Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинантные миниантитела человека в формате scFv к энтеротоксину A стафилококков

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинантные миниантитела человека в формате scFv к энтеротоксину A стафилококков"

На правах рукописи

Фурсова Ксения Константиновна

Рекомбинантные миниантитела человека в формате 8сРу к энтеротоксину А стафилококков: получение и характеристика

Специальность 03.01.03 — молекулярная биология

а л 2.5 АПР 2013

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Пущино 2013 005057689

005057689

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ФБУН ФИБХ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, ФБУН ФИБХ РАН

Бровко Федор Александрович, кандидат химических наук, ФБУН ФИБХ РАН Ламан Александр Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

ФГУП "ГосНИИГенетика" Носиков Валерий Вячеславович доктор биологических наук, ФБУН Институт биофизики клетки РАН Моренков Олег Сергеевич

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки

Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

У/. /У

Защита состоится ' / _ 2013 г. в '2— часов на заседании Дис-

сертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов".

Автореферат разослан ^& года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, доцент

Т.Д. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Бактерии рода Staphylococcus являются одной из основных причин пищевых отравлений. Причинами патогенности S. aureus считаются факторы вирулентности вырабатываемые бактерией - это и факторы адгезии, и разнообразные ферменты, играющие роль факторов "агрессии и защиты", и комплекс секретируемых экзотоксинов (Becker et al., 2003). Около 6% синтезируемого клеткой белка составляют энтеротоксины (Thomas et al., 2007; Lowy, 1998). На сегодняшний день описано более 25 различных энтеротоксинов, среди которых наиболее распространен SEA.

Энтеротоксины - семейство белков с молекулярной массой 23-30 кД, взаимодействующих с антигенами гистосовместимости (MHC-II) и Т-клеточным рецептором (TCR) (Thomas et al., 2009). В результате формируется комплекс двух видов клеток и молекулы SEA, провоцирующий гипериммунный ответ (Proft, Fraser, 2003; Descloux, Ferry, 2005).

Отравление пищевыми продуктами, содержащими энтеротоксины стафилококков, широко распространено и находится на втором месте после отравлений, вызываемых сальмонельными инфекциями (Lowy, 1998; Le Louir et al., 2003). При пищевых отравлениях возможны различные осложнения, включая развитие пневмонии (Cheng et al., 2012), аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Howell et al.,1991.), атопический дерматит (Ikezawa et al., 2010; Niebuhr et al., 2010), и аллергические заболевания. Синтезируемые бактериями энтеротоксины могут проникать в кровоток не только через ткани желудочно-кишечного тракта, но и через эпителиальные ткани дыхательных путей.

Таким образом, задача детекции и нейтрализации токсинов актуальна как для здравоохранения, так и для современной науки. Вакцинация пациентов природным антигеном осложняется ответной гиперреакцией организма. Применение рекомбинантных аналогов энтеротоксина и конкурентных молекул, блокирующих взаимодействие токсинов с рецепторами на компетентных клетках оказалось малоэффетивно. Показано, что антитела иммунных доноров способны нейтрализовывать энтеротоксины при пассивной вакцинации. Поэтому получение нейтрализующих антител или искусственных конструктов на их основе может быть одним из решений данной задачи. Один из основных способов получения антител человека - это конструирование библиотек антител на основе генетического материала антителопродуцирующих клеток доноров и отбор из этих библиотек антител с заданными свойствами.

Цель данной работы: получение рекомбинантных миниантител человека в формате scFv против стафилококковго энтеротоксина А с помощью технологии фагового дисплея и характеристика их взаимодействия с антигеном.

В задачи работы входило:

1. провести аффинное обогащение фаговой библиотеки на стафилококковом энтеротоксине А и определить уровень детекции SEA ;

2. экспрессировать антитела в клетках Е. coli и выделить очищенные препараты;

3. разработать способ хранения полученного препарата миниантител;

4. определить основные характеристики полученных миниантител: аффинность и специфичность;

5. провести картирование эпитопов стафилококкового энтеротоксина А, распознаваемых полученными миниантителами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Используя библиотеку миниантител, сконструированную на основе анти-телопродуцирующих клеток неиммунных доноров с помощью методов аффинной селекции возможно получить миниантитела к стафилококковому энтеротоксину А. Антитела распознают SEA как в иммуно-ферментном анализе, так и в методе иммуно-ПЦР в фаговом формате .

2. Полученные рекомбинантные антитела эффективно экспрессируются в клетках Е. coli. Миниантитела синтезируются как в виде растворимого клеточного белка, так и виде телец включения. Рефолдинг миниантител методом гельфильтрации в присутствии аргинина позволяет успешно получать активный препарат миниантител из телец включения.

3. Полученные рекомбинантные антитела распознают эпитопы, локализованные на разных доменах стафилококкового энтеротоксина А. Эпитопы представляют собой линейные участки длиной 5-7 аминокислот.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые были получены человеческие миниантитела в формате scFv против стафилококкового энтеротоксина А. На основе полученных фаговых антител разработан способ детекции SEA с использованием метода фагового иммуно-ПЦР. Предложен способ выделения и ренатурации миниантител из телец включения методом гельфильтрации через слой раствора аргинина. Впервые показана возможность хранения лиофилизованного препарата фаговых миниантител. Установлены эпитопы взаимодействия полученных антител со стафилококковым эн-теротоксином А.

Полученные миниантитела можно использовать для создания диагностического набора на основе твердофазного ИФА или ПЦР. Также возможно использование антител для создания препарата, нейтрализующего стафилококковые энтеротоксины.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2013), 9th IST Asia Pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Vladivostok, 2011), 10-ом съезде Научного общества гастроэнтерологов России "Российские научные школы. Технологии качества" (Москва, 2010), на ежегодных Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010, 2011, 2012), V Международная конференция "Наука и образование для целей биобезопасности" (Пущино, 2008).

Диссертационная работа была апробирована на межлабораторном семинаре ФБУН ФИБХ РАН 14 марта 2013 и на семинаре секции "Молекулярная биология" Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика 28 марта 2013г.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 10 печатных работах, из которых 4 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК, и 6 опубликованы в виде материалов конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть", "Результаты и обсуждение ", "Выводы", "Список сокращений" и "Список литературы". Работа содержит 37 рисунков и 9 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1 Миниантитела в фаговом формате.

1.1 Получение scFv фрагментов в составе фаговой частицы.

Для получения рекомбинантных одноцепочных миниантител scFv в составе фаговой частицы использовалась неиммунная фаговая библиотека мини-антител человека в формате scFv (Улитин и др., 2005). Репертуар библиотеки составляет 6 х 109 клонов.

Для отбора специфичных клонов из фаговой библиотеки использовали метод аффинной селекции. Первый раунд селекции проводили в довольно мягких условиях: высокая концентрация антигена (10 мкг/мл) и длительное время инкубации (ночь при 4 °С). На последующих этапах селекции для отбора

5

клонов с большей степенью аффинности селекцию проводили в более жестких условиях. Это достигалось за счет понижения концентрации антигена, сокращения времени взаимодействия, а также ужесточения условий, препятствующих неспицефическому взаимодействию (Таблица 1).

Таблица 1. Условия проведения раундов обогащения фаговой библиотеки миниантител.

Раунд Концентра- Концентра- Блокирующий Количество Количе-

селек- ция фагов, ция антигена, агент на основе отмывок, ство

ции ф.ч./мл мкг/мл PBST PBST/PBS колоний,

шт

I 1012 10 2% молоко 10/5 3 х 105

II 1012 5 2% BSA 20/10 105

III ю12 1 2% желатин 0,2% Triton 5 х 106

30/10

Для определения эффективности обогащения библиотеки искомыми антителами после каждого раунда селекции учитывали число колоний Е. coli после заражения фаговыми частицами.

Уровень обогащения целевыми scFv оценивали с помощью непрямого ИФА (Рис. 1).

Рис. 1. Оценка обогащения фаговой библиотеки миниантител в течение трех раундов селекции. Непрямой ИФА. Фаги титровали трехкратными разведениями от 1013 ф/мл при постоянной концентрации SEA (1мкг/мл(100 нг на лунку)). Детекцию связавшихся фагов проводили с помощью конъгогата кроличьих поли-клональных антител против белков фага с пероксидазой хрена - анти-М13 HRPO (1 мкг/мл). □ - уровень обогащения после I, Д - после II, * - после III раундов селекции. уровень неспецифического взаимодействия библиотеки с блокирующим агентом.

Как видно из приведенных данных (Рис. 1), после первого раунда селекции общий фаговый пул давал некоторый положительный результат в ИФА, однако сигнал довольно быстро падал при понижении концентрации антигена, что связано с малой долей целевых фаговых частиц в общем пуле библиотеки. На следующих раундах сигнал возрастал, и сохранялся при значительном понижении концентрации антигена, что свидетельствует об обогащении пула высокоаффинными клонами.

Чтобы на следующих этапах избежать неточностей при усреднении характеристик клонов из фагового пула, проводили его клонирование. Индивидуальные клоны оценивали с помощью ИФА на взаимодействие с SEA (Рис. 2). Для дальнейшей работы было отобрано 8 клонов: 1, 4, 5, 9, 13, 24, 30, 35.

Рис. 2. Активность фаговых мини-антител в отношении SEA. Непрямой фаговый ИФА. Концентрация SEA в анализе составляла 1мкг/мл, концентрация фагов - 1012 ф/мл 1011 фагов на лунку). Детекцию связавшихся фагов проводили с помощью конъюгата анти-М13 HRPO. Столбцы: 1,4,5,9,13,24,30,35 - активность антител в отношении SEA; столбец анти-М13 HRPO - контроль активности конъюгата в отношении SEA -отрицательный контроль.

Проверка на кроссреактивность с энтеротоксинами стафилококков показала, что отобранные с помощью аффинной селекции на SEA миниантитела проявляли активность разной степени также и в отношении родственных энте-ротоксинов (SE В, С, D, Е, G, I).

Рис. 3. Специфичность взаимодействия фагового scFv 5 с антигенами SEA и SEE. Непрямой фаговый ИФА при понижающихся концентрациях антигенов. SEA и SEE наносили в концентрации 1мкг/мл с последующим двухкратным разведением. Детекцию связавшихся фагов проводили с помощью анти-М13 HRPO.

Наибольшая активность отмечена в отношении SEE. Данный факт можно объяснить большой гомологией между SEA и SEE, составляющей около 83 % по первичной структуре (Munson, 1998).

Для исследования специфичности взаимодействия антител с SEA и SEE, имеющих наибольшую гомологию первичной последовательности, изучали взаимодействие при понижающихся концентрациях антигенов по характеру кривой

титрования (Рис. 3). Было установлено, что миниантитела более специфично

7

Мышиные моноклональные антитела использовали в качестве "нижних" - "улавливающих" антител, а в качестве "верхних" - детектирующих, антител использовались полученные scFv.Наилучший предел чувствительности наблюдался у пар, образованных моноклональными антителами 7 и 8 с фаговым антителом 5. В непрямом "сэндвич"—ИФА значения составляли б нг/мл. Полученный уровень детекции с одной стороны может считаться достаточным для детекции SEA, так как по литературным данным токсическая доза разных стафилококковых токсинов варьирует, но в среднем составляет 10 мкг/кг веса животного, что вызывает рвотный эффект или диарею. Однако известно, что в некоторых случаях даже пикограммовые количества SEA в крови, вызывают аутоиммунные расстройства. В связи с этим возникает потребность в более чувствительных методах детекции SEA.Несмотря на высокую чувствительность и специфичность методов, основанных на ДНК или мРНК анализе, предпочтительными являются технологии непосредственного обнаружения энтеротоксинов как белков, учитывая их большую физико-химическую стабильность. В связи с этим была поставлена задача разработки метода детекции SEA с помощью полученных фаговых scFv.

1.2.2 Детекция SEA методом иммуно—ПЦР в фаговом формате.

Использование фаговых антител, позволяет модифицировать классический метод иммуно—ПЦР (Guo et al., 2006). Фаговая частица с экспонированными на ее поверхности миниантителами, представляет собой готовый комплекс антитела и ДНК. Миниантитела взаимодействуют с антигеном, а фагмида со встроенной последовательностью scFv является матрицей для ПЦР. Аналогично традиционной иммуно—ПЦР, такой способ позволяет увеличить уровень детекции антигена на несколько порядков по сравнению с традиционным ИФА.

В работе использовали пары антител, которые проявляли лучший уровень детекции SEA в "сэндвич"—ИФА, и составляющий 6-12 нг/мл при наименьшем неспецифическом сигнале (Рис. 4).

В качестве матрицы для реакции амплификации использовали фаговую ДНК, праймерами служили последовательности, комплементарные одной из цепей scFv. Оптимизировались

Таблица 2. Предел детекции SEA в "сэндвич" анализе

Пара антител Уровень детекции

ИФА Фаг-ПЦР

Mab8/scFv5 12 нг/мл 0,4 пг/мл (14 фМ)

Mab7/scFv5 12 нг/мл 1 пг/мл (37 фМ)

Mab7/scFv4 12 нг/мл 50 пг/мл (1,8 пМ)

13 13 24 24

♦^scFv

0,3 1 0,3 1 0,3 1 0,3 1 0,3 !PTG,mM

Рис. 9. Белковый профиль нерастворимой цитоплазматическон фракции. Электрофоретический анализ в денатурирующих условиях нерастворимой фракции белка различных клонов, синтезирующих 8сРу. Экспрессию мини-антител (бсРу 4, 5, 9, 13, 24) проводили в течение 3 ч. при 37°С, при различных концентрациях индуктора 1РТв 1 и 0,3 мМ; М - белковый маркер.

Возможность ренатурации антител оценивали с помощью электрофоре-тического разделения белка в понижающемся градиенте мочевины в присутствии восстанавливающего агента (Рис. 10).

0 М urea

8 М 0 М urea urea

8 М urea

Рис. 10. Электрофоретический анализ миниантител в градиенте мочевины. А - электрофоретический анализ зсЕу 4; Б - электрофоретический анализ веру 13.

Для ряда антител наблюдался низкий уровень выхода ренатурированного продукта (веру 4) (Рис. 10 А). Антитело бсРу 13 (Рис. 10 Б) характеризовалось большей способностью к ренатурации. Присутствие белка наблюдалось при понижении концентрации денатутрирующего агента.

Высокий уровень белка в клетке, а также наличие 6 х Шв-последовательности в молекуле позволяли осуществить эффективную очистку белка и одновременный его рефолдинг с помощью металл-хелатной хроматографии на №ЫТА - агарозе (Рис. 11).

Полученные антитела характеризовались высокой чистотой препарата. Однако в процессе хранения в растворе при 4°С активность антител терялась, так как полученные препараты содержали значительное количество олигомер-ных форм белка, что приводило к их агрегации.

Для получения мономерных форм бсБу в физиологическом буферном растворе нами был разработан способ рефолдинга гельфильтрацией через слой

4 9 13 М

-4 31

Рис. 11. Электрофоретический анализ мини-антител. Миниантитела (эсру 4, 9 и 13) выделяли с помощью металл-хелатной хроматографии в денатурирующих условиях, М - белковый маркер.

аргинина. Известно, что аргинин положительно влияет на рефолдинг белков (ТзитоЮ е1 а1., 2004). Схематически метод можно представить следующим образом (Рис. 12): в процессе хроматографии на первом этапе происходит удаление денатурирующего агента и замена его на аргинин, а на последующих этапах отделение аргинина и замена его на компоненты буфера.

Для оценки эффективности рефолдинга анализировали профили элюции белка. В зависимости от природы антител наблюдалась различная эффективность ренатурации (Рис. 13). На рисунке 13 А представлен профиль элюции ренатурированных миниантител, для которых наблюдалась незначительная степень агрегации и достигалось эффективное отделение мономерной формы от агрегированной. Как правило, выход мономерной формы по отношению к исходному количеству антитела составлял 50—70 %. На рисунке 13 Б представлен профиль элюции антител с большей склонностью к образованию агрегатов. Получение мономерной формы таких антител осложнялось низкой эффективностью разделения агрегированной и мономерной форм. Выход мономерной формы составлял от 30 до 45%. Рис. 13 В демонстрирует профиль элюции миниантител, для которых основной является мономерная форма. Выход таких антител был наибольшим и достигал 80%. Для проверки влияния аргинина на эффективность рефолдинга проводили гельфильтрацию препарата в отсутствие аргинина. При этом наблюдались значительные потери белка, связанные с его агрегацией, выход активного препарата уменьшался в разы. Данный факт свидетельствовал о значительной роли аргинина в процессе рефолдинга исследованных миниантител.

^ конец хроматографии

ренатурированные scFv Arg, мочевина

Мономеры

Агрегаты

10 20

- Arg

• -Л1 -

fb Г" -щ— scFv в растворе мочевины

Т начало хроматографии

Рис. 12. Схематическое изображение ре-фолдинга миниантител с помощью гель-фильтрации через слой раствора аргинина. В качестве буфера для рефолдинга использовали PBS. Сначала наносили раствор аргинина (0,4 М), затем раствор scFv (1,5-5 мг/мл) в буфере, содержащем денатурирующий агент (8М мочевина).

10 20 Мопомеры

Л

Фракции

Рис. 13. Профили элюции зсКу. Мономерная фракция бсРу соответствовала 18 пробирке. Наблюдалась разная эффективность рефолдинга (А, Б, В), что проявлялось присутствием пика агрегированных форм соответствовавших 12 -17 пробиркам элюата.

Эффективность отделения препаратов миниантител от аргинина контролировали с помощью нингидринового теста, который показал, что аргинин элю-ировался значительно позже выхода белковых фракций.

В молекулярной организации антител характерно преобладание /3 - элементов. Детектировали спектры кругового дихроизма растворимых и ренатури-рованных через слой аргинина антител (Рис. 14). Как видно из приведенного рисунка, спектры растворимых и ренатурированных антител были очень близки из чего можно заключить, что в процессе рефолдинга молекулы эсРу приобретали характерную для антител конформацию с преобладанием ¡5 - структуры.

2.5.2 Анализ взаимодействия миниантител с родственными стафилококковыми энте-ротоксинами.

Помимо SEA, в семейство энтеротоксинов входит ряд белков, характеризующихся различной степенью гомологии аминокислотной последовательности. Был проведен анализ взаимодействия полученных антител с членами семейства стафилококковых энтеротоксинов (Рис. 17). Антитела проявляли различную степень активности в отношении различных антигенов. Для большинства антител наблюдался высокий уровень активности как в отношении SEA, так и в отношении SEE. Активность миниантител в отношении SEE объясняется высокой гомо-

Рис. 17. Активность миниантител в отношении энтеротоксинов стафилококков. Непрямой ИФА. Антигены (БЕ А, В, С, Б, Е, О, I) вносили в концентрации 1 мкг/мл (ЮОнг на лунку), антитела веру титровали двукратными разведениями от 50 мкг/мл. Детекцию осуществляли с помощью антител 9Е10 и конъюгата анти-тоизе НЯРО.

логией первичной структуры, составляющей 83% (Munden et al., 1998). Причина активности в отношении других антигенов точно не установлена. Несмотря на имеющиеся значительные различия в аминокислотный последовательности, анализ кристаллических структур указывает на близкое строение белковых молекул (Schad et al., 1995; Sundstrom et al., 1996). Перекрестная активность антител - довольно типичное явление ( Ulrich et al., 1998; Bavari et al., 1999). Она может быть связана как с аминокислотной гомологией, так и с другими причинами. Описано, что одно и тоже антитело может распознавать разные эпитопы в разных токсинах (Kum et al., 2000; Pang et al., 2000; Кит et al., 2001).

В нашем случае было видно, что антитела с наибольшей аффинностью взаимодействовали с целевым антигеном, что подтверждает эффективность селекции на антигене (Рис. 17).

Другая причина кросс-реактивности scFv может заключаться в структуре самих миниантител. По сравнению с полноразмерными антителами, для scFv характерна большая конформационная подвижность вариабельных регионов молекулы, связанная с отсутствием в молекуле константных участков. Данное явление широко известно и наблюдается при переводе полноразмерных антител в

миниантитела (Shepelyakovskaya et al., 2011).

18

€.25 3 '25 1,563 0,78 1 0.Э91 0.195 0.036 0М9

Концентрация scFv, мкг/мл

Данный эпитоп входит в состав домена II SEA. В состав данного эпито-па входит His 187, участвующий в формировании металл-связывающего домена. Сайт, находящийся на поверхности /3-складки во II домене, важен для взаимодействия с MHC-1I-/3. Можно предположить, что взаимодействие scFv 9 с молекулой SEA может приводить к структурным изменениям антигена и влиять на связывание Zn2+ молекулой SEA и взаимодействие токсина с MHC-II-/3.

Для миниантитела scFv 13 была установлена консенсусная последовательность H(S/T)W(Y/H)N. Можно предположить, что ее аналогом является 61HSWYN65 (Рис. 21).

Рис. 21. Локализация эпитопа антитела scFv 13 в молекуле SEA. А - структура молекулы в виде тяжей; Б - структура молекулы в виде поверхности. Синим цветом выделена последовательность 61HSWYN65, определяемая scFv 13. Моделирование Chimera 1.6.1.

Данный эпитоп входит в состав домена I молекулы SEA и располагается на петле между /32 и /33 тяжами, отличающимися высокой подвижностью в молекуле. В целом молекула SEA имеет довольно жесткую структуру с выраженным гидрофобным ядром. Вероятно, связывание scFvl3 с подвижным участком между /32 и /33 -структурами может повлечь изменения в подвижности и соответственно стабильности всей молекулы в целом. Кроме того, аминокислотные остатки ТгрбЗ - Туг64, локализованные на выпетливании между /32 и /33 структурами, наряду с остатками из а2 спирали, /34Ь и а5 структур принимают участие в формировании взаимодействия между SEA и TCR.

Установленные эпитопы представляют собой небольшие линейные участки молекулы SEA, длиной 5-7 а.о. и локализованы на поверхности белковой молекулы (Рис. 21 ), из чего можно сделать предположение о важности этих эпитопов в распознавании их МНС или TCR.

А

Б

выводы.

1. С помощью технологии фагового дисплея получены миниантитела человека в формате scFv к стафилококковому энтеротоксину А. Разработан способ детекции стафилококкового энтеротоксина А в фемтомолярных концентрациях методом иммуно-ПЦР в фаговом формате.

2. Предложены условия экспрессии миниантител в растворимом виде и в виде телец включения. Разработан способ рефолдинга одноцепочных миниантител в присутствии раствора аргинина с помощью метода гельфильтрации. Метод позволяет отделять мономерную активную форму мининатител от агрегированной. Эффективность рефолдинга составляет 50-80 % .

3. Подобраны условия хранения миниантител. Показано, что миниантитела, экспонированные в виде слитного scFv-pIII белка на фаговой частице, так и свободные миниантитела сохраняют свою активность после лиофилизации в присутствии 0,1 М трегалозы.

4. Исследована специфичность взаимодействия полученных миниантител с энтеротоксинами стафилококков. Константы диссоциации миниантител при взаимодействии со стафилококковым энтеротоксином А составляют Ю-7 -10"8.

5. Установлены последовательности распознаваемых миниантителами эпито-пов. Показано, что миниантитела распознают линейные эпитопы, локализованные на разных доменах стафилокококкового энтеротоксина А.

Публикации автора по теме диссертации

1. Fursova К.К., Laman A.G., Melnik B.S., Semisotnov G.V., Kopylov P.K., Kise-leva N.V., Nesmeyanov V.A., Brovko F.A. Refolding of scFv mini-antibodies using size-exclusion chromatography via arginine solution layer // Journal of Chromatography B. 2009. Vol. 877, no. 22. P. 2045-2051.

2. Shepelyakovskaya A.O., Laman A.G., Lomonosova A.V., Fursova K.K., Savi-nov G.V., Vertiev Y.V., Brovko F.A., Grishin E.V. Effect of the format of antibodies on their specificity // Molecular Immunology. 2011. Vol. 49, no. 3. P. 433^40.

3. Lomonosova A.V., Laman A.G., Fursova K.K., Shepelyakovskaya A.O., Vertiev Y.V., Brovko F.A., Grishin E.V. Generation of scFv phages specific to Staphylococcus enterotoxin CI by panning on related antigens // mAbs. 2011. Vol. 3, no. 6. P. 513-516.

4. Улитин А.Б., Капралова В.М., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Булгакова

E.В., Фурсова К. К., Аббасова С.Г., Волков С.К., Бровко Ф.А., Несмеянов, В.А. Библиотека мини-антител человека в формате фагового дисплея. Создание и апробация // Доклады Академии наук. 2005. Т. 405, № 4. С. 555-558.

5. Лоскутова И.В., Щанникова М.П., Фурсова К.К., Шепеляковская А.О., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Гришин Е.В. Картирование эпитопов токсинов стафилококков // XXV Международная зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Россия, Москва, 2013.

6. Щанникова М.П., Фурсова К.К., Бровко Ф.А. Рекомбинантные антитела как инструмент детекции стафилококкового энтеротоксина А методом фа-гоопосредованной иммуно-ПЦР // Всероссийская молодежная конференция "Актуальные проблемы химии и биологии". Russia, Пущино, 2012.

7. Fursova К.К., Laman A.G., Shepelyakovskaya А.О., Vertiev Yu.V., Brovko

F.A., E.V. Grishin. High sensitivity detection of staphylococcal enterotoxin A by phage display mediated immuno-PCR // 9th 1ST Asia Pacific meeting on animal, plant and microbial toxins. Russia, Vladivostok, 2011.

8. Фурсова K.K., В.H. Макеев. Детекция стафилококкового энтеротоксина А с помощью иммуно-ПЦР в варианте фагового дисплея миниантител // 15-ая Международная Путинская Школа-Конферепцйя Молодых Ученых " Биология - наука XXI века". Россия, Пущино, 2011.

9. Мешалкина Д.А., Фурсова К.К., Бровко Ф.А. Рекомбинантные человеческие миниантитела к стафилококковому энтеротоксину А // 14-ая Международная Пущинская Школа-Конференция Молодых Ученых " Биология - наука XXI века". Россия, Пущино, 2010.

10. Фурсова К.К., Ломоносова A.B., Вертиев Ю.В., Бровко Ф.А., Е.В. Гришин. Рекомбинантные антитела scFv человека к стафилококковым энтеротокси-нам // V Международная конференция "Наука и образование для целей биобезопасности". Россия, Пущино, 2008.

Подписано в печать:

04.04.2013

Заказ № 8307 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фурсова, Ксения Константиновна, Пущино

ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО,

УЧРЕЖДЕНИЯ НАУКИ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи ФУРСОВА КСЕНИЯ КОНСТАНТИНОВНА

і

і

РЕКОМБИНАНТНЫЕ МИНИАНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА

В ФОРМАТЕ 8сЕУ

I

К ЭНТЕРОТОКСИНУ А СТАФИЛОКОККОВ: ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА

I і

Молекулярная биология - 03.01.03 Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

і

і Научные руководители: і

!

доктор биологических наук, | Бровко Федор Александрович; I кандидат химических наук, Ламан Александр Георгиевич

Пущино 2013

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................8

1.1. Энтеротоксины стафилококков.............................................................................................8

1.1.1. Стафилококки - условно-патогенные микроорганизмы...........................................8

1.1.2. Энтеротоксины стафилококков......................................................................................9

1.1.3. Молекулярная структура стафилококкового энтеротоксина А.............................11

1.1.4. Механизм действия энтеротоксинов стафилококков...............................................15

1.1.5. Методы молекулярной детекции стафилококковых энтеротоксинов..................18

1.2. Антитела...................................................................................................................................21

1.2.1. Структура иммуноглобулинов......................................................................................21

1.2.2. Разнообразие форматов антител...................................................................................27

1.2.3. Методы и технологии получения бсЕу.........................................................................33

1.2.4. Экспрессия бсГу................................................................................................................39

1.2.5. Применение антител........................................................................................................42

1.3. Продукция рекомбинантных белков в клетках Е.соИ.....................................................44

1.3.1. Основные аспекты рефолдинга.....................................................................................44

1.3.2. Выделение телец включения.........................................................................................46

1.3.3. Способы рефолдинга белка............................................................................................47

1.3.4. Добавки при рефолдинге................................................................................................49

1.3.5. Вклад дисульфидных связей в белковый фолдинг...................................................52

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................55

2.1. Материалы исследования......................................................................................................55

2.2. Методы......................................................................................................................................55

2.2.1. Аффинная селекция миниантител из фаговой библиотеки....................................55

2.2.2. Скрининг индивидуальных продуцентов из фаговой библиотеки........................56

2.2.3. Выделение фаговых частиц...........................................................................................56

2.2.4. ИФА бсГу в фаговом формате........................................................................................56

2.2.5. ИФА эсЕу-фрагментов.....................................................................................................57

2.2.6. «Сэндвич»-иммуноанализ на иммунопланшетах......................................................57

2.2.7. Иммуно-ПЦР в фаговом формате.................................................................................58

2.2.8. Клонирование генов миниантител в экспрессионный вектор...............................58

2.2.9. Трансформация и анализ клонов Е.соИ.......................................................................59

2.2.10. Экспрессия всЕу в клетках Е.соИ.................................................................................59

2.2.11. Анализ уровня синтеза всЕу.........................................................................................60

2.2.12. Экспрессия и выделение эсЕу из телец включения.................................................60

2.2.13. Экспрессия и выделение растворимых бсЕу.............................................................61

2.2.14. Рефолдинг миниантител с помощью металл-хелатной хроматографии............61

2.2.15. Рефолдинг миниантител гель фильтрацией..............................................................61

2.2.16. Определение аргинина с помощью тонкослойной хроматографии.....................62

2.2.17. Электрофоретический анализ белковых препаратов в нативных условиях.....62

2.2.18. Регистрация спектров кругового дихроизма............................................................62

2.2.19. Определение констант диссоциации..........................................................................62

2.2.20. Эпитопный анализ стафилококкового энтеротоксина А.......................................63

2.2.21. Иммуно-блот анализ......................................................................................................64

2.2.22. Лиофилизация миниантител.......................................................................................64

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................65

3.1. Миниантитела в фаговом формате......................................................................................65

3.1.1. Получение всЕу фрагментов в составе фаговой частицы........................................65

3.1.2. Использование фаговых миниантител для детекции...............................................70

3.2. Миниантитела всЕу.................................................................................................................77

3.2.1. Анализ уровня синтеза миниантител...........................................................................77

3.2.1.1. Выделение миниантител из растворимой фракции...............................................80

3.2.1.2. Выделение миниантител в денатурирующих условиях........................................81

3.3. Оценка стабильности миниантител при различных условиях хранения...................88

3.4. Характеристика миниантител..............................................................................................90

3.4.1. Аффинность миниантител в отношении SEA............................................................90

3.4.2. Анализ взаимодействия миниантител с родственными стафилококковыми энтеротоксинами........................................................................................................................91

3.4.3. Эпитопный анализ стафилококкового энтеротоксина А.........................................94

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................103

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Бактерии рода Staphylococcus являются одной из основных причин пищевых отравлений и аутоиммунных расстройств. К причинам патогенности Staphylococcus aureus относятся факторы вирулентности вырабатываемые бактерией - это и факторы адгезии, и разнообразные ферменты, играющие роль факторов «агрессии и защиты», и комплекс секретируемых экзотоксинов (Becker et al., 2003). Около 6% синтезируемого клеткой белка составляют энтеротоксины (Thomas et al., 2007; Lowy, 1998). На сегодняшний день описано более 20 энтеротоксинов, среди которых SEA один из наиболее распространенных.

Энтеротоксины - семейство белков с молекулярной массой 23-29 кД, взаимодействующих с антигенами гистосовместимости (MHC-II) и Т-клеточным рецептором (TCR) (Thomas et al., 2009). В результате такого взаимодействия является образование комплекса из двух видов клеток и антигена, провоцирующий гипериммунный ответ (Profit, Fraser, 2003).

Отравление пищевыми продуктами, содержащими энтеротоксины стафилококков, широко распространено и находится на втором месте после отравлений, вызываемых сальмонельными инфекциями (Lowy, 1998; Le Louir et al., 2003). При пищевых отравлениях возможны различные осложнения, включая развитие пневмонии (Cheng et al., 2012), аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Howell et al.,1991.), атопический дерматит (Ikezawa et al., 2010; Niebuhr et al., 2010), и аллергические заболевания. Синтезируемые бактериями энтеротоксины могут проникать в кровоток не только через ткани желудочно-кишечного тракта, но и через эпителиальные ткани дыхательных путей и кожных покровов (Balaban, Rasooly, 2000; Peterson et al., 2005).

Таким образом, задача детекции и нейтрализации токсинов является актуальной в здравоохранении, и представляет интерес для современной науки. Вакцинация пациентов природным антигеном осложняется ответной

гиперреакцией организма. Применение рекомбинантных аналогов энтеротоксина и конкурентных молекул, блокирующих взаимодействие токсинов с рецепторами на компетентных клетках оказалось малоэффективно (Bavari et al., 1996; Bavari et al., 1999). Показано, что антитела иммунных доноров способны нейтрализовывать энтеротоксины при пассивной вакцинации. Поэтому получение нейтрализующих антител или искусственных конструктов на их основе может быть одним из решений данной задачи и представляет несомненный интерес.

Один из основных способов получения антител человека - это конструирование библиотек антител на основе генетического материала антителопродуцирующих клеток доноров и отбор из этих библиотек антител с заданными свойствами.

Цель данной работы: получение рекомбинантных миниантител человека в формате scFv против стафилококкового энтеротоксина А с помощью технологии фагового дисплея и характеристика их взаимодействия с антигеном. В задачи работы входило:

1. провести аффинное обогащение фаговой библиотеки на стафилококковом энтеротоксине А и определить уровень детекции SEA с помощью фаговых антител;

2. экспрессировать антитела в клетках Е. coli и выделить очищенные препараты миниантител в активной форме;

3. разработать способ хранения полученного препарата миниантител;

4. определить основные характеристики полученных миниантител: аффинность, специфичность;

5. провести картирование эпитопов SEA, распознаваемых полученными миниантител ами.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые были получены миниантитела человека в формате scFv против стафилококкового энтеротоксина А. На основе полученных фаговых антител разработан способ детекции SEA с

использованием фагового иммуно-ПЦР. Разработан способ выделения и ренатурации миниантител из телец включения методом гельфильтрации через слой раствора аргинина. Впервые показана возможность хранения лиофилизованного препарата фаговых миниантител. Установлены эпитопы взаимодействия полученных антител со стафилококковым энтеротоксином А.

Научно-практическая значимость работы

Полученные антитела возможно использовать для создания диагностического набора на основе твердофазного ИФА или ПЦР метода, а также терапевтического препарата с токсин-нейтрализующей активностью. Антитела могут быть перспективным инструментом для структурно-функциональных исследований стафилококковых энтеротоксинов.

Методология работы состояла из набора молекулярно-биологических методов, таких как технология фагового дисплея, молекулярное клонирование, экспрессия и выделение рекомбинантных белков, ПЦР. Характеристика антител проводилась с помощью физико-химических и иммунохимических методов: белковый электрофорез, спектроскопия кругового дихроизма, иммуно-ферментный анализ и иммуноблоттинг. Для установления эпитопов использовались базы данных и пакеты программ NCBI/BLAST, Chromas, GeneRunner 3.05, ClustalW, UCSF Chimera 1.6.2.

Положения, выносимые на защиту

1. Используя библиотеку миниантител, сконструированную на основе неиммунных доноров с помощью методов аффинной селекции возможно получить миниантитела к стафилококковому энтеротоксину А. Разработан способ детекции SEA с использованием полученных миниантител с помощью метода иммуно-ПЦР в фаговом формате.

2. Полученные рекомбинантные антитела эффективно экспрессируются в клетках Е. coli. Миниантитела синтезируются как в виде растворимого клеточного белка, так и виде телец включения. Полученные миниантитела успешно подвергаются рефолдингу телец включения с помощью метода

гельфильтрации через слой аргинина. Участие аргинина в данном процессе способствует повышению выхода ренатурированного препарата. 3. Полученные рекомбинантные антитела распознают разные эпитопы молекулы стафилококкового энтеротоксина А. Эпитопы представляют собой линейные участки длиной 5-7 аминокислот, локализованные на поверхности молекулы SEA.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2013), 9th IST Asia Pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Владивосток, 2011), 10-ом съезде Научного общества гастроэнтерологов России «Российские научные школы. Технологии качества» (Москва, 2010), на ежегодных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012), V Международная конференция «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008).

Диссертационная работа была апробирована на межлабораторном семинаре ФБУН ФИБХ РАН, и семинаре секции "Молекулярная биология" Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика.

Основные результаты по теме диссертации изложены в 10 работах: 4 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК; 6 - представлено в виде материалов конференций.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Энтеротоксины стафилококков

1.1.1. Стафилококки - условно-патогенные микроорганизмы

Бактерии рода Staphylococcus семейства Staphylococcaceae широко распространены в почве, воздухе, и входят в состав нормальной кожной микрофлоры человека. Согласно классификации Euzéby, 2010г., род Staphylococcus включает 42 вида и 24 подвида (Vasconcelos, Cunha, 2010). S. aureus - факультативно-анаэробный неспорообразующий грамположительный кокк с оптимумом метаболизма при 37°С. Проблему представляет то, что при благоприятных для микроорганизма условиях он переходит в патогенную форму и проявляет устойчивость к антибиотикам (З-лактамного ряда, традиционно использующихся в медицине для борьбы с такого рода инфекциями. Причинами патогенности S. aureus являются факторы вирулентности вырабатываемые бактерией - это и экзотоксины, включающие поверхностные капсульные компоненты, пептидогликаны, тейхоевые кислоты, липазы, каталазы, эксфолиативные токсины, лейкоцидины, гемолизины и многие другие компоненты (Dinges et al., 2000; Becker et al., 2003). Около 6% синтезируемого клеткой белка составляют энтеротоксины (Thomas et al., 2007; Lowy, 1998).

Отравление пищевыми продуктами, содержащими энтеротоксины стафилококков, широко распространено и находится на втором месте после отравлений, вызываемых сальмонельными инфекциями (Le Louir et al., 2003; Lowy, 1998; Bunning et al., 1997; Archer, Young, 1988). При пищевых отравлениях возможны различные осложнения, включая развитие пневмонии (Cheng et al., 2012), аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Howell et al.,1991.), атопический дерматит (Herz et al., 1999; Yarwood et al., 2000; Breuer et al., 2000; Ikezawa et al., 2010; Niebuhr et al., 2010), и аллергические заболевания.

1.1.2. Энтеротоксины стафилококков

Стафилококковые энтеротоксины (SE) наиболее полно охарактеризованные белки из семейства бактериальных суперантигенов. SE представляют собой небольшие молекулы белковой природы, с молекулярной массой 23 - 29 кД. На сегодняшний день описано более 20 различных стафилококковых энтеротоксинов (Holbrook et al., 1997; Lina et al., 2004; Ono et al., 2008; Chiang et al., 2008; Miller et al., 2009) и для большей части установлены их структуры. Номенклатурное название токсинов в алфавитном порядке соответствует времени открытия токсинов (Lina et al., 2004) (Таблица 1).

Таблица 1 - Основные характеристики семейства энтеротоксинов стафилококков (Lina et al., 2004)

SE ORF (bp) Длина предшественника (аа) Длина зрелого токсина (aaj MW (kDa) Pi

А 774 257 233 27.100 7.3

В 801 266 239 28.336 8.6

С! 801 266 239 27.53 1 8.6

С2 80! 266 239 27.531 7.8

сз 801 266 239 27.563 8.1

С (bo\ine) 27.618 7.6

С(sheep) 27.5 17 7.6

с: (unat) 27.600 7.0

L) * 777 258 228 26.360 7.4

г: 774 257 230 26.425 7.0

с. "7 "7*7 258 233 27.043 5.7

и 726 241 218 25.210 Nd

I 729 242 218 24.928 Nd

J 806 268 245 28.5652 8.65

к 729 242 219 25.539 6.5

L 723' 2401 215 24,593-' 8.66

м i 239' 217 24 S422 6.24

N 720' 258' 227 26.06 72 6.97

С) 783" 260' 232 26.777: 6.55

К энтеротоксинам относят только те токсины стафилококков, которые при пероральном введении вызывают рвотный эффект. Все остальные белки, имеющие структурное и функциональное сходство, но не оказывающие данного эффекта относятся к энтеротоксин-подобным белкам (Огшп а1., 2002; Ошое е1 а1., 2005). Свойство суперантигенности заключается в бифункциоанальности энтеротоксинов: одной частью молекулы они с высокой аффинностью взаимодействуют с антигенами гистосовместимости, экспонированными на

антигенпрезентирующих клетках, а другой - с участками Т-клеточных

рецепторов. Результатом такого взаимодействия является образование

комплекса двух клеток и неконтролируемая продукция набора лимфокинов

(Thomas et al., 2009; Profit, Fraser, 2003). При этом концентрация самого токсина

12 j ^

может быть очень малой и составлять 10" - 10" M (Choi et al., 1989; Marrack et al, 1990).

Для энтеротоксинов характерна гомология первичной структуры, которая составляет от 20% до 80% (Papageorgiou, Acharya, 2000; Munson et al., 1998) (Таблица 2).

Таблица 2 - Гомология стафилококковых энтеротоксинов

(Munson et al., 1998)

Ioxiit sr.л si .в slci su) six SI .ci sui si.i su si:m SUN su)

ska kw 33 30 50 s3 27 3 / 39 64 35 39 37

si. в I0Ü 68 35 32 43 33 31 о 29 32 36

sic 1 100 31 29 41 27 26 •m 26 29 33

su) изо 52 t- 35 51 41 38 39

su: 100 27 35 35 63 3, 39 37

six 100 34 28 29 2.S 31 30

SUI su 100 .и 100 35 í4 38 31 34 31 31 57

SU.) SI'.M 100 38 100 42 28 33 31

shn 100 42

sr.o 100

15% аминокислотных остатков консервативны и располагаются в центральной и С-концевой части молекулы (Dinges et al., 2000). Традиционно энтеротоксины разделяют на 4 группы по гомологии аминокислотной последовательности (Papageorgiou, Acharya, 2000). К первой группе относятся SEA, SED и SEE, имеющие 53 - 83% аминокислотной гомологии, а также SE1J, SEIN, SEIO и SE1P. Вторая группа включает SEB, SEC1-3, обладающие 66 - 98% аминокислотной гомологии, а