Design of specific immunogenes using filamentous phage at the carrier. // Gene. 1993. - V. 128. - P. 85-88.

172. Mitchell, T., Sugden, B. Stimulation of NF-kB-mediated transcription by mutant derivatives of the latent membrane protein of Epstein-Barr virus. // J. Virol. 1995.- V. 69. P. 2968-2976.

173. Model, P., Russel, M. The bacteriophages. In: Calendar R.(Ed). V.2. Plenum, N.Y. 1988. p.375-456.

174. Morea V., Tramontano A., Rustici M., Chothia C. and Lesk A.M. Conformations of the third hypervariable region in the VH domain of immunoglobulins. // J. Mol. Biol.- 1998.-V. 275.-P. 269-294.

175. Moreland L., Baumgartner SW., Schiff MH. Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human necrosis factor receptor (p75)-Fc fision protein. // N. Engl. Med.-1997.-V. 337.-P. 141-147.

176. Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C.& Kieff, E. The Epstein-Barr virus transforming protein LMP1 engages signaling proteins for the tumor necrosis factor receptor family. // Cell. 1995. - V. 80. - P. 389-399.

177. Mulligan R.C., Berg P.J. Expression of a bacterial gene in mammalian cells. // Science. 1980. - V. 209. - P. 1422-1427.

178. O'Neil K.T., Hoess R.H., Jackson SA., Ramachandran NS., Mousa SA., DeGrado W.F. Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library. // Proteins. 1992. - V. 14. - P. 509-515.

179. Nissim A., Hoogenboom H.R., Tomlinson I.M., Flynn G., Midgley C., Lane D. and Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. // EMBO J. 1994. - V. 13. - P. 692-698.

180. Noronha E.J., Wang X., Desai S.A., Kageshita T. and Ferrone S. Limited diversity of human scFv fragments isolated by panning a synthetic phage-display scFv library with cultured human melanoma cells. // J. Immunol. 1998. - V.161. - P. 2968-2976.

181. O'Connell D., Becerril B., Roy-Burman A., Daws M. and Marks J.D. Phage versus phagemid libraries for generation of human monoclonal antibodies. // J. Mol. Biol. -2002,- V. 321.-P. 49-56.

182. Orlandi, R., Gussov, D.H., Jones, P.T., Winter, G. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 3833-3837.

183. Padlan E.A., Silveston E.W., Sheriff S., Cohen G.H., Smith-GillS J., Davies D.R. Structure of antibody- antigen complex: crystal structure of the My HEL-10 Fab-lisozime complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 5938-5942.

184. Pallares N., Frippiat J.P., Giudicelli V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V. 15. - P. 8-18.

185. Park S.S., Kim J., Brandts J.F., and Hong H.J. Stability of murine, chimeric and humanized antibodies against pre-S2 surface antigen of hepatitis B virus. //Biologicals. 2003. - V. 31. - P. 295-302.

186. Parmley S.F. and Smith G.P. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. // Gene. -1988. V.73.- P.305-318.

187. Perelson A.S. and Oster G.F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. // J. Theor. Biol. 1979. - V. 81. - P. 645-670.

188. Persic L., Roberts A., Wilton J., Cattaneo A., Bradbury A. and Hoogenboom H.R. An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. //Gene. 1997. - V. 187. - P. 9-18.

189. Persson MA., Caothien RH., Burton DR. Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. -V. 88. - P. 2432-2436.

190. Pescovitz M.D., Rituximab, an anti-cd20 monoclonal antibody: history and mechanism of action. //Am. J. Transplant. 2006. - V. 6. - P. 859-866.

191. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E., Nichol S., Ksiazek T.G., Murphy F.A. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // Fields virology /Eds B.N Fields et al. 3d Ed.-NY.: Raven Press, 1996. Vol. 1. p. 1161-1176.

192. Petrov N.A., Karginov V.A., Mikriukov N.N., Serpinski O.I., Kravchenko V.V. Complete nucleotide sequence of the bacteriophage X DNA region containing gene Q and promotor PR> // FEBS Lett. -1981. V. 133 (2). - P. 316-320.

193. Presta L.G. Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function. //Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - V. 58. - P. 640-656.

194. Radko B.V., Boitchenko V. E., Nedospasov S. A. and Korobko V. G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor. // Russian

195. Journal of Immunology. 2002. - V. 7(4). - P. 371-374.

196. Rastetter W., Molina A., and White C.A. Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases. //Annu. Rev. Med. 2004. - V. 55. - P. 477503.

197. Ravanello M.P., Hruby D.E.Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly.// J Virol. 1994a - V.68 - P. 6401-6410.

198. Ravanello M.P., Hruby D.E.Characterization of the vaccinia virus L1R myristylprotein as a component of the intracellular virion envelope.// J Gen Virol. -1994b.-V. 75.-P. 1479-1483.

199. Reading S.A., and Dimmock NJ. Neutralization of animal virus infectivity by antibody. //Arch. Virol. -2007. V. 152. - P. 1047-1059.

200. Reff,M.E. High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells. //Curr. Opin. Biotechnol. 1993. - V. 4. - P. 573-576.

201. Reichert J.M., Rosensweig C.J., Faden L.B., and Dewitz M.C. Monoclonal antibody successes in the clinic. //Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 1073-1078.

202. Reichmann L., Clark M., Waldman H., Winter G. Reshaping human antibody for therapy. //Nature. 1988. - V. 332. - P. 323-327.

203. Riechmann L., Davies J. Backbone assignment, secondary structure and protein A binding of an isolated, human antibody VH domain. // Journal of Biomolecular NMR. 1995. - V. 6. - P. 141-152.

204. Ridder R., Schmitz R., Legay F., Gram H. Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris. // Biotechnology. 1995. -V. 13. - P. 255-260.

205. Ridder R., Geisse S., Kleuser B., Kanallek P., Gram H. A COS: cell-based system for rapid production and quantification of scFv::IgGk antibody fragments.// Gene -1995. V. 166. - P. 273-276.

206. Rodrigues M., Snedecor B., Chen C., Wong W., Carg S., Blank G., Maneval D.,

207. Carter P. Engineering Fab' fragments for efficient F(ab)2 formation in Escherichia coli and for improved in vivo stability. //J Immunol. 1993. - V. 15. - P. 69546961.

208. Queen C., Schneider W.P., Selick H.E., Landolfi N.F., Duncan J.F., Avdalovic N.M., Levitt M., Junghans R.F., Waldmann T.A. A humaniezed antibody that binds to the interleukin 2 receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 1002910033.

209. Sanders D.S. Mucosal integrity and barrier function in the pathogenesis of early lesions in Crohn's disease.// J. Clin. Pathol. 2005. - V. 58. - P. 568-572.

210. Sastry, L., Alting, M.M., Huse, W.D., Short, J.M., Sorge, J.A., Hay, B.N., Janda, K.D., Benkovic, S.J., Lerner, R. // Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1989. - V.86. -P.5728-32.

211. Sblattero D. and Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. //Nat. Biotechnol. 2000. - V.18. - P.75-80.

212. Schmaljohn C., Cui Y., Kerby S., Pennock D. and Spik K. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatorial library. // Virology. 1999. - V. 258. - P. 189200.

213. Schroder K., Hertzog P.J., Ravasi T., Hume D.A. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. // J. Leukoc. Biol. 2004. - V. 75. - P. 163-189.

214. Skerra A., and Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. // Science. 1988. - V. 240. - P. 1038-1041.

215. Smith G.P. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the virion. //Science. 1985. - V. 228. - P. 1315-1317.

216. Smith and Scott. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. // Methods in Enzymology. 1993. - V. 217. - P. 228-257.

217. Solar I., Gershoni J.M. Linker modification introduces useful molecular instability in a single chain antibody. // Protein Engineering . 1995. - V. 8. - P. 717-723.

218. Stevens F.J. Modification of an ELISA-based procedure for affinity determination: correction necessary for use with bivalent antibody. // Mol. Immunol. 1987. - V. 24.-P. 1055-1060.

219. Suss J., Schrader C., Abel U. et al. Characterization of tick-borne encephalitis (TBE) foci in Germany and Latvia (1997-2000). // Int. J. Med. Microbiol. 2002. -V. 291(Suppl. 33). - P. 34-42.

220. Takashima I., Morita K., Chiba M. et al. A case of tick-borne encephalitis in Japan and isolation of the virus // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 1943-1947.

221. Takashima I., Hayasaka D., Goto A. et al. Epidemiology of tick-borne encephalitis (TBE) and phylogenetic analysis of TBE viruses in Japan and Far Eastern Russia // J. Infect. Dis. 2001. - V. 54. - P. 1 -11.

222. Tang Y., Jiang N., Parakh C. and Hilvert D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.-P. 15682-15686.

223. Taub R., Gould R.J., Garsky V.M., Ciccarone M., Hoxie J., Friedmann P.A., Shattil

224. J. A monoclonal antibody against the platelet fibrinogen receptor contains a sequence that mimics a receptor recognition domain in fibrinogen. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 259-65.

225. Thomas P. and Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2005. - V. 51. - P. 187200.

226. Thompson J. Applications of antisense and siRNA during preclinical drug development. // Drug Discov. Today. 2002. - V. 7. - P. 912-917.

227. Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 776-798.

228. Tomlinson I.M., Cox J.P., Gherardi E., Lesk A.M. and Chothia C. The structural repertoire of the human V kappa domain. // EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 46284638.

229. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly aery lamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

230. Trikha M., Zhou Z., Timar J., Raso E., Kennel M., Emmell E., and Nakada M.T., Multiple roles for platelet GPIIb/IIIa and alphabeta 3 integrins in tumor growth, angiogenesis, and metastasis. //Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 2824-2833.

231. Trill J.J., Shatzman A.R., and Ganguly S. Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. //Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 553-560.

232. Tsehanovskaya N., Matveev L., Rubin S. et al. Epitope analysis of tick-borne encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). // Virus Res. 1993. - V. 30. - P. 290-295.

233. Turner D.J., Ritter M.A. and George A.J. Importance of the linker in expression of single-chain Fv antibody fragments: optimisation of peptide sequence using phage display technology. // J. Immunol. Methods. 1997. - V. 205. - P. 43-54.

234. Tutter A., Riblet R. Conservation of immunoglodulin variable-region gene family indicates a specific, noncoding function. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 7460-7464.

235. Van Wezenbeek P., Huloenmakers J.G. Nucleotise sequence of the filamentous bacteriophage M13 DNA genome: Comparison with phage fd. // Gene. 1980. - V. 11.-P. 129-148.

236. Virnekas B., Ge L., Plucthun A., Schneider K., Wellnhofer G, Moroney S.E. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotodis for random mutagenesis. // Nucl.Acids Res. 1994. - V. 22. -P. 5600-5607.

237. Ward E.S., Gussow D.H., Griffiths A.D., Jones P.T., Winter G. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. //Nature. 1989. - V. 341. - P. 544-546.

238. Ward E.S., Bibbington C.R. Genetic manipulation and expression of antibodies. In Monoclonal antibodies: principles and application. Willey-Liss Inc. 1995. p. 137185.

239. Waterhouse P., Griffiths A.D., Johnson K.S. and Winter G. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 2265-2266.

240. Weigert M., Gatmaitan L., Loh E., Schilling J., Hood L.E.//Nature. 1978. - V. 276. -P. 785-790.

241. Weiss R. Virulence and pathogenesis. // Trends Microbiol. 2002. - V. 10. - P. 314317.

242. Weissenhorn W., Weiss E., Schwirzke M., Kahnze B., Weidle U.H. Chimerization of antibodies by isolation of rearranged genomic variable regions by the polymerase chain reaction. // Gene. 1991. - V. 106. - P. 273-277.

243. Welschof M., Terness P., Kipriyanov S.M., Stanescu D., Breitling F., Dorsam H., Dubel S., Little M. and Opelz G. The antigen-binding domain of a human IgG-anti-F(ab')2 autoantibody. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 1902-1907.

244. Willats W.G. Phage display: practicalities and prospects. // Plant Mol. Biol. 2002. -V. 50.-P. 837-854.

245. Williams W.V., Hoss D.a., Kieber-Emmons T., Cohen J.A., Myers J.N., Weiner D.B., Greene M.I. Development of biologically active peptides based on antibody structure. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 5537-5541.

246. Williams S.C., Frippiat J.P., Tomlinson I.M., Ignatovich O., Lefranc M.P. and Winter G. Sequence and evolution of the human germline V lambda repertoire. // J. Mol. Biol. 1996. - V. 264. - P. 220-232.

247. Williamson R.A., Burioni R., Sanna P.P., Partridge L.J., Barbas C.F., Burton D.R. Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries. // Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 4141-4145.

248. Wilson A., Rini J., Fremont D., Fieser G., Stura E.A. X-ray crystallographic analysis of free and antigen-complexed Fab fragments to investigate structural basis of immune recognition. // Meth. Enzymol. 1991. - V. 203. - P. 153-176.

249. Wilson J.A., Hevey M., Bakken R., Guest R, Bray M., Schmaljohn A., Hart M. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus.// Science. -2000.-V. 287.-P. 1664-1666.

250. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E. and Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - V. 12. - P. 433-455.

251. Whitlou M., Filpula D. Single-chain Fv proteins and their fusion proteins. // Methods Companion Methods Enzymol. 1991. - V. 2. - P. 97-103.

252. Wolffe EJ, Vijaya S, Moss B. A myristylated membrane protein encoded by the vaccinia virus L1R open reading frame is the target of potent neutralizing monoclonal antibodies.// Virology. 1995 - V. 211- P. 53-63.

253. Wood C.R., Dorner A.J., Morris G.E., Alderman E.M., Wilson, D., O'Hara, R.M., Jr., and Kaufman, R.J. High level synthesis of immunoglobulins in Chinese hamster ovary cells. //J. Immunol. 1990. - V. 145. - P. 3011-3016.

254. Wright A. and Morrison S. Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering. //Trends Biotechnol. 1997. - V. 15. - P.26-32.

255. Wu T.T., Kabat E.A. An analysis of the sequences of the variable region of Bence Jones protein and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. // J. Exp. Med. 1970. -V. 132. - P. 211-250.

256. Wu, T.T., Johnson, G., Kabat E.A. Length distribution of CDRH3 in antibodies. // Proteins:Struct. Funct. Genet. -1993. V. 16. - P. 1-7.

257. Xiong H., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y., and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies. // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. - V. 38. -P.414-419.

258. Zhou, Y., Takekoshi, M., Maeda, F., Ihara, S., Esumi, M. Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis C virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro. Antiviral Research. 2002. - V.56. - P.51-59.

259. Zinkernagel R. Anti-infection immunity and autoimmunity. // Ann. N.Y. Acad.Sci. -2002.-V. 958.-P. 3-6.

260. Zinoviev V.V., Tchikaev N.A., Chertov O.Yu., Malygin E.G. Identification of the gene encoding vaccinia virus immunodominant protein p35. // Gene. 1994. - V. 147 (2). - P. 209-14.

Информация о работе

Тикунова, Нина Викторовна
доктора биологических наук
Кольцово, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Дизайн рекомбинантных антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Дизайн рекомбинантных антител ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Дизайн рекомбинантных антител"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тикунова, Нина Викторовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дизайн рекомбинантных антител"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тикунова, Нина Викторовна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тикунова, Нина Викторовна, Кольцово

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дизайн рекомбинантных антител
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология