Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вируснейтрализующие рекомбинантные антитела против вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вируснейтрализующие рекомбинантные антитела против вируса клещевого энцефалита"

На правахрук^рца^__

Леванов Лев Николаевич

ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.03 - «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2009

003476741

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук, доцент Тикунова Нина Викторовна

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Евстропов Александр Николаевич доктор биологических наук Разумов Иван Алексеевич

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «2» октября 2009 года в часов на заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан « М» —2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета -Лу^— Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка гибридомной технологии определила бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей. Созданы десятки тысяч высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также с низкомолекулярными антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями - токсинами, ферментами, а также магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами. Однако все упомянутые выше антитела и их производные широко используются, в основном для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии ограничивается тем, что с помощью гибридомной технологии удается получать, главным образом, молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их связыванию и удалению из организма (Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006). Создание человеческих гибридом затрудняется из-за сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломных клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильности образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммуногенности мышиных моноклональных антител (МКА) путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. Для решения этой проблемы были разработаны подходы, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов антител мыши с константными доменами человеческих антител, "гуманизация" путем замены гипервариабельных районов в молекуле антитела человека на аналогичные участки из мышиного антитела, получение полноразмерных антител человека с помощью трансгенных мышей и технологии фагового дисплея.

В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинантных антител, одобренных и разрешенных FDA для терапевтических целей, подавляющее количество антител являются химерными.

На сегодняшний день в клинике используются следующие препараты химерных антител: abciximab (ReoproR: Fab anti-GpIIb/IIIa, Centocor/Eli Lilly) - для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, Rituximab (RitxanR: IgGl anti-CD20, Biogen-IDEC) -для лечения больных неходжкинскими лимфомами, infliximab (RemicadeR: IgGl anti-TNF-a, Centocor) - для лечения ревматоидных артритов и болезни Крона, Basiliximab

(SimulectR: IgGl antí-CD25, Novartis) - в трансплантологии при отторжении трансплантата, Cetuximab (ErbituxR: IgGl anti-EGRF, ImClone) - для лечения рака прямой кишки (Gavilondo, 2000; Laffly, 2005; Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006).

К настоящему времени получены химерные антитела против ряда вирусных патогенов: вируса иммунодефицита человека (Major, 1994), вируса гепатита В (Preston, 1998; Bose, 2006), С (Law, 2008) и Е (Luo, 2007), вируса Varicella-Zoster (Shankar, 2005). Показано, что химерные антитела могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов (Shankar, 2005; Bose, 2006; Luo, 2007).

Одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов на территории Российской Федерации является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать серьезные поражения нервной системы. Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболеваемости (Локтев, 2007). Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гамма-глобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать вируснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ.

Целью данной работы являлось получение вируснейтрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• клонировать гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых (Vh) и легких (VL) цепей МКА 13D6 и 10С2 против вируса КЭ и определить их нуклеотидные последовательности;

• сконструировать на основе полученных Vh- и Уь-гепов рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие химерные и одноцепочечные антитела против вируса КЭ;

• исследовать иммунохимические свойства полученных химерных и одноцепочечных антител;

• исследовать вируснейтрализующие свойства полученных рекомбинантных антител. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе

впервые сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие

продукцию вируснейтрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса

4

КЭ в эукариотических клетках и в клетках Е. coli, соответственно. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности этих антител. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 способны ингибировать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для одноцепочечного и химерного антител SC13D6 и chl3D6 в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vera Е6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ. Исследованы иммунохимические свойства одноцепочечных и химерных антител. С помощью методов иммуноферментного анализа определены константы аффинности полученных рекомбинантных одноцепочечных и химерных антител.

В ходе данной работы впервые были получены химерные антитела против вируса КЭ, обладающие вируснейтрализующими свойствами. Полученные антитела после проверки их терапевтических свойств могли бы стать основой для разработки препарата для лечения клещевого энцефалита.

Получен стабильный штамм-продуцент растворимых вируснейтрализующих одноцепочечных антител против вируса КЭ, который задепонирован в коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 8 Международных конференциях: 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "The interface between Immunology and Medicine" (Москва, Россия, 2005), 8th International EMBL PhD Student Symposium "Biology of Disease A Molecular Battlefield" (Гейдельберг, Германия, 2006), 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "Immunology and viral infection" (Москва, Россия, 2007), 1st International Summer School 2008 "Pathogen-Host Interplay" (Берлин-Потсдам, Германия, 2008), International Life Sciences Students' Conference (Варшава, Польша, 2008), FEBS Practical Course "Structural variations in genome, gene expression, single cell analysis: arrays, beads, high-throughput sequencing" (Прага, Чехия, 2008), the 13th CIMO Winter School "Biomolecules in health and disease" (Хельсинки, Финляндия, 2009), 34th FEBS Congress "Life's Molecular Interactions" (Прага, Чехия, 2009); и одной Российской конференции - III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 38 рисунков и 3 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (141 наименований).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В процессе конструирования рекомбинантных антител всегда встает вопрос о сохранении их биологических свойств и о том, какой аффинностью они будут обладать. Последний показатель особенно важен для антител, предназначенных для медицинского применения. Как было неоднократно показано, антитела с высокой константой аффинности более эффективны в терапии, поскольку они успешнее конкурируют за целевой антиген (Xie, 2005). Кроме того, от аффинности в значительной степени зависит терапевтическая доза препарата и отчасти его фармакокинетические свойства.

Для того чтобы оценить, какой будет аффинность у целевых полноразмерных рекомбинантных антител, обладающих двумя центрами связывания с антигеном, возможно измерение аффинности их моновалентных аналогов с поправкой на бивалентную природу молекулы иммуноглобулина (Ройт, 2000). Такими аналогами могут быть одноцепочечные антитела. Поскольку такие антитела представляют собой антигенсвязывающий домен исходного иммуноглобулина, они, как правило, сохраняют специфичность и обладают сходным сродством к антигену (Bird, 1988). Перед тем как конструировать химерные антитела, мы решили получить одноцепочечные антитела на основе тех же вариабельных доменов и детально исследовать проблему сохранения сродства рекомбинантных антител к целевому антигену. Кроме того, одноцепочечные антитела интересны как инструмент для изучения возможных механизмов нейтрализации вирусной инфекционное™ исходными МКА.

Для конструирования рекомбинантных антител к вирусу КЭ в качестве прототипа были использованы МКА 13D6 и 10С2, продуцируемые мышиными гибридомами (Цехановская, 1993). Эти гибрид омы были получены в результате слияния миеломной клеточной линии Sp2/0-Agl4 со спленоцитами мыши, иммунизированной очищенным белком Е вируса КЭ, штамм Софьин (Цехановская, 1993). Выбор этих гибридом был обусловлен тем, что МКА 13D6 и 10С2 способны блокировать гемагтлютинирующую активность вируса КЭ и по предварительным данным защищать модельных животных от вирусной инфекции в реакции биологической нейтрализации. Кроме того, МКА 13D6 способно ингибировать инфекционную активность штаммов Софьин и 205 вируса КЭ в культуре эукариотических клеток (Цехановская, 1993).

6

Получение генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей моноклональных антител 13D6 и 10С2

На первом этапе работы амппифицировали гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых (Vh) и легких (Vi.) цепей мышиных МКА против вируса КЭ. Для этого из клеток гибридом 13D6 и 10С2, любезно предоставленных Матвеевым Л.Э. (ИХБиФМ СО РАН, Новосибирск) была выделена суммарная РНК. Синтез кДНК и амплификацию генов, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов мыши, проводили методом ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров. Дизайн праймеров для амплификации Vh- (Vhdir и Vhrev) и VL-reHOB (Vldir и Vlrev) проводили на основе литературных данных по оптимизации олигонуклеотидов для амплификации последовательностей, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов мыши (Wang, 2000). Концевые сайты рестрикции в этих праймерах были модифицированы нами для дальнейшей встройки целевых фрагментов в экспрессионные плазмндные вектора. Так в праймеры Vhdir и Vhrev были введены сайты для Xhol и Я«/ЕП эндонуклеаз рестрикции, соответственно, а в праймеры Vldir и Vlrev были введены сайты для Sad и BgUl эндонуклеаз рестрикции, соответственно. Синтезированные праймеры добавляли в реакционные смеси, состоящие из компонентов коммерческого набора "Titan one tube RT-PCR". Для амплификации Vu-генов МКА в реакционную смесь добавляли праймеры Vhdir и Vhrev, а для синтеза VL-reHOB - Vldir и Vlrev. Результаты ОТ-ПЦР представлены на рис. 1.

587 457 434

267

168

123 114

Рис. 1. Электрофоретический анализ в 8% ПААГ фрагментов ДНК, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей МКА 1306 и МКА 10С2. Дорожки: 1 - ^-фрагмент 1306, 2 -Ун-фрагмент 10С2, 3 - Уь-фрагмент 1306, 4 -Уь-фрагмент 10С2, М - стандарты молекулярных масс (//аеШ-гидролизат плазмиды р!Ж327).

M 1 2 3 4 M

На следующем этапе проводили определение нуклеотидных последовательностей амплифицированных Ун- и VL-фрагментов МКА 13D6 и 10С2. Сравнительный анализ последовательностей, полученных нами фрагментов Уц и Vl доменов, с имеющимися в базе данных GenBank позволил определить семейства V-генов, к которым они принадлежат. В результате было показано, что Vn-сегменты МКА 13D6 и 10С2 принадлежат к семействам VHJ558.45 и VHJ558.47 тяжелых цепей антител мыши, входящим в состав III группы, a V[-сегменты принадлежат к Ш группе к-цепей.

Конструирование рекомбииантных плазмнд, кодирующих одноцепочечные антитела против вируса клещевого энцефалита

Амплифицированные Ун- и Vi-гены МКА 13D6 далее объединяли между собой в единую молекулу с помощью олигонуклеотида, кодирующего линкерный пептид (Gly4Ser)3.

Для этого были синтезированы две пары олигонуклеотидов, после отжига которых получали фрагмент ДНК с концевыми сайтами рестрикции Bs/EIl и Seid (рис. 2).

BstEII SacI

GTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATTGAGCT

GCAGAGGAGTCCACCGCCACCGAGCCCGCCACCACCCAGCCCACCGCCGCCTAGACTGTAAC

Рис. 2. Структура олигонуклеогидного коннектора, кодирующего линкерный пептид (Gly4Ser)3

Полученный в результате отжига олигонуклеотидов Äs/EII/iSacI-фрагмент сшивали при помощи ДНК-лигазы фага Т4 с 3'-концом Ун-гена, обработанного эндонуклеазами рестрикции Xhol и ß.viEII, и с 5'-концом VL-reHa, обработанного эндонуклеазами рестрикции Sad и Bgm. Таким образом был получен ген одноцепочечного антитела SC13D6.

Далее ген одноцепочечного антитела встраивали в плазмиду pGEMl под транскрипционный контроль позднего промотора бактериофага Т7. В эту же плазмиду в 5-конец гена, кодирующего одноцепочечное антитело 13D6, был встроен фрагмент ДНК, кодирующий лидерный пептид пектатлиазы В (pelB) Erwinia carotovora, полученный на основе плазмиды рЕТ (rF 11) (Беспалов, 1995) с использованием ПЦР. Известно, что лидерные пептиды эффективно секретируемых прокариотических белков, таких как pelB, направляя секрецию в периплазматическое пространство, способствуют правильной упаковке молекул одноцепочечных антител. Считается, что секреция белка в периплазму бактерий имитирует его транспорт через эндоплазматический ретикулум в эукариотических клетках. В результате была получена рекомбинантная плазмида

8

рЙСИОб. Аналогичным образом была сконструирована плазмида р5С10С2 (рис. 3). Правильность встраивания ДНК-фрагментов подтверждали секвенированием.

T7 promoter

Рис. 3. Схема строения рекомбинантных плазмид pSC13D6/pSC10C2. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Т7 - поздний промотор фага Т7; pelB - фрагмент ДНК, кодирующий лидерный пептид; Vh и Vl-вариабельные участки генов, кодирующих тяжелые и легкие цепи рекомбинантных антител; linker (G^Ser)} - фрагмент ДНК, кодирующий линкерный пептид; Арг - ген устойчивости к ампициллину.

Экспрессия генов одноцепочечных антител в клетках Е. coli

Для экспрессии генов одноцепочечных антител сконструированными плазмидами pSC13D6 и pSC10C2 трансформировали клетки Е. coli BL21(DE3). Клетки Е. coli BL21 (DE3)/pSC 13D6 и Е. coli BL21(DE3)/pSC10C2 индуцировали IPTG в среднелогарифмической стадии роста и культивировали в течение ночи. Электрофоретический анализ лизатов клеток Е. coli BL2)(DE3)/pSC13D6 и Е. coli BL21(DE3)/pSC10C2 показал в обоих случаях наличие в индуцированных культурах дополнительного белка с молекулярной массой около 26 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе одноцепочечных антител (рис. 4, дорожки 2, 3). В контрольном лизате индуцированных клеток, содержащих плазмиду без встройки, этот белок отсутствовал (рис. 4, дорожка 1). Уровень продукции scl3D6 и sclOC2 составлял около 5 мг на литр культуральной жидкости. Исследование внутриклеточной локализации scl3D6 и sclOC2 показало, что в обоих случаях одноцепочечные антитела секретировались в периплазматическое пространство (рис. 4, дорожки 5, 6).

Для подтверждения специфичности одноцепочечных антител, продуцируемых клетками Е. coli, была протестирована способность лизатов этих клеток связывать вирус КЭ штамм 205, сорбированный на поверхность иммунологического пластика. В качестве контроля использовали лизаты клеток Е. coli BL21(DE3)/pGEMl. Результаты ИФА показали, что значение оптической плотности при связывании с вирусом КЭ образцов, содержащих рекомбинантные одноцепочечные антитела, достоверно превышает таковое в контроле, что доказывает способность SC13D6 и sclOC2 эффективно связываться с вирусом КЭ (рис. 5).

ьДа 65

-15

18

Ml 2 3 4 5 б М 7 8 9 10 11

Рис. 4. Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ лизатов клеток, периплазматических и цитоплазматических фракций, а также очищенных одноцепочечных антител. Дорожки: лизаты клеток Е coli BL21(DE3)/pGEMl (1), Е coli BL21(DE3)/pSC13D6 (2), Е coli BL21(DE3)/pSC10C2 (3); периплазматические фракции клеток Е coli BL21(DE3)/pGEMl (4), Е. coli BL21 (DE3)/pSC 13D6 (5), Е. coli BL21(DE3)/pSC10C2 (6); цитоплазматические фракции клеток Е. coli BL21(DE3)/pGEMl (7), Е coli BL21(DE3)/pSC13D6 (8), Е. coli BL21 (DE3)/pSC 10C2 (9); очищенные scl3D6 (10) и sclOC2 (11); M - стандарты молекулярных масс.

■ -BL21 |DE3ypSC13D0 i—BL21 ¡DE3VpSC10C2 — [iiJ 1 (DE3jipGEM1

t'30 !i40 t/80 1ЛБ0

Разведения клеточных лизатов

Рис. 5. Иммуноферментный анализ взаимодействия клеточных лизатов, содержащих 8с1306 и 8с10С2, с лизированным вирусом КЭ, штамм 205. Клеточные лизаты нанесены в последовательных разведениях; проявление антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1/1000.

Очистка одноцепочечных антител

Одноцепочечные антитела выделяли из смеси периплазматических белков гель-фильтрацией на сорбенте сефакрил Б-ЗОО. На рис. 6 и рис. 7 представлены хроматографический профиль, а также электрофореграмма анализа фракций. Пробы, содержащие мини-антитело, объединяли, белок концентрировали и использовали в дальнейших исследованиях. Результаты очистки одноцепочечных антител представлены на рис. 4 (дорожки 10, 11).

Анализ геля с помощью программы "Gel-Pro" показал, что уровень очистки целевых белков составил приблизительно 70%. Концентрация белка в полученных образцах, измеренная с помощью метода Лоури-Фолина (Досон, 1991), составила (2.8 ± 0.1) мг/мл и (2.6 ± 0.1) мг/мл для антител sel 3D6 и sclOC2, соответственно.

Рис. 6. Профиль гель-фильтрации. - объем удержания. Одноцепочечное антитело выходит между 90 и 100 мл элюента.

кДа

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 М

Рис. 7. Электрофореграмма в 14% ДСН-ПААГ, иллюстрирующая состав различных фракций. Дорожки: 4-5 - фракции, содержащие белок Е. coli с молекулярной массой около 36 кДа, 11-12 - фракции, содержащие одноцепочечное антитело. М - стандарт молекулярных масс.

Специфичность очищенных всПОб и зс10С2 подтверждали с помощью вестерн-блот анализа. Было показано, что оба одноцепочечных антитела (в концентрации 20 нг) выявляли рекомбинантный белок Е вируса КЭ. В качестве положительного контроля использовали исходные МКА 13Э6 и 10С2. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную неиммунную мышиную сыворотку (рис. 8).

кДа 65 "

45

26 " 18 ~

Рис. 8. Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ рекомбинантного белка Е вируса КЭ (1) и вестерн-блот анализ этого белка с использованием очищенных 8с1306 (2), всШСг (3), МКА 13Б6 (4), МКА 10С2 (5), а также нормальной мышиной сыворотки (6); М - стандарт молекулярных масс.

1 М 2 3 4 5 б

Конструирование химерных антител против вируса клещевого энцефалита

Химерные антитела (ch) против вируса КЭ конструировали на основе полученных Vh- и Уь-генов МКА 13D6 и МКА 10С2. Кроме того, исходным генетическим материалом для создания целевых антител послужили следующие плазмиды:

а) pBVK14a2 и pBVKl-б, кодирующие лидерные последовательности соответственно тяжелой и легкой цепей мышиного МКА FIO (Radko, 2002);

б) pClgGl, кодирующая константные домены Сц1-Сн2-СнЗ тяжелой цепи IgGl человека (Aliev, 2002);

в) рСкар, кодирующая каппа-домен легкой цепи IgG человека (Шингарова, 2007).

Плазмиды, кодирующие лидерные последовательности и константные домены,

были любезно предоставлены к.х.н. Шингаровой Л.Н., с.н.с. лаборатории инженерии белка ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (г. Москва).

Из имеющихся конструкций для каждого одноцепочечного антитела проводилась сборка двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых кодирует полипептид со свойствами тяжелой цепи, другая - со свойствами легкой цепи химерного антитела.

12

Совместная ко-трансфекция этими илазмидами клеток человека линии НЕК293Т обеспечивает синтез полипептида со свойствами химерного антитела класса IgGI.

Конструирование плазмидпой ДНК, кодирующей тяжелую цепь химерного антитела, проходило в несколько этапов:

На первом этапе с помощью ПЦР была получена лидерная последовательность иммуноглобулина мыши для объединения с Vn-фрагментом 13D6. В качестве матрицы для амплификации лидерной последовательности тяжелой цепи была использована плазмида pBVK14a2. Vn-фрагмент 13D6 был также получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pSC13D6. Продукты амплификации после элюции из ПЦР смеси использовали в качестве матриц на второй стадии ПЦР в присутствии соответствующих праймеров. Полученный объединенный фрагмент ДНК размером около 465 п.н., содержал последовательности генов, кодирующие лидерную последовательность и вариабельный домен тяжелой цепи scl3D6. После элюции из ПЦР-смеси фрагмент обрабатывали рестриктазами Nhel и Apäl и повторно элюировали из агарозного геля для последующего лигирования.

На втором этапе был получен фрагмент ДНК размером около 800 п.н, кодирующий константные домены Сц1-Сн2-СцЗ тяжелой цепи IgGI человека. Этот фрагмент получали путем обработки плазмидной ДНК pCIgGl, содержащей данный ген, эндонуклеазами рестрикции Apal и Xho\.

На заключительном этапе полученные фрагменты ДНК встраивали в экспрессионную плазмиду pcDNA3.1(+), предварительно обработанную рестриктазами Nhel и Xhol. Скрининг клонов, после трансформации клеток Е. coli XLlBlue лигазной смесью, проводили ПЦР-анализом. В результате была получена рекомбинантная плазмида pD6H, кодирующая тяжелую цепь chl3D6 против вируса КЭ (рис. 9 а). Аналогичным образом была получена плазмида рС2Н, кодирующая тяжелую цепь chl0C2 против вируса КЭ. Правильность встраивания ДНК-фрагментов подтверждали секвенированием.

Конструирование плазмидной ДНК, кодирующей легкую цепь химерного антитела:

На первом этапе с помощью ПЦР была получена лидерная последовательность иммуноглобулина мыши для объединения с Vi,-фрагментом 13D6. В качестве матрицы для амплификации лидерной последовательности легкой цепи бьша использована плазмида pBVKl-б. Уь-фрагмент 13D6 был также получен с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pSC13D6. Продукты амплификации после элюции из ПЦР смеси использовали в качестве матриц на второй стадии ПЦР в присутствии соответствующих праймеров. Полученный объединенный фрагмент ДНК

13

размером около 390 п.н., содержал последовательности генов, кодирующих лидерную последовательность и вариабельный домен легкой цепи вЫЗБб. После элюции из ПЦР смеси фрагмент обрабатывали рестриктазами Ше\ и ХтаЛ и повторно элюировали из агарозного геля для последующего лигирования.

На втором этапе был получен фрагмент ДНК размером около 400 п.н, кодирующий каппа-домен иммуноглобулина человека. Этот фрагмент получали путем обработки плазмидной ДНК рСкар, содержащей данный ген, эндонуклеазами рестрикции ХтаЛ и

На заключительном этапе полученные фрагменты ДНК встраивали в экспрессионную плазмиду рс!ЖА3.1(+), предварительно обработанную рестриктазами Ше1 и ХЬо\. Скрининг клонов, после трансформации клеток Е. соИ ХЫВ1ие лигазной смесью, проводили ПЦР-анализом. В результате была получена рекомбинантная плазмида рБ6Ь, кодирующая легкую цепь сЫЗБб против вируса КЭ (рис. 9 б). Аналогичным образом была получена плазмида рС2Ь, кодирующая легкую цепь сЫ0С2 против вируса КЭ. Правильность встраивания ДНК-фрагментов подтверждали секвенированием.

Рис. 9. Схема строения рекомбинантных плазмид, кодирующих тяжелые (а) и легкие (б) цепи химерных антител 13D6 и 10С2. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Pcmv -цитомегаловирусный промотор; RBS - сайт связывания рибосомы; Ampicillin - ген устойчивости к ампициллину; Neomycin - ген устойчивости к неомицину.

Xhol.

rbs

RBS

Экспрессия генов химерных антител в клетках НЕК 293Т

Для экспрессии генов химерных антител против вируса КЭ использовали клетки линии НЕК293Т (клетки почек человека). Известно, что эта линия клеток трансформирована вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации и обладает способностью экспрессировать вирусный Т-антиген. Поэтому при трансфекции клеток экспрессионной плазмидой, содержащей область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эндогенным Т-антигеном, что сопровождается внехромосомной репликацией плазмиды с образованием большого числа ее копий в цитоплазме клеток. Подбор времени культивирования трансфецированных клеток в нашем случае проводили с использованием плазмидных конструкций, кодирующих chlOC2. Для этого клетки линии НЕК293Т трансфецировали сконструированной парой плазмид рС2Н и pC2L, с использованием реагента "Липофектамин 2000". Аликвоты культуральной жидкости, отобранные после 5, 48, 72 и 96 часов инкубации до нанесения на аффинную колонку анализировали в твердофазном ИФА по связыванию с рекомбинантным белком Е вируса КЭ для анализа эффективности трансфекции и характера экспрессии антител в процессе культивирования трансфецированных клеток.

Анализ результатов твердофазного ИФА показал, что при использовании реагента для трансфекции "Липофектамин 2000" специфическая активность рекомбинантного продукта выявлялась через 48 часов культивирования и сохранялась практически на одном уровне с незначительным понижением к 96 часам культивирования. Фракции, продемонстрировавшие специфическую активность, объединяли и из суммарной культуральной жидкости выделяли химерное антитело.

Выделение химерного антитела chl0C2 из культуральной жидкости проводили методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein A Sepharose 4 Fast Flow.

В результате из 150 мл культуральной жидкости было выделено 0,5 мг chlOC2. Фракции, содержащие химерное антитело, объединяли и диализовали против буфера ФСБР. Уровень продукции для chlOC2 составлял 3,4 мг/л. Очищенное и диализованное антитело характеризовали с помощью электрофореза в 12% ДСН-ПААГ в присутствии и отсутствии 2-меркаптоэтанола. Результаты электрофореза демонстрировали наличие бэндов, по подвижности соответствующих природным иммуноглобулинам класса G (рис. 10).

Химерное антитело chl3D6 получали аналогичным образом. Из 150 мл культуральной жидкости было выделено 0,85 мг chl3D6. Уровень продукции для chl3D6 составил 5,7 мг/л.

Полноразмерная

форма химерных антител

М 1 2 3 4 М

Рис. 10. Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ очищенных сЫЗБб и сЬ10С2. Дорожки: 1,2 - сЫЗБб и сЬ10С2, обработанные 2-меркаптоэтанолом при температуре 95°С, 3,4 -сЫЗОб и сЫ0С2, не обработанные 2-меркаптоэтанолом (температура 37°С); М -стандарты молекулярных масс.

Специфичность очищенных сЫЗБб и сИ10С2 подтверждали с помощью вестерн-блот анализа. Было показано, что оба химерных антитела (в концентрации 20 нг) выявляли рекомбинантный белок Е вируса КЭ. В качестве положительного контроля использовали исходные МКА 13Б6 и 10С2. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную неиммунную мышиную сыворотку (рис. 11).

кДа

65

«■«Км»'»*

Рис. 11. Электрофореграмма в 12% ДСН-ПААГ рекомбинантного белка Е вируса КЭ (1) и вестерн-блот анализ этого белка с использованием очищенных сЫЗБб (2), сЬ10С2 (3), МКА 1306 (4), МКА 10С2 (5), а также нормальной мышиной сыворотки (6); М - стандарт молекулярных масс.

1 М 2 3 4 5 б

Определение констант аффинности рекомбинантных антител

На следующем этапе были определены константы аффинности полученных одноцепочечных и химерных антител. Константы аффинности определяли с помощью методов ИФА. В случае с одноцепочечными антителами были определены константы для двух типов равновесия: образования комплексов антиген-антитело в растворе, а также на поверхности полистирола. В первом случае константа аффинности характеризует взаимодействие с антигеном, циркулирующем в организме. Вторая система имитирует процесс связывания антитела с антигеном, экспонированным на поверхности клеточной мембраны. Вследствие возможных конформационых изменений, а также некоторых поверхностных эффектов, константа гетерофазного равновесия может существенно отличаться от константы равновесия в растворе.

Константу равновесия в растворе определяли согласно методике, описанной ранее (Рп§ие1, 1985), с незначительными модификациями. В частности для вычисления константы диссоциации проводили нелинейную регрессию результатов эксперимента с использованием следующей зависимости:

где OD405 - оптическая плотность раствора в лунке планшета, Ао - суммарная концентрация антитела в растворе (на стадии первоначальной инкубации), Во - суммарная концентрация белка Е, Kd - константа равновесия диссоциации комплекса антиген-антитело в растворе, N — нормировочный множитель, который определяется параметрами эксперимента и не зависит от концентрации антител. Регрессию осуществляли с использованием математического пакета Origin® 7.0. График зависимости значения оптической плотности раствора от концентрации антитела приведен на рис. 12 а. Константы аффинности для scl3D6 и sclOC2 составили (3,0 ± 0,2) х 107 М"1 и (1,2 ± 0,3) х 107 М"1, соответственно.

В случае связывания антитела с антигеном, сорбированным на поверхности, константу равновесия определяли согласно методике (Beatty, 1987). Для регрессии экспериментальных данных использовали следующую зависимость оптической плотности раствора от концентрации антител:

OD4m (B0) = N-[Ao-B0-Ki,+ 4(А0+В0+К,У,

\

/

где OD405 - оптическая плотность раствора в лунке планшета, Ао - суммарная концентрация антитела в растворе, bo - общее количество белка Е, сорбированного на поверхности, К d - константа равновесия диссоциации комплекса антиген-антитело на поверхности, V - объем раствора в лунке, N - нормировочный множитель. Регрессию осуществляли с использованием математического пакета Origin® 7.0. График зависимости значения оптической плотности раствора от концентрации антитела приведен на рис. 12 б. Константы аффинности для scl3D6 и sclOC2 составили (2,8 ± 0,3) х 107 М"1 и (8,1 ± 0,3) х 106 М"1, соответственно.

Полученные значения констант свидетельствовали о том, что аффинность scl3D6 и sclOC2 остается приблизительно такой же вне зависимости от того, находится антиген на поверхности или в растворе. Видимо, конформация рекомбинантного белка Е в этих экспериментах не претерпевала существенных изменений.

Одновременно с определением констант аффинности одноцепочечных антител были определены константы гетерофазного равновесия химерных антител и исходных МКА. Константы равновесия для химерных и моноклональных антител определяли согласно методике (Beatty, 1987). Графики зависимости значения оптической плотности раствора от концентрации антитела приведены на рис. 13. Константы аффинности для chl3D6 и chlOC2 составили (7,3 ± 0,2) * 107 М"1 и (2,8 ± 0,2) х ю7 М"1, а для МКА 13D6 и МКА 10С2 - (3,8 ± 0,2) х 107 М"1 и (1,4 ± 0,2) х 107 М"1, соответственно.

»81336*^*12 810 3). 19. W *cioc2K^i.e.tiOJbi£:f.M'

Концентрация антител, М

Концентрация антител, М

Рис. 12. Иммуноферментный анализ взаимодействия очищенных БсИБб и бсЮС2 с рекомбинантным белком Е вируса КЭ в растворе (а) и на поверхности (б); проявление антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1/1000.

Концентрация антитела, М Концентрация антител, М

Рис. 13. Иммунофермеитный анализ взаимодействия очищенных chl3D6 и chlOC2 (а), а также МКА 13D6 и МКА10С2 (б) с рекомбинантным белком Е вируса КЭ на поверхности; проявление антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1/1000.

Полученные значения констант связывания (табл. 1) одноцепочечных, химерных, а также исходных моноклональных антител свидетельствуют о незначительной разнице в аффинности между одноцепочечными и полноразмерными химерными и моноклональными антителами. Следует сказать, что обычно разница в аффинности между одноцепочечными антителами и полноразмерными антителами составляет 1-2 порядка. Так, в работе Gould с соавторами (2005) было показано, что одноцепочечные антитела scFv 79 и scFv 95 против вируса Западного Нила обладали константами аффинности 1,8 х 108 М1 и 3,2 х 108 М"1, соответственно, а сконструированные на их основе полноразмерные антитела формата scFv-Fc имели константы связывания 7,3 х Ю10 М'1 и 2,9 х 10'° М"1, соответственно.

Таблица 1. Константы аффинности МКА и рекомбинантных антител, измеренные с помощью методов ИФА.

МКА (на поверхности) sc (в растворе) sc (на поверхности) ch (на поверхности)

13D6 3,8 х Ю7 М"1 3,0 х ю7М"' 2,8 х ю7 М"1 7,3 х 107 М'1

10С2 1,4 х Ю7М"' 1,2 х 107М"' 8,1 х Ю6М"' 2,8 х Ю7М"'

Подобное отличие в аффинности отметили также Оопса1уе2 с соавторами (2008). В этой

работе константы связывания моновалентных РаЬ-фрагментов против вируса японского

19

энцефалита на 2 порядка отличались от констант связывания гуманизированных антител, созданных на их основе. Однако следует сказать и о том, что имеются работы, в которых разницы между константами связывания моновалентных и полноразмерных антител практически не наблюдалось. Так, в работе Николенко с соавторами (1999) было показано, что рекомбинантное одноцепочечное антитело scFv Е6В и исходное МКА Е6В против вируса КЭ имели константы связывания 1,1 х 108 М"1 и 5,5 * 108 М"1, соответственно, а в работе Itoh с соавторами (2001) рекомбинантный моновалентный Fab-фрагмент против онкомаркера CD98 обладал аффинностью, схожей с аффинностью исходного моноклонального антитела. Авторы последней работы объясняют подобную схожесть тем, что исходное МКА взаимодействовало с CD98 одним сайтом связывания. Видимо, в нашем случае незначительная разница в константах между одноцепочечными и полноразмерными антителами связана с тем, что полноразмерные антитела используют для связывания гликопротеина Е вируса КЭ один антигенсвязывающий сайт.

Как предполагают некоторые исследователи валентность антитела зависит, в первую очередь, от природы молекулы иммуноглобулина. Показано, что способность антитела связываться с антигеном двумя центрами связывания зависит от гибкости его шарнирного участка, который, прежде всего, определяется изотипом антитела. Кроме того, немаловажное значение при связывании имеет расстояние между эпитопами на поверхности молекулы антигена (Reading, 2007).

Измеренные значения констант аффинности свидетельствуют также о том, что константы связывания исходных МКА и химерных антител различаются примерно в два раза. Следует сказать, что обычно химерные антитела, содержащие константные домены того же изотипа, что и исходные МКА, демонстрируют аффинность схожую с аффинностью исходных моноклональных антител (Morelock, 1994). Однако в нашем случае константы связывания химерных антител были выше констант связывания исходных МКА. Подобные результаты были получены в работе Knight с соавторами (1993), где было показано, что константа аффинности сконструированного химерного антитела А2 против TNF-a в 1,5 раза превышала константу связывания исходного МКА того же изотипа. Авторы работы полагали, что некоторое увеличение аффинности в данном случае могло произойти вследствие изменения конформации антигенсвязывающих сайтов в молекуле химерного антитела. Причиной этого изменения, по мнению авторов статьи, может быть замена мышиных константных доменов человеческими. По всей видимости, в нашем случае замена мышиных константных доменов на человеческие аналогичным образом повлияла на антигенсвязывающие свойства химерных антител путем некоторой стабилизации структуры

20

антигенсвязывающих сайтов. При этом и мышиные, и человеческие константные домены принадлежали к 1§С1 подклассу антител.

Исследование вируснейтрализующих свойств рекомбинантных антител

На заключительном этапе работы, полученные химерные, одноцепочечные, а также исходные моноклональные антитела против вируса КЭ были протестированы в реакции ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток (сто Е6 (рис. 14), а также в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ (рис. 15). Результаты этих экспериментов показали, что рекомбинантные антитела 5с13Эб и сЫЗОб, сконструированные на основе МКА 1306, как и прототипное антитело, способны ингибировать и образование фокусов, и образование бляшек вирусом КЭ на монослое эукариотических клеток. Антитела 8с10С2, сЬ10С2 и МКА 10С2 не обладали способностью ингибировать инфекционность вируса КЭ на монослое эукариотических клеток. Для вируснейтрализующих антител были определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционное™ (1С50) (табл. 2).

-■C13DS

5,е п.: 22. Концентрация а

1.5625 3.125 6.25 12.5

Концентрация антител, мкг/ып

50 ICO

Концентрация антител, мкг/мл

Рис. 14. Нейтрализация вируса КЭ одноцепочечным антителом scl3D6 (а), химерным антителом chl3D6 (б) и моноклональным антителом МКА 13D6 (в) в реакции ингибирования фокусообразования на монослое перевиваемых клеток Vero Е6.

—I—,—,—,—I—,—I—,—,—I—1—'—I—I—I—.—I—

0.39 O/'E 1.56 3.1 6,2 12.5 25 50 ICO Концентрации антител, мкг/мл

Рис. 15. Нейтрализация вируса КЭ одиоцепочечиым антителом 5с13Б6 (а), химерным антителом сЫЗЭб (б) и моноклональным антителом МКА 13Б6 (в) в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое перевиваемых клеток СПЭВ.

Таблица 2. Концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционное™ МКА 1ЗР6 и его рекомбинантных аналогов.

МКА 13D6 chl3D6 scl3D6

1С50 (фокусы) 11,5 мкг/мл 4,5 мкг/мл 16,7 мкг/мл

1С50 (бляшки) 2,9 мкг/мл 1,9 мкг/мл 11,2 мкг/мл

Рассчитанные значения 1С;о, позволили нам сравнить их с уже известными значениями для рекомбинантных и моноклональных антител. Показано, например, что значение 1С50 для высоконейтрализующего антитела 5сРу-Рс-9Е2 против вируса Западного

22

Нила равняется 0,0825 мкг/мл (Pereboev, 2008), а значение IC50 для МКА 2Н2 против вируса Японского энцефалита составляет 0,195 мкг/мл (Wu, 2004). Что касается моновалентных аналогов этих антител, то их значения концентраций 50% ингибирования вирусной инфекционное™ уступали 1-2 порядка. Рассчитанные нами значения IC50 для исследуемых антител свидетельствуют о незначительной разнице в биологической активности между полноразмерными и одноцепочечными антителами. В нашем случае значения IC50 полноразмерных антител всего лишь в 3-4 раза отличались от значения IC50 для одноцепочечного антитела. Столь несущественная разница связана с тем, что chl3D6 и МКА 13D6 вероятно являются моновалентными антителами.

Следует также отметить, что химерное антитело chl3D6 продемонстрировало более высокую нейтрализующую активность на монослое эукариотических клеток Vera Е6 и СПЭВ по сравнению с исходным МКА. Подобные результаты описаны для химерного антитела А2, нейтрализовавшего TNF-a в культуре эукариотических клеток при более низком значении IC50 по сравнению с исходным моноклональным антителом (Knight, 1993). По всей видимости, в обоих этих случаях изменение биологической активности химерных антител связано с теми конформационными изменениями в антигенсвязывающих сайтах, которые могли произойти при замене мышиных константных доменов человеческими.

Таким образом, в ходе проделанной работы были получены одноцепочечные антитела в растворимой форме против вируса КЭ. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. Исследовано связывание одноцепочечных антител с вирусом КЭ и рекомбинантным белком Е вируса КЭ в ИФА и вестерн-блот анализе, соответственно. Определены константы аффинности одноцепочечных антител для равновесия в растворе и на поверхности. Показано, что scl3D6 способно ингибировать инфекционность вируса КЭ на монослое эукариотических клеток Vera Е6 и СПЭВ. Определена концентрация 50% ингибирования вирусной инфекционности для SC13D6. На основе охарактеризованных одноцепочечных антител были сконструированы химерные антитела, способные взаимодействовать с рекомбинантным белком Е вируса КЭ в ИФА и вестерн-блот анализе. Определены константы аффинности полученных химерных антител. Показано, что химерное антитело chl3D6 способно ингибировать инфекционность вируса КЭ на монослое эукариотических клеток Vera Е6 и СПЭВ. Определена концентрация 50% ингибирования вирусной инфекционное™ для chl3D6. На основе полученных результатов о нейтрализующих способностях одноцепочечных, химерных и моноклональных антител были предложены возможные механизмы нейтрализации вирусной инфекционное™ этими антителами.

23

выводы

1. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности Vh- и Vi.-доменов мышиных МКА 13D6 и 10С2, направленных к гликопротеину Е вируса КЭ, и показано, что Vh-сегменты МКА 13D6 и 10С2 принадлежат к семействам VHJ558.45 и VHJ558.47 тяжелых цепей антител мыши, входящим в состав III группы, а VI-сегменты принадлежат к III группе к-цепей.

2. На основе VH- и Vi -генов МКА I3D6 и 10С2 сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела scl3D6 и sclOC2 против вируса КЭ. Получены штаммы-продуценты этих одноцепочечных антител. Показано, что константы аффинности одноцепочечных антител scl3D6 и sclOC2 составили 3,0 х ю7м-' и 1,2 х ю7 М"1 для равновесия в растворе, а в случае образования комплексов антиген-антитело на поверхности - 2,8 х 107М"' и 8,1 х Ю6 М"1, соответственно.

3. На основе Vh- и Vi.-генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы пары рекомбинантных плазмидных ДНК pD6H и pD6L, а также рС2Н и pC2L, обеспечивающих при совместном введении в клетки НЕК293Т синтез химерных антител chl3D6 и chl0C2, специфично взаимодействующих с рекомбинантным белком Е вируса КЭ. Константы аффинности chl3D6 и chlOC2 составили 7,3 х 107 М"1 и 2,8 х ю7 М1, соответственно.

4. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 обладают способностью нейтрализовать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для этих антител в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero Е6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ, которые составили 16,7 мкг/мл и 11,2 мкг/мл для одноцепочечного антитела scl3D6 и 4,5 мкг/мл и 1,9 мкг/мл для химерного антитела chl3D6, соответственно.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. Леванов Л.Н., Матвеев Л.Э., Юн Т.Э., Лебедев Л.Р., Швалов АН., Банков И.К., Матвеева В.А., Рихтер В.А., Тикунова Н.В. Одноцепочечное антитело против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т.82. - №7. - С. 38-43.

2. Леванов Л.Н., Тикунова Н.В., Матвеев Л.Э., Гончарова Е.П., Юн Т.Э., Рыжиков А.Б., Матвеева В.А., Рихтер В.А. // Рекомбинантная плазмидная ДНК pSC13D6, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pSC13D6 - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, обладающих вируснейтрализующими свойствами. Заявка на патент. Справка о приоритете № 2008115680 от 21.04.2008.

3. Леванов Л.Н., Матвеев Л.Э., Юн Т.Э., Гончарова Е.П., Лебедев Л.Р., Швалов А Н., Рыжиков А.Б., Байков И.К., Матвеева В.А., Рихтер В.А., Тикунова НВ. Нейтрализующее одноцепочечное антитело против вируса клещевого энцефалита // Биоорганическая химия. - 2009. - Т.35. - С. 524-532.

4. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun Т.Е., Tikunova N.V. Generation of chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus. The 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "The interface between Immunology and Medicine". September 5-9, 2005, Moscow, Russia, p. 27.

5. Леванов Л.Н., Юн Т.Э., Тикунова Н.В. Получение одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. III Российская научная конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера". 27-29 сентября, 2006, Новосибирск, Россия, с. 196.

6. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun Т.Е., Tikunova N.V. Generation and characterization of chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus. The 8th International PhD Student Symposium "Biology of Disease - A Molecular Battlefield". November 30 -December 2, 2006, Heidelberg, Germany, p. 62.

7. Леванов Л.Н., Матвеев Л.Э., Юн Т.Э., Тикунова Н.В. Получение одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Материалы 11т Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. 28-31 мая, 2007, Санкт-Петербург, Россия, с. 149-150.

8. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Generation and characterization of scFv-antibodies against tick-borne encephalitis virus. The 8,h John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "Immunology and Viral Infection". September 10-15, 2007, Moscow, Russia, p. 32.

9. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Generation of chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus. The first international summer school 2008 "Pathogen-Host Interplay". July 20-27, 2008, Berlin-Potsdam, Germany, p. 76.

10. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Construction and characterization of recombinant antibodies against tick-borne encephalitis virus. International Life Sciences Students' Conference. September 10-14, 2008, Warsaw, Poland, p. 19.

11. Levanov L.N., Matveev L.E., Yun T.E., Tikunova N.V. Construction and characterization of recombinant antibodies against tick-borne encephalitis virus. 34th FEBS Congress "Life's Molecular Interactions". July 4-9, 2009, Prague, Czech Republic, p. 375.

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г. Новосибирск, пр. К. Маркса,20, тел./факс (383) 346-08-57, ngtu@ngs.ru формат 60 х 84/16, объем 1.75 п.л., тираж 100 экз. заказ № 339 подписано в печать 22.07.09г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леванов, Лев Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирус клещевого энцефалита.

1.1.1. Таксономия и строение вируса.

1.1.2. Строение и свойства структурных белков вируса КЭ.

1.1.3. Строение н свойства неструктурных белков вируса КЭ.

1.1.4. Жизненный цикл вируса клещевого энцефалита.

1.1.5. Профилактика клещевого энцефалита.

1.2. Структура и свойства антител.

1.2.1. Общий план строения антител.

1.2.2. Инженерия антител.

1.2.3. Механизмы нейтрализации вирусной инфекционпостн антителами.

1.2.4. Механизмы нейтрализации флавивирусной инфекционности антителами.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Растворы.

2.1.3. Ферменты.

2.1.4. Культу рал ьные среды.

2.1.5. Эукариотические клетки и бактерии.

2.1.6. Вирусы и рекомбинантные белки.

2.1.7. Плазмиды.

2.1.8. Используемые олигонуклеотиды.

2.2. МЕТОДЫ.

2.2.1. Выделение суммарной РНК из гибридомных клеток.

2.2.2. Синтез кДНК и амплификация генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов мыши.

2.2.3. Ферментативный гидролиз ДНК.

2.2.4. Элюция фрагментов ДНК.

2.2.5. Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду.

2.2.6. Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов мыши.

2.2.7. Электрофоретическое фракционирование ДНК.

2.2.8. Трансформация клеток Е. coli плазмндной ДНК.

2.2.9. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

2.2.10. Приготовление субклеточных фракций Е. coli.

2.2.11. Очистка одноцепочечных антител.

2.2.12. Трансфекция эукариотических клеток илазмидными ДНК.

2.2.13. Очистка химерных антител с помощью аффинной хроматографии.

2.2.14. Электрофоретический анализ белков.

2.2.15. Вестерн-блот анализ.

2.2.16. Иммуноферментный анализ.

2.2.17. Определение констант аффинности одноцепочечных антител в растворе.

2.2.18. Определение гетерофазных констант аффинности одноцепочечных, мопоклонпльных и химерных антител.

2.2.19. Исследование вируснейтрализующей активности рекомбинантных антител против вируса КЭ в реакции ингибировання фокусообразования на монослос эукариотических клеток Veto Е6.

2.2.20. Исследование вируснейтрализующей активности рекомбинантных антител против вируса КЭ в реакции ингибнрования бляшкообразования на монослое эукарпотнческих клеток СПЭВ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Получение генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей моноклональных антител 13D6 и 10С2.

3.2. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих одноцепочечные антитела против вируса клещевого энцефалита

3.3. Экспрессия генов одноцепочечных антител в клетках Е. coli.

3.4. Оценка специфичности одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов.

3.5. Очистка одноцепочечных антител.

3.6. Определение констант аффинности scl3D6 и sclOC2.

3.7. Исследование вируснейтрализующих свойств одноцепочечных антител.

3.8. Конструирование химерных антител против вируса клещевого энцефалита.

3.9. Экспрессия генов химерных антител в клетках НЕК 293Т.

3.10. Исследование иммунохимических свойств полученных химерных антител.

3.11. Исследование вируснейтрализующих свойств химерных антител.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вируснейтрализующие рекомбинантные антитела против вируса клещевого энцефалита"

В 1975 году была описана методика, позволяющая получать гибридомные клеточные линии, секретирующие моноклональные антитела (МКА) с желаемой антигенной специфичностью. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии. Созданы десятки тысяч высокоаффинпых антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также с низкомолекулярньши антигенами. На их основе получены конъюгаты с различными функциональными соединениями -токсинами, ферментами, а также магнитными частицами, радиоактивными и рсптгеноконтрастными атомами. Такие конъюгаты находят широкое применение в научных исследованиях, медицине, ветеринарии. Описаны примеры получения с помощью указанной технологии антител, обладающих каталитической активностью, так называемых абзимов (Maynard, 2000; Kipriyanov, 2004). Однако все упомянутые выше антитела и их производные широко используются, в основном для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии ограничивается тем, что с помощью гибридомной технологии удается получать, главным образом, молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их связыванию и нейтрализации (Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006). Создание человеческих гибридом затрудняется из-за сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломпых клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильное™ образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммупогенности мышиных МКА путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. Для решения этой проблемы были разработаны подходы, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов антител мыши с константными доменами человеческих аитител, «гуманизация» путем замены гипервариабельных районов в молекуле антитела человека па аналогичные участки из мышиного антитела, получение полноразмерных антител человека с помощью трансгенных мышей и технологии фагового дисплея.

В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинапгпых антител, одобренных и разрешенных FDA для терапевтических целен, подавляющее количество антител являются химерными.

На сегодняшний день в клинике используются следующие препараты химерных антител: abciximab (ReoproR: Fab anti-GpIIb/IIIa, Centocor/Eli Lilly) -для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, Rituximab (RitxanR: IgGl anti-CD20, Biogen-IDEC) - для лечения больных неходжкинскими лнмфомами, infliximab (RemicadeR: IgGl anti-TNF-a, Centocor) - для лечения ревматоидных артритов и болезни Крона, Basiliximab (SimulectR: IgGl anti-CD25, Novartis) - в трансплантологии при отторжении трансплантата, Cetuximab (ErbituxR: IgGl anti-EGRF, ImClone) - для лечения рака прямой кишки (Gavilondo, 2000; Laffly, 2005; Gonzales, 2005; Hwang, 2005; Presta, 2006).

Кроме того, значительное количество химерных антител находится на стадии клинических испытаний: С225 (IgGl anti-EGRF-рецептор, ImClone Systems) - для лечения раковых заболеваний, ChTNT-l/b (IgGl anti-CD20, Techniclone Int.) - для лечения больных неходжкинскими лимфомами, CaroRXTM (IgA anti-Strepococcus mutans, Planet Biotechnology) - для профилактики кариеса (Gavilondo. 2000; Laffly. 2006).

К настоящему времени получены химерные антитела против ряда вирусных патогенов: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (Major, 1994), вируса гепатита В (Preston, 1998; Bose, 2006), С (Law, 2008) и Е (Luo, 2007), вируса Varicella-Zoster (Shankar, 2005). Показано, что химерные антитела могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов (Shankar. 2005; Bose, 2006; Luo, 2007).

Одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов на территории Российской Федерации является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать серьезные поражения нервной системы. Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболеваемос i и (Локтев, 2007). Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гамма-глобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать вируснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ.

Целью данной работы являлось получение вируснеГп рализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• клонирован^ гены, кодирующие вариабельные домепы тяжелых (Vh) и легких (VL) цепей МКА 13D6 и 10С2 против вируса КЭ и определить их нуклеотидные последовательности;

• сконструировать на основе полученных VH- и VL-reHOB рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие химерные и одноцепочечные антитела против вируса КЭ;

• исследовать иммунохпмические свойства полученных химерных и одноцепочечных антител;

• исследовать вируснейтрализующие свойства полученных рекомбинантных антител.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настоящей работе впервые скопсгруированы рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие продукцию вируснейтрализующих химерных и одноцепочечных антител прошв вируса клещевого энцефалита в эукариотпческих клетках и в клетках Е. соН,- соответственно. Определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности этих антител. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 способны ингибировать инфекционность вируса КЭ в культуре эукариотических клегок. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для одноцепочечного и химерного антител scl3D6 и chl3D6 в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero Е6 ив реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ. Исследованы иммунохимическпе свойства одноцепочечных и химерных антител. С помощью методов иммуноферментного анализа определены константы аффинности полученных рекомбинантных одноцепочечных и химерных антител.

В ходе данной работы впервые были получены химерные антитела против вируса клещевого энцефалита, обладающие вируснейтрализующими свойствами. Полученные антитела после проверки их терапевтических свойств могли бы стать основой для разработки препарата для лечения клещевого энцефалита.

Получен стабильный штамм-продуцент растворимых вируснейтрализующих одноцепочечных антител против вируса КЭ. который задепоннрован в коллекции микроорганизмов ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора.

Апробация работы и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 8 Международных конференциях: 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "'The interface between Immunology and Medicine" (Москва, Россия, 2005). 8th International EMBL PhD Student Symposium "Biology of Disease A Molecular Battlefield" (Гейдельберг, Германия, 2006), 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology "Immunology and viral infection" (Москва, Россия, 2007), 1st International Summer School 2008 "Pathogen-Host Interplay" (Берлин-Погсдам, Германия, 2008), International Life Sciences Students" Conference (Варшава, Польша, 2008), FEBS Practical Course "Structural variations in genome, gene expression, single cell analysis: arrays, beads, high-throughput sequencing" (Прага, Чехия, 2008), the 13lh CIMO Winter School "Biomolecules in health and disease" (Хельсинки, Финляндия,

2009), 34th FEBS Congress "Life's Molecular Interactions" (Прага, Чехия, 2009); и одной Российской конференции - III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск. Россия, 2006).

Вклад автора.

Большинство экспериментов, а также анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением тестирования антител на наличие вируснейтрализующей активности, которое проводилось к.б.н. Ь.П. Гончаровой и к.б.н. А.Б. Рыжиковым в лаборатории молекулярной иммунологии ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор'" Роспотребнадзора, руководитель к.б.н. А.Б. Рыжиков. Эксперименты по очистке одноцепочечных антител проводились совместно с сотрудником института Медицинской Биотехнологии (Филиал ФГУН Г11Ц ВБ "Вектор") к.б.н. JI.P. Лебедевым. Секвенирование генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей моноклональных антител, проводили сотрудники отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФГУН Г11Ц ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (к.б.н. А.В. Качко и И.В. Гаврилова).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Леванов, Лев Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Определены нуклеотндные и выведены аминокислотные последовательности VH- и V| -доменов мышиных МКА 13D6 и 10С2, направленных к гликопрогеину Е вируса КЭ, и показано, что Vh-сегменты МКА 13D6 и 10С2 принадлежат к семействам VHJ558.45 и VHJ558.47 тяжелых цепей антител мыши, входящим в состав III группы, а Vl-сегмепты принадлежат к III группе к-цепей.

2. На основе Уи- и У^генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела scl3D6 и scl0C2 против вируса КЭ. Получены штаммы-продуцепты этих одноцепочечных антител. Показано, что константы аффинности одноцепочечных антител scl3D6 и sclOC2 составили 3,0 х 107 М"1 п 1,2 х 10' М" для равновесия в растворе, а в случае образования комплексов антиген-антитело

7 16 1 на поверхности- 2,8 * 10 М" и 8,1 х 10 М" , соответственно.

3. На основе Ун- и У^генов МКА 13D6 и 10С2 сконструированы пары рекомбинантных плазмидных ДНК pD6H и pD6L, а также рС2Н и pC2L, обеспечивающих при совместном введении в клетки НЕК293Т синтез химерных антител chl3D6 и chlOC2. специфично взаимодействующих с рекомбинантным белком Е вируса КЭ. Константы аффинности chl3D6 и chlOC2 составили 7,3 х 107 М"1 и 2,8 х Ю7 М"1, соответственно.

4. Показано, что одноцепочечное антитело scl3D6 и химерное антитело chl3D6 обладают способностью нейтрализовать инфекционпость вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации 50% ингибирования вирусной инфекционности для этих антител в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клеток Vero Е6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на мопослое эукариотических клеток СПЭВ, которые составили 16,7 мкг/мл и 11,2 мкг/мл для одноцепочечного антитела scl3D6 и 4,5 мкг/мл и 1.9 мкг/мл для химерного антитела chl3D6, соответственно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леванов, Лев Николаевич, Кольцово

1. Байков И.К. Матвеев Л.Э., Леванов Л.Н., Тикунова Н.В. Одпоцепочечное антитело scl4D5 против белка Е вируса клещевого энцефалита // Вестник НГУ. 2009. (принята в печать).

2. Батанова Т.А. Создание неиммуной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и получение из этой библиотеки антител против фактора некроза опухоли альфа: Автореф. диссертации кандидата биологических наук. Новосибирск, 2005.

3. Беспалов И.А., Шиянов Г1.А., Лукашевич Л.В. Получение одноцепочечных антител к ферригину человека в клетках Escherichia coli // Молекулярная биология. 1993. - №27. - С. 451-460.

4. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: РИЦ МКД, 2000.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002.

6. Добрикова Е.Ю., Плетнев А.Г. Полноразмерная ДНК-копия генома вируса клещевого энцефалита // Биоорганическая химия. 1995. - Т. 21. - №7. -С. 528-534.

7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.

8. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики // Вопросы вирусологии. — 2005. -№3.~ С. 26-32.

9. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Руководство для врачей. -Новосибирск, 2001.

10. Исаева М.П., Леонова Г.Н. Кожемяко В.Б. и др. Апоптоз как механизмцитопатического действия вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1998. - №4. - С. 182-186.

11. Локтев В.Б., Терновой В.А., Негесов С.В. Молекулярно-гснетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. -2007. №5.-С. 6-10.

12. Льюин Б. Гены. М.: Мир, 1987.

13. Мапиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

14. Оценка эпидемиологической опасности природных очагов флавивирусных инфекций / О.В. Морозова, Л.Э. Матвеев, В.Н. Бахвалова и др. // Тез. докл. X юбилейного международного форума "Высокие технологии XXI века". М., 2009. - С. 355-357.

15. Николенгсо Г. Н., Протопопова Е. В., Ильичев А. А., Коновалова С. П., Карпенко Л. И., Локтев В. Б., Порываева В. А., Тикунова Н. В. Рекомбинантные антитела к вирусу клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии.-2002.-Т. 47.-№5.-С. 31-36.

16. Николенко Г.Н. Создание рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита и изучение их свойств: диссертация кандидата биологических наук. — Новосибирск, 1999.

17. Пол У. Иммунология. М.: Мир, 1989.

18. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощиантиидиотипических анштел // Вопросы вирусологии. 1997. - Т. 42. -№6. - С. 264-268.

19. Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1996. - №2. - С. 50-53.

20. Ратникова Л.И., Тер-Багдасарян Л.В., Миронов И.Л. Современные представления о патогенезе клещевого энцефалита // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. - №5. - С. 41-45.

21. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000.

22. Скрипченко Н.В., Моргацкий Н.В., Аксенов О.А., Иванова Г.П., Тюленева Г.А., Караськова Н.Г., Иванова М.В., Карасев В.В. Новый подход к профилактике клещевого энцефалита у детей // Инфекционные болезни. 2005. - Т. 3. - №4. - С. 61-64.

23. Финни Д. Введение в теорию планирования экспериментов. М.: Мир, 1970.

24. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2002.

25. Allison S.L., Schalich J., Stiasny К., Mandl C.W., Kunz С., Heinz F.X. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH // J. Virol. 1995. - V. 69 (2). - P. 695-700.

26. Barbas C., Bjorling E., Chiodi F. Recombinant human Fab fragments neutralize human type 1 immunodeficiency virus in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 9339-9343.

27. Batra S.K., Jain M., Wittel U.A., Chauhan S.C. and Colcher D. Pharmacokinetics and biodistribution of genetically engineered antibodies // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 13. - P. 603-608.

28. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay // Journal of immunological methods.- 1987,-V. 100.-P. 173-179.

29. Berger M., Shankar V. and Vafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies // Am. J. Med. Sci. 2002. - V. 324. - P. 14-30.

30. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7 - P. 1513-1523.

31. Bird R.E. Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee Т., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. Single-chain antigen-binding proteins // Science. 1988. - V. 242. - P. 423-426.

32. Bobrovnik S.A. Determination of antibody affinity by ELISA. Theory // J. Biochem. Biophys. Methods. -2003. V. 57.-P. 213-236.

33. Bose В., Khanna N., Acharya S.K., Sinha S. Generation and characterization of a single-gene mouse-human chimeric antibody against hepatitis В surfacc antigen // J. Gastroenterol. Hepatol. 2006. - V. 21 (9). - P. 1439-1447.

34. Breedveld F.C. Therapeutic monoclonal antibodies // Lancet. 2000. - V. 355. -P. 735-740.

35. Bressanelli S., Stiasny K., Allison S.L. Stura E.A., Duquerroy S., Lescar J. Heinz F.X., Rey F.A. Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation // EMBO J. 2004. - V. 23 (4). -P. 728-38.

36. Brioen P., Rombaut В., Boeye A. Hit-and-run neutralization of poliovirus // J. Gen. Virol. 1985. - V. 66. - P. 2495-2499.

37. Burton D.R. Antibodies, viruses and vaccines // Nat. Rev. Immunol. 2002. — V. 2.-P. 706-713.

38. Burton D., Barbas C., Persson M. A large array of human monoclonal antibodies to type 1 human immunodeficiency virus from combinatorial of asymptomatic seropositive individuals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88.-P. 10134-10137.

39. Cheung S., Dietzscold В. Koprowski H. A recombinant human Fab expressed in E. coli neutralizes rabies virus // J .Virol. 1992. - V. 66. - P. 6714-6720.

40. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions //Nature. 1989. - V. 342. - P. 877-883.

41. Co M., Deschamps M., Whitley R. Queen C. Humanized antibodies for antiviral therapy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 28692873.

42. Crill W.D., Roehrig J.T. Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vero cells // J. Virol. 2001. - V. 75. - P. 7769-7773.

43. Davies A., Greene A., Lullau E. and Abbott W.M. Optimisation and evaluation of a high-throughput mammalian protein expression system // Protein Expr. Purif. 2005. - V. 42.-P. 111-121.

44. Davis C.G., Jia X.C., Feng X. and Haak-Frendscho M. Production of human antibodies from transgenic mice // Methods Mol. Biol. 2004. - V. 248. - P. 191-200.

45. Delaet I., Boeye A. Monoclonal antibodies that disrupt poliovirus only at fever temperatures //J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 5299-5302.

46. Fishwild D.M. Hudson D.V. Deshpande U. and Kung A.II. Differential effects of administration of a human anti-CD4 monoclonal antibody, HM6G, in nonhuman primates // Clin. Immunol. 1999. - V. 92. - P. 138-152.

47. Flamand A., Raux H., Gaudin Y., Ruigrok R.W. Mechanisms of rabies virus neutralization // Virology. 1993. - V. 194. - P. 302-313.

48. Foon K.A., Yang X.D., Weiner L.M., Belldegrun A.S., Figlin R.A., Crawford J., Rowinsky E.K., Dutcher J.P., Vogelzang N.J., Gollub J., Thompson J.A.,

49. Schwartz G., Bukowski R.M., Roskos L.K. and Schwab G.M. Preclinical and clinical evaluations of ABX-EGF, a fully human anti-epidermal growth factor receptor antibody // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004. - V. 58. - P. 984990.

50. Foote J. and Winter G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops // J. Mol. Biol. 1992. - V. 224. - P. 487-499.

51. Friguet В., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L. and Goldberg M.E. Measurements of the true affinity constants in solution of antigen-antibody compexes by enzyme-linked immunosorbent assay // Journal of immunological methods. 1985,-V. 77. - P. 305-319.

52. Galili U., Rachmilewitz E.A., Peleg A. and Flechner I. A unique natural human lgG antibody with anti-alpha-galactosyl specificity // J. Exp. Med. 1984. - V. 160. - P. 1519-1531.

53. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium // Biotechniques. -2000. V. 29(1).-P. 128-132, 134-136.

54. Gollins S.W., Porterlield J.S. A new mcchanism for the neutralization of enveloped viruses by antiviral antibody // Nature. 1986. - V. 321. - P. 244246.

55. Golomb M. Chamberlin M. Characterization of T7-specific ribonucleic acid polymerase. IV. Resolution of the major in vitro transcripts by gel electrophoresis // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249 (9). - P. 2858-2863.

56. Goncalvez A.P., Chien C.H., Tubthong K., Gorshkova I., et al. Humanized monoclonal antibodies derived from chimpanzee Fabs protect against Japanese encephalitis virus in vitro and in vivo //J. Virology. 2008. - V. 82 (14). - P. 7009-7021.

57. Gonzales N.R. Pascalis R., Syed J.S., Kashmiri V.S. Minimizing the immunogenicity of antibodies for clinical application // Tumour Biol. — 2005. -V. 26(1).-P. 31-43.

58. Green A.M., Armstrong S.J., DimmockN.J. Mechanisms of neutralization of a nairovirus (Dugbe virus) by polyclonal IgG and IgM // J. Gen. Virol. 1992. -V. 73.-P. 1195-2001.

59. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Research. 2003. - V. 57 (1-2). - P. 129-146.

60. Hardy S.A., Dimmock N.J. Valency of antibody binding to virions and determination by surface plasmon resonance // Rev. Med. Virol. 2004. - V. 14.-P. 123-135.

61. Heinz F.X., Mandl C.W. The molecular biology of tick-borne encephalitis virus // APMIS. 1993. - V. 101 (10).-P. 735-745.

62. Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Harris B.A., Rey F., Harrison S.C. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallozation // J. Virol. 1991. - V. 65 (10).-P. 5579-83.

63. Huston J.S., Tai M.S., McCartney J., Keck P., Oppermann H. Antigen recognition and targeted delivery by the single-chain Fv // Cell Biophys. -1993.-V. 22.-P. 189-224.

64. Hwang W.Y., Foote J. Immunogenieity of engineered antibodies // Methods. -2005. V. 36 (1). - P. 3-10.

65. Icenogle J., Shiwen H., Duke G., Gilbert S., Rueckert R., Anderegg J. Neutralization of poliovirus by a monoclonal antibody: kinetics and stoichiometry// Virology. 1983.- V. 127.-P. 412-425.

66. Itoh K., Inoue K., Hirooka K., ct al. Phage display cloning and characterization of monoclonal antibody genes and recombinant Fab fragment against the CD98 oncoprotein // Jpn. J. Cancer Res. 2001. - V. 92. - P. 1313-1321.

67. Jakobovits A. Production of fully human antibodies by transgenic mice // Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 561-566.

68. Jacobs S.C., Stephenson J.R., Wilkinson G.W. High-level expression of the tick-bome encephalitis virus NS1 protein by using an adenovirus-based vector: protection elicited in a murine model // J. Virol. 1992. - V. 66 (4). - P. 208695.

69. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., Gould E.A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses // Virology. -1994.-V. 200.-P. 21-28.

70. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics // Curr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 1.3 - P. 593-597.

71. Kettleborough C.A., Saldanha J., Heath V.J., Morrison C.T. and Bendig M.M. Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation // Protein Eng. 1991. -V. 4.-P. 773-783.

72. Kipriyanov S. M., Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies // Mol. Biotechnol. 2004. - V. 26 (1). - P. 39-60.

73. Klasse P.J., Sattentau Q.J. Occupancy and mechanism in antibody-mediated neutralization of animal viruses // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 20912108.

74. Knappik A., Ge L., Honegger A., Pack P., Fischer M., Wellnhofer G., Hoess

75. A., Wolle J., Pluckthun A. and Virnekas B. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and^CDRs randomized with trinucleotides // J. Mol. Biol. 2000. -V. 296.-P. 57-86.

76. Knight D. M., Trinh H., Le J., Siegel S., Shealy D., McDonough M., Scallon

77. B., Moore M.A., Vilcek J., Daddona P., et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody // Mol. Immunol. 1993,-V. 30 (16).-P. 1443-1453.

78. Konishi E., Mason P.W. Proper maturation of the Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembrane protein // J. Virol. 1993. - V. 67 (3). - P. 1672-5.

79. Kopecky J., Grubhoffer L., Kovar V., Jindrak L., Vokurkova D. A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinoblotting // Intervirology. 1999. - V. 42. - P. 9-16.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

81. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. //Hum. Antibodies. -2005. V. 14 (1-2). - P. 33-55.

82. Lorenz I.C., Allison S.L., Heinz F.X., Helenius A. Folding and dimerization of tick-borne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum // J. Virol. 2002. - V. 76 (11). - P. 5480-91.

83. Luo W., Chen Y„ Li L., Xu C., Miao J. Shih J.W., Zhang J., Xia N. Construction and characterization of the chimeric antibody 8C11 to the hepatitis E virus // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007. - V. 51 (1). - P. 18-25.

84. Maldov D.G., Karganova G.G. Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells // Arch. Virol. 1992. - V. 127. - P. 321-325.

85. Mandl C.W. Steps of the tick-borne encephalitis virus replication cycle that affect neuropathogenesis // Virus Res. 2005. - V. 111 (2). - P. 161-174.

86. Maynard J, Georgiou G. Antibody engineering // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000. - V. 2. - P. 339-376.

87. Mazanec M.B., Coudret C.L., Fletcher D.R. Intracellular neutralization of influenza virus by immunoglobulin A anti-hemagglutinin monoclonal antibodies//J. Virol. 1995.-V. 69.-P. 1339-1343.

88. Mazanec M.B., Kaetzel C.S., Lamm M.E., Fletcher D., Nedrud J.G. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 6901-6905.

89. McCullough K.C., Smale С.J., Carpenter W.C., Crowther J.R., Brocchi E., Simone F. Conformational alteration in foot-and-mouth disease virus virion capsid structure after complexing with monospecific antibody // Immunology. -1987.-V. 60.-P. 75-82.

90. Mehlhop E., Whitby K., Oliphant Т., Marri A. Engle M., Diamond M.S. Complement activation is required for induction of a protective antibody response against West Nile virus infection // J. Virol. 2005. - V. 79. - P. 7466-7477.

91. Mian I.S., Bradwell A.R. and Olson A J. Structure, function and properties of antibody binding sites // J. Mol. Biol. 1991. - V. 217. - P. 133151.

92. Nose M. and Wigzell H. Biological significance of carbohydrate chains on monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P. 6632-6636.

93. Nowak Т., Wengler G. Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus // Virology. 1987. - V. 156 (1). - P. 12737.

94. Nybakken G.E., Oliphant Т., Johnson S., Burke S. Diamond M.S., Fremont D.H. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody // Nature. 2005. - V. 437. - P. 764-769.

95. Pereboev A., Borisevich V., Tsuladze G., Shakhmatov M., Hudman D., Kazachinskaia E., Razumov I., Svyatchenko V., Loktev V., Yamshchikov V. Genetically delivered antibody protects against West Nile virus // Antiviral Research. 2008. - V. 77. - P. 6-13.

96. Pierson T.C., Fremont D.H., Kuhn R.J., Diamond M.S. Structural insights into the mechanisms of antibody-mediated neutralization of flavivirus infection: implications for vaccine development // Cell Host Microbe. 2008. -V. 4(3).-P. 229-238.

97. Posner M.R., Hideshima Т., Cannon Т., Mukherjee M., Mayer K.H., Byrn R.A. An IgG human monoclonal antibody that reacts with HIV-l/gpl20. inhibits virus binding to cells, and neutralizes infection // J. Immunol. — 1991. — V. 146.-P. 4325-4332.

98. Presta L.G. Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - V. 58 (5-6). - P. 640-656.

99. Radko B.V., Boitchenko V.E., Nedospasov S.A., Korobko V.G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor // Russ.

100. J. Immunol. 2002. - V. 7. - P. 371-374.

101. Reading S.A., Dimmock N.J. Neutralization of animal virus infectivity by antibody // Arch. Virol. 2007. - V. 152 (6). - P. 1047-1059.

102. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. — 1995.-V. 375 (6529).-P. 291-298.

103. Roder J.C., Cole S.P. and Kozbor D. The EBV-hybridoma technique // MethodsEnzymol. 1986.-V. 121.-P. 140-167.

104. Roehrig J.T., Bolin R.A., Kelly R.G. Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica // Virology. -1998. -V. 246.-P. 317-328.

105. Schlesinger J.J., Brandriss M.W., Cropp C.B., Monath T.P.- Protection against yellow fever in monkeys by immunization with yellow fever virus nonstructural protein NS1 // J. Virol. 1986. - V. 60 (3). - P. 1153-5.

106. Shankar V., Kools J.J. Armour K.L., Clark M.R. A chimeric antibody to varicella-zoster virus glycoprotein E // Hybridoma. 2005. - V. 24 (1). - P. 5054.

107. Skerra A. Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli // Science. 1988. -V. 240. - P. 1038-1041.

108. Smith T.J., Olsen N.H., Cheng R.H., Liu H., Chase E.S., Lee W.M., Lcippe D.M., Mosser A.G., Rueckert R.R., Baker T.S. Structure of human rhinovirus complexed with Fab fragments from a neutralizing antibody // J. Virol. 1993. - V. 67. - P. 1148-1158.

109. Stiasny К., Brandler S. Kossl C., Heinz F.X. Probing the flavivirus membiane fusion mechanism by using monoclonal antibodies // J. Virol. -2007.-V. 81.-P. 11526-11531.

110. Thali M., Moore J.P.,* Furman C., Charles M., Ho D.D., Robinson J., Sodroski J. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gpl20 neutralization epitopes exposed upon gpl20-CD4 binding // J. Virol. -1993.-V. 67.-P. 3978-3988.

111. Thomas P. and Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2005. -V. 51. - P. 187-200.

112. Thompson B.S., Moesker В., Smit J.M., Wilschut J., Diamond M.S., Fremont D.H. A therapeutic antibody against west nile virus neutralizes infection by blocking fusion within endosomes // PLoS. Pathog. 2009. V. 5. — P. 193-200.

113. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. - P. 4350-4354.

114. Wright A., Tao M.H.,l£abat E.A. and Morrison S.L. Antibody variable region glyeosylation: position effects on antigen binding and carbohydrate structure // EMBO J. 1991.-V. 10. - P. 2717-2723.

115. Wu S.C. Lin Y.J., Chou J.W., Lin C.W. Construction and characterization of a Fab recombinant protein for Japanese encephalitis virus neutralization // Vaccine. 2004. - V. 23. - P. 163-171.

116. Xiong H., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y. and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. -V. 38.-P.414-419.