Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование методов идентификации и оценки безопасности и качества мяса кролика

ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов идентификации и оценки безопасности и качества мяса кролика"

На правах рукописи

Кондратьева Мария Вячеславовна

Совершенствование методов идентификации и оценки безопасности качества мяса кролика

06.02.05 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Москва-2013

005540177

Работа выполнена в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: Светличкин Вячеслав Владимирович

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом технического регулирования, стандартизации и сертификации ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственный наук

Официальные оппоненты: Белоусов Василий Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор, главный эксперт ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»

Хоминец Николай Геннадьевич

кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры стандартизации, метрологии и технологии производства продукции животноводства ФГБОУ ВПО «Российский университетдружбы народов

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии»

Защита состоится «18» декабря 2013 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д.006.008.01. на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « //¿24/^/7.0- 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Крутько Н.С.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Мясо кролика является экологичным, диетическим и легко усвояемым организмом человека пищевым продуктом. Оно имеет высокую питательную ценность, при этом содержит мало жира и калорий. В крольчатине почти не накапливается остаточных количеств пестицидов и других ксенобиотиков. Мясо кролика полезно людям с повышенной массой тела и страдающим сердечно-сосудистыми, желудочно-кишечными заболеваниями. Оно содержит полнорационный белковый состав и, по сравнению с мясом других видов животных, небольшие количества холестерина. В мясе кролика много витаминов и минеральных веществ (Мишанин Ю.Ф., Куц Р.Ф.,2003). Бульон из крольчатины включает компоненты, повышающие иммунитет и положительно влияет на пищеварительную систему человека (Плотников В.Г., 2004).

Учитывая высокую ценность крольчатины, существует вероятность подмены (фальсификации) ее другим мясом. Особенно вероятна фальсификация продуктов из мяса кролика, так как осуществить ее гораздо проще.

В этой связи актуальным является разработка эффективных методов идентификации крольчатины и определения фальсификаций.

В соответствии с Федеральным законом «О техническом регулировании» идентификация является одним из основных элементов при подтверждении соответствия продукции. Это особенно важно при подтверждении соответствия в системах сертификации «Экологичный продукт». Подобные системы достаточно хорошо развиты в ряде стран ЕС и имеются у нас и стране.

При сертификации в «Эко»-системах кроме основных показателей безопасности и качества вводятся дополнительные критерии (наличие различных возбудителей инфекций, синтетических гормонов, консервантов,

аллергенов, ГМО, красителей, ароматизаторов, антибиотиков и других вредных веществ).

Кроме того, некоторые из этих критериев определены нормативными документами для Государственного ветеринарного мониторинга остаточных и вредных веществ в сырье, продукции и кормах.

Для оценки показателей безопасности и качества сырья и продукции животного происхождения весьма эффективными показали себя методы ДНК- и иммунодиагностики (В.В. Светличкин 2002; A.M. Смирнов и др., 2003, 2012).

Однако, актуальным является апробация и адаптация методов для конкретных объектов, в частности, для мяса кролика и продуктов из него, а также совершенствование методов в плане эффективности анализа.

Цель и задачи исследований Целью исследований являлось совершенствование методов идентификации и оценки безопасности и качества мяса кролика.

В задачи исследований входило:

1. Адаптировать и усовершенствовать методы подтверждения подлинности мяса кролика и продуктов из него на основе ДНК- и иммунодиагностики.

2. Адаптировать и усовершенствовать методы микробиологического и токсикологического контроля безопасности мяса кролика на основе методов ДНК-диагностики и иммупохроматографии.

3. Экспериментально обосновать возможность применения методов и тест - систем ИФА и иммуномикрочиповой технологии для определения в мясе кролика сульфаниламидов, антибиотиков и синтетических гормонов.

Научная новизна

Получены экспериментальные результаты по адаптации и усовершенствованию методов и тест-систем идентификации и оценки безопасности и качества мяса кролика и продуктов из него на основе ДНК- и иммунодиагностики, разработаны модификации методов.

Экспериментальными данными показана возможность идентификации крольчатины и определения фальсифицирующих примесей животного и растительного происхождения, включая ГМО в продукции из мяса кролика с помощью разработанной модифицированной методики иммунодиффузии, а также иммунохроматографических тест-систем.

Апробирована и адаптирована модифицированная методика на основе амплификации с последующей ДИК-гибридизацией и регистрацией конечного результата по иммуноферментному типу для идентификации мяса кролика, которая позволяла определять до 0,1% фальсифицирующих примесей животного и растительного происхождения в продукции из этого мяса.

Усовершенствована индикация сальмонелл, золотистого стафилококка и кишечной палочки в мясе кролика с помощью модифицированной методики амплификации с рассеянной затравкой и последующей гибридизацией на мембранных фильтрах, которая позволяла проводить анализ при наличии сопутствующей микрофлоры.

Экспериментально подтверждена возможность выявления сальмонелл, и стафилококкового энтеротоксина в мясе кролика с помощью отечественных иммунохроматографических индикаторных элементов с наночастицами коллоидного золота, а также синтетических гормонов и антибиотиков с помощью иммуноферментных тест-систем.

Усовершенствовано определение сульфаниламидов и антибиотиков в мясе кролика на основе иммуномикрочиповой технологии с хемилюминесцентной детекцией, что позволило с высокой точностью и чувствительностью осуществлять качественный и количественный анализ в автоматическом режиме.

Практическая ценность

На основании результатов исследований для практического использования разработаны:

- Методические рекомендации по использованию иммунохрома-тографических тест-систем для выявления ГМО (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06. 2008 г. пп.1-10);

- Методическое пособие по определению нерегламентированных добавок из генномодифицированных растений в фаршах на основе иммунохроматографии (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10. 2010 г. пп. 1-7);

- Методическое пособие по идентификации мяса и определению нерегламентированных добавок растительного и животного происхождения в фаршах на основе иммунодиффузии» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10. 2010 г. пп. 1-5);

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- V международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва, МГУПБ, 2006 г.;

- III Международной конференции, Махачкала, 2007 г.;

- заседаниях Ученого совета ВНИИВСГЭ (2008 -2013 г.);

- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2013 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Адаптированные и модифицированные методики иммунодиффузии иммунохроматографии и амплификации для идентификации мяса кролика и определению фальсифицирующих примесей животного и растительного происхождения, включая ГМО в продуктах из этого мяса.

2. Адаптированная и модифицированная методика индикации в мясе кролика санитарно-показательных микроорганизмов, на основе амплификации с рассеянной затравкой и последующей ДНК-гибридизацией на мембранных фильтрах.

3. Результаты экспериментального обоснования возможности применения методики и отечественной тест-системы иммунохроматографии

для определения сальмонелл и энтеротоксина золотистого стафилококка в мясе кролика.

4. Результаты экспериментального обоснования методов иммуноферментного анализа и иммуномикрочиповой технологии для выявления остаточных количеств сульфаниламидов, антибиотиков и синтетических гормонов в мясе кролика.

Публикации

Результаты исследований отражены в 7 научных статьях, из них две - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 224 источника отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Матерналы и методы исследований.

Работа выполнялась в период с 2006 по 2012 гг. в отделе технического регулирования, стандартизации и сертификации Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН).

В работе использовались сыворотки производства (Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов), иммунохроматотрафические тест-системы «AgraStrip GMO RR» фирмы Romer Labs (США) для определения ГМО, ПЦР тест-наборы для определения видовой принадлежности мяса Tepnel BioSystes и SureFood, SureFood® Pathogen (Германия) для идентификации возбудителей инфекций,

реактивы для выделения ДНК и постановки ПЦР производства ЗАО «Синтол» (Россия), иммунохроматографические индикаторные элементы для выявления сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина производства ФГУП «ГосНИИБП» (Россия). Амплификацию проводили на термоциклире «Маз1егсус!ег epgradient Э eppendorf геа1р1еах2». При определении остаточных количеств антибиотиков, сульфаниламидов и синтетических гормонов использовали тест-системы на основе иммуномикрочиповой технологии и хемилюминометр фирмы КАЖЮХ (Великобритания), а также тест-системы ИФА ШОА^СЯЕЕМ (Германия).

Объектами исследований служили образцы отобранные для мониторинговых и сертификационных испытаний, а также экспериментальные образцы, искусственно контаминированные микроорганизмами или ксенобиотиками. В исследованиях использовалось не менее 5 повторностей.

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Адаптация и усовершенствование методов подтверждения подлинности мяса кролика и продуктов из него на основе ДНК- и иммунодиагностикн. ,

Первым этапом подтверждения соответствия продукции является ее идентификация. Идентификация осуществляется с помощью различных методов и критериев: морфологических, органолептических, гистологических и др. Однако, перечисленные методы имеют известные ограничения, в частности, это относится к разделанному мясу, полуфабрикатам, в особенности, состоящих из нескольких ингредиентов.

Ранее была показана возможность использования метода иммунодиффузии для идентификации мяса крупного и мелкого рогатого скота, свинины (Макаров М.М.и др., 2005, Морозова Е.Н.2005., Пермяков А.Н.2008.,). Нами проведены исследования по адаптации и усовершенствованию этого метода для идентификации мяса кролика и продуктов из него.

Принцип реакции (метод иммунодиффузии по Оухтерлони) основан на диффузии диагностических антител и испытуемого антигена из лунок в гель, при этом, в случае их взаимодействия, образуется полоса преципитации между лунками со специфичными антигенами и антителами.

В наших исследованиях из мяса кролика и мышечных тканей других животных экстрагировали антигены (сок тканей) и пропитывали ими мембранные диски из ацетатцеллюлозы Рога Л1 СА (Украоргсинтез) с диаметром пор 0,45мкм. Эти ацетатцеллюлозные мембраны способствуют лучшему диффундированию различных растворов. Другие диски пропитывали отечественными сыворотками, специфичными к антигенам различных видов животных. Фильтр с искомыми антигенами помещали в центр агарозного геля, по периферии располагали диски с сыворотками. Чашки с фильтрами инкубировали 20 часов при 37 -39"С.

В отличие от используемых ранее методик для оптимизации анализа мяса других животных мы использовали следующие приемы:

1. применяли мембранные диски из ацетатцеллюлозы РогаШ (Украоргсиинтез) с диаметром пор 0,45мкм

2. концентрация агара на 0,5% была ниже, чем в проводимых ранее экспериментах;

3. температура инкубации составляла 37°С.

Указанные манипуляции позволяли лучше диффундировать в гель используемым компонентам и четче формировать полосы преципитации. Результаты исследований показали, что модифицированная методика иммунодиффузии позволяла проводить идентификацию мяса кролика, при этом не было перекрестных реакций с антигенами тканей других видов животных (табл. 1)

Таблица 1

Результаты идентификации мяса на основе иммунодиффузии

Испытуемые образцы Результаты преципитации экстрактов мяса со специфичными сыворотками на:

крольчатину свинину

Крольчатина +

Свинина +

Говядина _ _

Баранина _ _

Мышечная ткань кошки - -

Мышечная ткань собаки - -

Методика позволяла выявлять до 5% крольчатины в смешанных фаршах из различного мяса.

При использовании в полуфабрикатах из мяса кролика компонентов растительного происхождения существует вероятность замены традиционных растительных культур на генномодифицированные. В этой связи нами была экспериментально подтверждена возможность применения метода иммунохроматографии для выявления трансгенных белков в искусственно приготовленных фаршевых смесях из мяса кролика и растительных ингредиентов.

В результате проведенных исследований была экспериментально обоснована возможность использования иммунохроматографических тест-систем «AgraStrip GMO RR» фирмы Romer Labs США для выявления трансгенных белков в фаршах из крольчатины и генномодифицированного растительного сырья.

Методики позволяла определять до 1 % примеси трансгенных растительных белков.

Ранее была показана возможность использования тест-систем серии SureFood (Германия) для определения видовой принадлежности мяса в сырье и мясных продуктах из говядины и свинины (Морозова E.H. и др., 2004; Смирнов A.M. и др., 2005).

Методика идентификации мяса с использованием тест-наборов SureFood основана на достаточно длительной и трудоемкой пробоподготовке, которая включает лизис клеток, выделение и очистку матричной ДНК с помощью протеолитических ферментов и многочисленных процедур центрифугирования и фильтрации. Далее проводятся ПЦР с праймерами, меченными биотином, связывание ампликонов со стрептавидином, иммобилизованным на иммуноферментных плашках, гибридизация с ДНК- зондами, меченными ферментом и, после реакций с субстратом и красителем определяются гибридные молекулы по интенсивности их окрашивания в лунках ИФА- планшета визуально или с помощью фотометра.

В наших исследованиях была разработана модифицированная методика идентификация крольчатины на основе амплификации с последующей гибридизацией, которая заключалась в выделении ДНК с помощью детергента СТАВ и дальнейшим анализом по схеме SureFood. Для выделения ДНК использовали СТАВ-буфер, состоящий из 2%- СТАВ, 1.4M-NaCL, 1 ООмМ TrisHCL до pH 7.8-8.0 и ЗОмМ EDTA. Далее проводили очистку матричной ДНК с помощью магнитосепарации и амплифицировали с праймерами, меченными биотином, связывали полученные ампликоны с иммобилизованном в лунках ИФА- планшета стрептавидином, проводили гибридизацию с ДНК-зондами, меченными ферментом и реакции с субстратом и красителем. Конечный результат определяли по интенсивности окрашивания иммобилизованных в лунках гибридных молекул (визуально) или на фотометре.

Усовершенствованная нами методика давала возможность не только идентифицировать мясо кролика, но и определять другие ингредиенты в

многокомпонентных полуфабрикатах. При этом, анализ осуществлялся как с нативной, так и с термообработанной продукцией.

2.2.2. Адаптация и усовершенствование методов

микробиологического и токсикологического контроля безопасности мяса кролика на основе методов ДНК-диагностики и

иммунохроматографии.

В процессе этого этапа исследований использовали методику амплификации с рассеянной затравкой последующей гибридизацией. Такой подход применялся ранее для оценки безопасности некоторых объектов ветеринарно-санитарного контроля (Светличкин В.В., 2002). Для анализа крольчатины нами была несколько модифицирована пробоподготовка и этап регистрации конечного результата. Схема анализа включала:

гомогенизирование проб из мяса кролика, элюирование бактерий, концентрирование их дифференциальным центрифугированием, выделение и очистка матричных ДНК детергентом Siliko и магнитосепарацией, амплификацию методом рассеянной затравки, очистку ампликонов колоночной хроматографией и гибридизацию их с ДНК-зондамии, иммобилизованными на реакции с конъюгатом, субстратом, и красителем и регистрацию конечного результата по интенсивности окрашивания гибридных молекул (визуально) или на рефлектометре.

Для индикации микроорганизмов методом точечной гибридизации нами были выбраны, используемые ранее специфичные нуклеотидные последовательности (Гинцбург А.Л., 1998 г., Lim, et. al., 1998). Для Escherichia coli - нуклеотидная последовательность fimA структурного гена, для сальмонелл последовательность на основе stn гена токсинообразования Salmonella typhimurium. ДНК-зонд па S. aureus получали в полимеразной цепной реакции с меченными биотином праймерами: Sa442-1 (5'-ААТ СТТ TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-3'), позиция с 5 по 34; Sa442-2 (5'-CGT GAG ATT TGA GAT AAT АСА ACA-3'), позиция с 83 по 112 (Светличкин В.В., 2002).

В таблице 2 представлены данные но определению возбудителей в мясе кролика и продуктах из этого мяса с помощью методики амплификации с последующей точеной гибридизации.

Таблица 2.

Результаты индикации Escherichia coli, Salmonella typhimurium, S. aureus в мясе кролика и продуктах из этого мяса методом амплификации с последующей точечной гибридизацией с ДНК-зондами

Образец Результаты гибридизации с ДНК-зондами:

ДНК-зонд Escherichia coli ДНК-зонд Salmonella typhimurium ДНК-зонд S. aureus

Мясо кролика, контаминированное Escherichia coli ++++ - -

Мясо кролика, контаминированное Salmonella typhimurium - ++++ -

Мясо кролика, контаминированное S. aureus - - ++++

Мясо кролика, не контаминированное - - -

Фарш из мяса кролика, контаминированный Escherichia coli ++-Г+ - _

Фарш из мяса кролика, контаминированный Salmonella typhimurium - _

Фарш из мяса кролика, контаминированный S. aureus 1 - - +++-h

Фарш из мяса кролика, I не контаминированный • -

(++++) - максимальная интенсивность окрашивания гибридных молекул при наличии микроорганизмов

(-) - отсутствие окрашивания и культуры микроорганизмов

Кролики часто болеют стафилококкозом. Хотя эти кролики выявляются на предубойной и убойной стадиях ветсанэкспертизы и не допускаются в оборот продукции, однако существуют вероятность появления в обороте мяса кроликов, контаминированного золотистым стафилококком, который продуцирует энтеротоксин, а также сальмонеллами. Стафилококковый энтеротоксин может оставаться в мясе кролика даже при отсутствии возбудителей. Ранее, в работах Яркова С.П. и Шиленко И.В. с сотр. было показано применение иммупохроматографических тест-систем отечественного производства ГосНИИБП для выявления бактерий и токсинов в объектах экологического надзора (Ярков С.П. и др., 2005, Шиленко И.В. и др., 2011). Нами проведена оценка возможности использования указанных тест-систем для выявления сальмонелл и стафилококкового энтеротоксиня в мясе кролика И продукции из него. При этом, был применен прямой анализ экстракта из мяса кролика и продукции из него методом иммунохроматографии. Однако, как показано теми же авторами, эта схема возможна только при высоком уровне контаминации объектов указанными микроорганизмами или токсинами, что является редким случаем. Длительность такой схемы анализа, включая пробоподготовку, не превышает одного часа. Пробоподготовка предусматривает гомогенизирование продукта, экстракцию клеток или токсинов буфером для анализа, фильтрацию или центрифугирование в мягких условиях, а затем последующее нанесение фильтрата или супернатанта на иммунохроматографический тест. При низкой концентрации микробных клеток, необходимо проводить предварительное обогащение. Для сальмонелл рекомендовано подращивание на неселективных средах (забуференная пептонная вода, +37°С, 21 ч) или в хлористо-магниевой среде в течение 17-18 ч. при температуре 37° С. Эта схема была использована также нами, что позволило выявить до 102...103 м.к./мл бактерий находившихся в исходных искусственно контаминированных образцах из мяса кролика.

Выявление энтеротоксина золотистого стафилококка в мясе кролика мы осуществляли по схеме прямого определения или после накопления бактерий - продуцентов в жидких питательных средах. Регистрацию конечного результата проводили визуально или на рефлектометре. Наличие окрашенной полосы в аналитической зоне указывало на присутствие искомого антигена, окраска контрольной зоны свидетельствовала о пригодности ИИХЭ. Степень окрашивания с применением видеоцифрового рефлектометра «Рефлеком» выражалась в относительных единицах. Данные рефлектометрии кореллировали с визуальной оценкой результатов, однако прибор давал возможность архивировать данные и уменьшал некоторые отрицательные факторы: субъективность восприятия, освещенность рабочего места.

В таблице 3 представлены результаты определения сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина в мясе кролика с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов Полученные результаты показали, что сальмонеллы или стафилококковый энтеротоксин определялись только при использовании гомологичных ИИХЭ и соответствующих концентраций антигенов.

Таблица 3

Результаты выявления сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина в мясе кролика с помощью иммунохроматографических индикаторных элементов

Исследуемая проба Иммунохроматограф ические индикаторные элементы (ИИХЭ) Интенсивность окрашивания, рефлектометри чески, усл. ед.

Анали тичес кая зона Контр ольная зона

S. typhimurium 04 №4836 5x106 На сальмонеллы группы в 1,8 15,3

Escherichia coli 5х106 На сальмонеллы группы в 0 14,8

S. typhimurium 04 №4836 5x102 с обогащением На сальмонеллы группы в 1,7 15,2

Мясо кролика,контаминированное S. typhimurium 04 №4836 5x106 На сальмонеллы группы в 1,8 15 ,2

Мясо кролика,контаминированное S. typhimurium 04 №4836 4836 5х102 с обогащением На сальмонеллы группы в 2,0 15,8

Мясо кролика, неконтаминированное на сальмонеллы группы в 0 15,0

Мясо кролика, контаминированное стафилококковым энтеротоксином в концентрации 1мкг/мл на стафилококковый энтеротоксин 1,6 14,5

Мясо кролика, контаминированное золотистым стафилококком 5x106 на стафилококковый энтеротоксин 1,7 14,9

Мясо кролика, контаминированное золотистым стафилококком 5x102 с обогащением на стафилококковый энтеротоксин 1,5 15,3

Мясо кролика, неконтаминированное на стафилококковый энтеротоксин 0 14,8

2.2.3. Результаты экспериментального обоснования возможности применения методов и тест - систем ИФА и иммуномикрочиповой технологии для определения в мясе кролика сульфаниламидов, антибиотиков и синтетических гормонов.

Весьма важным при оценке безопасности и качества мяса кролика и продуктов из него, является котролирование гормонов и антибактериальных веществ.

Эти препараты могут применяться в качестве лечебно-профилактических средств, а также с целью стимуляции роста и повышения эффективности откорма кроликов. В настоящее время в России содержание антибактериальных препаратов регламентируется рекомендацией ФАО-ВОЗ (приложением № 12 к СанПиНу 2.3.2.1078-01). Существует также «Государственный ветеринарный лабораторный мониторинг остатков запрещенных и вредных веществ в организме живых животных, продуктах животного происхождения и кормах» утвержденный приказом Россельхознадзора.

Несоблюдение нормативных требований использования или применение запрещенных препаратов приводит к накоплению их у животных, а также в сырье и продуктах. Остаточные количества указанных веществ с пищей могут попадать к человеку, что приводит к негативным последствиям.

Совершенствование выявления гормонов и антибактериальныых веществ в мясе кролика проводили на основе ИФА и иммуномикрочиповой технологии.

ИФА проводили с помощью тест-систем «КГОАЗСЛЕЕК» Германия. Оценку результатов проводили визуально и с помощью вертикального фотометра «Пикон» Россия.

В своих исследованиях мы экспериментально подтвердили возможность использования иммуноферментного анализа для определения остаточных количеств антибиотиков тетрациклина, хлорамфеникола и

сульфаметазина в мясе кролика и полуфабрикатах, изготовленных из крольчатины (фарш, котлеты, пельмени).

Схема определения антимикробных веществ включала гомогенизирование проб, экстракцию буфером, очистку методом твердофазной экстракции, и определение результатов на ИФА-фотометре (450 ' нм) или визуально. Как показали исследования содержание антибактериальных веществ в крольчатине и полуфабрикатах из мяса кролика обнаруживалось в очень низких концентрациях и не превышала ПДК.

Далее экспериментальными исследованиями нами была показана возможность определения синтетического гормона кленбутерола в искусственно контаминированных образцах мяса кролика и полуфабрикатах, изготовленных из крольчатины (фарш, котлеты, пельмени), с помощью метода иммуноферментного анализа и тест-системы тест-системы ИФА «ШОАБСКЕЕЫ».

Схема анализа включала экстракцию гормона из образцов, очистку методом твердофазной экстракции, постановку иммуноферментной реакции и считывание результатов на ИФА - фотометре при 450 нм или визуально.

При проведении исследований образцов, взятых из оборота, кленбутерол обнаружен не был.

Другим подходом к определению остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в крольчатине является иммуномикрочиповая технология.

Иммуномикрочиповая технология базируется на реакции антиген-антитело (АГ-АТ), проходящей на биочипе и последующей хемилюминесцентной детекцией прореагировавших молекул.

Биочип представляет собой керамическую матрицу размером 9 х 9

мм2.

Исследования проводили с помощью сканирующего хемилюминометра и тест-систем пробоподготовки и анализа фирмы «11апс1ох» Великобритания.

Полученные данные свидетельствовали о высокой чувствительности и воспроизводительное™ метода. Внесенные дозы антимикробных веществ были практически полностью выявлены (табл.4-5).

Таблица 4

Результаты определения сульфаниламидов в искусственно контаминированных образцах мяса кролика

Исследуемые образцы Внесенный сульфаниламид Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг

мясо кролика сульфадиметоксин 4,0 3,980

мясо кролика сульфадимезин 115,0 114,969

мясо кролика сульфаметоксипир идазин 12,0 11,972

мясо кролика сульфаметизол 6,0 5,977

Таблица 5

Результаты определения антибиотиков в искусственно контаминированных

образцах мяса кролика

Исследуемые образцы Внесенный антибиотик Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг

мясо кролика стрептомицин 220,0 221,004

мясо кролика цефопсразон (медоцеф) 395,0 394,978

мясо кролика цефтриаксон (лендацин) 10,0 9,969

Дальнейшими исследованиями было показано, что в исследуемых образцах крольчатины и полуфабрикатов из мяса кролика, взятых из оборота в торговой сети, не было обнаружено превышения уровней содержания сульфаниламидов, регламентируемых нормативными документами.

выводы

1. 1. Проведены исследования по адаптации и усовершенствованию методов для идентификации и оценки безопасности и качества мяса кролика и продуктов из него на основе ДНК- и иммунодиагностики, разработаны модификации методов.

2. Полученными экспериментальными данными показана возможность идентификации мяса кролика и определения фальсифицирующих примесей в продукции из этого мяса с помощью модифицированной методики иммунодиффузии с чувствительностью 5%.

3. Экспериментально подтверждена возможность выявления фальсифицирующих примесей растительного происхождения из ГМИ в полуфабрикатах из мяса кролика с помощью иммунохроматографических тест-систем.

4. Разработанная модифицированная методика на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией и определения конечного результата по иммуноферментному типу позволила проводить идентификацию мяса кролика и выявлять фальсифицирующие примеси с чувствительностью 0,1%.

5. Усовершенствованная модифицированная методика амплификации с рассеянной затравкой и последующей гибридизацией на мембранных фильтрах позволяла проводить индикацию сальмонелл, золотистого стафилококка и кишечной палочки в мясе кролика при наличии сопутствующей микрофлоры.

6. Получены экспериментальные данные по адаптации иммунохроматографических тест-систем для выявления сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина в мясе кролика. Чувствительность индикации сальмонелл составляла 5x106 и 5x102 при условии предварительного обогащения путем подращивания в жидких питательных средах.

7. Экспериментально подтверждена возможность выявления синтетических гормонов и антибиотиков в мясе кролика с помощью иммуноферментных тест-систем.

-8. Проведено усовершенствование определения сульфаниламидов и антибиотиков в мясе кролика на основе иммуномикрочиповой технологии с хемилюминесцентной детекцией, что позволило с высокой точностью и чувствительностью осуществлять качественный и количественный анализ в автоматическом режиме. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Комплекс разработанных и адаптированных методов на основе ДНК- и иммунодиагностики может быть использован при скрининговых анализах Государственного ветеринарного мониторинга, при подтверждении соответствия мяса кролика и продуктов из него, в особенности, в системах «ЭКО», а также для ускоренного определения опасных факторов в системах качества (ХАСП, ИСО 22000) с целью быстрого и эффективного проведения корректирующих мероприятий.

Для практического использования разработаны:

- Методические рекомендации по использованию иммунохрома-тографических тест-систем для выявления ГМО (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06. 2008 г. пп.1-10);

- Методическое пособие по определению нерегламентированных добавок из генномодифицированных растений в фаршах на основе иммунохроматографии (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10. 2010 г. пп. 1-7);

- Методическое пособие по идентификации мяса и определению нерегламентированных добавок растительного и животного происхождения п фаршах на основе иммунодиффузии» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.10. 2010 г. пп. 1-5);

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Кондратьева М.В. / Совершенствование метода определения видовой принадлежности крольчатины на основе иммунодиффузии // Материалы 6-ой международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения», - М.: МГУПБ, 2007. - С. 307-308.

2. Кондратьева М.В. / Совершенствование метода идентификации крольчатины на основе иммунодиффузии И Материалы сборника международной научной конференции «Основные проблемы ветеринарной медицины и стратегии борьбы с заболеваниями сельскохозяйственных животных в современных условиях», - Махачкала, 2007. - С. 261-262.

3. Писарева В.М., Светличкин В.В., Рощупкина JI.B., Розанов С.Н., Кондратьева М. В., Панюшкин А.И. / «Определение видового состава сырья и продукции животного и растительного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики» // Материалы сборника международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии», - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008. - С.74

4. Светличкин В.В., Панюшкин А.И., Аспандиярова М.Т., Розанов С.Н., Кондратьева М. В., Горяинова Г.М. / «Экспрессное определение трансгенных белков в кормах на основе иммунохроматографических тест-систем» // Материалы сборника международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии», - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008. - С.75.

5. Кондратьева М.В. / Идентификация крольчатины на основе ПЦР // Сборник ГНУ ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», М.: 2009, Кч 1, С. - 26 - 33.

6. Светличкин В .В., Кононенко А.Б., -Ярко в С.П., Стрелков A.A., Кондратьева М.В., Панюшкин А.И. / Тест-системы и технические средства ускоренного контроля безопасности и качества объектов ветеринарного

надзора // Сборник ГНУ ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», М.: 2010, № 1, С. - 26 - 33.

7. Бабунова B.C., Оншценко Д.Л., ЯроваО.А., Артемов A.B., Кондратьева М.В., Луцык C.B. / Применение иммуномикрочиповой технологии для контроля безопасности и качества пищевых продуктов // Сборник ГНУ ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», М.: 2011, № 1(5), С. - 12 -17.

Подписано в печать 13.11.13 г. Усл. печ. л. 1,0, тираж 80 экз., заказ 446/2 ГНУ ВНИИВСГЭ 123022, Москва, Звенигородское ш., д 5.