Совершенствование методов определения стафилококковых инфекций у животных и в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики

Розанов, Сергей Николаевич

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов определения стафилококковых инфекций у животных и в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики"

На правах рукописи

004600139

РОЗАНОВ СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВЫХ ИНФЕКЦИЙ У ЖИВОТНЫХ И В СЫРЬЕ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА ОСНОВЕ ДНК- И ИММУНОДИАГНОСТИКИ

06.02.02 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2010

004600199

Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: Светличкин Вячеслав Владимирович

доктор биологических наук, профессор (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты: Ленченко Екатерина Михайловна

доктор ветеринарных наук, профессор (ГОУ ВПО МГУПБ)

Цыбанов Содном Жамьянович доктор биологических наук, профессор (ВНИИВВиМ)

Ведущая организация: Московская Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии им. К.И. Скрябина (ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина).

Защита состоится « 17 » марта 2010 г. в /У часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, д. 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « / У » <-Д; 2010 г.

II

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Юдина А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Стафилококковые инфекции достаточно широко распространены у различных животных. Основными проявлениями стафилококковой инфекции являются: гнойные воспаления кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколиты, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы. Резервуаром инфекции коагулазопозигивных стафилококков являются грызуны, птицы, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, кошки. При этом заболевание проявляется у всех возрастных групп, но в большей степени у молодняка. Высок риск взаимного заражения золотистым стафилококком животных и человека. Выделение возбудителя происходит с носовыми истечениями, фекальными массами, мочой, истечениями из половых органов (препуция и влагалища), гнойными выделениями из кожных поражений (язвы, свищи).

Инкубационный период продолжается несколько дней. Клинические проявления стафилококковых болезней многообразны. При смешанном заражении стафилококками и вирусами (например, парвовирус) иногда наблюдаются сходные клинические признаки заболеваний. Возбудитель ПВС-2 очень устойчив в окружающей среде и при комнатной температуре может сохраняться в инфицированных объектах в течение 6 месяцев (Б.Ф. Шуляк, 2003; М. Уиллард, Г. Тведтен, 2004; Я.Рэмси, Б.Теннат, 2005г). Лечение заболеваний, вызванных бактериальными, вирусными или смешанными инфекциями требуют различного подхода, вследствие чего, существует необходимость дифференциации возбудителей заболеваний.

Сырье животного происхождения (молоко, мясо, субпродукты) подвержено как первичной, так и вторичной контаминации ( Логвинов Д.Д.,

1992; Горяинова Г.М., 2004; Eshraghi Н., 1997; Pfleger R. et al„ 2002). При ветеринарно-санитарной экспертизе актуальным является дифференциация золотистого стафилококка от других бактериальных инфекций, в частности от синегнойной палочки, сальмонелл, стрептококков.

Диагностика стафилококковых инфекций основана на классическом бактериологическом анализе с применением питательных сред: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА). Определение патогенности возбудителя проводят в реакции плазмокоагуляции.

Для ускоренной диагностики стафилококковых и парвовирусных инфекций применяют методы ПЦР анализа и ИФА (В.Н. Сюрин, А .Я. Самуйленко и др. 1998; М. Уиллард, Г. Тведтен и др.,2004 г).

Для проведения мониторинговых исследований по определению золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций в большом количестве биоматериала животных и сырья животного происхождения актуальным является разработка ускоренных методов на основе ИФА и ДНК-диагностики.

Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлась разработка и совершенствование методов определения стафилококковых и сопутствующих парвовирусных инфекций у животных, а также стафилококковых инфекций в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики.

В задачи исследований входило:

- провести мониторинговые исследования по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих парвовирусных инфекций в биоматериале домашних животных по городу Москва;

провести мониторинговые исследования по выявлению Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения;

- усовершенствовать методику определения Staphylococcus aureus и сопутствующих парвовирусных инфекций в биоматериале животных на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

- усовершенствовать определение антигенов парвовируса у домашних животных с использованием тест системы IDEXX SNAP;

- усовершенствовать определения Staphylococcus aureus в мясном сырье и субпродуктах на основе модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

- разработать модифицированную методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в мясном сырье и субпродуктах на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами;

- определить чувствительность и специфичность методов;

- провести сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики выявления Staphylococcus aureus у животных и в мясном сырье и субпродуктах.

Научная новизна

Проведены мониторинговые исследования по выявлению стафилококковых и парвовирусных инфекций у домашних животных и стафилококковых инфекций в мясном сырье и субпродуктах на территории мегаполиса Москва, которые показали заболеваемость в 2008 году стафилококкозом до 86,1%, парвовирусным энтеритом до 95,7%, совместных инфекций - 30,2%, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3% - в 2009 году. Золотистый стафилококк был выявлен в сырье животного происхождения в относительно не большом проценте исследуемых проб.

Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus и других сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы в мясе, субпродуктах и у животных на основе разработанных модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющих

проводить анализ в течение 6-8 часов. Методики дают возможность одновременно определять смешанные инфекции (Staphylococcus aureus и Salmonella typhi murium) в мясном сырье и субпродуктах и (Staphylococcus aureus и парвовирус) в биоматериале животных.

Усовершенствовано определение парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP. Тест-система позволяет проводить анализ в течение одного часа.

Разработана методика ускоренного определения Staphylococcus aureus в мясе и субпродуктах на основе ДНК гибридизации со специфичными ДНК-зондами. Методика позволяет проводить дифференциацию Staphylococcus aureus от других бактериальных инфекций.

Практическая ценность.

На основе проведённых исследований разработаны:

1. «Методические рекомендации по определению антигенов и антител на основе иммуноферментного анализа при инфекционных заболеваниях мелких домашних животных», утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.05.2008г.

2. Проект Национального стандарта Российской Федерации «Экспресс-метод определения антигенов и антител при внутренних заболеваниях животных, на основе иммуноферментного анализа».

Аиробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения Героя Социалистического труда, лауреата Государственной

премии СССР и премии Эстонской ССР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ А.Х. Саркисова (Москва, 2009 г.).

- на Ученом совете ГНУ ВНИИВСГЭ (2009 г.).

- на межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ (2009 г.).

Публикации Результаты исследований отражены в 3 научных статьях.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 154 источника отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа проводилась в период с 2006 по 2009 гг. в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации ГНУ ВНИИВСГЭ, а также в Городской ветеринарной лаборатории ГУ «Мосветобъединение».

В качестве объектов исследования использовали биоматериал домашних животных, мясо и субпродукты.

В работе использовалось не менее пяти повторностей. Золотистый стафилококк определяли классическим

микробиологическим методом на селективных питательных средах, методом ДНК-гибридизации на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах с ДНК-зондами, меченными биотипом. ДНК-зонды получали в полимеразной цепной реакции. Выявление золотистого стафилококка проводили также, с помощью ГГПР с последующей детекцией ампликонов, методом гибридизации или электрофорезом в агарозном геле.

Парвовирус выявляли на основе ИФА в соответствии с Наставлением по применению набора для выявления антигенов парвовирусного энтерита, а также с помощью SNAP-тестов фирмы IDEXX, производства США.

Для выявления парвовируса использовали ПЦР в соответствии с Наставлением по применению тест-системы «ПАРВОВИР» для выявления возбудителя парвовирусного энтерита собак, разработанного ООО «Интерлабсервис».

Статистическую обработку результатов исследований проводили по Стьюденту.

Результаты исследований.

1. Результаты мониторинговых исследований по выявлению Staphylococcus aureus н сопутствующих инфекций в биоматериале животных, в мясном сырье и субпродуктах.

На первом этапе наших исследований мы проводили мониторинговый анализ выявления инфекций, вызванных Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения, а так же Staphylococcus aureus и парвовирусом у домашних животных, находящихся в приютах и у частных лиц города Москвы. Определение золотистого стафилококка проводили по классическому микробиологическому методу, выявление возбудителя парвовирусного энтерита собак и кошек осуществляли с помощью тест-набора ИФА и ПЦР в соответствии с наставлениями к применению, утвержденными Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ. В опытах использовали мясное сырье и субпродукты, а также биоматериал: слизь из носа, половых органов, кровь, мочу, фекалии.

Результаты исследований представлены в таблице! и таблице 2.

Таблица №1

Результаты индикации золотистого стафилококка и парвовируса у домашних животных.

№ Вид

п/п инфекции 2008 год 2009 год

Кол-во Обнаруж. % Кол-во Обнаруж. %

исслед. инфекции исслед. инфекции

животных животных

1. Staphylococcus

aureus 847 730 86,1 723 595 82,3

2. Парвовирус 540 517 95,7 502 497 99,0

3. Совместные инфекции 1387 420 30,2 1225 592 48,3

Таблица №2

Результаты индикации золотистого стафилококка в мясе и

№ Вид 2008 год 2009 год

п/п продукции Кол-во Положит. Кол-во Положит.

проб пробы % проб пробы %

1. Мясо 911 97 10,7 663 83 12,5

2. Субпродукты 234 27 11,5 117 19 16,2

Проведенные исследования показали, что заболеваемость стафилококкозом у домашних животных составляла 86,1%, парвовирусным энтеритом - 95,7% и совместных инфекций - 30,2% в 2008 году, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3% - в 2009 году

При определении золотистого стафилококка в мясе и субпродуктах процента1 контаминированных проб был значительно ниже, чем в биоматериале животных и составлял 10-16,2%.

2. Разработка и совершенствование методик определения Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в мясном сырье, субпродуктах и биоматериале животных на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией

При ветсанэкспертизе сырья животного происхождения существует необходимость дифференциации стафилококковой инфекции от других возбудителей бактериальной природы (синегнойной палочки, сальмонелл, стрептококков).

При диагностике стафилококкозов также возникает необходимость дифференциации этой бактериальной инфекции от возбудителей вирусной этиологии, в частности, от парвовируса.

Стафилококковые и парвовирусные инфекции наиболее часто встречаются у домашних животных. Причем часто, парвовирус может осложняться вторичной стафилококковой инфекцией и наоборот. При патологоанатомическом вскрытии обнаруживаются сходные изменения внутренних органов (сердце, легкие, тонкий отдел кишечника). Этим обстоятельством и были обусловлены направления наших исследований по одновременному определению этих инфекций.

Нами разработаны модифицированные методики амплификации для определения Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, мясном сырье и субпродуктах.

В первом варианте мы разработали модификацию метода на основе ПЦР выделенных из исследуемого материала матричных ДНК с последующей ДНК-гибридизацией с меченными биотином ДНК-зондами. Пробы гомогенезировали буфером, проводили осаждение крупных частиц центрифугированием. К супернатанту добавляли лизостафин (для лизиса стафилококка), протеиназу К, ДНК-парвовируса и Staphylococcus aureus,

очищали на сорбенте и добавляли в инкубационную смесь для ПЦР, содержащую дезоксинуклеозидтрифосфаты и праймеры для парвовируса и Staphylococcus aureus. Ампликоны иммобилизовали на мембранные фильтры и гибридизовали с меченными биотином специфичными ДНК-зондами. ДНК-зонды предварительно получали в ПЦР с меченными биотином дезоксинуклеозидтрифосфатами. После реакции с конъюгатом, субстратом и красителем по визуальной оценке окрашенных пятен с гибридными молекулами определяли возбудители. Схема определения парвовируса представлена на рисунке 1.

Проба

I

Гомогенезирование буфером

I

Центрифугирование при 2000 об/мин

I

Супернатант матричной ДНК 1

Очистка ДНК (лизостафин, протеиназа К. сорбент) i

ПЦР 1

Денатурация и иммобилизация ампликонов

I

Точечная гибридизация на фильтрах со специфичными зондами

i

Реакция с конъюгатом, субстратом и красителем

Визуальная детекция результатов окрашенных гибридных молекул

Рисунок 1. Схема модифицированной методики выявления Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций на основе гибридизации иммобилизованных исследуемых ампликонов с меченными биотином ДНК-зондами

Второй вариант был основан на амплификации выделенных ДНК с неспецифичиыми гексонуклеатидными праймерами в присутствии меченым биотином дезоксинуклеозидтрифосфатами и последующей гибридизацией с иммобилизованными на мембранные фильтры специфичными ДНК-зондами. Схема анализа представлена на рисунке 2.

Проба i

Гомогенезирование с PBS-буфером

I

Центрифугирование при 2000 об/мин

I

Супернатант матричной ДНК

I

Очистка ДНК (лизостафин. протеиназа К. сорбент)

I

Амплификация матричных ДНК с гексонуклеотидными праймерами в присутствии меченных биотином дезоксинуклеозидтрифосфатами и последующей гибридизацией с иммобилизованными на мембранные фильтры специфичными ДНК-зондами !

Денатурация меченных ампликонов 1

Точечная гибридизация меченных ампликонов с иммобилизованными на фильтрах специфичными зондами

I

Реакция с конъгогатом. субстратом и красителем 1

Визуальная детекция результатов окрашенных гибридных молекул

Рисунок 2. Схема модифицированной методики выявления Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций на основе неспецифичной амплификации и последующей гибридизации меченных ампликонов с иммобилизованными ДНК-зондами

В процессе исследований были отработаны условия амплификации для первой и второй модификаций. Установлено, что чувствительность модифицированных методик на чистых культурах позволяла определять

единичные бактериальные клетки. При определении специфичности показано, что обе методики дают возможность проводить индикацию возбудителей в смеси с другими бактериями (таблица 3).

Таблица 3.

Результаты определения специфичности индикации Staphylococcus aureus с помощью модифицированных методик на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией_

Интенсивность окрашивания гибридных молекул

после гибридизации с ДНК-зондами

После гибридизации После гибридизации

исследования меченых ампликонов с

Исследуемые иммобилизованных иммобилизованными ДНК-

бактерии ампликонов с мечеными зондами (модификация 2)

ДНК-зондами

(модификация 1)

Staphylococc Salmonella Staphylococcus Salmonella

us aureus typhi aureus typhi

murium murium

Staphylococcus ++++ » ++4+ _

aureus

Salmonella typhi - ++++ - ++++

murium

Escherichia coli - - - -

бактериальная

смесь (1:1) ++++ +-H-+ ++++ +-H-

Staphylococcus aureus

Salmonella typhi

murium

бактериальная

смесь (1:1) ++++ - ++++ -

Staphylococcus aureus

- Escherichia coli

(++++) - максимальное окрашивание гибридных молекул (-) - отсутствие окрашивания гибридных молекул

Проведенные исследования показали эффективность разработанных

модификаций в определении возбудителей в биоматериале домашних

животных и сырье животного происхождения (таблицы 4 и 5).

Таблица 4.

Результаты определения Staphylococcus aureus и в сырье и субпродуктах с помощью модифицированных методик на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией_

Интенсивность окрашивания гибридных молекул после

гибридизации с ДНК-зондами

После гибридизации После гибридизации

иммобилизованных меченых ампликонов с

Исследуемые ампликонов с мечеными иммобилизованными ДНК-

пробы ДНК-зондами зондами (модификация 2)

(модификация 1)

Staphylococcus Salmonella Staphylococcus Salmonella

aureus typhi aureus typhi

murium murium

1.Свинина - - - -

2.Свинина, ++++ - ++++ -

контаминированная*

Staphylococcus

aureus

З.Свинина, - ++++ - +++

контаминированная

Salmonella

typhi murium

4.Свинина, ++++ ++-H- ++++ +++

контаминированная

Staphylococcus

aureus и Salmonella

typhi murium

б.Печень - - - -

б.Печень, ++++ - ++++ -

контаминированная

Staphylococcus

aureus

7.Печень, - ++++ - +++

контаминированная

Salmonella typhi

murium

8.Печень, ++++ ++++ ++++ ++++

контаминированная

Staphylococcus

aureus и Salmonella

typhi murium

^Естественная контаминация, подтвержденная микробиологическими опытами;

(++++) - максимальное окрашивание гибридных молекул (-) - отсутствие окрашивания гибридных молекул

Таблица5.

Результаты определения Staphylococcus aureus и парвовируса в биоматериале животных с помощью модифицированных методик на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией_

Исследуемые Интенсивность окрашивания гибридных молекул после

пробы гибридизации с ДНК-зондами

биоматериала от После гибридизации После гибридизации

животных исследования меченых ампликонов с

иммобилизованных иммобилизованными ДНК-

ампликонов с мечеными зондами (модификация 2)

ДНК-зондами

(модификация П

Staphylococcus Parvovirus Staphylococcus Parvovirus

aureus aureus

Биоматериал - - - -

без

симптоматики

Биоматсриал ++++ - ++++ -

инфицированный

Staphylococcus

aureus

Биоматериал - ++++ - ++++

инфицированный

Parvovirus

Биоматериал ++++ ++++ ++++ ++++

инфицированный

смешанными

инфекциями

Staphylococcus

aureus

Parvovirus

(++++) - максимальное окрашивание гибридных молекул (-) - отсутствие окрашивания гибридных молекул

3. Усовершенствование определения парвовируса в биоматериале с использованием тест -системы ШЕХХ SNAP.

Тест набор для детекции парвовируса собак является экспресс -тестом на основе иммуноферментного анализа, тест детектирует антигены парвовируса собак (CPV) в фекалиях инфицированных собак.

Каждый набор содержит специальные устройства, для отбора проб из анализируемого материала, а также SNAP тесты. Каждый SNAP тест, включает промывочный раствор и раствор субстрата, заключенных внутри самого теста.

Определение парвовируса с применением данного набора проводится при комнатной температуре.

Для проведения исследований брали мазки-отпечатки из биоматериала, помещали в устройство и смешивали с рабочим раствором SNAP-теста.

Образец двигался к окну для чтения результатов на тесте, и доходил до активационного круга в течение 30-60 секунд.

При появлении цветного окрашивания активационного круга сразу же нажимался активатор устройства SNAP.

Чтение результата проводилось через 8 минут. Результаты учитывали по появившимся в окне для чтения результатов цветным пятнам и сравнивали интенсивность окрашивания пятен по пятну отрицательного контроля.

Результаты считались положительными, если окрашивание пятен образца становилось темнее, чем пятно отрицательного контроля.

Окрашивание пятна только положительного контроля свидетельствовало об отрицательном результате.

Проведенные нами исследования показали что, методика позволяла выделять парвовирус с чувствительностью 100%, при этом практически не наблюдалось перекрестных результатов с отрицательными контролями и вирусными вакцинами и бактериальными антигенами.

Результаты индикации парвовируса с применением тест -системы IDEXX SNAP коррелировали с данными, полученными с применением утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ методик ПЦР (тест-система «ПАРВОВИР») и ИФА (тест-система производства «Нарвак»),

4. Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами

Для упрощения определения Staphylococcus aureus нами разработана модифицированная методика ускоренного выявления Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения на основе ДНК гибридизации со специфичными ДНК-зондами. С этой целью пробы гомогенезировали и элюировали физраствором бактерии и проводили обогащение путем подращивания в жидкой питательной среде. Бактерии концентрировали с помощью центрифугирования, из биомассы выделяли ДНК, денатурировали кипячением, иммобилизовали на мембранные нитроцеллюлозные фильтры 0,2 мкм и гибридизовали с предварительно меченными биотином специфичными ДНК-зондами. После реакции с конъюгатом, субстратом и красителем по визуальной оценке окрашивания пятен с гибридными молекулами выявляли Staphylococcus aureus. Схема определения анализа представлена на рисунке 3.

Проба 1

Гомогенезирование и здюирование микроорганизмов физраствором

1

Подращивание микроорганизмов в жидкой питательной среде

I

Концентрирование бактерий центрифугированием

I

Гомогенезирование осадка микроорганизмов буферным раствором

1

Очистка от дебриса центрифугированием 1

Супернатант определяем й ДНК

I

Очистка ДНК (лизостафин. протеиназа К. сорбент)

I

Денатурация и иммобилизация определяемой ДНК

I

Точечная гибридизация на фильтрах со специфичными зондами

I

Реакция с конъюгатом. субстратом и красителем 1

Визуальная детекция результатов окрашенных гибридных молекул

Рисунок 3. Схема методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами.

Как показали исследования, данный способ давал возможность определения бактерий только при их высокой концентрации - 103 клеток в пробе. Предварительное обогащение бактерий в жидкой питательной среде позволяло проводить анализ единичных бактериальных клеток.

Методика давала возможность определять Staphylococcus aureus в пробах мясного сырья и субпродуктах в присутствии бактерий других видов.

5. Сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики по выявлению Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного происхождения

На следующем этапе наших исследований мы проводили сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики для выявления Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного происхождения. Результаты анализа представлены в следующей таблице 6.

Полученные данные показали, что методы ДНК-диагностики и микробиологического анализа позволяют с высокой специфичностью и чувствительностью до единичных клеток (за исключением методики ДНК-гибридизации без обогащения) выявлять Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного происхождения. Однако время анализа методов ДНК-диагностики приблизительно на порядок меньше, чем микробиологических, что дает возможность использовать их для ускоренного контроля микробной контаминации в исследуемых пробах.

Таблица 6.

Результаты сравнительного анализа микробиологических методов и методов •ДНК-диагностики для выявления Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного происхождения

Исследуемый материал

Методика Показатели Мяс Субпро Биомате

0 дукты риал

Микробиологический Чувствительность Един. Един. Един.

анализ клетки клетки клетки

Специфичность 100% 100% 100%

Время анализа До 10 До 10 До 10

суток суток суток

ПЦР с Чувствительность Един. Един. Един.

электрофоретически клетки клетки клетки

м разделением ампликонов Специфичность 100% 100% 100%

Время анализа 6-8 ч 6-8 ч 6-8 ч

Амплификация с Чувствительность Един. Един. Един.

последующей ДНК- клетки клетки клетки

гибридизацией Специфичность 100% 100% 100%

Время анализа 6-8 ч 6-8 ч 6-8 ч

Точечная Чувствительность 105 105 103

гибридизация с ДНК- клеток клеток клеток

зондами (без обогащения) Специфичность 100% 100% 100%

Время анализа 8-12 ч 8-12 ч 8-12 ч

Точечная Чувствительность Един. Един. Един.

гибридизация (с клетки клетки клетки

Специфичность 100% 100% 100%

предварительным обогащением) Время анализа 24 ч 24 ч 24 ч

ВЫВОДЫ.

1. Проведенные мониторинговые исследования проб биоматериала и сырья животного происхождения показали, что заболеваемость стафилококкозом у домашних животных составляла 86,1%, парвовирусным энтеритом - 95,7% и совместных инфекций - 30,2% в 2008 году, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3% - в 2009 году. Процент контаминированных проб мяса и субпродуктов золотистым стафилококкоком был значительно ниже, чем в биоматериале животных и составлял от 10 до 16,2%.

2. Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus и других сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы в мясе, субпродуктах и у животных на основе разработанных модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющее проводить анализ в течение 6-8 часов.

3. Модифицированные методики позволяют одновременно определять смешанные инфекции (Staphylococcus aureus и Salmonella typhi murium) в мясном сырье и субпродуктах и (Staphylococcus aureus и парвовирус) в биоматериале животных.

4. Усовершенствовано определение парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP. Тест-система позволяет проводить анализ в течение 2-3 часов.

5. Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus в мясе и субпродуктах на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами. Методика позволяет проводить дифференциацию Staphylococcus aureus от других бактериальных инфекций с чувствительностью 105 клеток

(без обогащения) или с чувствительностью до единичных клеток с предварительным обогащением.

6. Сравнительные исследования показали, что методы ДНК-диагностики не уступают микробиологическим методам по чувствительности и специфичности и на порядок превосходят их по затраченному времени анализа.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Для использования в научных учреждениях и исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами:

1. «Методические рекомендации по определению антигенов и антител на основе иммуноферментного анализа при инфекционных заболеваниях мелких домашних животных», утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.05.2008г.

2. Проект Национального стандарта Российской Федерации «Экспресс-метод определения антигенов и антител при внутренних заболеваниях животных, на основе иммуноферментного анализа»

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Уша Б.В., Родин В.И., Суворов A.B., Розанов С.Н., Светличкин В.В., Смирнов A.A./ Диагностика заболеваний мелких домашних животных вирусной и бактериальной этиологии с помощью иммуноферментных тест-систем. //Труды Международной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», 2008 г., стр. 58.

2. Розанов С.Н. /Стафилококковые инфекции у собак и кошек и методы их диагностики. // «Ветеринария и кормление», 2009 г., № 6, стр. 32-33

3. Розанов С.Н., Светличкин В.В. /Определение возбудителей стафилококковых и парвовирусных инфекций на основе ДНК- и иммунодиагностики. // «Практик», 2010 г., №1, стр. 22-25.

ГНУ ВНИИВСГЭ. г. Москва, Звенигородское шоссе, 5

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Розанов, Сергей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Золотистый стафилококк и его характеристика.

1.2. Стафилококковые и сопутствующие инфекции у животных, в сырье и продуктах животного происхождения.

1.3. Методы диагностики золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Цель и задачи исследования.

2.2. Объекты и методы исследований.

2.2.1. Микробиологические методы определения Staphylococcus aureus в биоматериале.

2.2.2. Выделение и очистка ДНК из бактерий.

2.2.3. Включение биотина в ДНК методом ник-трансляции.

2.2.4. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции.

2.2.5. Методика идентификации бактерий точечной ДНК-гибридизацией на мембранных фильтрах с биотинилированными ДНК-зондами.

2.2.6. Методика идентификации парвовируса с применением тест-системы «ПАРВОВИР».

2.2.7. Методика определения стафилококковых и сопутствующих инфекций на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией

2.2.8. Методика определения антигенов парвовируса собак с использованием тест-набора SNAP Parvo.

2.2.9. Методика выявления антигенов парвовирусного энтерита собак иммуноферментным анализом.

2.2.10. Статистическая обработка результатов.

2.3. Результаты исследований

2.3.1. Результаты мониторинговых исследований по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, в мясном сырье и субпродуктах.

2.3.2. Разработка и совершенствование методик определения Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в мясном сырье, субпродуктах и биоматериале животных на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией.

2.3.3. Усовершенствование определения парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP.

2.3.4. Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами.

2.3.5. Сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики по выявлению Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного происхождения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Совершенствование методов определения стафилококковых инфекций у животных и в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики"

Актуальность темы.

Стафилококковые инфекции достаточно широко распространены у различных животных. Основными проявлениями стафилококковой инфекции являются: гнойные воспаления кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколиты, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы. Резервуаром инфекции коагулазопозитивных стафилококков являются грызуны, птицы, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, кошки. При этом заболевание проявляется у всех возрастных групп, но в большей степени у молодняка. Высок риск взаимного заражения золотистым стафилококком животных и человека. Выделение возбудителя происходит с носовыми истечениями, фекальными массами, мочой, истечениями из половых органов (препуция и влагалища), гнойными выделениями из кожных поражений (язвы, свищи).

Инкубационный период продолжается несколько дней. Клинические проявления стафилококковых болезней многообразны. При смешанном заражении стафилококками и вирусами (например,' парвовирус) иногда наблюдаются сходные клинические признаки заболеваний. Возбудитель ПВС-2 очень устойчив в окружающей среде и при комнатной температуре может сохраняться в инфицированных объектах в течение 6 месяцев (Б.Ф. Шуляк, 2003; М. Уиллард, Г. Тведтен, 2004; Я.Рэмси, Б.Теннат, 2005г). Лечение заболеваний, вызванных бактериальными, вирусными или смешанными инфекциями требуют различного подхода, вследствие чего, существует необходимость дифференциации возбудителей заболеваний.

Сырье животного происхождения (молоко, мясо, субпродукты) подвержено как первичной, так и вторичной контаминации ( Логвинов Д.Д., 1992; Горяинова Г.М., 2004; Eshraghi Н., 1997; Pfleger R. et al., 2002). При ветеринарно-санитарной экспертизе актуальным является дифференциация золотистого стафилококка от других бактериальных инфекций, в частности от синегнойной палочки, сальмонелл, стрептококков.

Диагностика стафилококковых инфекций основана на классическом бактериологическом анализе с применением питательных сред: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА). Определение патогенности возбудителя проводят в реакции плазмокоагуляции.

Для ускоренной диагностики стафилококковых и парвовирусных инфекций применяют методы ПЦР анализа и ИФА (В.Н.Сюрин, А.Я. Самуйленко и др. 1998; М. Уиллард, Г. Тведтен и др., 2004 г).

Для проведения мониторинговых исследований по определению золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций в большом количестве биоматериала животных и сырья животного происхождения актуальным является разработка ускоренных методов на основе ИФА и ДНК-диагностики. Цель и задачи исследований.

Целью исследований являлась разработка и совершенствование методов определения стафилококковых и сопутствующих парвовирусных инфекций у животных, а также стафилококковых инфекций в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики.

В задачи исследований входило: провести мониторинговые исследования по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих парвовирусных инфекций в биоматериале домашних животных по городу Москва; провести мониторинговые исследования по выявлению Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения;

- усовершенствовать методику определения Staphylococcus aureus и сопутствующих парвовирусных инфекций в биоматериале животных на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

-усовершенствовать определение антигенов парвовируса у домашних животных с использованием тест системы IDEXX SNAP;

- усовершенствовать определения Staphylococcus aureus в мясном сырье и субпродуктах на основе модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

- разработать модифицированную методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в мясном сырье и субпродуктах на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами;

- определить чувствительность и специфичность методов;

- провести сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики выявления Staphylococcus aureus у животных и в мясном сырье и субпродуктах.

Научная новизна

Проведены мониторинговые исследования по выявлению стафилококковых и парвовирусных инфекций у домашних животных и стафилококковых инфекций в мясном сырье и субпродуктах на территории мегаполиса Москва, которые показали заболеваемость в 2008 году стафилококкозом до 86,1%, парвовирусным энтеритом до 95,7%, совместных инфекций - 30,2%, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3%) - в 2009 году. Золотистый стафилококк был выявлен в сырье животного происхождения в относительно не большом проценте исследуемых проб.

Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus и других сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы в мясе, субпродуктах и у животных на основе разработанных модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющих проводить анализ в течение 6-8 часов. Методики дают возможность одновременно определять смешанные инфекции (Staphylococcus aureus и Salmonella typhi murium) в мясном сырье и субпродуктах и (Staphylococcus aureus и парвовирус) в биоматериале животных.

Усовершенствовано определение парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP. Тест-система позволяет проводить анализ в течение одного часа.

Разработана методика ускоренного определения Staphylococcus aureus в мясе и субпродуктах на основе ДНК гибридизации со специфичными ДНК-зондами. Методика позволяет проводить дифференциацию Staphylococcus aureus от других бактериальных инфекций.

Практическая ценность.

На основе проведённых исследований разработаны:

1. «Методические рекомендации по определению антигенов и антител на основе иммуноферментного анализа при инфекционных заболеваниях мелких домашних животных», утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.05.2008г.

2. Проект Национального стандарта Российской Федерации «Экспресс-метод определения антигенов и антител при внутренних заболеваниях животных на основе иммуноферментного анализа».

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения Героя Социалистического труда, лауреата Государственной премии СССР и премии Эстонской ССР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ А.Х. Саркисова (Москва, 2009 г.).

- на Ученом совете ГНУ ВНИИВСГЭ (2009 г.).

- на межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ (2009 г.).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Розанов, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Проведенные мониторинговые исследования проб биоматериала и сырья животного происхождения показали, что заболеваемость стафилококкозом у домашних животных составляла 86,1%, парвовирусным энтеритом - 95,7% и совместных инфекций - 30,2% в 2008 году, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3% - в 2009 году. Процент контаминированных проб мяса и субпродуктов золотистым стафилококкоком был значительно ниже, чем в биоматериале животных и составлял от 10 до 16,2%.

2. Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus и других сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы в мясе, субпродуктах и у животных на основе разработанных модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющее проводить анализ в течение 6-8 часов.

3. Модифицированные методики позволяют одновременно определять смешанные инфекции (Staphylococcus aureus и Salmonella typhi murium) в мясном сырье и субпродуктах и (Staphylococcus aureus и парвовирус) в биоматериале животных.

4. Усовершенствовано определение парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP. Тест-система позволяет проводить анализ в течение 2-3 часов.

5. Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus в мясе и субпродуктах на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами. Методика позволяет проводить дифференциацию Staphylococcus aureus от других бактериальных инфекций с чувствительностью 105 клеток (без обогащения) или с чувствительностью до единичных клеток с предварительным обогащением.

6. Сравнительные исследования показали, что методы ДНК-диагностики не уступают микробиологическим методам по чувствительности и специфичности и на порядок превосходят их по затраченному времени анализа.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Для использования в научных учреждениях и исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами:

1. «Методические рекомендации по определению антигенов и антител на основе иммуноферментного анализа при инфекционных заболеваниях мелких домашних животных», утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.05.2008г.

2. Проект Национального стандарта Российской Федерации «Экспресс-метод определения антигенов и антител при внутренних заболеваниях животных, на основе иммуноферментного анализа»

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Розанов, Сергей Николаевич, Москва

1. Абаджиева А.Н./ Генетическая и биохимическая характеристика детерминантной устойчивости грамположительных микроорганизмов к антибиотикам // М., 1987, с. 56-67.

2. Акатов А.К., Зуева B.C. /Стафилококки // М., изд. «Медицина», 1983, с. 87-94.

3. Антонов А .С./ Молекулярные основы геносистематики // Изд. МГУ, М., 1980, с. 24-31.

4. Асеев Н. В., Светличкин В.В., Астахова О.И. /Тест-система для ускоренной индикации- и идентификации сальмонелл и кишечной палочки в продуктах убоя с/х животных на основе генных зондов // Труды ВНИИВСГЭ, 1994, т. 94, с. 95-98.

5. Белоусова Р.В., Гончарова Т.М., Асеев Н.В. и др./ Разработка способов и технических средств полевой индикации возбудителей инфекционных заболеваний животных на основе генных зондов // В кн.: Вопросы ветеринарной биологии, М., 1994, с. 68-70.

6. Вальехо-Роман К. М. /Гибридизация ДНК В кн.: Молекулярные основы геносистематики // Изд-во МГУ, М., 1980, с.86-105.

7. Вахромеева В.В. /Антигенная структура и анализ межштаммовых различий парвовирусов плотоядных // Автореферат диссертации насоискание ученой степени кандидата биологических наук ВНИИВВиМ, г. Покров, 2000 г.

8. Ветеринарная микробиология./ Под ред. Е.В. Козловского, П.А. Емельяненко // М., изд. «Колос», 1982, с. 138-141.

9. Гаврилин А.С. /Уровень заболеваемости коров маститом и его этиология // Сб. тр. "Селекция, кормление, содержание с.-х. жив-х и технология произ-ва продуктов жив-ва", 2002, Вып. 13, с. 104-106.

10. Гаршина И.А., Дагина A.M., Яковлев В.П./ Влияние антибиотиков на адгезию микроорганизмов // Антибиотики и химиотерапия, 1990, том 35, № 3, с. 50-53.

11. Гейдрих Г., Ренк В. /Маститы сельскохозяйственных животных и борьба с ними. // М., «Колос», с. 1968, с. 376.

12. Гинцбург А. Л. /Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов и решение задач медицинской микробиологии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1999, № 5, с. 22-26.

13. Горбовицкая М. /Диагностика болезни Марека с использованием ДНК-зондов // Птицеводство, М., 1996., №> 2, с. 27-28.

14. Горяинова Г.М. /Идикация Staphylococcus aureus методами ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах//. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, ВНУ ВНИИВСГиЭ, г. Москва, 2004 г.

15. Госионов Р. /Некультивируемые формы микроорганизмов. // Ветеринарная газета, 2000, № 5.

16. ГОСТ 10444.2-94 /Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus.// 1996.

17. Громов Б.В., Павленко Г.В. /Экология бактерий // JL, изд. ЛГУ. 1989.

18. Демидова Л.Д. /Этиология мастита у коров // Тез.докл. IX Междунар. симпозиума по маш. доению с.-х. жив-х., Оренбург, 1997, с.188-189

19. Дерюшева С.Е./ Биотинилирование ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции // Труды ВНИИ генетики и разведения с/х животных, Санкт- Петербург, 1993, с.43-45.

20. Друца В.Л./ Радиоизотопное мечение ДНК // В. кн.: Молекулярные основы геносистематики // М., изд. МГУ, 1980, с. 35-50.

21. Дрыгин Ю.Ф., Бузмаков А.В., Тетерина Н.Л., Морозов С.Ю. /Нерадиоактивная диагностика вирусных инфекций зондами "ДНК-пероксидаза" //Молекулярная биология, 1992. т. 26, с. 18-22.

22. Егоров Н.С./ Основы учения об антибиотиках // М., изд. МГУ, 1994, с. 51-59.

23. Золотарев Ф.Н, Голубев Д.Б., Петров Н.А./ Метод точечной гибридизации в вирусологии.// Успехи современной биологии.- 1989.-том 108.- с. 375-382.

24. Иванов Л.Г./ Систематика, морфологическая характеристика и биологические свойства возбудителей токсикоинфекций // Автореф. на соискание ученой степени доктора биологических наук, МГУ им. Ломоносова, 1992.

25. Калина В.П. /Инволюция патогенных бактерий, как биологическая закономерность // Журнал микробиологии, эпизоотологии и иммунологии. 1988, № 4, с. 33-40.

26. Карташова В.М., Ивашура А.И. /Маститы коров // М., ВО «Агропромиздат», 1988.

27. Касянчук В.В. /Мастит: основы диагностики и лечения. // Молоч. и мясн.скотоводство, 1992, №4, с.15-16.

28. Кац Л.Н. /Субмикроскопическая структура микроорганизмов с дефектной клеточной стенкой // Успехи микробиологии. 1980, вып. 15, с. 186-196.

29. Коромыслов Г.Ф., Фомин Б. А., Артюшин С.К. и др. /Диагностикумы инфекционных болезней сельскохозяйственныхживотных на основе генной инженерии // Труды ВИЭВ, 1994, т. 69, с. 8-14.

30. Красько А.Г., Ркхадзе Г.Г., Сергеев В.А. и др. /Диагностика ротавирусной инфекции человека методом точечной гибридизации // Вопросы вирусологии, 1987, т. 32, № 2, с. 208-212.

31. Кривононосов М.В. /Организация защиты качества продуктов питания // Международный медицинский журнал (г. Харьков), 1998, №4, с. 104-106.

32. Логвинов Д. Д. /Маститы и качество молока // Молоч. и мясн. скотоводство, 1992, №5-6., с.5-7.

33. Маккреди Б.Д., Чимера Д.А./Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами // В кн. Молекулярная клиническая диагностика, М., изд. «Мир», 1999, с.496-506.

34. Мальков И.Г. /Нетрадиционные методы анализа в ускоренной диагностике патогенных бактерий // В кн.: Проблемы ветеринарной санитарии, 1992, с. 3-14.

35. Мамаев М.А./ Разработка ускоренных способов ДНК-диагностики для определения бактерий в мясе и мясопродуктах // Авторефератдиссертации на соискания ученой степени кандидата вет. наук, М., 2000.

36. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж./ Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., изд. «Мир»., 1994, с. 159-172.

37. Методика по применению тест-системы «ПАРВОВИР» для выявления возбудителя парвовирусного энтерита собак//М. Минсельхоз России, 2002, с 2-13.

38. Методические указания по применению набора для выявления антигенов парвовируса собак, вирусов энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом (ИФА) // М. ЗАО «НПО НАРВАК», 2005, с. 1-4.

39. Методы общей бактериологии. /(Под ред. Герхардта Ф. и др) // М., изд. «Мир», 1984, с. 89-96.

40. Механизм действия антибиотиков./ (Под ред. Гаузе JI.) // М., изд. «Мир», 1975, с. 5-64.

41. Монахова Е.В., Власов В.П., Вуцан В.Н., Е.И.Седых, Н.К.Михась./Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации холерных вибрионов // Молекул, генетика микроб, вирусол, М., изд. «Медицина», 1993.-4, с.8-11.

42. Николаев Ю.А., Воронина Н.А. /Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов // Микробиология, 1999, 68, № 1, с. 45-50.

43. Общая микробиология / (Под ред. Вершигора А .Я.) // Киев, 1988, с. 25-36.

44. Околелов В.И./ Современные физико-химические методы биодетекции и идентификации микроорганизмов // Актуальные проблемы вет. медицины в россии, Новосибирск, 1998, с. 339-346.

45. Определитель бактерий Берджи / под ред. Г.А. Заварзина // М., изд. «Мир», 1997.

46. Павлова И.Б. /Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде (электронно-микроскопическое исследование) // Диссертация в виде научного доклада, М., 1999.

47. Павлова И.Б., Куликовский А.В., Джентемирова К.М. /Экология бактерий в популяции // Вестник сельскохозяйственной науки, 1990, № 2, с. 75-78.

48. Павлова И.Б., Куликовский А.В. и др./ Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в популяциях. Морфология колоний бактерий // Журнал микробиологии, эпизоотологии и иммунологии, 1990, № 9, с. 15-20.

49. Паников Н.С. /Кинетика роста микроорганизмов. Общие закономерности и экологические положения // М., изд. «Наука», 1991, с. 4-72.

50. Панчини Д., Паретти Ф. /Антибиотики. //М., изд. «Мир», 1985, с. 41-58.

51. Париков В.А., Слободяник В.И., Кузьмин Г.Н. и др./ Дифференциация кокковой микрофлоры молока // Ветеринария, 1981, №11, с. 64-65.

52. Петров Н.Б. /Методы изучения реассоциации ДНК // В кн. Молекулярные основы геносистематики, М., изд. МГУ, 1980, с. 51-75.

53. Печуркин Н.С. /Популяционная микробиология // Новосибирск, "Наука", 1978, с. 39-46.

54. Поставин В. А. /Пищевые токсикоинфекции // М., изд. "Медицина", 1980, с. 6-49.

55. Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов. /Утв.

56. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР, 27 декабря 1983 г.// М, ВО «Агропромиздат», 1988.

57. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. /L-форма бактерий // М., изд. «Медицина», 1981, с. 5-112.

58. Рахманина М.М., Сулимов А.А., Селиванов А.В. /Биологические свойства парвовируса собак.// Ветеринария, 1994, №7,с21-26.

59. Рэмси Я. Теннант Б. /Инфекционные болезни собак и кошек.//М., изд. «Аквариум», 2005, с. 151-155.

60. Светличкин В.В. / Разработка тест-систем и технических средств ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля.//Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, М., 2002.

61. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б./ Определитель зоопатогенных бактерий//М., изд.»Колос», 1985, с. 22-25.

62. Синагатуллина Э.М. /Разработка тест-систем для выявления инфекционных агентов с использованием нерадиоактивных биотиниллированных ДНК-зондов // Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук, М., 1992.

63. Стафилококки и стафилококковые инфекции // Изд. Сарат. ун-та., 1980, с. 52-93.

64. Стикланд Ю.Е. /Получение зондов и их мечение // В кн. Молекулярная клиническая диагностика. М, изд. «Мир», 1999, с. 329372.

65. Сулимов А.А., Уласов В.И., Могильный Ю.И. /Парвовирусная инфекция животных семейства псовых.// Сборник научных трудов ВГНКИ, 2005, № 65, с.60-64.

66. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. /Вирусные болезни животных // М. изд. ВНИТИБП, 1998, с.561-569.

67. Тимченко Н.Ф. Генетико-биохимические механизмы патогенности бактерий и перспективы их изучения //Бюлл. АМН СССР, 1986, №4, с. 66-71.

68. Уиллард М., Тведтен Г.,Торнальд Г. /Лабораторная диагностика в клинике мелких домашних животных//М., изд. «Аквариум», 2004., с. 207-209.

69. Франклин Т., Сноу Дж./ Биохимия антимикробного действия // М., изд. «Мир», 1984, с. 15-49.

70. Фрумгарц Л.Ф., Киприянов С.М., Калачиков С.М. и др. /Получение флуоресцентной меченой ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации // Биоорганическая химия, 1986, №11, с. 1508-1513.

71. Херрингтон С., Макги Дж. /Молекулярная клиническая диагностика//М, изд. «Мир», 1999, с.558.

72. Чан Т.В.Т./ Гибридизация нуклеиновых кислот // В кн. Молекулярная клиническая диагност, методы, М., 1998, изд. «Мир», с. 374-394.

73. Шибата Д.К./ Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биотопов // В кн. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М., изд. «Мир», 1999, с. 395-425.

74. Шлегель Г. /Общая микробиология // М., изд. «Мир», 1987, с. 2034.

75. Шуляк Б.Ф. /Руководство по бактериальным инфекциям собак. //М. изд. «Олита», 2003,1 т., с. 14-50.

76. Шур дуба Н.А., Сотникова В.М., Нагорных A.M. / Определение энтеротксигенности S. Aureus, выделенного из молока и молочных продуктов // Российский журнал «проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» № 1, 2009 г., стр. 20-24.

77. Экологическая биотехнология /(Под ред. Форстера К.Ф., Вейза Д.А.) // Д., изд. «Химия», 1990, с. 21-39.

78. Экология и генетика микроорганизмов /(Под ред. Иванова А.И.) // Свердловск, 1991, с. 5-41.

79. Agrowal S., Cristodoulou С., Gait М. /Efficient methods for attaching nonradioactive labels to the 5 ends of syntheticaligodeoxy ribonucleotides // Nucl. Acid. Res., 1986., v. 14, p. 6227-6245.

80. Alcerlund Т./ Growth and division of E. coli cells // Sci. and Technol, 1995, № 170, p. 1-47.

81. Andrew V., Sayler G./ The use of gene probes in the rapid analysis of natural microbial communities // J. Ind. Microbiol., 1988, 3, №5, p. 281292.

82. Ashall F., Miless M. /Diagnosis of parasitic diseases using DNA to DNA hybridization // Trans Roy Soc trop. Med. Hyg, 1988, № 2, p. 235236.

83. Baker R.F. /Binding of DNA to cellulose nitrate filters under denaturing conditions // Anal. Biochem, 1977, v.78, p. 569-571.

84. Basant К. et. al./ Subclinical mastitis: A real challenge to dairy industry (Detection and bacteriological studies) // Techn. Symposium on Dairy «Mastitis and milk quality», 2002, New Delhi, India, p. 30-33.

85. Beard J. /Gene probes Locate waterborne diseases // New Sci, 1987, № 1562, p. 237.

86. Bennett R. /Milk quality. A second look// Dairy Herd. Manag., 1988, v. 25, №1, p. 30-31.

87. Bernet C., Carret M., de Barbeyrac B. /Detection ofMycoplasma pneumoniae by Using the Polymerase chain Reaction // J.clin. Microbiol.-1989.-Vol. 27. NII,- p. 2492-2495.

88. Bevan I.S, Daw R.A., Day P.J.R., Ala F.A., Walker M.R./ Polymerase chain reaction for detection of human cytomegalovirus infection in a blood donor population // Brit. J. Haematol., 1991, v.78, № 1, p. 94-99.

89. Boom R, Sol C, Beld M., Weel J., Goudsmit J., Wertheim-van Dillen. /Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate DNA isolation Procedure Based on Selective Binding of Bovin Alpha-Casein to Silica Particles // J. Clin. Microbiol, 1999, v.37, № 3, p.615-619.

90. Brun Buisson Ch. / Staphylococcus aureus stable of resist methociclin. Evolution, epidemic, part in clinic // Pathol. Biol., 1998, v. 46, p. 227-234.

91. Brytting M, Sundgvist V.-A., Stahlhandske P., Linde A., Wahren B. /Cytomegalovirus DNA detection of an immediate early protein gene with nested primer oligonucleotides // J. Virol. Meth., 1991, v. 32, № 2-3, p. 1127-138.

92. Burtonboy G, Coignoul F, Delfrriern,Pastoret P.P. /Canine hemorraqgic enteritis: detection of viral partieles by election microscopy//Arch. Vitol., 1979, № 61(1),pl-11.

93. Cassiman I. /Diagnosis of genetic diseases by probes // Acta clin. Belg, 1988, p. 181-184.

94. Chou S., Merigan Т.С./ Rapid detection and quantitation of human cytomegalovirus in urine through DNA hybridization // New England Journal of Medicine., 1985, v. 308, p. 921-925.

95. Chu B.C.F., Wahl G.M., Orgel L.E./ Derivatization of unprotected polynucleotides//Nucl. Acid Res., 1983, v.ll, p. 6513-6529.

96. Coates P.J., Мак W.P., Slavin G., Ardenne A.J. /Detection of singl copies of Epstein-Barr virus in paraffin wax sections by nonradioactive in situ hybridization // J. Clin. Pathol., 1991, v.44, № 6, p. 487-491.

97. Costa A.L., Valenti A., Veronese M. /Study of the Morphogunetiohal Alterations Produced Fenticonazole on strains of Staphylococcus aureus, Using the Scaning Electron Microscope (S.E.M.) // Microbiology, 1984., v. 27, p. 29-35.

98. Сох K.H., DeLeon D.V., Angerer L.M. /Detection of mRNAs in sea unchin embryos by in situ hibridization using asymmetric RNA probes //Developmental Biology, 1987, v. 101, p.485-502.

99. Day P.J.R., Bevan I.S., Gurney S.J., Young L. S., Walker M.R. /Synthesis in vitro and application of biotinylated DNA probes for human papiloma virus type 16 by utilizing the polimerase chain reaction // Biochmi., 1990, v.267, №1, p.l 19-123.

100. Denhardt D.T. /А membrane filter technique for the detection of complementery DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1966, v.23, p. 641-646.

101. Dodd F.H. /Progress in mastitis control // Kieler Milchw. Forsch.-Ber., 1985, v. 37, h. 3, p. 216-223.

102. Falkow S., Moseley S. /Specific DNA probes in diagnostic microbiology // Патент США № 4358535, 10.11.1982,435/15.

103. Fine S.P., Reddy G.R., Marnett L.J. /Mutagenicity in Escherichia coli of the mayor DNA adduct derived from the endogenous mutagen malondialdehyde // Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, v.94, p. 8652-8657.

104. Flint S.H., Hartley N.J. /Evaluation of the TECRA Escherichia coli 0157 visual immunoassay for tests on dairy products // Lett Appl Microbiol, 1995, v. 21(2), p.79-82.

105. Forster A., Modness J., Skingle D. /Non-radioactive hybridization probes prepared by chemical labeling of DNA and RNA with novel reagent, photobiotin //Nuc. Acid Res., 1985, № 3, p.745.

106. Fox L. /Staph, aureus: source, impact. // Dairy Herd. Manag., 1990, v. 27, № 6, p. 32.

107. Fox L., Hancock D. /Follow the basics to control S. aureus // Hoards' Dairyman, 1990, v. 135, № 16, p. 767.

108. Garger S., Turpen T. /Use of RNA probes to detect plant RNA viruses // «Eth Enzymol., v.l 18, Orlando, 1986, p. 717-722.

109. Gou D. F., Kubota H, Onuma N, Kodama H./ Detection of salmonid heipes virus in fisli by Southern-blot technique // J. Vet. Mod. Sci., 1991, v. 53, NI.P 43-48.

110. Halt C.,Ward M.E.,Clarke 1 .N./Analysis of the entire nucleotide sequence of the ciyptic plasrnid of Chlamidia trachomatis serovar L I .Evidence for involvement in DNA replication // Nucl. Acid. Res., 1988, v. 16, p. 4053-4067.

111. Hames B.D., Higgins S.J./ Nucleic acid hybridization: a practical approach// IRL Press, Oxford, 1985.

112. Herrick J., Michalet X., Conti C., Schurra C., Bensimon A. /Quantifying single gene copy number by measuring fluorescent probe lengths on combed genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, v. 97 (1), p 222-227.

113. Hill W., Payne A./ Detection and enumeration of virulent Yersinia enterocalitica in food by DNA colony hybridization // Appl. F Environmental Microbiology, 1984, №4, p. 801-807.

114. Huss H.H. /Control of indigenous pathogenic bacteria in seafood // Food control, 1997, v.8, № 2, p.91-98.

115. Ikeda S., Yamamoto M., Nagao K., Zhang В., Watanabe S., Oda T. /Non-radioactive hybridization probes prepared using M13 phage vector and the universal sequencing primer // Acta mod. Okajama., 1989, v.43, № 4, p. 1197-1202.

116. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J J., White T.J./ Optimization of PCRs. In: PCR protocols, a guide to methods and applications // Academic Press, San Diego, California, 1990, p. 16-21.

117. Joseph Т., Navo P.E., Caron C.F. /Molecula characterization of Chlamidia trachomatis and Chlamidia psitace; Plasmids // Infect. Innwn., 1986, v.51, p.699- 703.

118. Jremstein M. and Hognes D./ Colony hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene // Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 1975, p. 3961-3965.

119. Kalorey D.R. /Recent concepts in epidermiology and control of mastitis // Techn. Symposium on Dairy «Mastitis and milk quality», 2002, New Delhi, India, p. 102-107.

120. Kohne D. /Novel approach for rapid and sensitive detection of microorganisms // Clinicae Microbiol, 1987, № 6, p. 110-112.

121. Lakshmi D., James D. /А solution hybridization assay for the quantitation of prodynorphin mRNA // Mol. Brain Res., 1987, № 2, p. 173176.

122. Langer P. R., Waldrop A.A., Ward D.C. /Enzymatic synthesis of biotim-labelled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes // Proc. Nat. Acad. Science., 1982, v.19, p. 4381-4385.

123. Leiser R., Schubert J. /Nachweis phytopathogener Virren mit Hilfe der RNA-RNA-hydridisierung auf Filtern // Acta biotechnol, 1986, №1, p.14-16.

124. Longer P. /Enzymatic synthesis of biotin-labelekl polynucleotides novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1981, №11, p. 6633.

125. Martm R. H. /Non-radioactive techiques for the labelling of nucleic acids // Biotech. Adv., 1991, v.9, p. 185-190.

126. Matsunaga Т., Yoshida T. et al./ Identification of Staphylococci from bovine mastitis and fb examination of their susceptibility to antibiotics // Japan J. Vet. Sci., 1990, v. 52, № 6, p. 1219-1227.

127. Mauriello G., Moschetti G., Villani F., Coppola S. /Antibiotic resistance of coagulase negative staphylococcal isolated from artisanal Naples-types salami //Int. J. Food Sci. andNutr, 2000, -51, № 1, p. 19-24.

128. More Mardret J., Henricn James В./ Quantitative cell lyses of indigenous microorganisms and rapid exstraction of microbial DNA from sediment // Appl. and Environ. Microbiol., 1994, 60, № 5, p. 1574-1580.

129. Moseley S.L., Hyg J. /Detection of enterotoxigen Esherichia coli by DNA colong hybridization // J. Infect., 1989, № 6, p. 892-898.

130. Murtanyh M.P., Lin G.F., Haggard D.L., Weber A.F., Meiske J.C. /Detection of bovine leukemia virus in cattle by the polymerase chain reaction // J. Virol. Meth., 1991, v. 33, № 11-12, p. 73-85.

131. Neeelam S./ A rabid method for the preparation of plastid DNA // Indian J. Exp. Biol., 1995, 33, № 5, p. 387-391.

132. Ozawa M., Mijazawa K., Ohsaki R. /Evaluation of cefroxime in the treatment for bovine clinical mastitis // J. Japan Vet. Med., 1989, v. 42, № 12, p. 843-848.

133. Paul P.S. /Application of nucleic acid probes in veterinary infectious diseases // Voter. Microbiol., 1990, v. 24, № 3/4, p. 409-417.

134. Peirce C. /DNA technology provides new tools for identifycirung genetic causes of disease // Res. Resour. Report., 1988, №8, p. 1-4.

135. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White T.J. /Target selection and optimization of amplification reaction // In: Diagnostic molecular microbiology, ASM, 1993, p. 88-102.

136. Pulco P R., Khatib R., Barientes S., Atmar R., Tony M.A. /Detection of all 6 Coxsackieviral cerotype by polymerize chain reaction // J. Cell Biochem., 1991, Suppl. 15, p. 194.

137. Rifai S., Barbancon V., Prevost G., Piemont Y. /Staphylococcus aureus Synthetic exfoliative toxin A and В DNA probes for detecton of toxigenic Staphylococcus aureus strains // J. Clin. Microbiol., 1989, №3, p. 504-506.

138. Rippinger P., Bertschinger H.U., Imberechts H., Nagy В., Sorg I., Stamm M., Witting W. /Designations F18ac for the related fimbrial types

139. F107, 2134Р and 8813 of Escherichia coli isolated from porcine postweaning diarrhoea and from oedema disease // Veterinary Microbiology, 1995, № 45, p. 281-295.

140. Rusvai F., Belak S. /Detection of bovine adenovirus nucleic acid sequences in nasal specimens by biotinylated DNA probes // J. Virol., 1992, №4, p. 311-316.

141. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Erlich Н.А./ Genetic ahalisis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, p. 6230-6234.

142. Serhir В., Dugord D., Jacques M., Higgins R., Harel J. /Cloning and characterization gene (dexS) from Streptococcus suis // GENE, 1997, № 190, p. 257-261.

143. Sonnleither B. / Microorganisms dynamic packuption // J. Biotechnol, 1998, v. 65, № 1, p. 47-60.

144. Trinidad P., Nickerson S.C. Adkinson R.W. /Histothology of Staphylococcus mastitis in unbred dairy heifers //1 Dairy Sci, 1990, v.73, p. 639-642.