Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке

Нагорных, Алексей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке
ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке"

На правах рукописи

НАГОРНЫХ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА С ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА В СЫРОМ МОЛОКЕ

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Москва-2010

004600196

Работа выполнена в лаборатории санитарии молока Государственного

научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института

ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии

сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: Шурдуба Николай Александрович

кандидат ветеринарных наук, доцент (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты: Светличкин Вячеслав Владимирович

доктор биологических наук, профессор (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Никитченко Владимир Ефимович доктор ветеринарных наук, профессор (РУДН)

Ведущая организация: Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки

к _____

г. в часов на

Защита состоится «/t^C^lfü^- 2010

заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, д. 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « » $7¿¿jfctf"^ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Юдина A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В современных условиях при непрерывном повышении загрязнения окружающей среды вопросы гигиены сырого молока и контроля его качества становятся приоритетными. Поэтому к высококачественному молоку может быть отнесено лишь то молоко, которое соответствует предъявляемым к нему требованиям не только по пищевой ценности и органолептическим показателям, но прежде всего по безопасности потребления.

Среди микроорганизмов — возбудителей пищевых отравлений ведущее место по частоте выделения занимает золотистый стафилококк. Стафилококковые отравления при употреблении разнообразных пищевых продуктов, например, молочных, мясных, кондитерских, кулинарных изделий, являются результатом нарушения технологических режимов получения сырья, его переработки и реализации готовой продукции (Карташова В.М.Д980; Демидова Л.Д.,1995; Когшпе К., 2000).

Особенностью интоксикаций стафилококковой природы является то, что они возникают в результате воздействия на организм энтеротоксинов, а не живых микробных клеток. Другими словами, термическая обработка продуктов убивает стафилококк, но не разрушает его токсины, и отравление наступает даже после длительного проваривания и прожаривания пищи. Это обстоятельство затрудняет выявление причин вспышек микробиологическими методами, заставляя прибегать к методам обнаружения энтеротоксинов (Карташова В.М.,1980; Флуер Ф.С.,1991; ВигсЫа О.,1994; КогруБа XV., 2002).

лококковой этиологии, от чего часто погибают (Adesiyun А.Р., 1995; Garcia M.L., 1980; Kuroishi Т., 2002).

Для эффективной оценки роли стафилококков в возникновении пищевых отравлений самого факта выделения культуры стафилококков, даже коагулазопозитивных, недостаточно, тем более, что в пищевых продуктах, содержащих патогенные дозы энтеротоксина, жизнеспособные микробные клетки могут и не выявляться. Поэтому в процессе биологической диагностики стафилококковых пищевых отравлений необходимо преследовать двойную цель: найти энтеротоксигенные стафилококки и выявить энтеротоксин. Оба патогена надо исследовать на всех этапах эпидемической цепи и тогда определение стафилококков позволит конкретно выяснить источник и механизм развития токсикоза, а нахождение энтеротоксина в продукте и в материале от потерпевших -окончательно подтвердить диагноз пищевой стафилококковой интоксикации.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка иммуноферменгной тест-системы для индикации стафилококкового энтеротоксина типа С в сыром молоке.

В задачи исследований входило:

1. Определить уровень контаминации молока и секрета вымени лактирую-щих коров с различным состоянием молочной железы золотистыми, в том числе энтеротоксигенными, стафилококками.

2. Определить типы энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, выделенных из молока и секрета вымени лактирующих коров и отобрать наиболее токсигенные штаммы для последующей иммунизации, выделить и очистить энтеротоксин типа С S.aureus.

3. Провести гипериммунизацию кроликов с целью получения антиэнтеро-токсических сывороток, выделить и очистить иммуноглобулины к энтероток-сину типа С золотистого стафилококка.

4. Создать иммуиоферментную тест-систему к энтеротоксину типа С золо-

тистого стафилококка, изучить ее чувствительность и специфичность.

5. Разработать методику индикации энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке и определить ее эффективность.

Научная новизна. Получены данные, характеризующие высокий уровень контаминации молока и секрета вымени коров энтеротоксигенными золотистыми стафилококками в зависимости от функционального состояния молочной железы. Определен спектр типов энтеротоксинов у золотистого стафилококка и выявлен энтеротоксин типа С как наиболее часто встречающийся в сыром молоке и секрете вымени здоровых и больных маститом коров.

Подобрана оптимальная плотная среда и способ культивирования для накопления стафилококкового энтеротоксина типа С. Получен в виде гомогенного белка очищенный концентрат энтеротоксина типа С. Установлена наиболее эффективная схема иммунизации кроликов, которая позволила за короткий срок с меньшими затратами энтеротоксина и без гибели подопытных животных получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка.

Получены очищенные иммуноглобулины, которые были использованы для разработки тест-системы на основе ИФА для определения энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке, отработаны основные параметры тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции.

Разработан доступный способ пробоподготовки для ИФА с целью снижения фонового влияния компонентов сырого молока на чувствительность тест-системы.

Практическая ценность работы.

На основании результатов исследований совместно с Шурдуба Н.А. и Сотниковой В.М. разработаны «Методические рекомендации по разработке иммуноферментной тест-системы для индикации и идентификации

энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.)

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- 16-м Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2008 г.);

- VI и VII Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007,2008 гг.);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008 г.);

- расширенном заседании лаборатории санитарии молока ВНИИВСГЭ (2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных статьей, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 стр. компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 163 источника (42 отечественных и 121 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 15 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований Работа осуществлялась в период с 2006 по 2009 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в соответствии с ГНТП 08.05.02.10 «Разработать иммуноферментный метод индикации энтеротоксина золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах».

Пробы молока и секрета вымени от коров с различным состоянием

молочной железы, а также сборное молоко отбирали в хозяйствах и частных подворьях Московской, Вологодской и Смоленской областей, ветеринарным специалистам которых приносим глубокую благодарность за предоставленную возможность работать в производственных условиях.

Всего в процессе работы было исследовано 442 пробы молока и секрета молочных желез, выполнено более 1636 бактериологических, иммунологических, биохимических и микроскопических исследований.

В работе использовали штаммы различных тест-микроорганизмов из коллекции лаборатории санитарии молока, а также полевые штаммы S. aureus, выделенные из молока и секрета вымени коров, больных маститом.

При диагностике субклинической формы мастита исследовали секрет молочной железы при помощи быстрого маститного теста, постановки пробы отстаивания и бактериологического исследования молока.

Быстрый маститный тест проводили с 2%-ным раствором мастидина в соответствии с «Рекомендациями по борьбе с маститом коров» (1983).

Бактериологические исследования отобранных образцов проводили, руководствуясь «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» (1983) и ГОСТом 30347-97 Молоко и молочные продукты. «Методы определения Staphylococcus aureus».

Идентификацию культур золотистых стафилококков осуществляли на основе изучения способности коагулировать плазму крови кролика (ГОСТ 30347-97) и ДНК-азной активности( Lachica R.V. et al.,1971). Для определения ДНК-азной активности использовали готовый агар для теста на ДНК-азу с толуидиновым голубым.

В качестве референтной тест-системы использована иммуноферментная тест-система RIDASCREEN®SET A,B,C,D,E фирмы R-Biopharm, Германия (МУ 4.2.2429-08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах»).

Для получения токсинсодержащего материала культивирование

отобранных штаммов S. aureus проводили на плотных питательных средах: среде Casman и мясо-пептонном агаре с добавлением 5% дрожжевого экстракта.

Токсигенную культуру выращивали с применением целлофана (Major R.F, 1978).

Очистку энтеротоксина проводили путем высаливания сульфатом аммония (Hebert G.A. et al., 1973), а также на колонках с Сефадексом-С75. Концентрирование энтеротоксина проводили в полиэтиленгликоле (Poison A.et al., 1964).

Концентрацию энтеротоксина и иммуноглобулинов определяли с помощью красителя кумасси бриллиантового синего G-250 по методу Sendmack Р., Grossberg М.С. (1977) на спектрофотометре СФ-26 (JIOMO, г. Санкт-Петербург).

Антиэнтеротоксические сыворотки получали путем иммунизации кроликов породы шиншилла весом 2,5-3 кг по 3-м оригинальным схемам.

При изучении титра антител использовали метод двойной радиальной иммунодиффузии в 1,5% агаровом геле Difco, USA (Ouchterlony О., 1958).

Получение конъюгатов IgG с пероксидазой из хрена проводили по методу перйодатного окисления (Nakane P.K. and Kawaoi A., 1974).

Содержание молочного жира определяли по ГОСТ 5867-90 Молоко и молочные продукты. «Методы определения жира».

Статистическую обработку полученных данных, построение необходимых графиков и диаграмм проводили с использованием компьютерной программы Excel.

Результаты исследований

1. Определение уровня контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров золотистыми, в том числе

энтеротоксигенными, стафилококками.

Для выяснения уровня обсеменения молока золотистыми

стафилококками были проведены микробиологические исследования сборного молока и секрета вымени от лактирующих коров с различным состоянием молочной железы.

Так, из молока и секрета вымени здоровых и больных маститом коров было выделено 168 штаммов (38%) золотистого стафилококка, из них 8 (8,7%) штаммов из молока клинически здоровых коров, 128 (59,3%) штаммов — из молока коров, больных субклиническим маститом. Наряду с этим было обнаружено, что из секрета вымени коров с клинической формой воспаления выделяли 21 (28,8%) штамм S.aureus, что в 2 раза меньше, чем из молока коров, больных субклиническим маститом. Также было выявлено 11 (18%) штаммов S.aureus из сборного молока, что в 3,2 раза меньше, чем из молока коров с субклинической формой мастита.

По встречающимся в литературе сведениям, в нашей стране практически не определялись энтеротоксигенные стафилококки, выделенные из молока и секрета вымени больных маститом и здоровых коров, а имеющиеся данные противоречивы. Поэтому нам было необходимо выяснить, какие из типов энтеротоксинов чаще встречаются среди энтеротоксигенных золотистых стафилококков, выделенных из молока, и, соответственно, под какой тип энтеротоксина необходимо в первую очередь создавать тест-систему.

Каждую культуру золотистого стафилококка, выделенную из проб молока и секрета вымени, проверяли на способность продуцировать энтеротоксины.

Было обнаружено, что энтеротоксигенные золотистые стафилококки в сборном молоке выявлялись в 36,4%, тогда как в молоке здоровых коров и секрете вымени больных клиническим маститом — в 25,0 и 33,3% соответственно. Наибольшее количество штаммов S. aureus, вырабатывающих энтеротоксины, выявлялось в молоке коров с субклинической формой мастита (42,2%), что коррелирует со значительным процентом (59,3%) обнаружения золотистых стафилококков при этой форме заболевания.

2. Исследования по определению типов энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, отбор наиболее токсигенных штаммов для последующей иммунизации, выделение и очистка энтеротоксина типа С S.aureus.

Следующим этапом наших исследований стало определение серологических типов энтеротоксинов у выделенных культур S.aureus. Наиболее часто выявлялись штаммы S.aureus, продуцирующие энтеротоксины типа С (53,8% от числа энтеротоксигенных стафилококков). Причем количество распределялось приблизительно в равной пропорции между штаммами S. aureus, выделенными из сборного молока и секрета вымени коров с различным состоянием молочной железы; по 13,4% - типы D (были обнаружены только у клинически больных коров) и CD (чаще у здоровых коров — 50% от числа всех выделенных штаммов, вырабатывающих энтеротоксин типа CD). Что касается других типов энтеротоксинов, выявленных среди энтеротоксигенных стафилококков, то обнаруживались следующие: А, В, АВ, ВС, ABC, ACD и CDE - в количестве от 1,5 до 4,5%.

Несмотря на то, что золотистые стафилококки, вырабатывающие токсин типа С, выявлялись в 53,8% случаев от всех выделенных энтеротоксигенных культур стафилококков, нас интересовал вопрос о максимальной встречаемости энтеротоксинов различных типов, поскольку 29,9% штаммов S.aureus вырабатывали два и три различных типа энтеротоксинов одновременно.

Так, энтеротоксин типа С выявлялся в 80,9% случаев среди энтеротоксигенных золотистых стафилококков, энтеротоксин типа D встречался в 2,5 раза реже, чем энтеротоксин типа С, а типы А и В — в 6,7-7,7 раза, причем максимальное количество энтеротоксинов всех типов было обнаружено у S.aureus в молоке коров, больных субклиническим маститом.

Исходя из полученных данных по частоте встречаемости различных типов энтеротоксинов S.aureus, выделенных из молока здоровых и больных маститом коров, было решено разработать иммуноферментную тест-систему по

выявлению энтеротоксина типа С, поскольку он наиболее часто вырабатывается у обнаруженных золотистых стафилококков.

Подбор энтеротоксигенного штамма S. aureus и способа культивирования для накопления энтеротоксина типа С

Для выявления лучшего штамма-продуцента энтеротоксина типа С были проведены предварительные исследования с использованием в качестве питательной среды скошенного МПА.

Из 36 штаммов золотистого стафилококка, продуцирующих энтеротоксин типа С, диапазон колебаний концентрации белка составил от 2 до 132 мкг/мл. Только два штамма S. aureus вырабатывали энтеротоксин в значительном количестве — 120 и 132 мкг/мл, поэтому один из них и было решено использовать в дальнейших опытах.

В качестве среды для накопления энтеротоксина типа С использовали среду Casman, не содержащую белка.

Получение энтеротоксина типа С золотистого стафилококка для •иммунизации кроликов

Так как энтеротоксины золотистого стафилококка, особенно неочищенные, обладают значительной термоустойчивостью, на первом этапе с целью дополнительной очистки от микроорганизмов и образовавшихся нерастворимых частиц надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования смыва культуры, выращенной на среде Casman, прогревали на водяной бане при температурах от 50 до 80°С в течение 10-30 минут с последующим центрифугированием в течение 10 минут при 3500 g с отбрасыванием осадка. Поскольку известно, что антигенную структуру стафилококковый энтеротоксин сохраняет при нагревании до 80°С в течение 20 мин, было решено выяснить, какая предельно-минимальная температурно-временная экспозиция влияет на максимальное осаждение балластных белков при сохранении антигенности энтеротоксина. Качество осаждения контролировали спектрофотометрически по оставшемуся в надосадочной

жидкости белку.

Оптимальным оказалось нагревание культуралыюго центрифугата в водяной бане при температуре 80°С в течение 20 мин, поскольку нагревание супернатанта до 50-60°С не давало значительного осаждения балластных белков, а прибавление времени нагревания при температуре 80°С не увеличивало осаждение нерастворимых частиц. При оптимальной экспозиции данный этап позволил предварительно очистить энтеротоксин в 1,4 раза.

На втором этапе мы очищали энтеротоксин с помощью сульфата аммония. Диапазон рекомендуемых конечных концентраций сульфата аммония при высаливании энтеротоксинов варьируется в пределах 60-80%, поэтому были проведены исследования по определению оптимальной концентрации сульфата аммония для осаждения энтеротоксина.

В результате проведенных исследований было установлено, что наибольший выход энтеротоксинсодержащего белка обеспечивало высаливание сульфатом аммония до 70% концентрации, при этом содержание токсического белка, выпадающего в осадок, было выше в 1,8 раза по сравнению с концентрацией 40-50% и в 1,2 раза — при концентрации 60%, тогда как повышение концентрации сульфата аммония до 80% не давало значительных изменений в количестве осажденного белка.

После насыщения надосадочной жидкости сухим сульфатом аммония до 70%, выдерживания в течение ночи в холодильнике при 8°С и центрифугирования образовавшийся осадок растворяли в дистиллированной воде, диализовали и повторно центрифугировали, после чего проводили гельфильтрацию на колонке с Сефадексом G75, повторный диализ и концентрирование в 50% -ном растворе полиэтиленгликоля с молекулярной массой 19000-20000 Д. Полученный антиген использовали для иммунизации кроликов и в качестве положительного контроля при конструировании иммуноферментной тест-системы.

3. Выбор схемы гипериммунизации для получения антиэнтеротоксичсских стафилококковых сывороток и определение их специфичности, выделение и очистка иммуноглобулинов к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка.

Для получения антиэнтеротоксических сывороток нами использованы три схемы иммунизации, которые отличались количеством и кратностью вводимого антигена.

1-ая схема: иммунизацию начинали с 50 мкг энтеротоксина, через каждые 7 дней вводили соответственно 150, 250, 500 мкг энтеротоксина. Цикл иммунизации длился 5 недель.

2-ая схема: иммунизацию начинали с 5 мкг энтеротоксина. Дальнейшие введения проводили с интервалом в 7 дней в следующих дозах: 10,20,50,100, 200,250, 500 мкг. Общий цикл иммунизации длился 9 недель.

3-ая схема: иммунизацию начинали с 50 мкг энтеротоксина, затем через каждые 2 недели вводили по 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 мкг. Иммунизация длилась 17 недель.

В каждой схеме иммунизации было использовано по 3 кролика породы Шиншилла весом 2,5-3,0 кг. Смесь, содержащую энтеротоксин типа С и адъювант Фрейнда в соотношении 1:1, в количестве 2 мл вводили кроликам подкожно в область спины в несколько точек (по 0,4-0,5 мл). Два кролика были контрольными, которые содержались в аналогичных условиях. Через 7 дней после окончания последней иммунизации кроликов проводили тотальное обескровливание. Полученную кровь отстаивали, отделившуюся сыворотку сливали, центрифугировали для освобождения от эритроцитов, разливали в пластмассовые капсулы объемом 1 мл, укупоривали, этикировали и хранили в замороженном состоянии при -20°С.

Титр полученных антисывороток тестировали методом диффузной преципитации в агаровом геле. В качестве антигена применяли очищенный препарат энтеротоксина С, использовавшийся при иммунизации. В качестве

отрицательного контроля использовали нормальную кроличью сыворотку, сыворотку каждого кролика тестировали отдельно.

Максимальный титр антисывороток составил ] :32. Несмотря на то, что в среднем при различных схемах иммунизации титр был примерно одинаков, более эффективной оказалась 1-ая схема, так как при этом способе затрачено меньшее количество антигена, количество введений и длительность цикла были минимальными.

Проверку специфичности антисыворотки к энтеротоксину типа С проводили с супернатантами полевых и музейных культур S.aureus, вырабатывающих энтеротоксины типов А, В, С и D, а также с супернатантами, полученными после выращивания музейных штаммов Е. coli О 139 ВГНКИ, Proteus vulgaris «ЗП», Morganella morganii Зг/85, Citrobacter freundii №1 Ульян., Enterobacter aerogenes №3.

Антисыворотка стафилококкового энтеротоксина типа С характеризовалась высокой специфичностью, так как она образовывала одну полосу преципитата с супернатантами, полученными при выращивании полевого штамма S.aureus, вырабатывающего энтеротоксин типа С, а с остальными гетерологичными супернатантами результаты реакции диффузной преципитации были отрицательными.

Полученные моноспецифические высокоактивные

антиэнтеротоксические сыворотки позволили перейти к созданию иммуноферментной тест-системы.

Получение иммуноглобулинов и конъюгата пероксидаза-антиэнтеротоксические иммуноглобулины

Иммуноглобулины рекомендуется осаждать насыщенным раствором сульфата аммония, забуференным до рН=7,3, при конечном насыщении 33% в сыворотке. Однако имеются сведения, что наибольший выход иммуноглобулинов наблюдается при 40-45% насыщении сульфатом аммония. В связи с этим были проведены опыты по определению оптимальной

конечной концентрации сульфата аммония с целью получения максимального количества очищенных иммуноглобулинов, полученных в наших условиях.

В опытах были испытаны следующие концентрации сульфата аммония: 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% и 60%. Значительного осаждения иммуноглобулинов удалось добиться при конечном насыщении раствора до 45%, (выход белка составил 92% против 73-78% при концентрациях 30-40%). Дальнейшее повышение концентрации сульфата аммония оказалось неэффективным, так как не позволило увеличить выход иммуноглобулинов.

Степень чистоты пероксидазы характеризуется по величине отношения оптической плотности раствора при 403 нм к величине, полученной при 280 нм, и выражается коэффициентом чистоты — RZ. Для работы мы использовали пероксидазу фирмы «Sigma» (США), с коэффициентом чистоты 3,0, что является обязательным условием для приготовления конъюгата белок-фермент. Для ковалентного связывания фермента — пероксидазы хрена с иммуноглобулинами выбран метод перйодатного окисления. Очистку конъюгата проводили сульфатом аммония и диализом. После диализа определяли оптическую плотность конъюгатов на спектрофотометре при 280 и 403 нм. Известно, что для конструирования иммуноферментных тест-систем наилучшим является коньюгат с показателями Rz от 0,4 до 0,6. В результате контроля коэффициента чистоты было установлено, что для иммобилизации достаточной является концентрация белка 8 мг на 1 мл, так как при использовании 10 мг/мл показатель соотношения экстинкции пероксидазы хрена и белка оставались на том же уровне при большем расходе белка. 4. Отработка параметров иммунофермеитной тест-системы Конструирование иммуноферментного диагностикума включало поиск оптимальных параметров тест-системы, от которых зависят чувствительность и специфичность проводимой реакции. Важным фактором в разработке тест-системы являлось определение условий адсорбции на твердой фазе, т. е. установление оптимальной концентрации иммуноглобулиновой фракции

антиэнтеротоксических антител, состава сенсибилизирующего буфера, условий отмывания несвязавшихся компонентов, времени и температуры связывания иммуноглобулинов с поверхностью лунок полистироловых планшетов, рабочей дозы приготовленного специфического конъюгата антител с пероксидазой.

Определение оптимальной концентрации антител и оптимальных условий блокирования

Для подбора оптимальных условий сорбции оценивали интенсивность иммуноферментной реакции при различных концентрациях иммуноглобулинов в растворе. Недостаток антител приводит к снижению чувствительности теста, а избыток к перерасходу дорогостоящего реагента. На достоверность результатов ИФА оказывает влияние неспецифическое связывание реагентов со свободными сайтами полистироловых планшет. В наших экспериментах мы испытывали различные количества антител в интервале 1-20 мкг/мл. Процесс адсорбции антител оценивали по интенсивности реакции с контрольными специфическими и негативными сыворотками. Определяли средние величины (коэффициент позитивности) P/N, где Р и N — показатели оптической плотности положительной и отрицательной контрольной сывороток. Чем выше данный показатель, тем эффективнее шел процесс адсорбции. Самый высокий уровень насыщения поверхности планшет .достигался при концентрации белка, равной 10 мкг/мл, так отношение P/N варьировало от 4,1 до 5,2 при выборе концентраций 1,2,4,20 мкг/мл, а при внесении антител в концентрации 10 мкг/мл показатель был равен 6,5.

С целью снижения неспецифической реакции были проведены исследования по уменьшению фоновых «помех» при использовании различных концентраций бычьего сывороточного альбумина (БСА) в буферном растворе для разведения энтеротоксина, конъюгата, и в качестве промывочного раствора. Были испытаны концентрации БСА 0,1%, 0,5%, 1%, 2%.

Исследования, проведенные в этом направлении, позволили установить,

что блокирование свободных центров связывания на планшете целесообразно проводить 0,5% раствором БСА на фосфатно-солевом буфере рН 7,4 с добавлением 0,05% Твин-20, поскольку использование БСА в буфере уменьшало фоновые «помехи», на что указывали максимальные значения Р/Ы-показателей, которые соответствовали для концентрации 0,1%- 4,2; 0,5%-6,3; 1%-5,6;2%-5,8, тогда как без использования БСА этот показатель равнялся 3,8. На основании этих данных в последующих исследованиях блокирование осуществляли 0,5%-ным раствором БСА в буферном растворе.

Определение влияния рН буферных растворов при фиксации на планшетах поликлональных антител к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка.

Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН комплексирующего буфера. Полистироловые планшеты сенсибилизировали антителами к энтеротоксину золотистого стафилококка в буферных растворах с рН от 4,0 до 10,0: ацетатном, фосфатном и карбонат-бикарбонатном. Все буферные растворы содержали по 10 мкг/мл поликлональных антител к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка.

На основании анализа результатов проведенных исследований было установлено, что при рН 9,6 0,1М карбонат-бикарбонатного буфера обеспечивался самый высокий уровень адсорбции поликлональных антител к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка на поверхности полистироловых планшет.

Оптимизация условий иммобилизации антител

Следующим этапом наших исследований стало изучение влияния температуры и времени экспозиции на адсорбцию антител к энтеротоксину типа С в лунках планшета. С этой целью испытывали режимы иммобилизации в течение 24 ч при температуре 4°С, 16 ч при 20°С и 1 ч — при 37°С.

Анализ результатов проведенных исследований позволил установить, что оптимальным для сенсибилизации лунок планшета иммуноглобулинами

является режим при температуре 4°С в течение 24 ч или в течение 16 ч при температуре 20°С (коэффициент позитивности равен 5,6-6,0), в то время как при 37°С и выдержке в 1 ч адсорбционная способность иммуноглобулинов несколько ниже (коэффициент позитивности около 4,2).

Определение оптимального разведения коньюгатов

Для определения оптимального уровня активности полученных конъгогатов при проведении ИФА подбирали оптимальное рабочее разведение, дающее максимальную цветовую реакцию при внесении их в полистироловые планшеты. В лунки планшет добавляли разведения коньюгатов в концентрациях 1:200, 1:400, 1:600, 1:800, 1:1000. Рабочим разведением конъюгата служила концентрация, при которой выявляли наибольшее разведение антител при минимальном фоне неспецифической адсорбции.

Было установлено, что при рабочем разведении 1:600 коэффициент позитивности составил 12,1 против 9,8-10,6 при разведениях 1:1000-1:800. При изменении концентрации в диапазоне 1:400-1:200 существенной разницы в значениях коэффициента позитивности отмечено не было. Данный факт свидетельствует о насыщении сорбционной емкости планшета конъюгатом, начиная с разведения 1:600.

Определение оптимальной продолжительности инкубации энтеротоксина типа С 8.аигеи.я в тест-системе ИФА.

Для определения оптимальной продолжительности инкубации антигена в непрямом твердофазном методе ИФА, оценивали интенсивность реакции по коэффициенту позитивности в зависимости от времени инкубирования (15,30,60,90 минут) при температуре 37°С.

Результаты проведенных нами исследований позволили установить, что 60 - минутная экспозиция при температуре 37°С является оптимальным временем инкубации энтеротоксина типа С с адсорбированными иммуноглобулинами при постановке непрямого ИФА, поскольку установлено, что коэффициент позитивности в диапазоне от 15 до 60 мин возрастал с 10,4

до 13,8, а далее стабилизировался.

Определение чувствительности и специфичности тест-системы

В модельных опытах для реакции с адсорбированными на поверхности полистироловых планшет специфическими антителами к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка готовили двукратные разведения энтеротоксина типа С в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% Твин-20 и 0,5% БСА (ФСБ-ТВ-БСА) в следующих количествах: 1000 нг/мл, 500 нг/мл, 250 нг/мл, 125 пг/мл, 63 нг/мл, 32 нг/мл, 16 нг/мл, 8 нг/мл, 4 нг/мл, 2 нг/мл, 1 нг/мл, 0,5 нг/мл (по белку). В качестве отрицательного контроля использовали иммуноглобулины нормальной сыворотки крови кролика в концентрации 10 мкг/мл. Для определения предела чувствительности метода использовали формулу определения величины Х+Зб, где X - среднее арифметическое отрицательных контрольных проб, в - стандартное отклонение. Стандартное

отклонение рассчитывали по формуле s= ± , где £D2=Di2+ D22 + D32 +

D42+ D„2. Db D2, D3 и т.д. - отклонение отдельных измерений (m) от среднего арифметического (X), т. е. D„= X-mn, где п- число измерений. То наименьшее количество энтеротоксина, для которого значение оптической плотности еще превышало величину X+3s, принимали за характеристику чувствительности метода.

Чувствительность выявления стафилококкового энтеротоксина типа С составила 8 нг/мл.

Для определения специфичности разработанной тест-системы ИФА по выявлению энтеротоксина типа С золотистого стафилококка мы провели серию опытов с внеклеточными продуктами изолятов полевых культур и музейных штаммов S. aureus, продуцирующих и не продуцирующих энтеротоксин типа С, а также энтеробактерий, которые исследовали в концентрациях 125 нг/мл, 63 нг/мл, 32 нг/мл, 16 нг/мл, 8 нг/мл, 4 нг/мл (по белку в надосадочной

жидкости). В качестве контроля использовали соответствующие разведения нормальной сыворотки кролика.

Показатели экстинкции гетероперекрестных реакций адсорбированных на планшете поликлональных антиэнтеротоксических антител с растворимыми антигенами различных штаммов микроорганизмов находились в границах оптических единиц от 0,072 до 0,116. Анализ данных позволил установить, что у иммуноглобулинов к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка отсутствуют перекрестные реакции с гетерологичными антигенами используемых культур микроорганизмов, поскольку значения величин оптической плотности во всех случаях были ниже порога чувствительности и даже ниже значений оптической плотности в отрицательном контроле.

Определение диагностической чувствительности разработанного иммуноферментного метода в сравнении с референтной тест-системой.

Диагностическую чувствительность иммуноферментной тест-системы определяли путем сравнения результатов, полученных с ее использованием, и результатов при применении коммерческой тест-системы RIDAS CREEN®SET A,B,C,D,E (R-Biopharm, Германия). С этой целью с помощью разработанной тест-системы проводили скрининг 36 штаммов золотистого стафилококка, вырабатывающих энтеротоксин типа С.

Исследованиями выявлено, что при использовании разработанной тест-системы из 36 культур S.aureus 35 были положительными в отношении выработки энтеротоксина типа С и 1 - отрицательной. На основании полученных результатов рассчитали диагностическую чувствительность разработанной тест-системы по отношению к коммерческой. Установлено, что диагностическая чувствительность разработанного диагностикума составила 97,2%.

5. Определение возможности обнаружения энтеротоксина типа С в сыром молоке с помощью разработанного метода ИФА.

В связи с тем, что молоко содержит жир, казеин и растворимый в молоке

протеин А золотистых стафилококков, было необходимо выяснить фоновое влияние компонентов сырого молока на чувствительность тест-системы при определении стафилококкового энтеротоксина типа С. Были проведены исследования 15 проб молока от здоровых лактирующих коров, полученных из молочно-товарных ферм Московской области на наличие S.aureus. Пробы, в которых не был обнаружен золотистый стафилококк, исследовали на наличие энтеротоксинов с помощью коммерческой тест-системы RIDASCREEN®SET A,B,C,D,E и использовали в последующих опытах. Дня искусственной контаминации стафилококковым энтеротоксином типа С было взято свободное от энтеротоксинов молоко с 4,2%-ной жирностью. В опытах использовали сырое молоко 2,1%, 1,0% и 0,5%-ной жирности (указанную жирность получали методом разведения). В качестве положительного контроля использовали растворы аналогичных концентраций стафилококкового энтеротоксина типа С в ФСБ-ТВ-БСА, а в качестве отрицательного — иммуноглобулины нормальной кроличьей сыворотки в концентрации 10 мкг/мл.

В 50 мл чистого от энтеротоксинов молока вносили стафилококковый энтеротоксин типа С таким образом, чтобы достичь концентрации в растворе 250 нг/мл, 125 нг/мл, 63 нг/мл, 32 нг/мл, 16 нг/мл, 8 нг/мл, тщательно перемешивали, выдерживали 30 мин при комнатной температуре и подвергали ИФА.

При сравнении данных с результатами, которые были получены при добавлении этих же количеств стафилококкового энтеротоксина типа С к ФСБ-ТВ-БСА было сделано заключение о том, что жиры и белки молока понижают чувствительность выявления энтеротоксина типа С, причем молоко 4,2%-ной жирности — в 8 раз, 2,1%-ной и 1,0%-ной жирности — в 4 раза, 0,5%-ной — в 2 раза.

С целью устранения фонового влияния молочного жира и белков молока на чувствительность выявления энтеротоксина типа С нами были проведены исследования различных вариантов пробоподготовки.

Во всех вариантах казеин молока осаждали соляной кислотой, а протеин А связывали нормальной кроличьей сывороткой.

При использовании 1-го способа пробоподготовки (центрифугирование проб при комнатной температуре при 7880 в в течение 30 мин) чувствительность ИФА-метода для образцов молока 0,5%-ной жирности сравнялась с таковой в положительном контроле при конечной концентрации энтеротоксина в продукте 8 нг/мл, 1%-ной жирности — 16 нг/мл, тогда как подготовка образцов молока более высокой жирности подобным образом не дало результатов. 2 вариант пробоподготовки

Поскольку значительная часть жира после центрифугирования при комнатной температуре оставалась в испытуемом растворе, то для устранения влияния жира на чувствительность выявления энтеротоксина было решено центрифугировать пробы при охлаждении при температуре 15°С при 7880 g в течение 45 мин.

Использование центрифугирования при 15°С во 2-м способе пробоподготовки позволило определять концентрацию энтеротоксина не менее 8 нг/мл в молоке 1,0 и 2,1%-ной жирности и до 16 нг/мл в молоке 4,2%-ной.

3 вариант пробоподготовки

С целью более эффективного удаления молочного жира центрифугирование проводили при 7880 g при температуре 4°С, позволило убрать фоновое влияние компонентов молока высокой жирности на результаты в ИФА-анализе, так как центрифугирование при 4° С позволило выявлять энтеротоксин типа С в молоке 4,2%-ной жирности в концентрации 8 нг/мл.

Таким образом, наиболее эффективным оказался 3-й вариант пробоподготовки, поскольку показатели оптической плотности во всех пробах молока различной жирности были выше порога чувствительности метода при концентрации энтеротоксина 8 нг/мл, что соответствует чувствительности разработанной иммуноферментной тест-системы.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что с помощью данной тест-систсмы можно выявлять энтеротоксин типа С золотистого стафилококка в сыром молоке независимо от присутствия самих стафилококков, чувствительность и специфичность тест-системы высоки, и она может использоваться для выявления минимального количества энтеротоксина — 8 нг/мл.

ВЫВОДЫ

1. Из молока лактирующих коров, больных субклиническим маститом, было выделено 59,3% штаммов золотистого стафилококка, из секрета вымени коров с клинической формой мастита и сборного молока — 28,8% и 18,0% соответственно, тогда как из четвертей вымени клинически здоровых коров было выделено лишь 8,7% S.aureus.

2. Уровень контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров энтеротоксигеннымии штаммами золотистого стафилококка зависит от характера патологического процесса в вымени и составил 42,2% при субклиническом мастите, 36,4% - в сборном молоке, 33,3% при клинической форме мастита и 25,0% у здоровых коров.

3. Наиболее часто (53,8% от общего числа выделенных типов энтеротоксигенных штаммов S.aureus) в молоке и секрете вымени лактирующих коров обнаруживали золотистые стафилококки, продуцирующие только один энтеротоксин типа С. В 29,9% случаях у выделенных штаммов золотистого стафилококка обнаруживали способность одновременно вырабатывать 2-3 типа различных энтеротоксинов. Энтеротоксин типа С выявляли в 80,9% случаев среди выделенных энтеротоксигенных стафилококков, вырабатывающих данный токсин как отдельно, так и в комплексе с другими типами энтеротоксинов.

концентрат энтеротокеина типа С, проведена гипериммунизация кроликов по оптимальной схеме, получены гипериммунные диагностические антиэнтеротоксические сыворотки с титром 1:32 в реакции диффузной преципитации.

5. Предложена методика получения максимального выхода очищенных иммуноглобулинов к энтеротоксину типа С при 45%-ном насыщении сульфатом аммония исходной гипериммунной сыворотки. На основе полученных антиэнтеротоксических иммуноглобулинов к энтеротоксину типа С приготовлен конъюгат с коэффициентом чистоты 0,51.

6. Разработан доступный способ пробоподготовки сырого молока для ИФА, заключающийся в осаждении казеина в кислой среде и последующем центрифугировании образцов при 4°С с целью удаления молочного жира и казеина.

7. Разработана специфичная иммуноферментная тест-система для обнаружения энтеротокеина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке с диагностической чувствительностью 97,2% по отношению к коммерческому диагностикуму. Чувствительность иммуноферментной тест-системы составила 8 нг/мл.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ На основании проведенных исследований материалы по разработке иммуноферментной тест-системы для определения энтеротокеина типа С в сыром молоке включены в разделы 3,4,5,6,7,8 и 9 ((Методических рекомендаций по разработке иммуноферментной тест-системы для индикации и идентификации энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Нагорных A.M. Выявление энтеротокеина золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах.// Материалы VI Международной научной

конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, МГУПБ, 2007, с. 240-241.

2. Нагорных A.M. Уровень контаминации молока энтеротоксигенными золотистыми стафилококками у здоровых и больных маститом коров.// Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, МГУПБ, 2008, с. 313-314.

3. Нагорных A.M. Взаимосвязь между заболеваемостью коров маститом и обнаружением в молоке и секрете вымени энтеротоксигенных стафилококков.// Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА, 20-22 мая 2008 г, T.IV, Вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ, биотехнологии, Ульяновск, 2008, с.119-120.

4. Шур дуба H.A., Сотникова В.М., Нагорных A.M. Определение энтеротоксигенности Staph.aureus, выделенного из молока и молочных продуктов.// Сборник научных трудов ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», № 1, 2009, с. 20-23.

5. Нагорных A.M. Иммуноферментный метод определения стафилококкового энтеротоксина типа С в культурах золотистого стафилококка, выделенных из молока здоровых и больных маститом коров.// Журнал «Ветеринарная патология», Москва, № 4, 2009, с.23-27.

ВНИИВСГЭ, 2010 г., г. Москва, Звенигородское шоссе, д.5 Заказ 33 ?/-/ Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Нагорных, Алексей Михайлович

1 введение

2 обзор литературы.

2. 1 История возникновения стафилококковых пищевых отравлений.

2.2 Систематика и общие свойства стафилококков.

2.3 Роль энтеротоксигенных стафилококков в этиологии клинического и субклинического мастита коров.

2.4 Факторы, влияющие на накопление энтеротоксина S. aureus в молоке и продуктах животного происхождения.

2.5 Физико-химические, биологические, антигенные и иммуногенные свойства стафилококковых энтеротоксинов.

2.6 Получение и очистка стафилококковых энтеротоксинов, выделенных из культур S. aureus.

2.7 Методы определения стафилококковых энтеротоксинов.

3. собственные исследования.

3.1 Материалы и методы.

3.2 Результаты исследований.

3.2.1 Определение уровня контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров золотистыми стафилококками.

3.2.2 Выявление энтеротоксигенных штаммов S. aureus и определение типов энтеротоксинов.

3.2.3 Подбор штамма S. aureus, питательных сред и условий культивирования для получения максимального количества энтеротоксина типа С.

3.2.4 Получение энтеротоксина типа С золотистого стафилококка для иммунизации кроликов.

3.2.5 Выбор оптимальной схемы иммунизации для получения антиэнтеротоксических стафилококковых сывороток.

3.2.6 Получение иммуноглобулинов и конъюгата пероксидазаантиэнтеротоксические иммуноглобулины.

3.2.7 Отработка параметров иммуноферментной тест-системы.

3.2.8 Определение чувствительности и специфичности иммуноферментной те ст-системы.

3.2.9 Определение диагностической чувствительности разработанного иммуноферментного тест-системы в сравнении с референтной тест-системой.

3.2.10 Разработка способа пробоподготовки для эффективного обнаружения энтеротоксина типа С в сыром молоке с помощью разработанного метода обсуждение результатов выводы. предложения для практики.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке"

В современных условиях при непрерывном повышении загрязнения окружающей среды вопросы гигиены сырого молока и контроля его качества становятся приоритетными. Поэтому к высококачественному молоку может быть отнесено лишь то молоко, которое соответствует предъявляемым к нему требованиям не только по пищевой ценности и органолептическим показателям, но прежде всего по безопасности потребления (4, 5).

Среди микроорганизмов — возбудителей пищевых отравлений ведущее место по частоте выделения занимает золотистый стафилококк. Стафилококковые отравления возникают при употреблении разнообразных пищевых продуктов, например, молочных, мясных, кондитерских и кулинарных изделий, и являются результатом нарушения технологических режимов получения сырья, его переработки и реализации готовой продукции (14, 17, 23, 27, 46).

Стафилококковые интоксикации (стафилококковые токсикозы) — наиболее распространенные пищевые отравления, так как стафилококки являются са-профитами и широко распространены во внешней среде, включая и воздух помещений. Стафилококки относительно устойчивы к химическим и физическим факторам воздействия, что обусловливает их выживаемость в пищевых продуктах. Особенностью интоксикаций стафилококковой природы является то, что они возникают в результате воздействия на организм энтеротоксинов, а не живых микробных клеток (32, 33). Другими словами, термическая обработка продуктов убивает стафилококк, но не разрушает его токсины, и отравление наступает даже после длительного проваривания и прожаривания пищи. Это обстоятельство затрудняет выявление причин вспышек микробиологическими методами, заставляя прибегать к методам обнаружения энтеротоксинов (30, 70, 96, 100, 146).

Пищевые отравления, вызванные употреблением продуктов, зараженных энтеротоксигенными стафилококками, занимают первое место по количеству вспышек и числу госпитализированных больных во многих странах мира. Стафилококковые токсины и ферменты нарушают функцию нейтрофилов, макрофагов (подавляют хемотаксис), Т- и В-лимфоцитов, ингибируют иммунный ответ на бактериальные антигены. Выработка стафилококками гиалуронидазы способствует распространению инфекции. В месте размножения возбудителя инфекции скапливаются гранулоциты, кровеносные сосуды тромбируются, формируются фибринные сгустки, в центре которых происходит некроз тканей, гибель лейкоцитов и формирование гнойного очага, содержащего стафилококки. Токсины разносятся кровью и лимфой в различные органы и ткани, вызывая их поражение (17, 20).

Большое негативное влияние на развитие молочного животноводства и повышение его продуктивности оказывают заболевания животных, среди которых наибольшее значение имеет мастит коров, приводящий к недополучению большого количества молока и преждевременной выбраковке. Важную роль в этиологии мастита играют стафилококки. Видовая дифференциация стафилококков, выделенных из молока коров, имеет большое эпизоотическое и эпидемиологическое значение, а также она необходима при организации мероприятий по борьбе с маститом и профилактике пищевых отравлений молочного происхождения (54, 62). Молоко, получаемое от коров-стафилококконосителей внешне не изменено, но телята, питаясь им, заболевают значительно чаще, чем их аналоги, получавшие молоко от здоровых коров (49, 104). Наличие в молоке (молозиве) значительного количества токсигенных стафилококков приводит к тому, что новорожденные телята инфицируются и в тяжелой форме страдают энтеритами стафилококковой этиологии, от чего часто погибают (20, 46, 106).

Изучение энтеротоксигенности стафилококков представляет существенные трудности, обусловленные отсутствием стандартных диагностических коммерческих антиэнтеротоксичных сывороток (антиэнтеротоксинов). В развитых странах определение энтеротоксигенности изолированных культур стафилококков обязательно используется для их идентификации, а промышленность выпускает необходимые иммунологические и другие диагностические препараты. Это дает возможность определять энтеротоксигенность стафилококков в различных режимах (экспрессном, на этапах исследования материала, без выделения чистых культур и т. д.). Широкое распространение получили тест-системы для определения энтеротоксина с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), реакции непрямой гемагппотинации (РНГА), латекс-агглютинации и реакции преципитации (51, 55, 65). Применяют также методы изучения генетических маркеров энтеротоксигенности, где результат исследования не зависит от способности конкретных штаммов продуцировать энтеротоксин в условиях in vitro, ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция и др. (14, 18, 47, 83, 60, 91). В отечественных нормативно-методических документах достоверным методом определения токсигенности чаще всего является биопроба на животных (котятах и щенках), что может быть применено очень ограниченно, только в бактериологических лабораториях, которые имеют виварий. Некоторую информацию относительно токсигенности стафилококков косвенно может дать изучение ряда биологических свойств выделенных культур (21,31, 38).

По мнению многих авторов для идентификации золотистых стафилококков наиболее перспективными являются тесты, направленные на обнаружение у них способности образовывать коагулазу, термостабильную нуклеазу и протеин А, а для обнаружения энтеротоксинов — иммуноферментный метод.

Для эффективной оценки роли стафилококков в возникновении пищевых отравлений самого факта выделения культуры стафилококков, даже коагулазопозитивных, недостаточно, тем более, что в пищевых продуктах, содержащих патогенные дозы энтеротоксина, жизнеспособные микробные клетки могут и не выявляться. Поэтому в процессе диагностики стафилококковых пищевых отравлений необходимо преследовать двойную цель: найти энтеротоксигенные стафилококки и выявить энтеротоксин. Оба патогена надо исследовать на всех этапах эпидемического цепи, и тогда определение стафилококков позволит конкретно выяснить источник и механизм развития токсизоза, а нахождение энтеротоксина в продукте и в материале от потерпевших — окончательно подтвердить диагноз пищевой стафилококковой интоксикации.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлась разработка иммуноферментной тест-системы для индикации стафилококкового энтеротоксина типа С в сыром молоке.

Для решения цели были поставлены следующие задачи:

4. Создать иммуноферментную тест-систему к энтеротоксину типа С золотистого стафилококка, изучить ее чувствительность и специфичность.

Научная новизна

Получены результаты, характеризующие высокий уровень контаминации молока и секрета вымени коров энтеротоксигенными золотистыми стафилококками в зависимости от функционального состояния молочной железы. Определен спектр типов энтеротоксинов у золотистого стафилококка и выявлен энтеротоксин типа С как наиболее часто встречающийся в сыром молоке и секрете вымени здоровых и больных маститом коров.

Практическая значимость

На основании результатов исследований совместно с Шурдуба Н. А. и Сот-никовой В. М. разработаны «Методические рекомендации по разработке имму-ноферментной тест-системы для индикации и идентификации энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.)

Апробация работы

Основные результаты исследований доложены: - 16-м Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2008 г.);

VI и VII Международных научных конференциях студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007, 2008 гг.);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008 г.); расширенном заседании лаборатории санитарии молока ВНИИВСГЭ (2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 5 научных статей, в том числе одна в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Результаты, характеризующие уровень контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров золотистыми и энтеротоксигенными стафилококками, типы энтеротоксинов;

• Материалы по разработке иммуноферментного метода обнаружения стафилококкового энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 стр. компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 163 источника (42 отечественных и 121 зарубежных авторов).

Заключение Диссертация по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Нагорных, Алексей Михайлович

выводы

2. Уровень контаминации молока и секрета вымени лактирующих коров энтеротоксигеннымии штаммами золотистого стафилококка зависит от характера патологического процесса в вымени и составил 42,2% при субклиническом мастите, 36,4% — в сборном молоке, 33,3% при клинической форме мастита и 25,0% у здоровых коров.

3. Наиболее часто (53,8% от общего числа выделенных типов энтеротоксигенных штаммов S. aureus) в молоке и секрете вымени лактирующих коров обнаруживали золотистые стафилококки, продуцирующие только один энтеротоксин типа С. В 29,9% случаях у выделенных штаммов золотистого стафилококка обнаруживали способность одновременно вырабатывать 2-3 типа различных энтеротоксинов. Энтеротоксин типа С выявляли в 80,9% случаев среди выделенных энтеротоксигенных стафилококков, вырабатывающих данный токсин как отдельно, так и в комплексе с другими типами энтеротоксинов.

4. Подобрана наиболее оптимальная плотная питательная среда и способ культивирования на целлофане для накопления стафилококкового энтеротоксина типа С. Получен в виде гомогенного белка очищенный концентрат энтеротоксина типа С, проведена гипериммунизация кроликов по оптимальной схеме, получены гипериммунные диагностические антиэнтеротоксические сыворотки с титром 1:32 в реакции диффузной преципитации.

6. Разработан доступный способ пробоподготовки сырого молока для ИФА, заключающийся в осаждении казеина в кислой среде и последующем центрифугировании образцов при 4 °С с целью удаления молочного жира и казеина.

7. Разработана специфичная иммуноферментная тест-система для обнаружения энтеротоксина типа С золотистого стафилококка в сыром молоке с диагностической чувствительностью 97,2% по отношению к коммерческому диагностикуму. Чувствительность иммуноферментной тест-системы составила 8 нг/мл. предложения для практики

На основании проведенных исследований материалы по разработке иммуноферментной тест-системы для определения энтеротоксина типа С в сыром молоке включены в разделы 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 «Методических рекомендаций по разработке иммуноферментной тест-системы для индикации и идентификации энтеротоксинов в культурах золотистого стафилококка, сыром молоке и молочных продуктах» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30 сентября 2009 г.)

Заключение

Методы обнаружения стафилококковых энтеротоксинов делятся на две категории: биологические и иммуносерологические. В настоящее время из биологических методов кроме теста кормления обезьян используют еще тест кормления котят и кожную пробу на сенсибилизированных энтеротоксином морских свинках. Однако биологические методы определения энтеротоксинов вытесняются серологическими, которые гораздо проще, чувствительнее и дешевле.

Все серологические методы, использованные для обнаружения стафилококковых энтеротоксинов, требуют специфической антисыворотки, от качества которой зависит и результативность того или иного метода. В свою очередь, высокоспецифичную сыворотку можно получить лишь после иммунизации животных гомогенными препаратами энтеротоксинов. Иммуносерологические методы, основанные на принципе гельдиффузии, включают технику простой или двойной диффузии в геле, которую проводят в пробирках или капиллярах, а также тест двойной гельдиффузии (микрометод) на стекле, встречный иммуноэлектрофорез и метод электроиммунодиффузии. Из этих методов чаще всего используют микрометод двойной гельдиффузии, как наиболее чувствительный и экономичный. Для быстрого обнаружения энтеротоксинов с успехом используется метод встречного иммуноэлектрофореза, а для количественного определения — электроиммунодиффузия.

Для выявления стафилококковых энтеротоксинов также разработаны методы пассивной гемагглютинации, агрегат-гемагглютинации, ингибирования гемагглютинации и латексагглютинации. Несмотря на то, что методы агглютинации обладают высокой чувствительностью, недостатком их является часто встречающаяся спонтанная агглютинация, что приводит к ложной интерпретации результатов.

В последнее десятилетие широкое распространение получили методы с использованием меченых антигенов или антител: радиоиммунологический и иммуноферментный методы.

Радиоиммунологический метод по-прежнему остается наиболее чувствительным и достоверным количественным методом определения антигенов и антител, что было доказано многочисленными сравнительными исследованиями. Однако нужно отметить следующие недостатки метода: ограниченный срок годности меченых реагентов, необходимость специальных условий для работы с радиоактивным материалом, высокая стоимость радиоизотопных манипуляций и счетного оборудования, необходимость разделения свободной и связанной метки.

Иммуноферментный анализ — один из наиболее перспективных и быстро развивающихся методов исследования биологически активных веществ. Ферментная метка, применяемая в иммуноферментном анализе, лишена недостатков, присущих радиоиммунологическому методу. Ее принципиальное преимущество в том, что меченные ферментом препараты могут длительно сохранять как иммунологическую, так и ферментативную активность. Стоимость реагентов, применяемых для анализа, невелика. Регистрацию результатов можно проводить визуально или при помощи спектрофотометра. По чувствительности иммуноферментный метод не уступает радиоиммунологическому.

Методы иммуноферментного анализа постоянно совершенствуются фирмами-производителями: повышается чувствительность и специфичность тест-систем, подбираются наиболее удобные условия для работы, сокращается число этапов проведения исследований, что способствует уменьшению возможности совершения ошибочных действий.

Своевременное обнаружение обсемененности продуктов энтеротоксигенными золотистыми стафилококками имеет важное значение в предупреждении пищевых отравлений, однако в ходе термической обработки продуктов они могут не обнаруживаться. В связи с этим необходим системный подход к исследованию продуктов на наличие энтеротоксинов золотистого стафилококка. собственные исследования

3.1 Материалы и методы исследований

Работа осуществлялась в период с 2006 по 2009 гг. в лаборатории санитарии молока ВНИИВСГЭ в соответствии с ГНТП 08.05.02.10 «Разработать иммуноферментный метод индикации энтеротоксина золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах», а также на молочно-товарных фермах Московской, Вологодской и Смоленской областей, ветеринарным специалистам которых за предоставленную возможность работать в производственных условиях приносим глубокую благодарность. Было исследовано 442 пробы молока и секрета молочных желез от коров, выполнено более 1636 бактериологических, иммунологических, биохимических и микроскопических исследований.

Для выделения энтеротоксинобразующих штаммов S. aureus в хозяйствах отбирали пробы молока и секрета вымени от коров с различным состоянием молочной железы, а также сборное молоко из танков и фляг.

Для постановки пробы отстаивания использовали молоко, давшее положительную или сомнительную реакцию с мастидином. Из таких четвертей вымени в пробирки надаивали по 10 см3 молока, закрывали резиновой пробкой и оставляли в холодильнике. Реакцию учитывали через 16-18 ч. При наличии осадка высотой 0,1 см и выше реакцию считали положительной. Наряду с этим учитывали также изменение цвета молока и слой сливок.

Бактериологические исследования отобранных образцов проводили руководствуясь «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» (1983) и ГОСТом 30347-97 Молоко и молочные продукты. «Методы определения Staphylococcus aureus». В качестве питательных сред использовали солевой бульон, желточно-солевой агар или агар Байрд-Паркера.

Идентификацию золотистых стафилококков осуществляли на основе изучения способности коагулировать плазму крови кролика (ГОСТ 30347-97) и ДНК-азной активности (Lachica R.V et al., 1971). Для определения термостабильной ДНК-азной активности использовали готовый агар для теста на ДНК-азу с толуидиновым голубым (Himedia). Среду разливали в чашки Петри, подсушивали при 4 °С в течение 1 ч, вырезали лунки диаметром 3 мм, удаляли пипеткой агар и вносили в лунки пастеровской пипеткой культуры, затем инкубировали при 37 °С. Перед исследованием культур пробирки с суточным ростом стафилококков на сердечно-мозговом бульоне (BHI) прогревали в кипящей водяной бане 15 мин и вносили в лунки в агаровой пластинке, содержащей ДНК агар и толуидин голубой. Зоны просветления с розовым окрашиванием образовывались в результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНК-азой стафилококков. Появление через 1-4 ч после внесения розовоокрашенных зон расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНК-азы.

При постановке реакции плазмокоагуляции использовали сухую плазму крови кролика. Реакцию ставили в агглютинационных пробирках, куда вносили 0,5 мл разведенной плазмы и добавляли по 2 капли суточной бульонной культуры испытуемых стафилококков. Одновременно ставили контроль реакции (в одну пробирку вносили заведомо известный штамм плазмокоагулирующего стафилококка, в другую — только плазму). Учитывали результат реакции при инкубации в термостате через 1, 2, 3, 18 и 24 ч по образованию желеобразного сгустка.

С целью подтверждения принадлежности характерных для золотистого стафилококка культур к виду S. aureus также проводили определение их способности ферментировать маннит в анаэробных условиях. Для этого в пробирку с регенерированным кипячением и остуженным полужидким пептонным агаром с 0,5% маннита с хромогенным индикатором вносили уколом петлей исследуемую культуру и заливали стерильным вазелиновым маслом на высоту 2 см. Засеянные пробирки инкубировали 5 сут при 37 °С. Изменение окраски индикатора свидетельствовало о ферментации маннита. В качестве контрольных использовали пробирки со средой, но без посева исследуемой культуры.

Также дополнительным тестом, подтверждающим отношение исследуемых культур к стафилококкам является тест на каталазу. Для этого с суточной агаровой культуры снимали петлей бактериальную массу и на стерильном предметном стекле смешивали с 3%-ной перекисью водорода. Образование пузырьков газа свидетельствовало о том, что культура образует каталазу.

Таким образом, если культура обладала плазмокоагулирующей и термонуклеазной способностью, ферментировала маннит в анаэробных условиях, обладала каталазой, а также по морфологическим и культуральным характеристикам типична для золотистого стафилококка, то такой штамм относили к виду S. aureus.

В качестве референтной тест-системы использован иммуноферментный диагностикум RIDASCREEN®SET A,B,C,D,E (R-Biopharm, Германия). Анализ выделенных штаммов золотистого стафилококка на энтеротоксины проводили в соответствии с МУ 4.2.2429-08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах». В рамку планшета вставляли стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа.

Лунки А-Е и Н покрыты антителами к энтеротоксинам стафилококка, соответственно А, В, С, D, Е, а лунки F и G с адсорбированными антителами от неиммунизированных животных служат для отрицательного контроля. При добавлении по 100 мкл исследуемых растворов в лунки A-G, и положительного контроля в лунку Н во время инкубации в течение часа при комнатной температуре энтеротоксины связывались на поверхности лунки специфическими антителами. Затем после 4-кратной отмывки стрипа 250 мкл моющего буфера из лунок удалялись все несвязанные компоненты исследуемых растворов, после чего добавляли 100 мкл конъюгата антител к энтеротоксинам с пероксидазой. При инкубации (1 ч) конъюгат иммуносорбировался на поверхности лунок энтеротоксинами. После следующей промывки планшета в лунки добавляли 50 мкл раствора субстрата (пероксид карбамида) и 50 мкл хромогена (тетраметилбензидин) и оставляли на 3 мин в темноте. В результате химического взаимодействия субстрата с хромогеном образовывались окрашенные продукты реакции, свидетельствующие о наличии энтеротоксинов в исследуемых пробах. По истечении срока добавляли по 100 мкл стоп-реагента и в течение 60 мин измеряли оптическую плотность при 450 нм. Для каждой пробы отдельно вычисляли среднее значение оптической плотности отрицательного контроля. Оптическая плотность, измеренная в лунках с положительным контролем, должна быть равна или больше 0,5. Средняя оптическая плотность, измеренная в лунках F и G (отрицательный контроль) должна быть равна или меньше 0,3.

Для получения токсинсодержащего материала культивирование отобранных штаммов S. aureus проводили на плотных питательных средах: 1. Среда Casman Е. Р. (1958), содержащая (г/л): гидролизата казеина 40,0; дрожжевого экстракта 10,0; агар-агара 1,5; гидрофосфата калия 1,0; тиамина гидрохлорида 0,0004; никотиновой кислоты 0,0012; кальция пантотената 0,005; дистиллированной воды до 1 л; рН 7,2-7,4. Витамины стерилизовали через мембранные фильтры № 2 (отдельно), остальные компоненты автоклавировали; 2. Мясо-пептонный агар, содержащий (г/л): питательного агара 35,0; NaCl 75,0; дрожжевого экстракта 50,0; воды дистиллированной до 1 л.

Токсигенную культуру выращивали с применением целлофана (Major R. F., 1978). Культивирование стафилококков проводили следующим образом: 30 стерильных чашек Петри заливали 15 мл расплавленной среды, после затвердевания агара на его поверхность помещали стерильный целлофан диаметром, большим диаметра чашки на 0,5 см. Посевной материал готовили путем смыва микробной культуры со скошенного питательного агара стерильным забуференным (рН 6,8-6,9) физраствором в объеме 2,0 мл. Взвесь стафилококков, смытых со скошенного питательного агара, наносили на поверхность целлофана и культивировали 48 ч при 37 °С. После инкубации культуры стафилококков смывали стерильным забуференным (рН 6,8-6,9) физраствором и центрифугировали при 3 500 g в течение 15 мин.

Очистку и концентрацию энтеротоксина проводили путем высаливания сульфатом аммония (Hebert G. A. et al., 1973), диализа в дистиллированной воде и концентрирования в полиэтиленгликоле (20 000 Д). Надосадочную жидкость, содержащую энтеротоксин, насыщали при комнатной температуре сухим сульфатом аммония. Сульфат аммония добавляли малыми порциями при тщательном перемешивании до полного растворения. После добавления сульфата аммония смесь помещали в холодильник (при 4 °С) на ночь. Образовавшийся за это время осадок отделяли центрифугированием при 3 500 g в течение 20 мин и перерастворяли его в дистиллированной воде в 1/10 части от исходного объема. Полученный раствор разливали в целлофановые мешочки и диализовали против дистиллированной воды до отрицательной реакции на сульфат ионы (контроль 10% раствором ВаСЬ). После этого диализат центрифугировали при 3500 g в течение 20 мин с целью удаления нерастворимых примесей.

Дальнейшая окончательная очистка энтеротоксина была проведена в химико-токсикологическом отделе Городской ветеринарной лаборатории ГУ «Московское объединение ветеринарии», сотрудникам которой приносим большую благодарность за помощь в проведении экспериментальных исследований. Полученный концентрат энтеротоксина обрабатывали ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,005 М Трис-HCl буфером рН 7,2. К одной части диализата добавляли одну часть влажной целлюлозы и смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин при медленном перемешивании. Затем смесь переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 7 880 g в течение 20 мин. С целью удаления оставшихся в растворе примесей использовали колонку размером 1,5x90 см, наполненную Сефадексом-С75. Сефадекс уравновешивали 0,05 М фосфатным буфером, содержащим 1 М NaCl рН 6,8. Сконцентрированный энтеротоксисодержащий материал осторожно наслаивали на поверхность Сефадекса G-75. Элюцию токсина проводили фосфатным буфером со скоростью 0,3-0,5 мл/мин. Сбор фракций проводили при помощи коллектора фракций.

Для последующей концентрации энтеротоксина применяли полиэтиленгликоль с молекулярной массой 20 000 Д. Для этого диализный мешок погружали в 50%-ный ПЭГ при 5 °С и выдерживали до тех пор, пока объем не снизится до 15-20 мл или меньше. Затем удаляли мешок из ПЭГ и тщательно промывали снаружи холодной водопроводной водой, замачивали в дистиллированной воде на 1-2 мин и в 0,2 М NaCl на 2-3 мин.

Концентрацию энтеротоксина и иммуноглобулинов определяли с помощью красителя кумасси бриллиантового синего G-250 по методу Sendmack Р., Grossberg М. С., 1977 на спектрофотометре СФ-26 (JIOMO, г. Санкт-Петербург). Метод основан на способности красителя в кислой среде вступать в комплекс с пептидами с молекулярной массой выше 10 000 Д. Об образовании комплекса судили по поглощению света при 595 нм на спектрофотометре.

Антиэнтеротоксические сыворотки получали путем иммунизации кроликов породы шиншилла весом 2,5-3 кг по трем схемам (изложены в собственных исследованиях).

При изучении титра антител антитоксических сывороток, полученных после иммунизации, использовали метод двойной радиальной иммунодиффузии в 1,5% агаровом геле Difco, USA (Ouchterlony О., 1958). 1,5 г агара Difco суспендировали в 100 мл 0,85% раствора NaCl и расплавляли на водяной бане. Горячий агарозный гель разливали слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляли их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делали лунки в геле, не допуская трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. Диаметр каждой лунки составлял 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносили автоматическими пипетками со сменными наконечниками, не допуская переливания. После заполнения чашки Петри закрывали крышками и инкубировали во влажной камере при температуре 25 °С. Реакцию учитывали не ранее чем через 48 ч. Чашки просматривали на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°.

Иммуноглобулины антиэнтеротоксических сывороток получали методом высаливания при комнатной температуре и постоянном перемешивании на магнитной мешалке насыщенным раствором сульфата аммония, забуференным до рН 7,3. Образующийся осадок отделяли центрифугированием в течение 20 мин, затем растворяли в дистиллированной воде и вторично осаждали сульфатом аммония при том же насыщении. Переосаждение повторяли еще один раз, затем осадок растворяли в физрастворе и удаляли избыток солей путем диализа против физраствора до отрицательной пробы с хлористым барием. Очищенный раствор иммуноглобулинов концентрировали в диализном мешочке против 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярным весом

20 ООО Д. Препараты иммуноглобулинов хранили в замороженном состоянии при минус 20 °С.

Для получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена использовали метод перйодатного окисления (Nakane Р. К. and Kawaoi А., 1974). Была использована пероксидаза хрена тип IV с коэффициентом чистоты (RZ) 3,0 («Sigma», США).

Отработку оптимальных концентраций антител, антигенов и оптимального разведения конъюгата проводили в 5-кратной повторности.

Полистироловые планшеты с положительным контролем инактивировали путем погружения в кюветы, заполненные 3%-ным раствором хлорамина Б.

Определение пероксидазы в сыром молоке проводили по ГОСТ 3623-73 Молоко и молочные продукты «Методы определения пастеризации».

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответствии с компьютерной программой Exel.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Нагорных, Алексей Михайлович, Москва

1. Азбелев В. Н. Приоритет профессора П. Н. Лащенкова в установлении этиологической роли стафилококка при пищевых токсикоинфекциях // Врачебное дело. 1951. - № 4. - С. 371-374.

2. Акатов А. К., Зуева В. С. Стафилококки. М.: Медицина, 1983. - 210 с.

3. Акатов А. К., Самсонова Т. М., Хатеневер М. Л. Классификация и биологическая характеристика коагулазоположительных стафилококков, выделенных от животных // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1983. - № 1. - С. 29-33.

4. Артемов А. А., Ванханен В. В. Идентификация источников загрязнения пищевых продуктов стафилококками // Рациональное питание. Киев, 1983. -вып. 18.-С. 101-103.

5. Архангельский И. И. Источники микробного загрязнения молока. В кн.: санитария производства молока. М.: Колос, 1970. - С. 9-13.

6. Бейлбаева М. Л., Тугамбаев Т. И. Методы иммунизации и их эффективность // Известия АН Казахе. ССР. 1983. - № 4. - С. 71-72.

7. Бугрова В. И. Стафилококковые энтеротоксины. Обзор // Вопр. питания. -1983.-№4. -С. 11-15.

8. Васенко С. В. Методы получения и очистки стафилококкового энтеротоксина // Актуальные вопр. инфекц. и инваз. болезней ж-х. М., 1995.-С. 88-91.

9. Гасанов Н. Г. Изучение гемолитической, коагулазной и ДНК-азной активности стафилококков / Рукопись. — М. — 1988. — 11 с.

10. Генералова А. Г., Бержц В. М. Идентификация Stahylococcus aureus путем определения нуклеазной активности и методом многомерного статистического анализа // Журн. микробиол. 1998. — № 3. — С. 6-10.

11. Демидова JT. Д., Юрков В. М., Миляновский А. Г. Актуальные проблемы санитарии производства молока // Проблемы вет. санитарии и экологии: Сб. науч. тр. ВННИВСГЭ. М., 1995. - Т. 98. - С. 103-113.

12. Доморадская Т. Н. Современные методы обнаружения энтеротоксигенных стафилококков в продуктах питания // Вопр. питания. — 1991.-№ 1. С.7-12.

13. Дорофеева И. К., Москаленко' Ю. С. Опыт изучения пищевой токсикоинфекции стафилококковой этиологии // Актуальные вопросы иммунологии и иммунопатологии. — Ростов/Дон, 1981. — С.53.

14. Карташова В. М., Гинзбург А. А. Разработка ускоренного метода индикации патогенных стафилококков в молоке коров с помощью РДПА // Дезинфекция в промышленном животноводстве. М., 1980. — С. 14-17.

15. Керопиан Е. А., Коротаев А. И.' РНК-азная активность как косвенный показатель энтеротоксигенности стафилококков // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1979. № 7. - С. 112-113.

16. Куваева Н. Б., Кармеканова Н. Р., Лукина JI. Б. Обнаружение энтеротоксигенных стафилококков в молоке и сыре // Вопр. питания. 1994. - № 4. - С. 29-31.

17. Кулиева Э. М., Шуман М. С. О вспышке стафилококковой пищевой интоксикации // Актуальные вопросы мед. паразитологии и тропической медицины. Баку, 1981.-С. 116-117.

18. Красницкая Е. С. К вопросу о стафилококковых интоксикациях в РСФСР // Гигиена и санитария. -1960. № 1. - С.74-76.

19. Куридзе Д. Г. Получение очищенного стафилококкового С2-энтеротоксина и антисыворотки к нему // Сб. научн. тр. Моск. вет. академии. -1985.-С. 53-55.

20. Методические указания 4.2.2429-08 «Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах» // Утв. фед. службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008 г.

21. Молоко и молочные продукты. «Методы определения Staphylococcus aureus», ГОСТ 30347-97, «Методы определения пастеризации», ГОСТ 3623

22. Методические указания по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров // Утв. ГУВ МСХ СССР, 1983.

23. Нагорных А. М. Иммуноферментный метод определения стафилококкового энтеротоксина типа С в культурах золотистого стафилококка, выделенных из молока здоровых и больных маститом коров // «Ветеринарная патология». — Москва, 2009. № 4. - С. 23-27.

24. Оксамитный Н.К. О некоторых патогенных свойствах стафилококков // Труды ВНИИВС. 1970. -№ 36. - С.101.

25. Осташевский А. Г., Образцов В. П., Котенко И. И. Применение реакции преципитации для определения энтеротоксигенности стафилококков // Материалы научно-производств. конф. по ветеринарной гигиене продуктов животноводства. Минск, 1968. - С. 4.

26. Павлова Ж. П., Дедюхина В. П., Ляхова И. С. Обсемененность сырого молока токсигенным стафилококком и его устойчивость при пастеризации // Вопр. питания. 1989. - № 1. - С. 67-68.

27. Петрас П., Машкова Л. Выявление стафилококковой энтеротоксигенности // Журн. гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Прага, 1984. - Т.28. - № 3. - С. 305-314.

28. Рекомендации по борьбе с маститом коров // Утв. ГУВ МСХ СССР. 1983.

29. Седова Н. Н., Попова Т. Я. Обнаружение стафилококковой термостабильной ДНК-азы в бульонных культурах и пищевых продуктах // Вопр. питания. 1982. - № 4. - С. 67-69.

30. Стаканчикова И. М. Определение типов энтеротоксинов золотистого стафилококка в продуктах молочного происхождения // Мат. междунар. научно-практич. конф. «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». Ульяновск, 2008. — С. 118.

31. Флуер Ф. С. Быстрый метод коагглютинации для типирования стафилококковых энтеротоксинов типов А и В с использованием сенсибилизированных антиэнтеротоксическими антителами стафилококков, содержащих белок А // Иммунология. 1985. - № 2. - С. 711-72.

32. Флуер Ф. С. Определение стафилококковых энтеротоксинов типа А, В, С2 методом агрегат-гемагглютинации // Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология. — 1982. — С. 81-82.

33. Флуер Ф. С. Определение стафилококковых токсинов А и В в пищевых продуктах иммуноферментным методом // Вопр. питания. -1991.-№3.-С. 56-59.

34. Флуер Ф. С. Бактериальные энтеротоксины и проблемы их дальнейшего изучения // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей в 4 томах, 2002. -Т.1.-С. 267-268.

35. Хоулт Дж. и др. Определитель бактерий Берджи, 9 изд. М., Мир, 1980.

36. Шурдуба Н. А., Сотникова В. М., Нагорных А. М. Определение энтеротоксигенности S. aureus, выделенного из молока и молочных продуктов // В сборнике научных трудов ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». № 1. — 2009. - С. 20-23.

37. Abbar F. М., Mohammed М. Т. Selected biological properties of enterotoxigenic staphylococci isolated from milk // J. of Food Propertion. 1986. -Vol. 49. — № 11. — P. 871-873.

38. Adekeye D. Enterotoxin production by strains of S. aureus isolated from animals and man in Nigeria // Vet. Microb. 1980. - № 5. - P. 143-150.

39. Adesiym A. A., Usman B. Isolation of enterotoxigenic strains of staphylococci from dogs // Vet. Micr. 1983. - Vol. 8. - № 5. - P. 459-469.

40. Adesiyun A. P. Characteristics of S. aureus strains isolated from bovinemastitis milk; bacteriophage and antimicrobial agent susceptibility and enterotoxigenicity // J. Veter. Med. Sc. B. 1995. - Vol. 42. - № 3. - P. 129-139.

41. Aldridge et al., Comparison of Rapid Identification Assays for Staphylococcus // Clin. Microbiol. 1984. - Vol.19 (5). - P. 703-704.

42. Ashour M. M., Omar M. M. Production of enterotoxin D by S. aureus in milk and some milk products // Zeitschrift fur die Gesamte Hygiene and ihre Grenzgebiete. 1984. - Vol. 30. - № 3. - P. 159-160.

43. Avena R. and Bergdoll M. Purification and Some Physicochemical Properties of Enterotoxin C, Staphylococcus aureus Strain 361 // Biochem. -1967.-Vol. 6.-P. 1474.

44. Baker et al., Evaluation of Various Rapid Agglutination Methods for the Identification of Staphylococcus aureus // Clin. Microbiol. 1985. - Vol. 21(5). -P. 726-729.

45. Balint J., et al. Detection and Characterization of Staphylococcal Enterotoxin В in Protein A Preparations Purified by Immunoglobulin G Affinity Chromatography // Immun. Meth. 1989. - P. 116-127.

46. Becker H. et al. Nachweis von Staphylococccus-aureus-Enterotoxinen in Lebensmitteln mit kommerziellen Enzymimmuntests // Archiv fur Lebensmittelhygiene. 1994. - Vol. 45. - P.25-48.

47. Becker H., Gang-Stiller K. Characterization of staphylococcus aureus strains isolated from raw milk with special reference to the clumping factor // Netherl. Milk Dairy J. 1989. - Vol.43. - № 3. - P. 355-366.

48. Berdal B. P., Olavik O. et al. A sandwich ELISA method for detection of S. aureus enterotoxins // Acta patologica et microbiologica Scandinavica. 1981.

49. Vol. 89. № 6. - P. 411-417.

50. Bennett R. W. et al. Visual screening with enzyme immunoassay for stahylococcal enterotoxins in foods // J. of the AOAC International, 1994. Vol. 77. - P. 27-32.

51. Bergdoll et al. A New Staphylococcus Enterotoxin. Enterotoxin F. Associated with the Toxic Shock Syndrome Staphylococcus aureus // Lancet 2. -1981.-№9.-P. 1017-1021.

52. Bergdoll M. et al. Identification of a New Enterotoxin as Enterotoxin С // Bacteriol. 1965. - P. 90.

53. Bergdoll M. et al. Identification of Enterotoxin E // Immun. 1971. - P. 593.60.' Blomster-Hautarnaa D. et al. Preparation of Toxic Shock Syndrome Toxin-1 // Methods in Enzymology. 1988. - P. 165-172.

54. Bolstrielge M. C., Roth G. Enterotoxigenicity of strain of S. aureus isolated from milk and milk products // Suid Afrikaance Tydoknifvir Sauvelkinde. 1985. -V. 17. - № 3. - P. 91-95.

55. Burdova O. Determination of St. enterotoxins in milk products by three methods // Arch. Veter. Pol. 1994. - Vol. 34. - Fasc. Уг. - P. 69-74.

56. Berke et al. Evaluation of Rapid Coagulase Methods for the Identification of Staphylococcus aureus // Clin. Microbiol. 1986. -. 23 (5). - P. 916-919.

57. Brooks J. Sensitive Enzyme-Amplified Electrical Immunoassay for Protein A-Bearing Staphylococcus aureus in Foods // App. and Envir. Microbiol. 1990. - P. 3278-3284.

58. Brown W. J. Comparison of a Yellow Latex Reagent with Other Agglutination Methods for the Identification of Staphylococcus aureus // Clin. Microbiol. 1986. - Vol/23. - P. 640-642.

59. Buning-Pfane H. et al. Einfache methode fur den nachweis von staphylokolken enterotoxin В in vanillepudding mittels ELISA-test // Zbl.1.bensm. Uters. Forsch. 1981. - № 173. - P. 351-355.

60. Bystron J., Molenda J. et al. Occurrence of enterotoxigenic strains of St. aureus in raw poultry meat // Pol. J. veter. Sc. 2005. - Vol. 8. - № 1. - P. 3740.

61. Bystron J., Molenda J. Staphylococcal enterotoxins // Advances in Agricultural Sc. 2004. - № 9. - P. 19-22.

62. Casman E. P., Bennett R. W. et al. The microslide gel doubie diffusion test for the detection and assay of staphylococcal enterotoxins // Health Lab. Sci. -1969.-№6.-P. 186-198.

63. Chang H. C. and Bergdoll M. Purification and Some Physicochemical Properties of Staphylococcal Enterotoxin D // Biochem. 1979. - P. 18-24.

64. Chu F.S., Thadhani K. Purification and characterization of staphylococcal enterotoxin A// Biochemistry. 1966. - Vol.5. - P. 3281-3289.

65. Das A. K., Panda S. N. Studies on staphylococcus aureus of bovine origin including phage typing // Anim. Health. 1990. - Vol. 29. - № 1. - P. 17-22.

66. Davison N., Dack G. M. Some chemical and physical studies of staphylococcus enterotoxin // Infection Dis. 1939. - № 64. - P. 302-306.

67. Deverise L. A. Identification of pathogenic staphylococci isolated from animals derived from animals // Appl. Bacter. 1980. - Vol. 49. - P. 1-11.

68. Dickie N., Konowalchuk J. Rapid solid-phase radioassay for staphylococcal protein A // Canad. J. Microbiol. 1977. - Vol. 23. - P. 832-834.

69. Dickie N., Akhtar S. Improved radioimmunoassay of staphelococcal enterotoxin A // Asmoc. Off. Anal. Chem. 1982. - № 65. - P. 180-184.

70. Doern G. V. Evaluation of a commercial latex agglutination test for identification of S. aureus // Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 19. - P. 191-193.

71. Donelly С. В., Leslie J. E. Serological identification of enterotoxigenic staphylococci from cheese // Appl. Micr. 1967. - № 15. - P. 1382-1387.

72. Essers et al. Rapid and Reliable Identification of Staphylococcus aureus bya Latex Agglutination Test // Clin. Microbiol. 1980. - Vol.l2(5). - P.641-643.

73. Evans J. В., Ananaba C. A. Enterotoxin production by atypical S.aureus from poultry // The J. of Appl. Bacter. 1983. - Vol. 54. - № 2. - P. 257-263.

74. Evenson M. L. et al. Estimation of human dose of staphylococcal enterotoxin A from a large outbreak of staphylococcal food poisoning involving chocolate milk // Int. J. Food Microbiol. 1988. - Vol. 7. - P. 311-316.

75. Fast D. et al. Toxic Shock Syndrome-Associated Staphylococcal and Pyrogenic Toxins Are Potent Inducers of Tumor Necrosis Factor Production // Infect. Immun. -1989. P. 291-293.

76. Fey H., Pfister H. Comparative evaluation of different enzyme-Linked immunosorbent assay systems for the detection of staphylococcal enterotoxin A, В and С // Clin. Micr. 1984. - № 19. - P. 34-38.

77. Freed В. C., Bvanasin M. J. Enzyme-ldenked Immunosorbent Assay for detection of staphyloccal Enterotoxins in Foods // Appl. Emvir. Microb. 1982. -44.-P. 1349-1355.

78. Fung D. Y., Steinberg D.H. Thermal activation of staphylococcal enterotoxin В и С // 1981. P. 321-324.

79. Fung D. Y., Wagner S. Cappilary tube assay for staphylococcal enterotoxin А, В and С // Appl. Microbiol. 1974. - № 21. - P. 559-591.

80. Freer J. and Arbuthnott J. Toxins of Staphylococcus aureus // Pharmac. Ther. -1983.-P. 55.

81. Garcia M. L., Garcia M. C., Otero A. et al. Biotypes of coagulase-positive staphylococci associated with bovine mastitis // Proc. Appendix. Stockholm. -1989. P. 24.

82. Garcia M. L. et al. Characterization of Staphylococci Isolated From Mastitic Cows in Spain // 39 Applied Environ. Microbiol. 1980. - P. 548-554.

83. Goldstein J. Microtube coagulase tests for detection of coagulase-positive staphylococci // Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 15. - P. 848-851.

84. Gunn В. A. et al. Comparison of Methods for Identifying Staphylococcus and Micrococcus spp // Clinical Microbiol. 1981. - P. 195-201.

85. Guzman et al. Novel Immunoenzvrnatic Assay for Identification of Coagulase and Protein A-Negative Staphylococcus aureus Strains // Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30 (5). - P. 1194-1197.

86. Hahn I. F., Pickenhahn P. An avidin-biotin ELISA for the detection of staphylococcal enerotoxins A and В // Immunol. Methods. 1986. - Vol. 92. - № 1,-P. 25-29.

87. Hebert G. A. et al. Determination of the optimal ammonium sulfate concentration for the fractionation of rabbit, sheep, horse and goat antisera. // Appl. Microbiol. 1970. - № 25. - P. 26-36.

88. Hcrooka E. Y. Enterotoxina estafilococica: avancos metodologicos na deteccao em alimentos // Semina. 1993. - Vol. 14. - № 1. - P. 32-35.

89. Hilker J. S., Heilman W. S. Heat inactivation of enterotoxin A from S. aureus in veronal buffer //Appl. Micr. 1968. - № 16. - P. 308-310.

90. Hogan J. S., Cornetta A. Comparison of four test procedures to identify Staphylococcus aureus isolated from bovine intramammary infections // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47. - № 9. - P. 2017-2019.

91. Holeckova B. Production of enterotoxins by St. aureus isolated from sheep milk // Bull. Veter. Inst, in Pulawy. 2004. - Vol. 48. - № 1. - P. 41-45.

92. Huang I. and Bergdoll M. The Primary Structure of Staphylococcal Enterotoxin В // J. Biol. Chem. 1970. - P. 245.

93. Humber J. K., Denny С. B. Influence of pH an the heat inactivation of staphylococcal enterotoxin A as determined by monkey feeding and serological assay //Appl. Microb. 1975. - № 30. - P. 755-758.

94. Iandolo J. Genetic Analysis of Extracellular Toxins of Staphylococcus aureus //Ann. Rev. Microbiol. 1989. - P. 343-375.

95. Kato E., Kumo T. Enterotoxigenicity of bovine Staphylococci isolated from California Mastitis test-positive milk // Jpn. Vet. Res. 1980. - № 28. - P. 75-85.

96. Kauffman P. E. Ensyme immunoassay for staphylococcal enteroloxin A // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1980. - № 63. - P. 1138-1143.

97. Korpysa W. et al. Osek J. Enterotoksyny gronkowcowe oraz ich wykrywanie w mleku, przetworach mlecznych // Med. Weter. 2005. - Vol. 61. -6.-P. 633-636.

98. Kuroishi Т., Komine K., Itigaki M. Cases of clinical staphylococcal mastitis accompanied by increased staphylococcal enterotoxin-C in mammary-gland secretion // Japan Veter. Med. ASSN. 2002. - Vol. 56. - № 3. - P. 147-151.

99. Lachica R.V. Simplified theromonuclease test for rapid identification of Staphylococcus aureus recovered on agar media // Appl. Environm. Microbiol. -1976. Vol. 32. - P. 633-634.

100. Lairscey et al. Performance of Four Slide Agglutination Methods for Identification of Staphylococcus aureus When Testing Methicillin-Resistant Staphylococci // Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25. - № 1. - P. 181-182.

101. Lakner M., Schneider E., Usleber E. et al. Development and application of immunochromatografic tests for the detection of staphylococcal enterotoxin E //

102. Food agr. Immunol. 1998. - Vol.10. - № 3. - P. 249-257.

103. Lamaita H. C., Cerqueira M. M., Carmol S. Staphylococcus sp. counting and detection of Staph, enterotoxins and toxic shock toxin syndrome from cooled raw milk // Agr. Brasil. Med. Veter. Zootech. 2005. - Vol. 57. - № 5. - P. 702709.

104. Lim Y. S., Jegathesan M. Relationship of some biochemical characteristics of S. aureus to enterotoxin production // Transaction of the royal society of tropical medicine and hygiene. 1986. - Vol. 80. - № 6. - P. 972-975.

105. Lens W., Thelen R. Detection of Enterotoxin in cultures of S.aureus by ELISA and the Microslide Immunodiffusion // Zbl. fur Bacter. Microbiol, und Hyg. 1983. - Vol. 253. - № 4. - P. 466-476.

106. Lim Y.S. Serological detection of enterotoxin from strains of S. aureus isolated in Malaysia // Singap. Med. J. 1995. - Vol. 26. - № 3. - P. 304-306.

107. Major P. Quantitative determination of staphylococcal B-type enterotoxin with Leeriest electicimurne diffusion method // Aeta Microb. Acad. Sci. 1979. — № 26. - P. 333-336.

108. Mayer R. F. Palmieri N. Y. Single radiani immunodiffusion method for screening staphylocoocal isolated for enterotoxin // Appl. Environ. Microbiol. -1980. № 40. - P. 1080-1085.

109. Morse S. A., Mah R. A. Microtiter hemagglutination-inhibition assaystaphylococcal enterotoxin В // Appl. Microbiol. 1967. - № 15. - P. 58-61.

110. Niskanen S.N. et al. Evaluation of Three Slide Agglutination Tests for Rapid Identification of S. aureus // Acta vet scand. 199 J. - Vol. 32. - P. 543-549.

111. Nacane P. K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjgation // Histochem. Cytochem. 1974. - Vol. 22. - P. 1084-1091.

112. Olsvik Q., Berdal B. A sensitive ELISA method for protein A detection // Acta pathol. Microbial. Scand. 1981. - Vol. 89. - P. 289-290.

113. Olsvik Q., Foseum K. Staphylococcal enterotoxin A, B. arid С produced by coagulase-negative strains within the family Micrococcacese // Acta Patol. Microb. et lmmun. Scand. 1982. - Volt-90. 6. - P. 441 -445.

114. Otenhajmer I., Mitis S. C. Correlation between the production of enterotoxin A and В and' some biochemical characteriction of S. aureus strains isolated from milk and dairy products // Acta Veterinaria. 1974. - Vol. 24. - № 6. - P. 255259. • •' ■ '

115. Ouchterlony- O.^ Diffusion-in-gel methods for immunological analysis // Prog.-allergy. 1958. - Vol. 5. - P. 1-77.

116. Park С.'E.'et al. Evaluation of a-commercial enzyme immunoassay kit (RIDASGREENR) for detiction of staphylococcus enterotoxins А, В, C, D and E in foods // Appl. and Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60. - P. 677-681.

117. Reiser R. F., Robbins R. N. Purification and Some Physicochemical Properties of Toxic-Shock Toxin // Biochemistry. 1983. - Vol. 22. - P. 39073912.

118. Reiser R. F., Conaway D. Detection of staphylococcal enterotoxin in foods // Appl. Microbiol. 1974. - Vol. 27. - P. 83-85.

119. Reiser R. F., Robbins R. N. Identification, purification and some Physicochemical properties of staphylococcal Enterotoxin C3 // Infec. Immun. -1984. № 45. - P. 625-630.

120. Reyes L. Determination of enterotoxigenicity of strain of S. aureus isolated from sheese // Revista Latinoamer. Microb. 1984. - Vol. 26. - № 26. - P. 277283.

121. Robern H., Cluson T. The use of polyethylene glycol in radioimmunoassay of staphylococcal enterotoxins // Can. J. microbial. 1978. - № 24. - P. 765-766.

122. Salomon L. L., Tew R. W. Assery of staphylococcal enterotoxin В by latex agglutination // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1968. - № 129. - P. 539-542.

123. Sanders G. G., Bartlett M. L. Double antibody solid phase enzyme immunoassay for detection staphylococcal enterotoxin A // Appl. Environ. Microbiol. 1977. - № 34. - P. 518-522.

124. Shibata J., Morita M., Amano J. The passive hemagglutination inhibition test for detection of staphylococcal enterotoxin В with sensitized and lyophilized red blood cells // Micr. Immun. 1977. - № 21. - P. 45-48.

125. Schocken-Iturrino R. P., Furlanetto S. M. Enterotoxigenic S. aureus in milk saples from mastitis cows //Ars. Veterin. 1986. - Vol. 2. - № 1. - P. 69-74.

126. Sendmack P., Grossberg M.C. A rapid, sensitive and versalite assay for protein using Comassie brilliant blue G-250 //Ann.Biochem. 1977. - Vol. 93. -P. 499-529.

127. Shinagawa K., Tanabayashi K., Kogure Y. Incidence and population of enterotoxigenic staphyloccus aureus in raw milk from milking to milk plant //

128. Veter. Sc. 1988. - Vol. 50. - № 5. - P. 1060-1064.

129. Shitandi A., Gathoni K. Toxin production by St. aureus from cases of bovine mastitis in Kenya //Agr. Trop. Subtrop. Praghe, 2003. - Vol. 36. - P. 46-51.

130. Silwarman G. J. Entertotoxin secretion during Extended Growth of S. aureus on Agar Surfaces // Bact. Prot. Toxin. 1984. - № 24. - P. 119-121.

131. Smith J. L. et al. Enterotoxin A synthesis in S. aureus: Ingibition by Glycerol and Maltose // Cen. Microb. 1986. - Vol. 132. - P. 3375-3381.

132. Soo H. M., Tatini S. R., Bennett R. V. Thermal enactivation of staphylococcal enterotoxin A and D in certain foods // Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Micr. 1974. - № 74. - P. 14.

133. Spero L., Griffin B. Effect of single and double peptide bond Scission by trypsin on the structure and activity of staphylococcal enterotoxin С // Biol. Chem. 1976. - Vol. 251. - P. 5580-5588.

134. Stelma G. N. Inactivation of Staphylococcal enterotoxin A by Chemical Modification // Biochem. Biophysic. 1982. - Vol. 105. - № 1. - P. 121-127.

135. Stiffer-Rosenberg G., Fey H. Simple assay for staphylococcal enterotoxin A, В and C:modification of enzyme-linked immunosorbent assay // Clin. Microbiol. -1978.-№8.-P. 473-479.

136. Su C.Y., Wong A. C. Current perspectives on detection of staphilococcal entertotoxin // Food Protect. 1997. - Vol 60. - P. 195-202.

137. Sugiyama H., Bergdoll M. S., Dack G. M. Early development of a temporary resistance to the emetic action of staphylococcus enterotoxin // Infect. Dis. 1962. - Vol. 3. - № 3. - P. 233-238.

138. Sommerfeld P., Terplan G. Methoden sum Nachweis von Staphylokokken enterotoxinen //Arch. Lebensmit. 1975. - № 26. - P. 128-137.

139. Takeshige K., Watanabe K., Igarashi H. Detection of S. aureus in Bovine Mastitis and Some Characteristics with Special Reference to Enterotoxin Producibility and Coagulase Types of Isolates // Jpn. J. Vet. Sci. 1983. - Vol. 45.-№3.- Р. 355-362.

140. Tranter H.S. Production purification and identefication of the staph, enterotoxin I I J. of App. Bacter. Symposium Supp. 1990. - Vol. 69. - P. 123-145.

141. Velan B. Chemiluminescence immunoassay: a new sensitive method for determination of antigens // Immunochemistry. 1978. - № 15. - P. 331-333.

142. Wairather F. J., Lewis E. E. Rapid quantitative serological assay of staphylococcal enterotoxin В //Appl. Microb. 1966. -№ 14. - P. 284-291.

143. Wanger S. et al. Latex Agglutination-Negative Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Recovered from Neonates: Epidemiologic Features and Comparison of Typing Methods // Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - № 10. -P: 2583-2588. ■

144. Watts J. L., Pankey J. W. Evaluation of the Staph-Ident and STAPHase systems for identification of staphylococci from bovine inlramammaiy infections // Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 20. - P. 448-452.

145. Weiss R. et al. Zum Nachweis der Protein-A-Bilding von Staphylokokken mittels der ELISA-Technik // Zbl. Vet. Med. 1984. - Vol. 31. - P. 424-434.

146. Windemann H., • Baumgarther P. S. Application of Ensyme-Linkcd Immunosorbents Assay (ELISA) with Labeled Antegen for Detection of Staphylococcal enterotoxins А, В and С in foods // Zbl. Bacter. microb. Hyg. -1985. Vol. 181. - № 3-5. - P. 345-364.

147. Yamada S., Igarashi H. Improved reversed passive hemagglutination foi simple and rapid detection of staphylococcal enterotoxins A-E in food // Micr. Immun. 1977. - № 21'. - P. 675-682.

148. Yolken R. ' H., Leister F. ' J. ' Staphylococcal protein A-enzyme immunoglobulin conjugates versatile tools for enzyme immunoassays // J. ol Immunological Methods. 1981. - Vol. 43. - P. 209-218.

149. Zarsour J.!, Bailie E. Evoluation of Three test procedures for Identefication of S. aureus from Clinical Sources // Clin: Microbiol. 1978. - № 8. - P. 133-136.

Информация о работе

Нагорных, Алексей Михайлович
кандидата ветеринарных наук
Москва, 2010
ВАК 06.02.05

Диссертация

Разработка иммуноферментной тест-системы для обнаружения энтеротоксина типа C золотистого стафилококка в сыром молоке - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы