Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК"

Денисова Елизавета Аркадьевна

Концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

автореферат 11 НОЯ 2015

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково - 2015

005564430

005564430

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ФГБНУ «ВНИИТИБП»)

Научный консультант: Самуйленко Анатолий Яковлевич, доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАН, академик НААН Украины; лауреат Государственной и Правительственной премии РФ, Заслуженный деятель науки РФ, директор ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности»

Официальные оппоненты: Гаврилов Владимир Андреевич, доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»,

Никяиовя Людмила Анатольевна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник отдела биохимических и химико-аналитических исследований ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста», эксперт в области подтверждения соответствия мяса, мясной продукции, мяса птицы, яиц и продуктов их переработки (Регистр системы сертификации персонала Госстандарта РФ),

Беро Иван Леонтьевич, доктор биологических наук, заместитель директора по экономическим вопросам в ФГБНУ «Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий».

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Защита состоится «25» декабря 2015 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической

промышленности» по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ФГБНУ «ВНИТИБП», E-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ФГБНУ ВНИТИБП

Автореферат разослан &_ 2015 г.

Автореферат 25 сентября 2015 г. размещен на сайте ФГБНУ «ВНИИТИБП» внитибп.рф и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru/.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, >

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Получаемые на предприятиях АПК сырье и продукты животного происхождения должны быть высокого качества, так как направлены на обеспечение пищевой безопасности и на получение компонентов биотехнологических процессов производства полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии, улучшающих воздействие на окружающую среду и формирование экологичной среды обитания человека и животных.

Комплекс средств н методов обеспечения безопасности на указанных предприятиях включает различные элементы: системы управления, систем контроля производственных помещений, оборудования, сырья и продукции, воздухо- и водоснабжения, отходов производства, а также систем деконтаминации и очистки. В современных условиях требования безопасности обеспечиваются соответствующими техническими регламентами, а так же стандартами систем качества (ИСО 22000, ХАССП, GMP) и стандартами экологического мененджмента. При этом, необходимо осуществлять быстрое и эффективное обнаружение опасных факторов, способных оказать негативное влияние в критических контрольных точках, своевременно анализировать эти факторы и проводить соответствующие корректирующие мероприятия. Такой подход с успехом используется за рубежом и у нас в стране (Бурыкина И.М., 2004, Ребезов М. Б. и др. 2014, Романенко, Г.А. 2004, Скотникова Т.А., Токарик Э.Ф. 2014, Dillon, M. 2005).

Одним из основных опасных факторов, влияющих на безопасность получения сырья и продукции животного происхождения является микробная контаминация. При этом важно определять не только общие показатели микробного обсеменения, а и проводить идентификацию возбудителей инфекции. К таким возбудителям, относятся прежде всего эшерихии, сальмонеллы, золотистый стафилококк, кампилобактерии и листерии (Дунченко Н.И. и др. 2007, Золотарев Ю.В. 2004, Маккреди Б.Д., Чимера Д.А. 1999, Самуйленко А.Я, Клюкина В.И. и др. 2012, Corbisier Р, Trapmann S. 2005). Существующие методы бактериологического анализа достаточно длительны и трудоемки (Галкин A.B., Комаров В.Н. и др. 1998, Долгов В.А. и др. 2004, Морозова E.H. 2003, Dillon, M. and Griffiths, С., 1998) и не совсем пригодны для скрининговых исследований микробных загрязнений в критических контрольных точках. Весьма перспективным в этом направлении являются методы на основе ПЦР в режиме «реального времени», ДНК-чипов, ускоренных тест-систем подрашивания на селективных хромагенных средах (RIDA COUNT), иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами колойдного золота. Несмотря на имеющиеся данные об успешном использовании этих методов и тест-систем для индикации и идентификации различных микроорганизмов (Артемов A.B., 2012, Горобчук Е. А. 2008, Светличкин В.В. 2001, Светличкин В.В. и др. 2010, Смирнов A.M., Уша Б.В. и др. 2012), актуальным является валидация их к конкретным объектам и разработка более эффективных модификаций.

В некоторых случаях под действием различных факторов (температура, химические воздействия и т. д.) популяции бактерий могут переходить в

гетероморфное состояние, которое затрудняет их индикацию (Прозоровский C.B. и др. 1981, Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., 1997, 1999, Емельяненко Е. Н. 1997, Павлова И.Б. 1999, Павлова И.Б. и др. 1990). Кроме того, в научных целях иногда важно знать в каком соотношении находятся популяции в различных гетероморфных состояниях. Это актуально, например, при определении эффективности корректирующих мероприятий с использованием различных средств дезинфекции в критических контрольных точках. В решении проблемы дифференциального определения популяции бактерий в различных гетероморфных состояниях перспективными представляются подходы на основе ДНК-диагностики (Лушников К.В. и др. 2004, Шиленко И.В., Ярков С.П., и др. 2011, Tani H, Nöda N, 2005).

Опасными факторами при получении продукции животного происхождения могут являться различные токсиканты, которые могут накапливаться в организме животных, попадать в соответствующее сырье и концентрироваться в продукции при различных технологических процессах. К таким токсикантам следует отнести нитрозамины, фосфорорганические соединения, антибактериальные и антигельминтные препараты, бактериальные токсины, загрязняющие сырье. Ботулинический и стафилококковый токсины могут накапливаться как в сырье, так и готовой продукции при ее хранении (Луцык C.B., Светличкин В.В. и др. 2012, Cherington M. 2004, Hunter, P.R. et Nichols, G. 2002). При несоблюдении технологии дезобработки могут накапливаться на различных поверхностях производства и самой продукции остаточные количества дезсредств, или их составляющих, например ПАВ, что в конечном итоге скажется на безопасности и качестве готовой продукции (Попов Н.И., Удавлиев Д.И. 2002, Попов и др. 2008, Quah, J.X., Ambu, S. 2011). Для ускоренного контроля перечисленных опасных факторов токсичной природы перспективным представляется использование методов и тест систем, основанных на реакциях антиген-антитело и ингибирования ферментативных систем или тест-организмов (Самуйленко А.Я. 2003, Уша Б.В., Светличкин В.В., и др. 2010, Corbisier P., Trapmann S. 2005). Эти методы хорошо зарекомендовали себя при специфичном и неспецифичном контроле безопасности (Иванкин А.Н. 2005, Уша Б.В., Светличкин В.В. и др. 2012, Ярков С.П., Третьяков С.И. 2005, Huang СС, Pan TM. 2005). Однако для применения их в конкретных случаях систем обеспечения безопасности при получении продукции требуется соответствующая адаптация.

Наконец, для каждого технологического процесса получения продукции животного происхождения необходимо создать свою систему на основе принципов ХАССП, определить критические контрольные точки и опасные факторы технологического процесса, разработать и совершенствовать системы контроля и проведения корректирующих мероприятий (Белов Ю.П., 2005, Лемеш В.М. 2006, , Лукин A.A. 2013, Муранова Ю.Л. 2005, Пономарева О. И. и др. 2003, Ребезов М. Б. и др. 2009, Colin P., Salvat G. 2003).

Степень разработанности проблемы. Несмотря на достигнутые успехи по внедрению систем качества на различных предприятиях агропромышленного комплекса, практическая реализация такого подхода требует совершенствования всех

4

элементов с учетом современных достижений науки и техники. Для конкретных производств необходимо разрабатывать и актуализировать все элементы систем обеспечения безопасности, определять критические контрольные точки, опасные факторы, проводить валидацию методов и верификацию приборов и оборудования.

Существующие методы контроля опасных факторов микробного происхождения на основе классического бактериологического анализа достаточно длительны и трудоемки и не совсем пригодны для скрининговых исследований микробных загрязнений в критических контрольных точках. Из проаналированных нами литературных источников известные ускоренные методы контроля микробных загрязнений - на основе ПЦР в режиме «реального времени», ДНК-чипов, тест-систем на хромагенных средах (RIDA COUNT), иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами колоидного золота не всегда валидированы к конкретным ККТ и не все из них в применяемых модификациях обладают достаточной чувствительностью, быстродействием и не охватывают необходимый спектр контролируемых микроорганизмов.

Важная характеристика микробных загрязнений - соотношение вегетативных и L-форм, длительное определение которых негативно сказывается на своевременности и эффективности проведения корректирующих мероприятий для нивелирования недопустимых рисков.

Ускоренные методы контроля токсичных веществ в ККТ на основе тест-систем ферментативного ингибирования in vitro, иммуномикрочиповой технологии, иммунохроматографических тест-систем также не всегда адаптированы к конкретным ККТ, не во всех случаях обладают достаточной чувствительностью и для определенных токсикантов не установлены пределы обнаружения.

Для эффективного проведения соответствующих предупреждающих и корректирующих мероприятий требуется дальнейшее совершенствование важных элементов обеспечения безопасности производств по получения мяса, рыбы и продуктов их переработки - дезинфекции, очистки производственной и сточной вод.

На основании изложенного, были сформулированы цель и задачи нашей работы.

Целью работы являлось: Разработка концепции комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК.

В задачи исследований входило:

1. Провести анализ отдельных технологий и элементов безопасности при получении мясной и рыбной продукции для последующего усовершенствования методов и средств обеспечения безопасности в соответствии с принципами ХАССП.

2. Усовершенствовать анализ микробных контаминаций в ККТ с помощью тест - систем RIDA* COUNT.

3. Усовершенствовать определение микроорганизмов, токсинов и трансгенных белков в ККТ с помощью иммнохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота.

4. Усовершенствовать индикацию и идентификацию патогенных бактерий в ККТ с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.

5. Разработать ускоренные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики.

6. Адаптировать тест-системы на основе ДНК-чипов для индикации патогенных бактерий в ККТ.

7. Адаптировать тест-системы на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы для токсикологического контроля воды, мясного и рыбного сырья

8. Адаптировать тест-системы на основе иммуномикрочиповой технологии для оценки мясного и рыбного сырья, полуфабрикатов, сухих мясных и рыбных питательных сред на содержание остаточных количеств лекарственных средств и пестицидов.

9. Провести сравнительную оценку методик определения опасных факторов при мониторинге ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки.

10. Провести теоретическое и экспериментальное обоснования усовершенствования систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемых на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки.

11. Провести теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования систем корректирующих мероприятий проведения дезинфекции объектов при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки.

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена на моделях концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов (мясо- и рыбоперерабатывающей промышленности) получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, включая компоненты питательных сред для биотехнологии с применением современных ускоренных методов мониторинга опасных факторов в ККТ на основе хромогенных тест-подложек, ДНК-диагностики, индикаторных иммунохроматографических элементов с наночастицами коллоидного золота, иммуномикрочиповой технологии, тест-систем ингибирования ферментативной активности in vitro, а также новых технологий дезинфекции и очистки производственных и сточных вод.

Разработаны адаптированные методики для контроля опасных факторов микробного происхождения в ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе ускоренных хромогенных тест - систем RIDA® COUNT, давших возможность сократить в 1,5 - 2 раза время анализа по сравнению с классическими микробиологическими методами.

Разработаны адаптированные методики для контроля опасных факторов сальмонелл, скафилококкового и бутулинического токсинов, трансгенных белков в ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе иммунохроматоргафических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота, позволяющих проводить ускоренный анализ в течении 1-4 часов. При этом,

6

впервые разработаны модификации на этапе пробоподготовки с применением сефадекса для концентрирования токсинов, повышающие чувствительность их определения в 2-3 раза.

Усовершенствован контроль опасных факторов на основе иммуномикрочиповой технологии с хемилюминисцентной детекцией, позволяющей проводить автоматизированный качественный и количественный анализ остаточных количеств пестицидов и лекарственных средств в течении 3-4 часов. При этом, впервые показана возможность применения данного метода для контроля опасных факторов в сухих мясных и рыбных питательных средах, используемых в том числе для биотехнологии.

Впервые усовершенствован контроль опасных факторов на основе ДНК-чипов и разработаны адаптированные модифицированные методики для ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, а также тест-система для одновременного анализа патогенных возбудителей: Sal. typhimurium, Е. coli, S. aureus, Yer. emerocolitica, Ps. aeruginosa.

Адаптированы тест-система и методики выявления токсичных опасных факторов на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro и впервые установлены пределы обнаружения в рыбе, мясокастительных полуфабрикатах и воде для диазинона, дихлофоса и диэтилдитиокарбамата натрия и монурона.

Впервые разработаны методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики, позволяющие сократить время анализа в 3-4 раза по сравнением с бактериологическими методами.

Усовершенствована система корректирующих мероприятий по нивелированию опасных факторов загрязнения сточной воды на основе рациональной технологической схемы очистки, включающей несколько последовательно расположенных блоков обработки: блок механической обработки - для удаления твердых частиц, блок биологической обработки - для подавления патогенных микроорганизмов и блок дезинфекционной обработки — для обеззараживания очищенной сточной воды.

Теоретически и экспериментально обоснованы эффективная стратегия и технологическая схема комплексной очистки сточных вод мясо -рыбоперерабатывающих предприятий, представляющей собой последовательную комбинацию нескольких различных по своей природе процессов, в ходе реализации которых вначале обеспечивается удаление всех взвешенных дисперсно-коллоидных частиц на участке механической очистки, затем биохимическое окисление загрязнений с помощью микроорганизмов активного ила в аэротенках и доочистка выводимых из очистных сооружений сточных вод от оставшихся органических и минеральных примесей в биофильтрах или биологических прудах.

Впервые разработан эффективный метод уменьшения количества патогенных организмов в питьевой воде, реализующий одновременно их физическое уничтожение и обеззараживание с помощью классических процессов фильтрации, коагуляции, флокуляции и осветления.

Научно обоснованны требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки ККТ технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, обеспечивающие высокую эффективность и положительные показатели: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкую токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.

Впервые, на основании изучения широкого спектра различных дезинфицирующих средств показана возможность образования L-форм при недостаточной концентрации рабочих растворов некоторых препаратов на основе четвертичных аммониевые соединений с помощью разработанных методик ДНК-диагностики.

Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность использования в качестве биоцидных средств для предприятий по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки моюще-дезинфицируюшие средства, применение которых позволяет совместить в одной операции стадии мойки и дезинфекции, сократить продолжительность санитарной обработки и расход используемой воды.

Практическая значимость работы. Результаты выполненной работы внедрены на мясо— и рыбоперерабатывающих предприятиях, что подтверждено соответствующими актами:

Акт «Апробация методов ускоренного микробиологического и токсикологического контроля безопасности мясного сырья и мясной продукции на основе ДНК- и иммунодиагностики (ПЦР в режвме реалного времени, ДНК чипов и иммуномикрочиповой технологии, иммунохроматографических индикаторных элементов) в критических контрольных точках технологических процессов в соответствии с принципами ХАССП» - ОАО «Черкизовский мясоперерабатывающий завод» от 07.07.2015 года.

- АКТ производственного опробования на действующих очистных сооружениях метода аэробной биологической очистки от биогенных элементов и патогенной микрофлоры - ООО «Кузнецовский комбинат» 28.08.2015 года.

- Справка об использовании проектной организацией результатов научно-исследовательской работы - ОАО «МосводоканалНИИпроект» от 23.12.2014 года.

- Справка ООО «Тихий океан» № 46-11 -14 от 19.11.2014 г.

- Справка ООО «Комбинат по производству пищевых продуктов «РУСКОН»

64/исх/2 от 25.04.2015 г.

- Справка ООО «ЕВРОФИШ» № 15 от 11.02.2014 г.

По результатам исследований разработаны и утверждены:

Патент РФ № 2535989. Способ аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов A.A., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский A.C., Чичилеишвили Г.Д., Гринь A.B., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. - Бюл. №35.

Патент РФ № 2535842. Установка для аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов А.А., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский А.С., Чичилеишвили Г.Д., Дадасян А.Я., Гринь А.В., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. -Бюл. Л» 35.

- Методическое пособие по применению ускоренных методов и тест-систем иммунохроматографии для мониторинга критических контрольных точек при производстве мясной и рыбной продукции на основе принципов ХАССП (утверждены отделением ветеринарии РАСХН 12.11.2013 г.).

- Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясе - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВС-ГЭ.

- Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясных полуфабрикатах - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

- Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясе на основе иммуномикрочиповой технологии- 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

- Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясных полуфабрикатах на основе иммуномикрочиповой технологии - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

Рекомендации по проведению ветеринарной дезинфекции на животноводческих комплексах и биопредприятиях - Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ, 2014 г.2014 г.

Методические рекомендации по дифференциальному определению вегетативных и L-форм бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах (Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 28.02.2001 г.).

- Методические указания по индикации Staphylococcus aureus в мясопродуктах с использованием генных зондов (Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 14.09.2000 г. № 13-5-2/194).

Основные положения, выносимые на защиту: усовершенствованная комплексная система обеспечения безопасности технологических процессов переработки мяса, рыбы и продуктов их переработки, включая компоненты питательных сред для биотехнологии с применением современных ускоренных методов мониторинга опасных факторов в ККТ на основе хромогенных тест-подложек, ДНК-диагностики, индикаторных

иммунохроматографических элементов с наночастицами коллоидного золота, иммуномикрочиповой технологии, тест-систем ингибирования ферментативной активности in vitro, а также новых технологий дезинфекции и очистки производственных и сточных вод;

- адаптированные методики для контроля опасных факторов сальмонелл, скафилококкового и бутулинического токсинов, трансгенных белков в ККТ технологий получения мясной и рыбной продукции на основе

иммунохроматоргафических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота;

- адаптированные методики контроля опасных факторов на основе ДНК-чипов для ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, а также тест-система для одновременного анализа патогенных возбудителей: Sal. typhimurium, Е. coli, S. aureus, Yer. cntcrocoliíica, Ps. Aeruginosa;

- адаптированные методики для конроля опасных факторов (остаточных количеств антибактериальных и противопаразитарных веществ) на основе тест-систем иммуномикрочиповой технологии и пределы обнаружения тетрациклина, фуразолидона, тиабендазола, левамизола в мясе и рыбе;

- адаптированые методики выявления токсичных опасных факторов на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro и пределы обнаружения в рыбе, мясокастительных полуфабрикатах и воде для диазинона, дихлофоса и диэтилдитиокарбамата натрия и монурона;

- ускоренные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики;

усовершенствованная система корректирующих мероприятий по нивелированию опасных факторов загрязнения сточной воды на основе рациональной технологической схемы очистки, включающей несколько последовательно расположенных блоков обработки;

- технологическая схема комплексной очистки сточных вод мясо -рыбоперерабатывающих предприятий, представляющей собой последовательную комбинацию нескольких различных по своей природе процессов, в ходе реализации которых вначале обеспечивается удаление всех взвешенных дисперсно-коллоидных частиц на участке механической очистки, затем биохимическое окисление загрязнений с помощью микроорганизмов активного ила в аэротенках и доочистка выводимых из очистных сооружений сточных вод от оставшихся органических и минеральных примесей в биофильтрах или биологических прудах;

- метод уменьшения количества патогенных организмов в питьевой воде, реализующий одновременно их физическое уничтожение и обеззараживание с помощью фильтрации, коагуляции, флокуляции и осветления;

- требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки ККТ технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, обеспечивающие высокую эффективность и положительные показатели: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкую токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.

Личный вклад автора. Диссертационная работы выполнена автором самостоятельно и является совокупностью многолетних научных исследований. Автором лично сформулирована проблема, определены цель и задачи исследований и пути их реализации. Проведены теоретическое и экспериментальное обоснование

ю

эффективности применения методов и тест-систем оценки показателей микробиологической и токсикологической безопасности исследуемых объектов, а также проведение корректирующих мероприятий на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки. Материалы диссертации проанализированы и обобщены лично автором. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Достоверность результатов исследований. Достоверность результатов исследований подтверждаются соответствием теоретических данных с полученными результатами экспериментов, а также их математической обработкой.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора В.А. Першина «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1998);

- Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения Н.Ф. Чуклова «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1998);

- Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (дезинфекция, дезинсекция, дератизация)» ВНИИВСГЭ РАСХН (г. Москва, 1999);

Международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии» 2013, Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (г. Москва, 2013).

-Международной научно-практической очно-заочной конференции «Современные проблемы ветеринарно-санитарной экспертизы и пути и решения творческого наследия А.П. Ермолаева (к 100-летию со дня рождения) 2013,Омск,

-Международной научно-практической конференции посвященной ветеранам ветеринарной науки ВНИИБТЖ (г. Москва, 2013).

- Международной научно-практической конференции,- г. Щелково, 5-7 декабря - 2012.

- Международной конференции посвященной 85-летию ГНУ Самарской НИВС, г. Самара, 16 октября 2014 г.

- Международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИиТИБП, Щелково, 27-28 ноября 2014 г.

- Научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии» посвященные 5-летию Ассоциации «Ветеринария, зоотехния и биотехнология» Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ, из них 13 в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ и 15 в сборниках и трудах Всероссийских и Международных конференций.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 424 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, содержащего 502 источника отечественных и зарубежных авторов, приложений. Работа содержит 61 таблицу и 25 рисунков.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Объекты исследований

Работа проводилась в период с 2006 по 2015 гт. Работа выполнена в Федеральном Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» ФАНО (ФГБНУ «ВНИИТИБП»),

В качестве объектов исследований использовались мясо, рыба и продукты их переработки, имитаторы поверхностей оборудования и производственных помещений, ККТ технологических процессов, вода производственная и сточная, воздух производственных помещений.

2.2 Материалы и методы исследований

В работе использовались тест-системы RIDA® COUNT Chisso Corporation, Япония.) для определения микроорганизмов, тест-системы для определения антибиотиков, сульфаниламидов и ангельминтиков фирмы RENDOX, Великобритания, иммунохроматографические индикаторные элементы (ИИХЭ) производства ФГУП «Гос НИИ биологического приборостроения» ФМБА России, тест-система Abraxis ОР/С, США для определения фосфорорганических соединений, мультиплексные тест-системы ПЦР в режиме «реального времени» для идентификации санитарно-значимых бактерий «Интрелабсервис» (Россия). Матричную ДНК выделяли с помощью роботизированного прибора Qiagen EZ1 Advanced XL, использующего технологию магнитных частиц, термоциклир «Mastercycler epgradient S eppendorf realpleax». В качестве дезинфектантов применяли «Заоркват 50», «Септокаль 2000» производство Израиль. Обработка результатов экспериментов проводилась с использованием статистического метода анализа и обработки данных. Электронномикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе "Hitachi-800" со сканирующей приставкой "Hitachi-8010".

Статистический анализ результатов проводился с учетом распределения Гаусса по критериям Колмогорова-Смирнова. Биометрическая обработка результатов работы проводилась с использованием программы Statistica for Windows, v.5.5 A (StatSoft, Inc).

2.3 Результаты исследований

2.3.1 Анализ отдельных технологий и элементов обеспечения безопасности при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки

В этом разделе работы нами проведен анализ известных данных, а также собственных исследований отдельных технологий и элементов безопасности при

12

получении мясной и рыбной продукции с целью для последующего усовершенствования методов и средств обеспечения безопасности в соответствии с принципами ХАССП.

При этом нами были проанализированы: цеха по убою животных и получению мяса, мясоперерабатывающие комбинаты, производства по выращиванию прудовой рыбы в искусственных водоемах, и рыбоперерабатывающие комбинаты.

Опасными факторами исследуемых производств являлись мезофильно аэробные, факультативно анаэробные микроорганизмы, бактерии группы кишечной палочки, психротрофные микроорганизмы, сульфитредуцируюшие клостридии, сальмонеллы, золотистый стафилококк, трематоды, цестоды, нематоды, скребни, токсичные элементы, радионуклиды, гистамин, нитрозамины, пестициды, полихлорированные бифенилы, элементы технологического оснащения, продукты износа машин и оборудования, в т.ч. металлические осколки, песок.

Оценивая полученные и проанализированные данные, следует отметить, что ККТ и опасные факторы для конкретных технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки различаются, однако и имеют много общего. ККТ определяются на соответствующих этапах технологических процессов, начиная от состояния различных факторов производства, (воды для разведения рыб, кормов для рыбы, животных для убоя, основного и вспомогательного оборудования, воздушной среды и т.д.). В большинстве случаях, в качестве опасных факторов в основном выступают сходные группы антропогенные и природные токсиканты, что давало основание к применению в дальнейшем аналогичных методик для контроля соответствующих опасных факторов.

Как известно система ХАССП предусматривает кроме контроля опасных факторов в ККТ, проведение предупреждающих действий для предотвращения или исключения опасности, или снижения её до приемлемого уровня.

К предупреждающим действиям относят: соблюдение ветеринарно-санитарных норм и контроль параметров технологического процесса производства, концентрации вредных веществ, мойку и дезинфекцию. Кроме того, необходимо проводить соответствующие корректирующие мероприятия в случае превышения допустимых уровней опасных факторов к процессе производства. Усовершенствование всех указанных систем обеспечения безопасности получения мяса, рыбы и продуктов их переработки явились задачами наших дальнейших исследований.

2.3.2 Усовершенствование анализа микробных контаминацмй в ККТ с помощью тест-систем RIDA* COUNT

На следующем этапе мы проводили исследования по усовершенствованию определения опасных факторов микробной природы на основе тест-систем RIDA5 COUNT Chisso Corporation, Япония. Данные тест-системы использовались ранее для определения санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов в некоторых продуктах питания (Бабунова B.C. и др. 2011 г.), однако требовалась валидация их для анализа опасных факторов в ККТ при получение мяса, рыбы и продуктов их переработки.

Метод с применением указанных тест-систем основан на использовании подложек, с набором хромогенных питательных сред.

С помощью указанных тест-систем была показана возможность определения опасных факторов микробного происхождения (общая микробная обсемененность, наличие грибов и дрожжей, бактерии группы кишечной палочки и Е. Coli, S. aureus, Salmonella) в искусственно контаминированных мясных и рыбных продуктах, а также на имитаторах поверхностей, оборудования, помещений предприятий по производству мяса, рыбы и в водной и воздушной среде указанных предприятий.

В процессе проведенного этапа исследований были разработаны и адаптированы методики определения микробных контаминаций и грибов на основе тест-систем RID ACCOUNT в различных критических контрольных точках.

Результаты определения микробных контаминаций с помощью данных тест-систем коррелировали с результатами, полученными с помощью классических бактериологических тестов. Однако, время постановки анализа с помощью хромагенных наборов было в 1,5 — 2 раза ниже, чем при использовании классического бактериологического анализа.

2.3.3 Усовершенствование определения микроорганизмов, токсинов и трансгенных белков в ККТ с помощью пммнохроматографических

индикаторных элементов с наночастнцамн коллоидного золота

Тесты с применением иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) позволяют проводить ускоренное определение бактерий, токсинов и трансгенных белков за относительно короткий промежуток времени. На данном этапе исследований нами проведена разработка и валидация методик индикации микроорганизмов, токсинов и трансгенных белков различных ККТ при контроле сырья и продукции животного происхождения на основе иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного, золота. Для определения сальмонелл, ботулинического токсина и энтеротоксина золотистого стафилококка использовали отечественные ИИХЭ производства ФГБУ «ГосНИИ биологического приборостроения. Наличие трансгенных белков в мясном сырье и растительных компонентов мясных и рыбных полуфабрикатов выявляли с помощью иммунохромаграфических тест-полосок фирмы. В работе использовались иммунохроматографические тест-системы «AgraStrip GMO RR» фирмы Romer Labs США для определения ГМО с трансгенными белками с устойчивостью к гербицидам и насекомым «Раундап»®.

Сущность метода иммунохроматографии заключается в том, что после экстрагирования антигенов (бактерий, белков-токсинов, трансгенных белков) из образцов растворы их наносят на тест-полоску, имеющую базовую зону иммобилизованного коллоидного золота, контрольную и опытную зоны с иммобилизованными антителами. Антигены вместе с наночастицами коллоидного золота диффундируют по полоске и при условии их специфичности антигенной с иммобилизованными антителами образовываются окрашенные зоны. Несложная пробоподготовка метода делает его экспрессным и пригодным для реализации в не

14

стационарных условиях. Интерпретацшо конечного результата проводили визуально и с помощью рефлектометра по степени окрашивания контрольных и аналитических зон.

Применение рефлектометрической детекции позволяло стандартизовать анализ и исключать субъективные факторы. Ранее Артемовым A.B. и Горобчук Е.А. было показано использование иммунохроматографическнх индикаторных элементов для определения сальмонелл, стафилококкового энтеротоксина, и трансгенных белков в мясе, мясных полуфабрикатов и мясных консервах. В рыбе, по известным нам источникам, таких данных нет. Нами проведены исследования по адаптации тест-систем для анализа опасных факторов с разработкой схем их обнаружения в критических контрольных точках (мясном и рыбном сырье, мясных и рыбных консервах, смывах с оборудования и поверхностей производственных помещений и в воде). Схемы методик представлены на рисунках 1-4.

Рисунок 1 - Схема индикация бактерий в мясном и рыбном сырье и продуктах их переработки с помощью ИИХЭ

Рисунок 2 - Схема индикации бактерий в воздушной среде производственных помещений

Рисунок 3 - Схема методики определения микробных контаминации на поверхностях оборудования и производственных помещений

Рисунок 4 - Схема методики определения микробных контаминации в производственной и сточной водах с помощью ИИХЭ

При изучении возможности использования ИИХЭ для анализа производственных и сточных вод проводили искусственную контаминацию стерильной водопроводной воды и воды, с добавлением бычьего сывороточного альбумина, для имитирования органических загрязнений сточных вод.

В процессе дальнейпигх исследований были получены данные о высокой специфичности методик по определению микроорганизмов в объектах контроля с помощью ИИХЭ в изучаемых объектах.

Результаты представлены в таблицах 1, 2.

Таблица 1 - Результаты определения опасных факторов бактериального происхождения в искусственно контаминированных объектах с помощью ИИХЭ на Sal. Typhimurium

Объект исследования Бактерия контаминант Результаты анализа с визуальной интерпретацией Результаты анализа с интерпретацией с помощью рефлектометра (интенсивность окрашивания в аналитической зоне)

Говядина Sal. Typhimurium + 1,3± 0,09

Е. coli - 0,1+0,01

S. aureus - 0,1 ±0,01

Свинина Sal. Typhimurium + 1,4±0,1

E. coli - 0,2+0,02

S. aureus - 0,1+0,01

Котлеты из говядины и свинины Sal. Typhimurium + 1,2±0,08

E. coli - 0,2+0,01

S. aureus - 0,1 ±0,01

Минтай Sal. Typhimurium + 1,5+0,1

E. coli - 0

S. aureus - 0

Филе минтай Sal. Typhimurium + 1,1 ±0,07

E. coli - 0,1 ±0,01

S. aureus - 0,2±0,01

Имитаторы поверхностей производственных помещении (кафельная плитка) Sal. Typhimurium + 1,7+0,1

E. coli - 0

S. aureus - 0,1 ±0,02

Имитаторы поверхностей оборудования (сталь) Sal. Typhimurium + 1,6±0,1

E. coli - 0,1 ±0,01

S. aureus - 0

Примечание: + положительное окрашивание в аналитической зоне - отсутствие окрашивание в аналитической зоне

Таблица 2 - Определение бактерий с помощью ИИХЭ в воде.

искусственно

Объект исследования Бактерия коптами нант Результаты анализа с ИИХЭ на Е. coli Результаты анализа с ИИХЭ на Sal. typhimurium

с визуаль IIOÍÍ иитерпр стацией с интерпретацией с помощью рефлектометра (интенсивность окрашивания в аналитической зоне) с визуальной интерпрета цией интерпретацией с помощью рефлектометра (интенсивность окрашивания в аналитической зоне)

Вода искусственно контами-нированная Sal. Typhimu rium 0,1±0, 08 + 1,2+0,1

Е. coli + 1,2+0,09 - 0,1 ±0,09

S. aureus - 0,1 ±0,01 - 0,1 ±0,08

Вода искусстве нно контами-нированная с добавлени ем бычьего сывороточ ного альбумина Sal. Typhimu rium 0,2±0,09 + 1,3±0,1

E. coli + 1,3+0,1 - 0,2±0,01

S. aureus 0,1 ±0, 07 0,1+0, 08

Примечание: + положительное окрашивание в аналитической зоне - отсутствие окрашивание в аналитической зоне

Как показали исследования, иммунохроматографическне тесты позволяли выявлять искомые бактерии в исследуемых объектах, пе давая перекрестных реакций с другими видами.

При высокой концентрации микроорганизмов можно проводить индикацию, исключив этапы обогащения Длительность прямых схем апхнва. включая пробоподготовку, не превышал 1.0 ч.

Для повышения чувствительности метода были разработаны модифицированные методики с предварительным обогащением бактериальных клеток путем кратковременного подращивания в жидких питательных средах в течении трех-ияти часов.

Предварительное обогащение контамнпированных сальмонеллами образцов сырья и продуктов питания в хлористо-магнисвой среде в течение 3-5 ч. при

температуре 37° С и последующий иммунохроматографический анализ позволяет выявить до 102...103 м.к./мл сальмонелл находившихся в исходных образцах. Для эшерихий и золотистого стафилококка применяли жидкие селективные среды.

Схема методик определения токсинов и трансгенных белков методом нммунохроматографии в исследуемых объектах включала: отбор проб, гомогенизирование. элюирование белков, осаждение крупных частиц, центрифугированием 500 g, концентрирование белков фильтрацией на колонке С100. внесение аликвоты на ИИХЭ, интерпретация результатов визуально или с помощью рефлектометра.

Результаты проведенных исследований (таблице 3) показали высокую специфичность иммунохроматографнческих тест-систем для определения токсинов и ГМО в искусственно контаминированных объектах и свидетельствовали о возможности использовании разработанных методик н тест-систем для ускоренного контроля опасных факторов в ККТ.

Полученные данные свидетельствовали о возможности обнаружения ботулннического токсина в мясных консервах до 0,030, а в рыбных консервах до 0.035 мкг/мг. Пределы обнаружения стафилококкового энтеротоксина в мясорастительных полуфабрикатах составляло от 0,20 до 0,85 мкг/мг. В мясораститсльных полуфабрикатах, содержащих трансгенный картофель с белком СР4ЕР8Р5 удавалось определять данный белок с помощью ИИХЭ с пределом обнаружения от 0.015 до 0.40 мкг/мг. При этом методика, включающая этап концентрирования, повышала чувствительность обнаружения белков в 4 — 9 раз.

Проведенные исследования показали перспективность использования ИИХЭ для ускоренного определения опасных факторов микробного происхождения (возбудители инфекции, токсины) и трансгенных белков в сырье, продукции, на поверхностях оборудования и производственных помещений и воде с визуальной пли приборной оценкой конечного результата. Время анализа с пробоподготовкой составляло от 0.5 до 1 часа.

Таблица 3 - Результаты определения токсинов и трансгенных белков в искусственно контаминированных объектах с помощью ИИХЭ

Объект исследования Контаминирующий белок Результаты анализа с визуальной интерпретацией ИИХЭ на Результаты анализа е интерпретацией на помощью рефлектометра (интенсивность Окрашивания в Аналитической зоне) с ИИХЭ па

Бутул иниче ский токси н Стафи локок ковый энтер отокс ин Трансгенный белок СР4ЕРБ Р5 Бутули ничеекц й токсин Стафил ококков ый энтерот оксин Транс генный белок СР4Е Р5Р5

Консервы из говядины антиген ботулиничеекого токсина + 1,8±0,07 0.1+0.002 0

антиген стафилококкового энтеро токсина + 0,2+0,08 1,9+0,09 0

трансгенный белок СР4ЕР5Р5 - - - 0 0 0

Консервы из свинины антиген ботулиничеекого токсина + 1,7±0,09 0,1+0,01 0

антиген стафилококкового энтеро токсина + 0,1+0,01 1,8+0,1 0,1± 0,01

трансгенный белок СР4ЕР5Р5 - - - 0 0 0

Мясораети тельные котлеты с трансгенным картофелем антиген ботулиничеекого токсина + 1,9+0,1 0,1 ±0,01 0

антиген стафилококкового энтеро токсина + 0 1,8+0,09 0

трансгенный белок СР4ЕР5Р5 - - + 0,1 ±0.01 0 1,7+ 0.02

Рыбный фарш с трансгенным картофелем антиген ботулиничеекого токсина + 1,8+0.1 0,1 ±0,01 0

антиген стафилококкового энтеро токсина + 0 1,9±0,1 0

трансгенный белок СР4ЕР5Р5 - - + 0 0 1,9±0,1

Примечание: + положительное окрашивание в аналитической зоне - отсутствие окрашивание в аналитической зоне

2.3.4 Усовершенствование индикации и идентификации патогенных бактерий в ККТ с помощью мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

На 'лом этапе исследования мы проводили исследования по апробации коммерческих тест-систем и методики мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» для индикации бактерий в ККТ. При исследовании образцов сырья и готовой продукции их гомогенизировали, экстрагировали и выделяли матричную ДНК с помощью набора для выделения и робототехники. Последняя позволяла в автоматическом режиме осуществлять депротеинизацию, разделение фракций липидно-белкового дебриса и ДНК и проводили мультиплексную ПЦР с праймерами на соответствующие бактерии. Анализ микробных контаминаций в воздухе проводили после концентрирования их в импинджер с помощью пробоотборника. Критические контрольные точки, связанные с оборудованием, помещением анализировали после отбора образцов с помощью тампонов. Указанный подход позволял в течении 3-4 часов проводить индикацию Е. Coli, включая патогенные штамм 0157Н7. сальмонеллы и золотистый стафилококк в искусственно коптамннированных имитаторах ККТ (говядине, свинине, котлетах из говядины и свинины, минтае, филе минтая, скумбрии холодного копчения, имитаторах поверхностей производственных помещений и оборудования, воде).

2.3.5 Разработка ускоренных методик дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики

Популяции бактериальных клеток являются лабильным организмом, и могут иметь различные морфологические формы, которые в свою очередь несут изменение морфологических и биохимических свойств. Индикация бактериальных клеток на всех стадиях их развития является важной задачей при контроле возбудителей инфекций в ККТ, так как при определенных условиях бактерии могут переходить в гетероморфное состояние или обратно реверсировать, что является фактором, определяющим критическую контрольную точку (Емельяненко Е. Н. 1997, Павлова И.Б. 1999 г.).

При разработке методики на основе ДНК-гибридизации с меченными ДНК-зондами использовали полученные ранее данные о дифференциальном разделении вегетативных и L-форм бактерий на мембранных фильтрах с различным диаметром пор (0.45 и 0.22 мкм), позволяющих разделять микроорганизмы в зависимости от их морфологического состояния (Павлова И.Б. 1999 г.).

При разработки первой модификации бактерии высевали на двойные мембранные фильтры, помещенные на мясопептонный агар (МПА) и на МПА с добавлением антибиотика, для моделирования опыта по искусственному получению бактерий в стадии гетероморфизма (Павлова И.Б. 1999 г.).

После иммобилизации. ДНК на фильтрах фиксировали прогреванием в течение 1 часа при температуре 80°С. Далее проводили гибридизацию с мечеными тритием ДНК в присутствии декстрансульфата в течение 8-12 часов.

Гибридные молекулы ДНК на фильтрах определяли в жидкостном сцинтилляционпом счетчике (при использовании изотопной метки).

22

Полученные данные показали, что реперные ДНК гибридизуются с иммобилизованными на верхних фильтрах ДНК гомологичных микроорганизмов и не гибридизуются с гетерологичнымн ДНК (степень связывания на уровни контроля сорбции). Практически отсутствует гибридизация с ДНК. иммобилизованными на нижних фильтрах (Ь-формы бактерий). Электронномикроскопические исследования показали, что на верхних фильтрах присутствуют, в основном, вегетативные формы бактерий.

Для адаптации методики дифференциального определения вегетативных и Ь-форм бактерий при анализа ККТ бактерии предварительно элюировали физиологическим раствором (для твердых объектов), жидкие объекты (вода) наносили непосредственно на твердые питательные среды, подращивали и проводили операции, согласно описанной выше методики. Дальнейшую идентификацию бактерий осуществляли с помощью меченой ДНК. Результаты проведенных исследований показали возможность дифференциального определения различных форм бактерий в искусственно конта.мшшрованных имитаторах ККТ.

Полученные данные коррелировали с результатами бактериологических исследований и данными электронной микроскопии. При этом время индикации и идентификации различных форм микроорганизмов с помощью разработанного метода было в 2-3 раза меньше по сравнению с бактериологическим анализом.

Дня ускоренной индикации вегетативных и Ь-форм бактерии в водных средах разработана модифицированная схема проведения анализа.

Она включает в себя предварительную фильтрацию водных сред через бумажные или стеклянные фильтры для отделения крупных частиц и последующую фильтрацию через систему мембран. Для лучшего разделения вегетативных и Ь-форм была подобрана система, включающая фильтры с диаметром пор для сорбции вегетативных форм 0.45 мкм и Ь-форм 0.1 мкм. При этом система фильтрации была изготовлена таким образом, чтобы размер пятна, содержащего бактерии, не превышал 0,5 см. Кроме того, система фильтрации была снабжена запорными клапанами для возможности обработки фильтров соответствующими растворами.

После фильтрации водных сред через укачанную систему проводили лизис клеток, депротеинизациго ДНК с использованием гуанидннтионзоционата. щелочную денатурацию ДНК и иммобилизацию ДНК на фильтрах путем фильтрации в солевом растворе с высокой ионной силой. Затем фильтры вынимали из системы и проводили дальнейшую обработку, как описано выше.

Гибридизацию проводили с ДНК-зондами меченными биотипом или тритием, как описано в методах. Результаты гибридизации оценивали по интенсивности окрашивания или радиоактивности гибридных молекул.

Предложенная схема позволяла выявлять вегетативные и [*-формы различных бактерий в водных средах. Время анализа составляло 6-8 часов с чувствительностью ЮМО1 клеток в пробе. Для повышения чувствительности бактерии необходимо подращивать на фильтрах в течение 18 часов. Для подращивания и гибридизации

бактерий использовали разработанную ранее укладку тест-систем и технических средств. Схемы различных модификаций методик представлены на рисунке 5.

При разработке методики использовали вегетативные и L-формы золотистого стафилококка (S. aureus).

Использование специфичных ДНК-зондов позволяла проводить индикацию в смеси микроорганизмов. При этом не требовалось выделение чистой культуры и обогащения материала, в результате чего экономится время анализа и повышается его информативность.

При определении бактерий в водных объектах бактериальные клетки концентрировали центрифугированием и далее проводили все операции, как описано выше.

Рисунок 5 - Схема дифференциального определения различных форм бактерий.

С целью ускорения анализов вегетативных и [.-форм нами разработаны методики на основе ПЦР.

Методика ПЦР в режиме реального времени, на наш взгляд, с использованием разных красителей представляется более эффективной для дифференцированного определения вегетативных и Ь-форм бактерий. Она более чувствительна, экспрессна и позволяет определять соотношения гетероморфных бактерий.

Суспензии гетероморфных бактерий фильтровали через сэндвич мембран с диаметром пор 0,45 мкм (верхний фильтр) и 0,2 мкм (нижний фильтр). Электронномикроскомическмими исследованиями показано, что на верхних фильтрах были вегетативные клетки, а на нижних Ь-формы (рисунки 6, 7).

Проведенные исследования показали корреляцию данных, полученных с помощью методик ДНК-диагностики с микробиологическим определением и данными элекгронномикроскопических исследований.

Рисунок 6 - Фрагмент колонии Рисунок 7 - Фрагмент колонии

Staphylococcus aureus — вегетативные Staphylococcus aureus — клетки в форме

формы L-трансформации

Сканограмма х 10000 Сканограмма х 10000

Методика на основе дифференциальной фильтрации на мембранах с различным диаметром пор. последующим выделением матричной ДНК и постановкой ПЦР в режиме реального времени позволяла проводить количественное определение вегетативных и L-форм. была более чувствительнее методики гибридизации и менее трудоемка.

Разработанная методика может быть использована по количественному определению гетероморфных бактерий в ККТ.

2.3.6 Адаптация тест- системы на основе ДНК-чипов для контроля микроорганизмов в ККТ

Ранее Артемовым A.B., Пульчевой И.А., Светличкиным В.В.. Кононенко А.Б. и другими было показано применение ДНК-чипов для определения возбудителей эмерджентных инфекций в различных объектах ветеринарного надзора.

Нами проведены исследования по адаптации тест-систем на основе ДНК-чипов для индикации микроорганизмов в ККТ. При этом были разработаны оригинальные схемы для различных объектов, а также использована модификация с иммобилизацией ДНК-зондов в лунках планшета для иммуноферментного анализа и расширен спектр определяемых бактерий.

ДНК-чипы готовили путем иммобилизации полученных в процессе амплификации специфичных последовательностей ДНК различных микроорганизмов на мембранные фильтры или в лунки планшета для иммуноферментного анализа. Адаптацию ДНК чипов для контроля опасных факторов проводили на искусственно контаминированных пробах.

В процессе исследований была разработаны модифицированные методики контроля опасных факторов микробного происхождения в различных объектах с

25

использованием ДНК-чипов, которая включала следующие этапы: элюирование микроорганизмов стерильным физраствором из пробы, подращивание в жидкой питательной среде в течстпш трех часов при низких концентрациях микроорганизмов, выделение ДНК с помощью детергентов и магнитосорбции, включение биотиновой метки методом рассееной затравки, гибридизацию со специфичными последовательностями ДНК иммобилизованных на чипах, отмывку нсспсцифической сорбции, реакцию с коньюгатом, субстратом и красителем и определение гибридных молекул по степени окрашивания ДНК-чипов визуально или в вертикальном фотометре.

Методики для водной и воздушной сред включали предварительное концентрирование микроорганизмов с помощью пробоотборников, как это описано в предыдущих главах и дальнейшее проведение всех этапов анализа, аналогично методикам для сырья и продуктов. Была показана возможность определения опасных факторов микробного происхождения (Sal. typhimuriiim, Е. coli, S. aureus, Yer. enterocolitica, Ps. aeruginosa) в исследуемых объектах.

Методики с использованием ДНК-чипов позволяли проводить индикацию микроорганизмов в различных объектах технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки, не давая перекрестных реакций. При этом осуществлялось одновременное определение нескольких микроорганизмов в автоматическом режиме, что давало определенные преимущества для ускорения контроля опасных факторов в ККТ. Потенциально можно использовать ДНК-чипы на все возможные опасные факторы микробного происхождения, включая грибы при наличии специфичных нуклеотидных последовательностей.

2.3.7 Усовершенствование токсикологического контроля опасных факторов в ККТ на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы m vitro

На различных этапах технологических процессов получения мяса, рыбы и продуктов их переработки имеет место быть опасные факторы токсичного происхождения. В частности, сырье животного и растительного происхождения может быть загрязнено остаточными количествами фосфорорганических пестицидов или лекарственных средств. Кроме того опасность могут представлять также карбаматы, производные карбаминовой кислоты, которые входят также в состав пестицидов или лекарственных средств и в связующие компоненты (полиуретаны) тары или оборудования. В последних случаях может происходить загрязнение продукции, как при хранении, так и при технологических процессах.

Ранее Светличкиным В.В., Галкиным A.B. Шурдубой H.A. было показано применение тест-системы на основе ингибирования ацетилхолинэстеразы in vitro для выявления фосфорорганических соединений (гетерофоса и диазинона) в молоке, говядине и зерне. Однако для рыбы, рыбной продукции и воды исследования по ФОС и карбаматам данным автором не проводились. Нами проведена работа по апробации тест-системы для определения фосфорорганических соединений для контроля опасных факторов в ККТ при получении мяса и мясопродуктов, а так же,

26

по адаптации тест-системы для токсикологического контроля воды, рыбы и рыбопродуктов, с выявлением как ФОС, так и карбаматов.

Принцип действия способа определения в модификации Эллмана заключался в ннгибнровании ацетилхолин эстеразы, ФОС и карбоматами н уменьшении степени окраски, которая проявлялась при взаимодействии фермента с 5.5'-дитио-бис (2) ннтробензойной кислотой. Реакцию проводили в лунках планшета для иммуноферментного анализа. Регистрацию конечного результата осуществляли колориметрическим определением степени окрашивания с помощью вертикального фотометра при 405 нм.

Проведенные исследования показали возможность выявления ФОС и карбаматов в мясном и рыбном сырье и в воде с помощью указанной тест-системы. Определены пределы обнаружения в указанных объектах диазинона, дихлофоса, диэтилдитиокарбамата натрия и монурона, которые находились в интервале 0,4 до 1,3 мкг/кг/л.

2.3.8 Адаптация тест- системы на основе мммуномикрочнповой технологии для оценки ККТ (сырье и продукция) на остаточные количества лекарственных средств

Мясо, рыба и полуфабрикаты на их основе могут быть загрязнены остаточными количествами лекарственных средств (антибактериальные вещества, антигельмиитики). Ранее было показано применение данных загрязнителей в мясе, рыбе и продуктах их переработки с использованием иммуномикрочнпового анализа (Бабунова B.C., Онищенко Д.А. и др.).

В основе иммуномикрочнпового анализа лежит технология микрочипа, базирующаяся на реакции антиген-антитело с хемилюминесцеитной меткой. На микрочипе иммобилизованы антитела, специфичные к различным агентам (токсинам, гормонам, антимикробным веществам, возбудителям заболеваний и т. д.), которые могут являться опасными факторам ККТ (сырья, готовых полуфабрикатов, производственных помещений, искусственных водоемов для выращивания рыбы и т.д.).

На биочипе проходит сэднвич-иммуноанализ в результате которого иммобилизованные антитела связываются с искомыми антигенами.

Световой сигнал, генерируемый каждой из тестовых зон микрочипа, определяется при помощи технологий получения цифрового изображения. Количественная оценка осуществляется с помощью калибровочной кривой, которую строят по стандартам образца с известной концентрацией. Регистрация конечного результата осуществляется с помощью хемилюминометра. Время реакции составляет от 10 до 20 минут. Весь анализ с пробоподготовкой занимает 1 - 2 часа.

Нами проведено исследование по адаптации тест-систем иммуномикрочнпового анализа для определения опасных факторов в ККТ при производстве некоторых видов мясной продукции (свинина, мясные полуфабрикаты из свинины, а также при производстве рыбы и рыбных продуктов).

В результате проведенных исследований разработаны адаптированные методики контроля опасных факторов. В опытах с искусственно контаминированными объектами, имитирующими различные ККТ показана возможность выявления опасных факторов в данных ККТ.

В таблице 4 представлены данные по определения антимикробных и антигельминтных препаратов в мясе, рыбе и продуктах их переработки.

Таблица 4 - Определение в искусственно контаминированных лекарственными средствами образцах мяса, рыбы и продуктов их переработки с помощью иммуномикрочипового анализа_

Искусственно контамини-рованные образцы Контаминирующие лекарственные средства

Группа веществ

Антибиотики Антигельминтики

Предел обнаружения (мкг/кг) лекарственных средств:

Тетрациклин Фуразолидон Тиабендазол Левамизол

Говядина 2,15 1,95 0,5 1,98

Свинина 2,05 2,00 0,7 2,00

Индейка 2,20 1,90 0,6 1,97

Карп 2,15 1,95 0,4 1,95

Полуфабрикаты из говядины 2,10 2,05 0,5 1,98

Полуфабрикаты из карпа 2,05 2,00 0,6 2,00

Проведенные исследования показали возможность определения опасных факторов лекарственного происхождения в мясном и рыбном сырье и продуктах с помощью тест-систем иммуномикрочиповой технологии.

2.3.9 Сравнительные исследования методик определения опасных факторов при мониторинге ККТ технологий получения мяса, рыбы и продуктов их переработки

Проведены сравнительные исследования разработанных методик в процессе мониторинга опасных факторов в ККТ технологических производств получения мяса, рыбы и продуктов их переработки.

Полученные данные свидетельствовали о том, что методика определения опасных факторов микробного происхождения с использованием методов на основе тест-систем RIDA® COUNT позволял выявлять общую бактериальную

обсемененность, бактерии группы кишечной палочки, грибы и плесени, патогенные микроорганизмы, включая сальмонеллы, золотистый стафилококк с чувствительностью до единичных клеток, так же как и классические методы бактериологического анализа, однако, в отличии от последних время анализа

сокращалось в 1,5-2 раза, и при этом методики с использованием хромогенных сред были значительнее удобней и технологичней. Ускоренные методики на основе ПЦР в режиме «реального времени» обладали высокой специфичностью и чувствительностью 10:-103 клеток, и до единичных клеток, в случае кратковременного предварительного подращивания. При этом мультиплексная ПЦР позволяла одновременно проводить индикацию нескольких видов бактерий, включая патогенные штаммы. Методика с использованием ДНК-чипов также давала возможность одновременно определять значительное число видов микроорганизмов. Обладала высокой специфичностью и чувствительностью 103 клеток. Методики с использованием иммунохромато графических элементов с наночастицами коллоидного золота позволяли выявлять 106 клеток микроорганизмов, а при кратковременном обогащении чувствительность возрастала до единичных клеток. ИИХЭ давали возможность определять бактериальные токсины и трансгенные белки с чувствительностью: к ботулиническому токсину от 0,030 до 0,20 мкг/мл, к стафилококковому энтеротоксину от 0,2 до 0,85 мкг/мл.

Методики на основе иммуномикрочиповой технолопш давали возможность определять антибиотики и антигельминтные вещества в сырье и продукции с чувствительностью для антигельминтиков от 0,4 до 2,0 мкг/кг, антибиотиков от 1,9 до 2,20 мкг/кг. При этом, можно было проводить как качественный так и количественный анализ одновременно нескольких проб по различным показателям в автоматизированном режиме в течении 3-4 часов.

Для определения опасных факторов токсичного происхождения (ФОС и карбаматов) весьма перспективными показали себя методики на основе тест-системы ингибирования ацетнлхолинэстеразы in vitro, которые давали возможность выявлять указанные токсиканты в течение 1-2 часов с пределом обнаружения для ФОС от 0,4 до 1.0 мкг/кг, для карбаматов от 0,7 до 1,4 мкг/кг.

2.3.10. Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствование систем корректирующих мероприятий по очистке воды используемой на предприятиях по получению мяса, рыбы и продуктов их переработки

На данном этапе теоретически и экспериментально обосновано усовершенствование технологической модели удаления патогенных микроорганизмов в системах водоподготовки и очистки сточных вод.

Системы, используемые в различных технологических схемах процесса очистки стоков, приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Системы, используемые для очистки стоков.

Обработка Система очистки

Предварительная обработка Система решеток + песколовка-жироловка оборудованная скребком у дна и на поверхности

Первичная очистка Отстойник

Вторичная очистка с активным илом Аэротенк + Вторичный отстойник + Устройство для рециркуляции активного ила + Устройство для выделения и удаления избыточного активного ила + Мешалки и аэраторы в аэротенке

Вторичная очистка с МБР Система МБР сконструированная по типу системы с активным илом (аэротенк), но отстойник заменен системой мембран

Третичная экстенсивная очистка Система из трех последовательно расположенных прудов

Четвертичная очистка с озонированием Установка по озонированию, содержащая 4 части: - очистка воздуха для производства озона, - электрогенератор озона, - транспорт озона в воду центрифугированием, гидро-инжекцией или диффузией, - система восстановления и обработки озон содержащей воздушной массы

Четвертичная очистка с УФ Обработка УФ происходит за два этапа: камера обработки воды (реактор) и электрический модуль

Эффективность различных видов очистки и обработки сточных вод по

отношению бактериям и простейшим представлена в таблице 7.

Таблица б - Эффективность различных технологических схем очистки сточных

вод по колиформным фекальным бактериям

Технологическая схема Технологическая схема обработки сточных вод Эффективность

Активный ил Предварительная очистка + Первичная очистка + Вторичная очистка с активным илом +Третичная очистка 3,2.10"® — 6,3.104

МВЯ Предварительная очистка + Первичная очистка + Вторичная очистка с МВк +Третичная очистка 4,0.104— 1.10'°

Пруд с макрофитами Предварительная очистка + Третичная экстенсивная очистка в пруду с макрофитами 1,6.10'-2,0.10'

Пруд с микрофитами Предварительная очистка + Третичная экстенсивная очистка в пруду с микрофитами 1,2.10-- 1,6.104

Слой гравия Предварительная очистка + Третичная экстенсивная очистка со слоем гравия 1,6.10-

Сравнительный анализ различных этапов обработки позволяет осуществить интегрированный анализ систекпл очистки и, таким образом, путем суммирования эффективности удаления колиформных фекальных бактерий и цист простейших (Giardia и Cryptosporidium), на разных технологических схемах очистных сооружения, осуществлять прогноз функционирования как отдельных блоков так и полной схемы сооружений.

В общем случае это позволяет надежно очистить и дезинфицировать источники водоснабжения и поддерживать регламентированное контролирующими органами качество воды во всей подающей водораспределительной сети водоподготовки и водоотведения.

2.3.11 Теоретическое и экспериментальное обоснование усовершенствования систем корректирующих мероприятий проведения дезинфекции объектов при получении мяса, рыбы и продуктов их переработки

Дезинфекция осуществлялась с помощью различных методов, а именно путем хлорирования, УФ излучения, озонирования, обработки

четвертичными аммониевыми соединениями и фенолами, йодосодержащими средствами, перекисью водорода, альдегидами.

Хлорирование производилось с помощью соединений на основе хлора, которые являются сильными окислителями и обеспечивают надежную ликвидацию микроорганизмов.

Бактерицидное действие хлора зависит от температурных условий и значений рН. Как показали исследования увеличение рН приводит к уменьшению бактерицидного действия хлора на суспензию спор Bacillus subtilis. Повышение температуры приводит к возрастанию эффективности дезинфекции. Например, увеличение температуры на 10 °С сокращает время стерилизации газообразным хлором с 60% до 80%.

На практике, хлорсодержащие дезинфицирующие средства используются при температурах ниже 70 °С.

К преимуществам хрорсодержащих дезинфекционных средств относят: низкую стоимость и токсичность, широкий бактерицидный спектр, благоприятное влияние температуры (увеличение на 30% от 50 - 60 °С), использование шелочной среды, незначительное содержание или отсутствие пены после дезобработки.

Дезинфекционные средства на основе хлора легко смываются и могут использоваться как для очистки, так и для дезинфекции и просты в обращении.

Ультрафиолетовая обработка является очень эффективной для удаления всех видов микроорганизмов и осуществляется с помощью облучения воды ртутными лампами.

Наиболее приемлемым критерием эффективности обработки УФ- системой является доза энергии, подводимая на единицу плошади. и энергия излучения на время экспозиции (мВт.с/см-). Изменение одного из этих двух факторов существенно влияет на эффективность дезинфекции.

По результатам работы установлено, что для снижения на 1.103 колиформных фекальных бактерий подаваемая доза УФ для передачи излучения в воду варьируется от 40 мВт.с/см2 до 100 мВт.с /см2.

Значительная инактивация протозойных возможна при относительно низких дозах УФ-лучей. Так, для получения степени удаления СгурШропсИит и (ЛагсНа в 1.103 требуются дозы УФ-излучения 12 и 11 мДж/см2 соответственно.

Обработка озоном позволяет при определенных условиях получить низкие концентрации колиформных фекальных бактерий в очищенных сточных водах -порядка 14 КОЕ/ЮОмл.

При проведении работы были испытаны также в качестве дезинфектантов такие химические вещества как четвертичные аммониевые соединения и фенолы, иодосодержащие средства, перекись водорода, препараты на основе альдегидов и спирты.

Установлено также, что четвертичные аммонийные соединения и фенолы в определенных дозах могут вызывать привыкание связанное с образованием Ь-форм, мутациями на уровне генетического материала клетки, что делает бактерии нечувствительными к биоцидным средствам. Экспериментально подтверждено, что препарат на основе четвертичных аммониевых соединений «Зоаркват 50» в низких концентрациях оказывает бактериостатическое действие на сальмонеллы и эшерихии на искусственно контаминированных поверхностях 0,05 %- раствором при расходе 0,05 л/кв.м и экспозиции 30-15 минут. При этом наблюдается переход указанных бактерий в Ь-формы, что подтверждается данными электронной микроскопии. При высоких концентрациях 0,1 - 0,2% раствором при норме расхода 0,1-0,2 л/кв.м и экспозиции 30 - 15 минут соответственно наблюдался бактерицидный эффект.

Эти соединения обладают противовирусным действием к грамположительным и некоторым грамотрицательным микроорганизмам, в том числе бактериям группы кишечных палочек, стафилококков, стрептококков, сальмонелл, активны в отношении бактерий, грибов и вирусов. Исследования дезинфицирующей активности проводились с новыми препаратами на основе четвертичных аммониевых соединений «Заоркват 50» и «Септокаль 2000». При изучении характеристик «Заоркват 50» установлено, что, по степени воздействия на организм при введении в желудок этот препарат относится к 3 классу умеренно опасных веществ, при нанесении на кожу - к 4 классу мало опасных соединений, при парентеральном введении - к 4 классу малотоксичных веществ. Средство в виде паров при ингаляционном воздействии по степени летучести мало опасно, но оказывает умеренное раздражающее действие на кожу и выраженное - на слизистые оболочки глаз. Средство не обладает сенсибилизирующим и кожно-резорбтивным действием. Средство «Септокаль 2000» имеет бактерицидные, антивирусные и фунгицидные свойства широкого спектра.

Иодосодержащие дезинфицирующие средства - соединения йода с поверхностно-активными веществами (йодофоры) в настоящее время находят

применение в пищевой промышленности. Испытания показали, что наибольшая бактерицидная активность йодофоров наблюдаются в диапазоне значений рН 3-5.

Галогены чувствительны к органических материалам и, в частности, к белкам. Галогенные препараты и белки образуют комплекс, не обладающий бактерицидным действием. Если количество белка достаточно большое, то дезинфицирующий раствор может стать полностью неэффективным. В присутствии белка йод более активен, чем хлор.

Активность йодофоров мало зависит от температуры, однако, следует избегать температуры выше 40 °С , так как при этом может происходить сублимация йода и увеличиваются его коррозийные свойства. Растворы йодофоров целесообразно применять при комнатной температуре.

Если сам йод незначительно разъедает нержавеющую сталь, то пары йода, наоборот, обладают серьезной коррозийной способностью.

Определено, что разбавленные растворы йодофоров сохраняются лучше, чем растворы гипохлорита.

Йодосодержашие дезинфицирующие средства целесообразно применять для дезинфекции воды, воздуха (аэрозоли в дозе 0,3 мг/м3), влажного материала, поверхностей (механически или аэрозолем)

Дезинфицирующие средства на основе перекиси эффективны при низких температурах и низких концентрациях. Однако, они требуют продолжительной экспозиции, т.к. перекись водорода освобождает кислород медленно.

Препараты, содержащие смесь перекиси водорода и надуксусной кислоты обладают спороцидным действием, и не вызывают привыкания. В рабочих концентрациях они, практически не имеют запаха, не пенятся, легко смываются, эффективны при низкой температуре.

Экспериментами проверено и подтверждено спороцидное действие нового дезсредства «Персепталь 150» содержащего в своем составе композит действующих веществ: 10,5-12% перекиси водорода, 5-10% уксусной кислоты, 14-16% надуксусной кислоты, а также ингибитор коррозии, стабилизатор и функциональные добавки.

Определенный интерес для проведения корректирующих дезинфекционных мероприятий могут представлять препараты на основе альдегидов. Из них прежде всего следует отметить альдегид муравьиной кислоты (формальдегид) и альдегид уксусной кислоты (ацетальдегид). Альдегиды могут легко полимеризоваться даже при низких температурах, образуя нерастворимые в воде соединения, препятствующая использованию дезинфекционных средств. Для исключения этого явления к указанным средствам добавляют стабилизаторы, например, метиловый спирт, который в свою очередь накладывает определенные ограничения в плане безопасности работ с такими препаратами.

На основании проведенных экспериментальных исследований можно сделать заключение, что для санитарной обработки на пищевых предприятиях предпочтение надо отдавать моюще-дезинфицирующим средствам. Применение таких препаратов

позволяет совместить в одной операции стадии мойки и дезинфекции, сократить продолжительность санитарной обработки и расход воды.

Проведенные исследования показали, что стратегия, ориентированная на использование последовательного ряда дезинфицирующих средств, является эффективной для инактивации простейших и других микроорганизмов, присутствующих в питьевой воде. Ввиду того, что УФ-излучение является весьма эффективным для инактивации простейших и в меньшей мере для инактивации вирусов, а хлор является высоко эффективным для инактивации бактерий, но в меньшей мере для инактивации простейших, целесообразно реализовать стратегию, ориентированную на использование таких дезинфицирующих средств как хлорирование и УФ-излучение.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований теоретически и экспериментально обоснована концепция комплексной системы обеспечения безопасности технологических процессов переработки продукции АПК на основе принципов ХАССП, включающая уточненные ККТ и опасные факторы современных технологических процессов получения мясной и рыбной продукции, методы и средства ускоренного выявления опасных факторов с применением ДНК- и иммуноанапиза, тест-систем ферментативного ингибирования, усовершенствованные способы и средства технологического контроля и системы корректирующих мероприятий.

2. На основании анализа литературных данных и собственных исследований по определению ККТ и опасных факторов технологий получения рыбных пресервов, убойного цеха и прудовых хозяйств по разведению карпа установлено, что при соответствующих различиях существуют значительное сходства, определяющихся характеристиками элементов производства: воды для разведения рыб, кормов для рыбы, животных для убоя, основного и вспомогательного оборудования, воздушной среды и т.д. В большинстве случаях, в качестве опасных факторов в основном выступают сходные группы антропогенные и природные токсиканты, что дает основание к применению аналогичных методик для контроля соответствующих опасных факторов.

3. В процессе исследований разработаны методики анализа опасных факторов микробного происхождения (дрожжи и плесневые грибы, E.coü, Sal. Typhimurium, S. aureus) в сырье, продукции, на поверхностях оборудования и помещений, воды, воздуха с использованием тест-системы RIDA COUNT с хромагенными питательными средами, которые позволили в 1,5-2 раза сократить время определения микробных загрязнений в ККТ по сравнению с классическим бактериологическим анализом.

4. Адаптированные и разработанные усовершенствованные методики с использованием иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота позволили проводить ускоренный мониторинг микроорганизмов, токсинов с трансгенных белков к ККТ. При этом чувствительность

34

индикации и идентификации сальмонелл в модификации с кратковременным подращиванием в жидких питательных средах в течении 3 часов позволяла определять единичные клетки. Предел обнаружения ботулинического токсина в мясных консервах составлял 0,030, а в рыбных консервах 0,035 мкг/мг. Пределы обнаружения стафилококкового энтеротоксина в мясорастительных полуфабрикатах составляли от 0,20 до 0,85 мкг/мг. При этом методика, включающая этап концентрирования, повышала чувствительность обнаружения белков в 4 — 9 раз. В мясорастительных полуфабрикатах, содержащих трансгенный картофель с белком CP4EPSPS удавалось определять данный белок с помощью ИИХЭ с пределом обнаружения от 0,015 до 0,40 мкг/мг.

5. Апробированные и адаптированные методики на основе коммерческих тест-систем мультиплексксной ПЦР в режиме реального времени и робототехники позволяли проводить ускоренный мониторинг ККТ в автоматизированном режиме и определять патогенные бактерии (E.coliH70I57, Sal. Typhimurium, S. aureus).

6. Впервые разработанные методики дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ДНК-диагностики, позволили сократить время анализа в 3-4 раза по сравнением с бактериологическими методами. Методики могут быть использованы для теоретического прогнозирования недопустимых рисков появления опасных факторов микробного происхождения в ККТ путем математического моделирования возможных изменений, влияющих на технологический процесс.

7. Разработанные модифицированные методики и тест-системы на основе ДНК-чипов позволили расширить определяемых микроорганизмов и проводить ускоренный мониторинг патогенных бактерий (Sal. Typhimurium, Е. coli, S. aureus, Yer. Enterocoliíica, Ps. aeruginosa) в ККТ с визуальной и приборной детекцией конечного результата.

8. Разработанные модифицированные методики на основе тест-системы ингибирования ацетилхолинэстеразы «in vitro» давали возможность в ускоренном режиме, в течение 1-3 часов определять опасные факторы ФОС и карбоматы. Пределы обнаружения составляли для диазинона, дихлофоса, диэтилдитиокарбамата натрия и монурона находились в интервале 0,4 до 1,3 мкг/кг/л.

Методики и тест-система могут быть использованы для мониторинга мяса и рыбы и продуктов их переработки, а так же искусственных водоемов при производстве рыбы.

9. Адаптированные методики на основе тест-систем иммуномикрочилового анализа могут быть использованы для количественного и качественного определения опасных факторов токсичной природы (сульфаниламиды, антибиотики, противопаразитарные препараты) в ускоренном автоматическом режиме при мониторировании ККТ при производстве мяса, рыбы и продуктов их переработки. Установленные пределы обнаружения составляли для антигельминтиков от 0,4 до 2,0 мкг/кг, антибиотиков от 1,9 до 2,20 мкг/кг.

10. Проведенные экспериментальные исследования с помощью разработанных методик дифференциального определения вегетативных и Ь-форм, а также данных электронной микроскопии показали, что препараты на основе четвертичных аммониевых соединений " Зоаркват 50 " и «Септокаль 2000» в определенных дозах могут вызывать привыкание, связанное с образованием Ь-форм, При достаточных концентрациях соответственно наблюдался бактерицидный эффект. Препараты хорошо сочетались с моющими компонентами и имели широкий спектр действия против вирусов, бактерий и грибов.

11. Разработана методология управления многофакторными системами, обеспечивающая прогнозирование и реализацию оптимальных технологических процессов удаления патогенных микроорганизмов и биогенных элементов при водоподготовке и водоотведении производственных сточных вод предприятий пищевой и перерабатывающей промышленности АПК.

12. Разработаны модели оптимальных технологических схем многокомпонентных систем очистки, обеспечивающих высокую надежность функционирования и показатели очистки, заданные санитарно-гигиенические нормами, к водоподготовке и природоохранными органами к водам, сбрасываемым в природные водоисточники.

13. Сформулированы научно-обоснованные требования к средствам дезинфекции, предназначенным для санитарной обработки различных объектов пищевой и перерабатывающей промышленности: широкий спектр антимикробного действия, медленное формирование резистентных штаммов микроорганизмов, безопасность для потребителя и окружающей среды, низкая токсичность, полное удаление с обработанных поверхностей после завершения дезинфекционной экспозиции, универсальность действия.

Предложения для практики

Для применения в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях могут предложены следующие документы:

1. Методическое пособие по применению ускоренных методов и тест-систем иммунохроматографии для мониторинга критических контрольных точек при производстве мясной и рыбной продукции на основе принципов ХАССП (утверждены отделением ветеринарии РАСХН 12.11.2013 г.).

2. Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясе - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

3. Методика определения энтеротоксинов на основе иммунохроматографии с применением коллоидного золота в мясных полуфабрикатах - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

4. Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясе на основе иммуномикрочиповой технологии- 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

5. Методика определения остаточных количеств антимикробных веществ в мясных полуфабрикатах на основе иммуномикрочиповой технологии - 07.11.2012 г., ГНУ ВНИИВСГЭ.

6. Рекомендации по проведению ветеринарной дезинфекции на животноводческих комплексах и биопредприятиях - Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ, 2014 г.2014 г.

7. Методические рекомендации по дифференциальному определению вегетативных и L-форм бактерий в объектах ветеринарно-санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах (Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 28.02.2001 г.).

8. Методические указания по индикации Staphylococcus aureus в мясопродуктах с использованием генных зондов (Утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 14.09.2000 г. № 13-5-2/194).

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статью в журналах, рекомендованных ВАК

1. Денисова Е.А. Разработка метода дифференциального определения вегетативных и L-форм бактерий в объектах ветеринарно -санитарного контроля с использованием ДНК-гибридизаиии на мембранных фильтрах / Денисова Е.А. // Журнал «Ветеринария и кормление».- № 3,- 2012,- С. 41-42.

2. Светличкин В.В. Применение иммунохроматографических тест-систем для ускоренной оценки безопасности объектов экологического и ветеринарно-санитарного контроля /' Светличкин В.В., Денисова Е.А., Горожанина Е.С., Ярков С.П. //Журнал «Ветеринария и кормление»,- № 2,- 2013,- С. 30-31.

3. Денисова Е.А. Система ХАССП, как одно из приоритетных направлений в обеспечении безопасности продукции животного происхождения / Денисова Е.А., Ганович Г.Г., Светличкин В.В. // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии,-№2(10) .- 2013 г.- С. 8-12.

4. Денисов А.А. Совершенствование механизма процессов седиментации дисперстных и коллоидных частиц органических загрязнений с помощью биополимеров активного ила i Денисов А.А., Крупский А.С., Денисова Е.А., Малышева А.А., Плотников М.В. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук,- 2013,- Л"» 5,- С. 52-56.

5. Денисова Е.А. Дифференциальное определение вегетативных и L— форм бактерий в объектах ветеринарного надзора с использованием «сэндвич» мембран и ПЦР в режиме «реального времени» / Денисова Е.А., Светличкин В.В., Матвеева И.Н. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук,- № 4,2014 г.- С. 53-54.

6. Денисова Е.А. Факторы, вызывающие гетероморфизм бактерий и разработка методов дифференциального определения вегетативных и L-форм Staphylococcus aureus в объектах ветеринарно-санитарного контроля / Денисова Е.А., Светличкин В.В., Канарская З.А. // Вестник Казанского технологического университета,- 2014 г.- Т. 17,- № 11,- С. 122-126.

7. Денисова Е.А. Микробиологический и токсикологический контроль биотехнологических производств с помощью ускоренных методов и тест-систем /

37

Денисова Е.А., Бабунова B.C., Светличкин В.В., Бобровская И.В. // Журнал «Ветеринария и кормление»,-№ 6,- 2014,- С. 45-46.

8. Самуйленко А.Я. Возможности применения метода ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах для определения вегетативных и L-форм Staphylococcus aureus при внедрении системы ХАССП на производстве мясной продукции / Самуйленко А.Я., Денисова Е.А., Светличкин В.В. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук,- № 3,- 2014,- С. 52-54.

9. Денисова Е.А. Ускоренные методы контроля остаточных количеств запрещенных и вредных веществ в сырье и продуктах животного происхождения / Денисова Е.А., Бабунова B.C., Светличкин В.В. // Журнал «Ветеринария и кормление».- № 3,- 2014,- С. 26-27.

10. Денисова Е.А. Удаление патогенных микроорганизмов при очистке сточных вод / Денисова Е.А., Светличкин В.В., Денисов A.A., Калистратов И.М., Плотников М.В. // Свиноводство.- 2014,- № 4,- С. 17-19.

11. Ганнович Г.Г. Ускоренные методы мониторинга критических контрольных точек при производстве мясной и рыбной продукции на предприятиях сертифицированной в системе ХАССП / Ганнович Г.Г., Денисова Е.А., Бровкина

A.Н. // КубГАУ-№98(04).-2014,-С. 1-13.

12. Денисова Е.А. Обеспечение безопасности получения сырья и продукции животного происхождения / Денисова Е.А., Ваннер Н.Э., Светличкин В.В. // Вестник-Российской академии сельскохозяйственных наук,- № 2,- 2015,- С. 19-21.

13. Смирнов A.M. Современные методы и тест-системы для контроля токсичных веществ в объектах ветеринарного надзора / Смирнов A.M., Дорожкин

B.И., Кононенко Г.П., Бабунова B.C., Денисова Е.А., Светличкин В.В. // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии,- № 2(14).- 2015,- С. 78-82.

Патенты на изобретение

14. Патент РФ № 2535989. Способ аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов A.A., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский A.C., Чичилеишвили Г.Д., Гринь A.B., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. -Бюл. № 35.

15. Патент РФ № 2535842. Установка для аэробной биологической очистки сточных вод. Самуйленко А.Я., Денисов A.A., Денисова Е.А., Плотников М.В., Крупский A.C., Чичилеишвили Г.Д., Дадасян А.Я., Гринь A.B., Положенцев И.М. Опубликован 20.12.2014 г. - Бюл. № 35.

Статьи и материалы конференций, семинаров

16. Денисова Е.А. Разработка методов и тест-системы ускоренного обнаружения и идентификации бактерий в объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля /' Светличкин В.В., Доля Е.А., Мамаев М.А., Денисова Е.А. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 70-летию со дня рождения профессора В.А. Першина, 14.08.1997г. ВНИиТИБП РАСХН (г. Щелково, 1997).- г. Щелково. - 1998. - С.53.

38

17. Денисова Е.Л. Действие антибиотиков на популяцию клеток Echerichia coli и Staphylococcus aureus / Денисова Е.А.. Павлова И.Б., Светличкнн В.В. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции ((Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 75-летию со дня рождения Н.Ф. Чуклова - г. Щелково. -1998. - С. 52-53.

18 Денисова Е.А. Действие различных групп антибиотиков на культуру клеток Staphylococcus aureus / Денисова Е.А. // Материалы Международной научной конференции «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (дезинфекция, дезинсекция, дератизация)» ВНИИВСГЭ РАСХН,- Москва.- 1999,- С. 157-158.

19. Денисова Е.А. Проблемы ускоренного мониторинга показателей токсикологический и микробиологической безопасности сырья и готовой продукции в критических контрольных точках производства мясной продукции / Горяинова Г.М. Рощупкина Л.В., Ганнович Г.Г., Светличкин В.В. // Материалы Международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии»,- Москва.- ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина,- 2013,- С.64-68.

20. Светличкин В.В. Разработка элементов системы ХАССП на рыбоперерабатывающем предприятии / Светличкин В.В., Денисова Е.А., Горяинова Г. М., Арсеньева Л. В., Ганович Г.Г. // Материалы Международной научно-практической очно-заочной конференции «Современные проблемы ветеринарно-санитарной экспертизы и пути и решения творческого наследия А.П. Ермолаева.-Омск - 2013.- С. 37-41.

21. Денисова Е.А. Разработка методики дифференцированного определения вегетативных и L-форм бактерий на основе ПЦР / Денисова Е.А. // Материалы Международной научно-практической конференции посвященной ветеранам ветеринарной науки ВНИИБТЖ,- Москва,- 2013,- С. 68-71.

22. Денисов А.А. Гидравлические режимы подавления нитчатого вспухания активного ила в аэротенках / Денисов А.А., Светличкин В.В., Денисова Е.А., Крупский А.С., Малышева А.А., Калистратов И.М., Чичилеишвили Г.Д. // Материалы международной научно-практической конференции,- г. Щелково.- 5-7 декабря -2012. - С.534-537.

23. Денисова Е.А. Микробиологический и токсикологический контроль производственных помещений, оборудования, сырья и готовой продукции перерабатывающих предприятий животноводческой продукции с помощью иммунохро.матографических индикаторных элементов / Денисова Е.А., Светличкин В.В. // Материалы международной конференции посвященной 85-летию ГНУ Самарской НИВС,- г. Самара, 16 октября 2014,- С. 141-145.

24. Денисова Е.А. Биологическая очистка сточных вод в трехфазном слое аэротенка / Денисова Е.А., Положенцев С.А., Денисов А.А., Павленко И.В., Скотникова Т.А., Неминущая Л.А. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИиТИБП.- Щелково,- 27-28 ноября 2014.-С. 427-430.

25. Денисов A.A. Гидромеханическая обработка активного или в системе очистки сточных вод / Денисов A.A., Крупский A.C., Денисова Е.А., Плотников MB. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВННиТИБП,- Щелково,- 27-28 ноября 2014.- С. 431-433.

26. Денисова Е.А. Пенообразование при аэробной биологической очистке / Денисова Е.А., Денисов A.A., Плотников М.В. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИиТИБП,- Щелково,- 27-28 ноября 2014,- С. 433-436.

27. Денисова Е.А. Микробиологический и токсикологический контроль биотехнологических производств с помощью ускоренных методов и тест-систем / Денисова Е.А., Бабунова B.C., Светличкин В.В., Бобровская И.В. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию ВНИиТИБП.- Щелково,- 27-28 ноября 2014,- С. 437-441.

28. Денисов A.A. Биотехнологическая переработка жидких отходов животноводческих и птицеводческих комплексов / Денисов A.A., Фисинин В.И., Самуйленко А.Я., Денисова Е.А., Положенцев С.А., Розаева A.B., Грудинин О.О. // Материалы научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии» посвященные 5-летию Ассоциации «Ветеринария, зоотехния и биотехнология».- Москва,- МСХ РФ,- С. 99-101.

Список основных сокращений АПК - Агропромышленный комплекс

ИСО - (International Organization for Standardization, ISO) Международная организация по стандартизации

ХАССП- Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) — анализ рисков и критические контрольные точки) — концепция, предусматривающая систематическую идентификацию, оценку и управление опасными факторами, существенно влияющими на безопасность продукции

GMP - Good Manufacturing Practice — (Надлежащая производственная практика) — система норм, правил и указаний в отношении производства.

ПЦР - Полимеразная цепная реакция ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота ККТ — Критические контрольные точки

ИИХЭ - Иммунохроматографические индикаторные элементы

БПК - Биохимическое потребление кислорода

МБР - Мембранный биологический реактор

КОЕ - Колония образующая единица

pH — Водородный показатель

УФ - Ультрафиолет

Подписано в печать 08.10.2015г.

Усл.п.л. - 2.5 Заказ № 29685 Тираж: 120 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru