Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Совершенствование методов ветеринарно-санитарной оценки сырого молока и сырых сливок

ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов ветеринарно-санитарной оценки сырого молока и сырых сливок"

На правах рукописи

Пульчева Ирина Алексеевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЕТЕРИНАРНО -САНИТАРНОЙ ОЦЕНКИ СЫРОГО МОЛОКА И СЫРЫХ СЛИВОК

06.02.05 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

11 ноя 2013

Москва 2013

005538626

Работа выполнена в лаборатории санитарии молока Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: Шурдуба Николай Александрович

кандидат ветеринарных наук, доцент, заведующий лаборатории санитарии молока ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственный наук Официальные оппоненты: Светличкин Вячеслав Владимирович

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом технического регулирования, стандартизации и сертификации ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственный наук Белоусов Василий Иванович доктор ветеринарных наук, профессор, главный эксперт ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория».

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии»

Защита состоится «// »013 г. в часов на заседании диссертационного совета /М 006.00^.01. при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5.

Автореферат разослан «2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ~ Крутько Н.С.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вопросы совершенствования ветеринарно-санитарного контроля безопасности и качества продукции животного происхождения являются весьма актуальными в свете проходящего в нашей стране процесса Технического регулирования и интеграции России в мировую экономику (Романенко Г.А., 2005; Алексеева Е.Ю., Посконная Т.Ф., 2004, Версан В.Г., 2003)

Сырое молоко и сырые сливки в соответствии с Федеральным законом, Техническим регламентом на молоко и молочную продукцию входят в число объектов технического регулирования этой продукции. Все процессы, применяемые при производстве сырого молока, условия содержания, кормления, доения сельскохозяйственных животных, условия сбора, охлаждения, хранения сырого молока, сырого обезжиренного молока, сырых сливок должны соответствовать требованиям ветеринарного законодательства Российской Федерации.

Сырое молоко должно быть получено от здоровых сельскохозяйственных животных на территории, благополучной и отношении инфекционных и других общих для человека и животных заболеваний.

Обладая высокой питательной ценностью, сырое молоко и сырые сливки являются скоропортящимися продуктами. Для эффективного хранения, перевозки и реализации необходимо принимать меры по обеспечению безопасности и сохранения качества данной сельскохозяйственной продукции. Среди этих мер немаловажное значение принадлежит контролю качества и безопасности. Это актуально для служб ветеринарного надзора, для фермерских хозяйств (Фомичев Ю.П.,2004), а также для предприятий по переработке указанного сырья.

Весьма важным при оценке качества является подтверждение подлинности продукции и выявление возможных фальсификаций. На безопасность молока и молочной продукции могут влиять различные загрязнители: микробные контаминации, токсины, остаточные количества антибиотиков и сульфаниламидов и др. Для определения этих показателей в скрининговых или арбитражных исследованиях необходимо использование ускоренных способов контроля, а также автоматизированных чувствительных методов и тест-систем гармонизированных с международными стандартами (Светличкин В.В., 2000; Смирнов A.M. и др., 2003).

В этом направлении эффективными, специфичными и чувствительными для контроля различных показателей безопасности и качества сырья и продукции животного происхождения зарекомендовали себя методы ДНК-иммунодиагностики (Самуйленко А.Я. и др., 1999; Родин В.И., 2000; Буркин A.A., Кононенко Г.П, 2003; Светличкин В.В. и др., 2010; Бабунова B.C. и др., 2011).

Однако, актуальным остается адаптация известных методик и тест-систем для оценки безопасности и качества сырого молока и сырых сливок, а также разработка и совершенствование новых методов для указанных объектов ветеринарного надзора. Цель исследования

Целью настоящей работы являлось - совершенствование методов ветеринарно-санитарной оценки сырого молока и сырых сливок. В задачи исследования входило:

- усовершенствовать определение подлинности сырых козьих молока и сливок на основе методики иммуноферментного анализа при адаптации тест-системы ИФА RIDASCREEN Casein к указанным объектам технического регулирования;

экспериментально обосновать возможность применения иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ)

отечественного производства для ускоренного контроля сальмонелл и энтеротоксина золотистого стафилококка в сыром молоке и сырых сливках;

- усовершенствовать контроль санитарно-показательных микроорганизмов в сыром молоке и сырых сливках на основе ДНК-чипов;

- усовершенствовать определение остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сырых молоке и сливках иа основе иммуномикрочиповой технологии.

- провести исследования по определению сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках, взятых из личных подворий и фермерских хозяйств, а также из оборота торговой сети.

Основные положения, выносимые на защиту 1. адаптация модифицированной методики ИФА с тест-системой «ИФА RIDASCREEN Casein» для выявления казеина в козьих сыром молоке и сливках для подтверждения их подлинности и выявления фальсификаций; 2.экспериментальное обоснование возможности применения иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) отечественного производства ГосНИИБП для определения в сыром молоке и сырых сливках сальмонелл различных серогрупп и стафилококкового энтеротоксина;

3. разработка и апробация модифицированной методики на основе ДНК-чипов для идентификации санитарно-показательных бактерий в сыром молоке и в сырых сливках;

4. экспериментальное обоснование определения остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках на основе иммуномикрочиповой технологии.

Научная новизна

Экспериментально обоснована возможность применения модифицированной методики ИФА с тест-системой «ИФА RIDASCREEN Casein» для выявления казеина в козьих сыром молоке и сливках для подтверждения их подлинности и выявления фальсификаций.

Экспериментально обоснована возможность применения иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) отечественного производства ГосНИИБП для определения в сыром молоке и сырых сливках сальмонелл различных серогрупп и стафилококкового энтеротоксина, для последнего разработана модифицированная методика пробоподготовки.

Разработана модифицированная методика на основе ДНК-чипов и показана возможность ее применения для идентификации санитарно-показательных бактерий в сыром молоке и в сырых сливках.

Экспериментально обоснована возможность применения иммуномикрочиповой технологии для одновременного

дифференцированного определения остаточных количеств антибиотиков (стрептомицина, цефоперазона, цефтриаксона) и сульфаниламидов (сульфадиметоксина, сульфадимезина, сульфаметоксипиридазина) в сыром молоке и сырых сливках. Установлена чувствительность определения.

При исследовании взятой из оборота молочной продукции, выявили наличие определяемых антимикробных веществ, в концентрациях не превышающих нормативные показатели.

Практическая ценность

На основании результатов исследований разработано методическое пособие по определению антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках с применением иммуномикрочиповой технологии, утвержденные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» МГУПП, Москва 2012 г.

- на расширенном совещании сотрудников лабораторий ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2013 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 работы, 2 из них в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на - 111 страницах машинописного текста, содержит 18 - таблиц, 11 - рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего - 167 источников (99 - отечественных, 68 - зарубежных) и приложения. 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Исследования проводили в период с 2009 г. по 2013 г.

Работа выполнена в лаборатории санитарии молока ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Объектами исследования являлись коровьи и козьи сырое молоко и сырые сливки, взятые из личных подворий и фермерских хозяйств Московской и Тульской областей, а также из оборота торговой сети (рынки), соответствие которых Техническому регламенту было установлено ветеринарными службами, указанных субъектов. В работе использовалось не менее пяти проб для каждого исследования.

В работе применялись иммунохроматграфические индикаторные элементы на стафилококковый энтеротоксин и сальмонеллы серогрупп А, В, С, D, Е производства ГосНИИБП. В работе использовались представленные ГосНИИБП бактериальные музейные культуры сальмонелл различных серологических типов: S. paratyphi А 225, S. typhimurium, S. heidelberg 1150, S. choleraesuis 595, S. newport, S. typhi 33, S. enteritidis 17, S. anatum 161 из коллекции Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток, а также культуры S. paratyphi В yava 04 4839, S. paratyphi В 4219, S. typhimurium

04 № 4836 из коллекции ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии

Роспотребнадзора.

Амплификацию проводили на термоциклере «Mastercycler epgradient S eppendorf realpleax». При определении подлинности применяли тест-систему ИФА RIDASCREEN Casein. При определении остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов использовали тест-системы и хемилюминометр фирмы RAND ОХ, Великобритания.

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Адаптация модифицированной методики ИФА с тест-системой «ИФА RIDASCREEN Casein» для выявления казеина в козьих сыром молоке и сливках для подтверждения их подлинности и выявления фальсификаций

На первом этапе проводили исследования по определению коровьего казеина в конкретных объектах Технического регулирования (коровьих и козьих сырых молока и сливках) с помощью тест-системы ИФА RIDASCREEN Casein.

Учитывая относительно высокую жирность объектов исследования, с целью повышения эффективности определения была предложена модифицированная схема пробоподготовки: молоко или сливки гомогенизировали с 1мМ ацетат-аммонийным буфером (8000-10000 об/мин), доводили рН до 4,6 разбавленной уксусной кислотой и казеин осаждали центрифугированием 5 мин, при 3000q, фракцию жира и сыворотки удаляли, а выпавший казеин гомогенизировали с 30 мл 1 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 4,6 и дважды повторяли очистку, осадок казеина гомогенизровали с 30 мл ацетона, фильтровали суспензию, промывали казеин на фильтре последовательно двумя порциями холодного ацетона по 30 мл, сушили казеин на фильтре, растворяли казеин в буфере инкубировали в течение 10 минут в ультразвуковой бане. При пробоподготовке сырых сливок, все операции были аналогичными, за исключением промывки ацетоном, которую проводили последовательно три раза.

Анализ ИФА выполняли следующим образом. В лунки планшета дозировали исследуемые растворы, стандартные растворы и антитела к коровьему казеину. Во время инкубации свободный и связанный на поверхности казеин, конкурируя между собой взаимодействовал с антителами к казеину. После промывки планшета, во время которой с поверхности удалялись все несвязанные компоненты растворов, в лунки добавлялись вторичные антитела, конъюгированные с ферментом.

Во время второй инкубации конъюгированные вторичные антитела связывались комплексом казеина с первичными антителами на поверхности планшета.

Далее, путем промывки планшета, из лунок удалялись несвязанные молекулы конъюгата.

После промывки планшета в его лунки дозировался раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе третьей инкубации при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образовывались окрашенные продукты реакции. После развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивался в голубой цвет, в лунки добавлялся стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора после добавления стоп-реагента менялся на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре при 450 нм, была обратно пропорциональна концентрации коровьего казеина в исследуемых образцах.

Результат интерпретировался как отрицательный, то есть, исследованная проба не содержала коровьего казеина, при соблюдении следующих условий:

А«,„„{стандарт 1(0%)} > А«он«{проба}> А4м„. {стандарт 2 (0,5%)}

Результат интерпретируется как положительный, то есть, исследованная проба содержала коровий казеин, если:

А45о„м{ проба} < А450нИ{ стандарт 3 (1%)}

Общее время пробоподготовки и анализа занимало 4,5-5 часов.

При определении специфичности и чувствительности выявления

коровьего казеина в молоке, сливках коровы и козы, готовили искусственные

смеси этих объектов в различном процентном соотношении.

Результаты анализа представленные в таблице № 1 показали, что

казеин обнаруживается только в молоке коровы. Реакция наблюдалась и в

разбавленном молоком коровы козьем молоке. Эти данные

свидетельствовали о высокой специфичности метода определения коровьего казеина.

Таблица 1

Результаты определения специфичности метода индикации коровьего казеина в молоке

Исследуемые образцы Процентное соотношение Результаты анализа

Молоко коровье 100 +

Молоко козье 100 -

Молоко коровье : Молоко козье 50 : 50 +

Молоко коровье : Молоко козье 25 : 75 +

( + ) - положительная реакция ( -) - отрицательная реакция

Аналогичные результаты были получены и при определении специфичности тест-системы при анализе сливок.

При определении чувствительности методики молоко козы смешивали с молоком коровы в различных соотношениях и проводили определение коровьего казенна.

Полученные данные показали, что предел чувствительности используемого метода индикации казеина в козьем молоке составляет 0,5%

(таблица 2), аналогичные данные были получены для сырых козьих сливок.

Таблица 2

Результаты определения предела чувствительности метода индикации коровьего казеина в молоке

Исследуемые образцы Процентное соотношение Результаты анализа

Молоко коровье : Молоко козье 50 : 50 +

Молоко коровье : Молоко козье 25 : 75 +

Молоко коровье : Молоко козье 10 : 90 +

Молоко коровье : Молоко козье 5 : 95 +

Молоко коровье : Молоко козье 1 : 99 +

Молоко коровье : Молоко козье 0,5 : 99,5 +

Молоко коровье : Молоко козье 0,4 : 99,6 -

Молоко коровье : Молоко козье 0,1 : 99,9 -

(+) - положительная реакция (-) - отрицательная реакция

Проведенными исследованиями получено экспериментальное обоснование возможности использования тест-системы ИФЛ RIDASCREEN Casein и модифицированной методики ИФА для ускоренного подтверждения подлинности сырых козьих молока и сливок.

2.3.2 Совершенствование методов контроля сальмонелл н энтеротокенна золотистого стафилококка в сыром молоке п сырых сливках на основе нммунохроматографических индикаторных элементов.

В соответствии с требованиями Технического регламента, сырые молоко и сливки не должны содержать патогенных бактерий, в том числе сальмонелл.

Кроме того, молоко должно быть получено от здоровых животных. У больных маститом коров часто в молоке обнаруживаются и золотистый стафилококк и стафилококковый энтеротоксин. Эти показатели подлежат ветеринарно-санитарному контролю со стороны надзорных ветеринарных органов. Своевременное выявление сальмонелл в сыром молоке и сливках представляет существенную ветерннарно-санитарную проблему. Бактериологический метод выявления микроорганизмов, безусловно, надежен и дает однозначные результаты, но и достаточно трудоемок и длителен - его постановка занимает более 72 часов. Ранее было показано эффективное применение иммунохроматографических индикаторных элементов для контроля сальмонелл серогрупп А, В, С, О, Е в некоторых объектах ветеринарного надзора (Артемов А.В.,2012). Нами проведены исследования по адаптации иммунохроматографических индикаторных элементов отечественного производства ГосНИИБП для выявления сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина в сыром молоке и сырых сливках.

ИИХЭ для выявления сальмонелл и энтеротоксина представляет собой сборку из нескольких мембран, встроенных в пластиковую оправу с отверстиями для нанесения образца и визуализации результата. На мембранах иммобилизованы иммуннокомпоненты: коньюгаты поликлональных антител к антигенам сальмонелл или энтеротоксина с нанончастицами коллоидного золота. Сальмонеллы или энтеротоксин, растворенные в буфере для анализа, наносят на ИИХЭ. Они диффундируют по мембране и взаимодействуют с антителами. В результате взаимодействия антигенов с антителами образуются окрашенные полосы, свидетельствующие о наличии сальмонелл или энтеротоксина.

Поскольку контаминация сырого молока и сырых сливок сальмонеллами может быть незначительной, а чувствительность прямого

определения бактерий с помощью ИИХЭ составляет 5x10Л клеток, иммунохроматографию проводили после предварительного обогащения, в соответствии с рекомендациями Шиленко И. В. (Шиленко И.В. и др., 2011).

Образцы молока и сливок искусственно . контаминировали сальмонеллами, отбирали пробы по ГОСТам, проводили обогащение путем подращивания в хлористо-мапшевой среде (37° С, 17-18 ч.) или среде Раппопорта-Василиадиса (41°С, 21 ч) до конечной концентрации 106-107 м.к./мл. В результате дальнейшего иммунохроматографического анализа удавалось выявить до 102... 103 м.к./мл сальмонелл находившихся в исходных растворах. Регистрацию конечного результата проводили как визуально по эффективности окрашивания зон с прореагировшими компонентами, так и с помощью видеоцифрового анализатора рефлектометра «Рефлском» (Россия). Положительным результатом, считали появление в аналитической зоне визуально-различимой окрашенной полосы вишнево-красного цвета, что соответствовало показаниям прибора «Рефлеком» не менее (0,9±0,2) усл.ед., а также появление окрашенной полосы в контрольной зоне. Среднеквадратическое отклонение показаний прибора рефлектометра при 95% доверительной вероятности не превышало 0,2 усл. ед.

Стафилококковый энтеротоксин определяли непосредственно в сыром молоке и сливках, после искусственной контаминации указанной продукции токсином и дальнейшей его очистки 1мМ ацетат-аммонийным буфером, осаждением (8000-10000 об/мин), промывкой ацетоном и растворении в буфере для хроматографии (таблица 3).

Результаты визуального определения наличия сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина в сыром молоке и в сырых сливках с

помощью ИИХЭ

Объект исследования Интенсивность Окрашивания ИИХЭ на сальмонеллы Интенсивность Окрашивания ИИХЭ на стафилококковый энтеротоксин

Сырое молоко от здоровых коров -

Сырые сливки, полученные из молока здоровых коров - -

Сырое молоко от здоровых коров, искусственно контминированное сальмонеллами серогрупп А, В, С, О, Е 10" - 103 м.к./мл +++ -

Сырые сливки, полученные из молока здоровых коров искусственно контминированное сальмонеллами серогрупп А. В. С. П. Е 102 — 1 о3 м у /М1 -

Сырое молоко, контаминированное энтеротоксином золотистого стафилококка в концентрации 1мкг/мл - ++

(-) - в образце отсутствуют искомые антигены

(++) - хорошо заметная окрашенная линия в аналитической зоне;

(+++) - интенсивная окрашенная линия в аналитической зоне.

Анализ конечного результата с помощью рефлектометра «Рефлеком» показал аналогичные результаты по специфичности определения сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина.

Результаты проведенных исследований продемонстрировали возможность ускоренного выявления сальмонелл и стафилококкового энтеротоксина в сыром молоке и в сырых сливках иммунохроматогафическим методом с помощью отечественных ИИХЭ.

2.3.3 Совершенствование метода определения санитарно-показательных микроорганизмов в сыром молоке и сырых сливках на основе ДНК-чинов

В сыром молоке наряду с сальмонеллами опасность могут представлять и другие патогенные и условно патогенные микроорганизмы из рода эшерихий, а также золотистый стафилококк.

Мы провели экспериментальное обоснование возможности использования метода па основе ДНК-чипов (Артемов A.B., 2012) для обнаружения и идентификации указанных возбудителей в сыром молоке и сливках. При этом, с целью повышения чувствительности, несколько модифицировали методику в плане пробоподготовки и проведения анализа.

Пробы молока и сливок искусственно контаминировали эшерихиями, сальмонеллами и золотистым стафилококком в концентрациях 102 - 103 м.к./мл. Аликвоты исследуемых образцов вносили в неселективные жидкие питательные среды и подращивали в течение 8-10 часов. Бактерии осаждали центрифугированием при 5000g. Осадок суспендировали в Трис-ЭДТА буфере содержащем лизоцим, лизостафин и протеназу К. Дальнейшую очистку ДНК проводили с помощью детергента «Silico» и магнитосепарации. Полученную ДНК амплифицировали с неспецифическими гексануклеотидными праймерами и дезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными биотипом. Ампликоны гибридизовали с ДНК-зондами иммобилизованными на чипах из нитрацеллюлозы. В качестве зондов, так же как и в работе Артемова A.B., (Артемов A.B., 2012) использовали специфичные олигонуклеотидные последовательности, предварительно полученные в реакции амплификации с использованием специфичных праймеров: на Staphylococcus aureus: Sa442-1 (5'-ААТ СТТ TGT CGC TAC ACG ATA TTC TTC ACG-3'), позиция с 5 по 34; Sa442-2 (5'-CGT GAG ATT TGA GAT AAT АСА ACA-3'), позиция с 83 по 112. Для индикации Е. coli была выбрана нуклеотидная последовательность fini А структурного гена Escherichia coli, (Lim, et. al., 1998), для сальмонелл выбран ДНК-зонд на

основе stn гена токсинообразования Salmonella typhimurium.

После проведения гибридизации добавляли конъюгат стрептавидинфосфатазу, субстрат и краситель. Результаты определяли по интенсивности окрашивания точек с гибридными молекулами (таблица 4).

Приведенные в таблице 4 данные свидетельствовали о возможности использования разработанной модифицированной методики на основе ДНК-чипов для идентификации санитарно-показательных бактерий в сыром молоке. Положительная реакция наблюдалась только в гомологичных системах (матричная ДНК и ДНК-зонд из одного и того же микроорганизма). Кроме того, искомые бактерии определялись в смеси с другими микроорганизмами, что указывало на высокую специфичность реакции.

Таблица 4

Результаты идентификации санитарно-показательных бактерий в сыром молоке с применением ДНК- чипов

Сырое молоко, искусственно контаминированое: Результаты окрашивания гибридных молекул с ДНК-зондами на:

Е. coli Salmonella typhimurium Staphilococcus aureus

Е. coli, К-12 ++++ - -

Salmonella typhimurium 04 4836 - ++++ -

Staphilococcus aureus - - ++++

Bac.subtilis 168 - - _

E. coli + Staphilococcus. aureus (1:1) ++++ - ++++

Salmonella typhimurium + E. coli (1:1) " ++++ ++++ -

E. coli + Staphilococcus. aureus + Salmonella typhimurium (1:1:1) ++++ ++++ ++++ і

(++++) - максимальная степень окрашивания гибридных молекул ( -) - отсутствие окрашивания

Аналогичные результаты были получены и для сливок.

2.3.4 Совершенствование определения остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сырых молоке и сливках на основе нммуномикрочиповой технологии

В молочном животноводстве антимикробные препараты широко применяются в качестве лечебно-профилактических средств, а также с целью стимуляции роста и повышения эффективности откорма скота. К таким препаратам относятся антибиотики и сульфаниламиды. Несоблюдение условий введения лекарственных средств приводит к накоплению их в молочных продуктах. Остаточные количества антимикробных веществ, находящихся в этих продуктах, могут попадать в организм человека и приводить к негативным последствиям.

В Техническом регламенте на молоко и молочную продукцию в сыром молоке и сырых сливках нормировано содержание антибиотиков тетрациклиновй группы, стрептомицина, левомицетина и пенициллина.

Содержание антимикробных препаратов регламентируется рекомендацией ФАО-ВОЗ. Контроль остаточных количеств указанных препаратов в сырье и продукции животноводства проводится в рамках Государственного пищевого мониторинга в соответствии приказами Роосельхознадзора.

Применение существующих методов ветеринарно-санитарной оценки по выявлению остаточных количеств антимикробных препаратов в молочных продуктах способствуют обеспечению безопасности продуктов питания.

Традиционно-используемый микробиологический метод основан на оценке биологического действия антибиотиков на чувствительные штаммы микроорганизмов. Однако, он имеет ряд недостатков, такие как: длительность и трудоемкость анализа (Кальницкая О.И. 2005,2009).

Совершенствование методов ветеринарно-санитарной оценки сырых молока и сливок на определение остаточных количеств антибактериальных препаратов мы проводили на основе иммуномикрочиповой технологии.

На сегодняшний день, иммуномикрочиповая технология является инновационным методом контроля остаточных количеств антимикробных препаратов в продуктах питания. Она основывается на иммунологической реакции антиген-антитело (АГ-АТ), происходящей на биочипе. Биочип представляет собой керамическую матрицу, на которой происходит указанная реакция, а так же регистрация конечного результата с помощью хемилюминесценции.

В своих исследованиях, для определения остаточных количеств сульфаниламидов и антибиотиков в сырых молоке и сливках, мы применяли тест-системы Evidence investigator Anti Microbial Array и сканирующий хемилюминометр фирмы RANDOX, Великобритания. Методика основана на конкурентном хемилюминесцентном иммуноанализе. Повышение концентрации антимикробных препаратов в образце приводит к уменьшению их связывания с антителами, при этом наблюдается снижение интенсивности хемилюминесценции.

В данных исследованиях, мы использовали аналогичные схемы пробоподготовки, указанные в ранее проведенных работах Яровой O.A. для меда (Ярова O.A. и др., 2010), однако объектами исследования служили искусственно контаминированные сульфаниламидами и антибиотиками образцы сырых молока и сливок. Пробы отбирали согласно ГОСТам. Были происследованы, как искусственно контаминированные образцы сырых молока и сливок, а так же образцы молочной продукции, взятые из оборота торговой сети.

Световой сигнал из каждой зоны биочипа регистрировался хемилюминометром и сравнивался с полученной калибровочной кривой, позволяя проводить количественную оценку.

Наличие антимикробных веществ в объектах исследования определяли по следующей схеме: отбор проб; добавление буфера; иммобилизация на иммуночип; термостатируемое встряхивание; добавление коньюгата; пятикратная промывка; добавление сигнального реагента; считывание

результата и обработка результатов. Время пробоподготовки и анализа занимало 1 - 2 часа.

Полученные данные обрабатывались автоматически при помощи соответствующего программного обеспечения.

Результаты исследований показали, что в контаминированнх продуктах мы обнаруживали практически все внесенные количества антимикробных препаратов (таблицы 5,6).

Таблица 5

Результаты исследования образцов коровьих сырых молока и сливок, контаминированных сульфаниламидами

Исследу емые образцы Внесенный сульфаниламид

сульфадиметоксин сульфадимезин сульфаметокси пиридазин

Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг

сырые молоко 2,7±0,005 2, 697 ±0,006 111,97± 0,08 110, 889± 0,09 9,00±0,02 8, 879± 0,002

сырые сливки 2,5± 0,004 2,499± 0,005 100,00± 0,07 98,9± 0,01 7,00±0,03 6,98±0,01

Результаты исследования образцов коровьих сырых молока и сливок, контаминированных антибиотиками

Исследуемые образцы Внесенный антибиотик

стрептомицин цефоперазон (медоцеф) цефтриаксон (лендацин)

Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг Внесенное количество, мкг/кг Выявленное количество, мкг/кг

сырые молоко 230,0± 0,2 229,861 ± 0,08 350,0± 0,09 349,751± 0,2 13± 0,004 12,899± 0,005

сырые сливки 218,1± 0,09 217,9± 0,07 390,0± 0,1 388, 99± 0,09 8,0± 0,003 7,989± 0,006

При исследовании сырого молока и сырых сливок, взятых из личных подворий и фермерских хозяйств, а также из оборота торговой сети, были обнаружены незначительные количества антибактериальных веществ, однако их содержание не превышало предельно допустимых норм (таблица 7).

Проведенными исследованиям было получено экспериментальное подтверждение возможности использования иммуномикрочиповой технологии с тест-системами фирмы ИАМООХ, Великобритания для определения остаточных количеств антимикробных веществ в сыром молоке сырых сливках.

Результаты исследований образцов сырого молока и сырых сливок,

взятых из личных подворий и фермерских хозяйств, __а также из оборота торговой сети_

№ п/п Сульфаниламиды Содержание препарата в пробах А» (мг/кг)

молоко сырое сливки сырые

1 Сульфадиазин (SZ) 0 0

2 Суфадимстоксин (SDM) 0 0

3 Сульфахиноксалин (SQ) 0,0008± 0,00002 0,0004± 0,00001

4 Сульфаметазин (SMT) 0,0004± 0,00004 0

5 Сульфатиазол (ST) 0,0002± 0,00001 0,0002± 0,00001

6 Сульфизоксазол (SS) 0,0008± 0,00003 0

7 Сульфапиридин (SP) 0 0

8 Сульфамеразин (SM) 0,0008± 0,00002 0,0004± 0,00001

Сульфа-

метоксипиридазин (SMP) 0,0018± 0,00006 0

10 Сульфа-хлорпиридазин (SCP) 0,0006± 0,00002 0

11 Сульфаметизол (SMZ) 0,0008± 0,00003 0

12 Сульфадоксин(SD) 0 0

ПДК (MRL) препаратов составляет 0,1 (мг/кг).

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальное обоснование пригодности современных, ускоренных методов и тест-систем ДНК-иммунодиагностики (ИФА, иммунохроматографии, иммуномикрочиповой технологии, ДНК-чипов) для контроля качества и безопасности сырого молока и сырых сливок позволило усовершенствовать ветеринарно-санитарную оценку указанных объектов технического регулирования.

2. На основе модифицированной методики ИФА и тест-системы ИФА RIDASCREEN Casein показана возможность подтверждения подлинности

сырых козьих молока и сливок, а также, выявления фальсификаций этой продукции, с чувствительностью 0,5%.

3. Экспериментально обоснована возможность определения сальмонелл и энтеротоксина золотистого стафилококка в сыром молоке и сырых сливках на основе методики иммунохроматографии с применением отечественных иммунохроматографических индикаторных элементов, при этом для индикации энтеротоксина была разработана модифицированная методика пробоподготовки.

4. Разработанная модифицированная методика на основе ДНК - чипов позволяла проводить определение единичных клеток санитарно-показательных бактерий (Е. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium) в сыром молоке и сырых сливках с высокой специфичностью, в присутствии сопутствующей микрофлоры.

5. Экспериментально обосновано применение иммуномикрочиповой технологии с хемилюминисцентной детекцией и тест-систем фирмы RANDOX, Великобритания для одновременного высокоточного дифференциального определения остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке в концентрациях: (стрептомицин-229,861 мкг/кг; цефоперазон-349,751 мкг/кг; цефтриаксон-12,899 мкг/кг; сульфадиметоксин-2,697 мкг/кг; сульфадимезин-110,889 мкг/кг; сульфаметоксипиридазин-8, 879 мкг/кг) в сырых сливках (стрептомицин -217,9 мкг/кг; цефоперазон - 388, 99 мкг/кг; цефтриаксон - 7,989 мкг/кг; сульфадиметоксин - 2,499 мкг/кг; сульфадимезин - 98,9 мкг/кг; сульфаметоксипиридазин - 6,98 мкг/кг) соответственно.

6. Обнаруженные при исследованиях образцов сырого молока и сырых сливок, взятых из личных подворий и фермерских хозяйств, а также из оборота торговой сети, в отдельных пробах были обнаружены сульфаниламиды в концентрациях от 0,0002 до 0,0008 мкг/кг, не превышающих предельно допустимых норм - 0,1 мкг/ кг.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Методическое пособие по определению антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках с применением иммуномикрочиповой технологии, утвержденные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

КЧубарова Е.А., Кальницкая О.И., Пульчева И. А. /Повышение эффективности контроля биологической безопасности молока и молочных продуктов на основе использования современных технологий // РЖ «Проблемы ветеринарной санитарии гигиены и экологии» 2011, №2 (6),

2.Пульчева И.А. /Определение антимикробных веществ в молоке и молочной продукции с помощью иммуномикрочипового анализа // Материалы 10 международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 2012,

3.Пульчева И.А. /Контроль остаточных количеств антимикробных веществ в молоке и молочной продукции с применением иммуномикрочиповой технологии // «Веткорм», 2013, №2, с.28-29.

с.16-17.

с.189-191.

Подписано в печать 30.10.13 г. Усл.печ.л.1.0. тираж 80 экз., заказ 445/1 ГНУ ВНИИВСГЭ 123022, Москва, Звенигородское ш., д.5.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Пульчева, Ирина Алексеевна, Москва

На правах рукописи

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ, ГИГИЕНЫ И ЭКОЛОГИИ

04201450426

Пульчева Ирина Алексеевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЕТЕРИНАРНО -САНИТАРНОЙ ОЦЕНКИ СЫРОГО МОЛОКА И СЫРЫХ СЛИВОК

06.02.05 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель кандидат ветеринарных наук доцент Шурдуба H.A.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................4

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ ..............................................................................8

1.1. Критерии безопасности и качества сырого молока и сырых сливок.........................................................................................8

1.2. Методы ДНК-иммунодиагностики и их использование для определения безопасности и качества сырья продукции животноводства...........................................................................27

2. СОБСТВЕННЫЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................36

2.1. Цель и задачи исследований ........................................36

2.2. Материалы и методы исследований ....................................................36

2.2.1.Методика подтверждения подлинности и выявления фальсификаций козьего молока и сливок на основе иммуноферментного анализа.......................................................................................37

2.2.2.Методика определения сальмонелл бактериологическим методом......................................................................................39

2.2.3.Методика определения сальмонелл в сыром молоке и сырых сливках с применением иммунохроматографических тест- систем.......40

2.2.4.Методика определения стафилоккового энтеротоксина с применением иммунохроматографических тест- систем......................41

2.2.5.Методика определения микроорганизмов в сыром молоке и сырых сливках на основе ДНК-чипов........................................................42

2.2.6.Методика выявления антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках на основе иммуномикрочиповой технологии.................................................................................47

2.2.7. Статистическая обработка результатов ...............................48

2.3. Результаты исследованиий........................................................................48

2.3.1. Адаптация модифицированной методики ИФА с тест-системой

и , I ,1 , ' < ' , , . »1 I 1 ( »

«ИФА RIDASCREEN Casein» для выявления казеина в козьих сыром молоке и сливках для подтверждения их подлинности и выявления фальсификаций............................................................................48

2.3.2.Совершенствование методов контроля сальмонелл и энтеротоксина золотистого стафилококка в сыром молоке и сырых сливок на основе иммунохроматографических индикаторных элементов .......................54

2.3.3. Совершенствование метода определения санитарно-показательных микроорганизмов в сыром молоке и сырых сливках на основе ДНК-чипов.........................................................................................67

2.3.4. Совершенствование определения остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках на

основне иммуномикрочиповой технологии......................................71

З.ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................77

ВЫВОДЫ.............................................................................................................89

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.............................................................91

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...........................................................................92

ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................................................................111

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Вопросы совершенствования ветеринарно-санитарного контроля безопасности и качества продукции животного происхождения являются весьма актуальными в свете проходящего в нашей стране процесса Технического регулирования и интеграции России в мировую экономику (Романенко Г. А., 2005; Алексеева Е.Ю., Посконная Т.Ф., 2004, Версан В.Г., 2003).

Сырое молоко и сырые сливки в соответствии с Федеральным законом, Техническим регламентом на молоко и молочную продукцию входят в число объектов технического регулирования этой продукции. Все процессы, применяемые при производстве сырого молока, условия содержания, кормления, доения сельскохозяйственных животных, условия сбора, охлаждения, хранения сырого молока, сырого обезжиренного молока, сырых сливок должны соответствовать требованиям ветеринарного законодательства Российской Федерации.

Сырое молоко должно быть получено от здоровых сельскохозяйственных животных на территории, благополучной в отношении инфекционных и других общих для человека и животных заболеваний.

Обладая высокой питательной ценностью, сырое молоко и сырые сливки являются скоропортящимися продуктами. Для эффективного хранения, перевозки и реализации необходимо принимать меры по обеспечению безопасности и сохранения качества данной сельскохозяйственной продукции. Среди этих мер немаловажное значение принадлежит контролю качества и безопасности. Это актуально для служб ветеринарного надзора, для фермерских хозяйств (Фомичев Ю.П.,2004), а также для предприятий по переработке указанного сырья.

Весьма важным при оценке качества является подтверждение подлинности продукции и выявление возможных фальсификаций. На

безопасность молока и молочной продукции могут влиять различные загрязнители: микробные контаминации, токсины, остаточные количества антибиотиков и сульфаниламидов и др. Для определения этих показателей в скрининговых или арбитражных исследованиях необходимо использование ускоренных способов контроля, а также автоматизированных чувствительных методов и тест-систем гармонизированных с международными стандартами (Светличкин В.В., 2000; Смирнов A.M. и др., 2003).

В этом направлении эффективными, специфичными и чувствительными для контроля различных показателей безопасности и качества сырья и продукции животного происхождения зарекомендовали себя методы ДНК-иммунодиагностики (Самуйленко А.Я. и др., 1999; Родин В.И., 2000; Буркин A.A., Кононенко Г.П, 2003; Светличкин В.В. и др., 2010; Бабунова B.C. и др., 2011).

Однако, актуальным остается адаптация известных методик и тест-систем для оценки безопасности и качества сырого молока и сырых сливок, а также разработка и совершенствование новых методов для указанных объектов ветеринарного надзора. Цель исследования

Целью настоящей работы являлось - совершенствование методов ветеринарно-санитарной оценки сырого молока и сырых сливок. В задачи исследования входило:

- усовершенствовать определение подлинности сырых козьих молока и сливок на основе методики иммуноферментного анализа при адаптации тест-системы ИФА RIDASCREEN Casein к указанным объектам технического регулирования;

экспериментально обосновать возможность применения иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) отечественного производства для ускоренного контроля сальмонелл и энтеротоксина золотистого стафилококка в сыром молоке и сырых сливках;

- усовершенствовать контроль санитарно-показательных микроорганизмов в сыром молоке и сырых сливках на основе ДНК-чипов;

- усовершенствовать определение остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сырых молоке и сливках на основе иммуномикрочиповой технологии;

- провести исследования по определению сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках, взятых из личных подворий и фермерских хозяйств, а также из оборота торговой сети.

Основные положения, выносимые на защиту 1. адаптация модифицированной методики ИФА с тест-системой «ИФА RIDASCREEN Casein» для выявления казеина в козьих сыром молоке и сливках для подтверждения их подлинности и выявления фальсификаций; 2.экспериментальное обоснование возможности применения иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ) отечественного производства ГосНИИБП для определения в сыром молоке и сырых сливках сальмонелл различных серогрупп и стафилококкового энтеротоксина;

3. разработка и апробация модифицированной методики на основе ДНК-чипов для идентификации санитарно-показательных бактерий в сыром молоке и в сырых сливках;

4. экспериментальное обоснование определения остаточных количеств антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках на основе иммуномикрочиповой технологии.

Научная новизна

Экспериментально обоснована возможность применения модифицированной методики ИФА с тест-системой «ИФА RIDASCREEN Casein» для выявления казеина в козьих сыром молоке и сливках для подтверждения их подлинности и выявления фальсификаций.

Экспериментально обоснована возможность применения иммунохроматографических индикаторных элементов (ИИХЭ)

отечественного производства ГосНИИБП для определения в сыром молоке и сырых сливках сальмонелл различных серогрупп и стафилококкового энтеротоксина, для последнего разработана модифицированная методика пробоподготовки.

Разработана модифицированная методика на основе ДНК-чипов и показана возможность ее применения для идентификации санитарно-показательных бактерий в сыром молоке и в сырых сливках.

Экспериментально обоснована возможность применения иммуномикрочиповой технологии для одновременного

дифференцированного определения остаточных количеств антибиотиков (стрептомицина, цефоперазона, цефтриаксона) и сульфаниламидов (сульфадиметоксина, сульфадимезина, сульфаметоксипиридазина) в сыром молоке и сырых сливках. Установлена чувствительность определения.

При исследовании взятой из оборота молочной продукции, выявили наличие определяемых антимикробных веществ, в концентрациях не превышающих нормативные показатели.

Практическая ценность

На основании результатов исследований разработано методическое пособие по определению антибиотиков и сульфаниламидов в сыром молоке и сырых сливках с применением иммуномикрочиповой технологии, утвержденные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

- на международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» МГУПП, Москва 2012 г.

- на расширенном совещании сотрудников лабораторий ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии (2013 г.).

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Критерии безопасности и качества сырого молока и сырых сливок.

Обеспечение безопасности и качества молока и молочной продукции всегда являлись актуальной проблемой сельского хозйства и перерабатывающих отраслей и весьма важная роль в этом принадлежала ветеринарно- санитарным аспектам [10,33-35,44,57,63,64,71,72,74,97].

Вопросы оценки безопасности и качества продукции получили свое развитие в связи проходящей в нашей стране реформой технического регулирования, а также в связи с вступлением России в ВТО. Государства, являющиеся членми ВТО подписали ряд документов, которые регламентируют правила обеспечения безопасности продукции. К ним относятся «Соглашение по применению санитарных и фитосанитарных мер» (СФС) и «Соглашение по техническим барьерам и торговле» (ТБТ). В этих документах признается важный вклад международных стандартов и систем оценки соответствия качества для повышения эффективности производства и ведения международной торговли. Вопросы обеспечения и качества продукции рассматриваются во многих работах и документах [2,14,24,43,54,59,61,62,68,70,73,80,81].

В соответствии с Федеральным законом, Техническим регламентом на молоко и молочную продукцию в число объектов технического регулирования этой продукции входят сырое молоко и сырые сливки[80]. В этом регламенте даны формулировки объектам технического регулирования. В частности, молоко это продукт нормальной физиологической секреции молочных желез сельскохозяйственных животных, полученный от одного или нескольких животных в период лактации при одном и более доении, без каких-либо добавлений к этому продукту или извлечений каких-либо веществ из него[80].

Сырое молоко - молоко, не подвергавшееся термической обработке при температуре более чем 40 градусов Цельсия или обработке, в результате которой изменяются его составные части[80].

Сливки - молочный продукт, который произведен из молока и молочных продуктов, представляет собой эмульсию жира и молочной плазмы и массовая доля жира в котором составляет не менее чем 9 процентов[80].

Сырые сливки - сливки, не подвергавшиеся термической обработке при температуре более чем 45 градусов Цельсия[80].

Условия получения от сельскохозяйственных животных молока, все процессы перевозки, реализации и утилизации сырого молока, сырого обезжиренного молока и сырых сливок, молочных продуктов непромышленного производства должны соответствовать требованиям законодательства Российской Федерации [80].

Сырое молоко должно быть получено от здоровых коров и других сельскохозяйственных животных на территории, благополучной в отношении инфекционных и других общих для человека и животных заболеваний. Эти требования научно обоснованы россйскими учеными [35,44,71] и гармонизированы с международными требованиями [22, 47,67].

Не допускается использование в пищу сырого молока, полученного в течение первых семи дней после дня отела животных и в течение пяти дней до дня их запуска (перед их отелом) и от больных животных и находящихся на карантине животных[71,80].

Изготовитель должен обеспечивать безопасность сырого молока и не допускать в нем содержания остаточных количеств ингибирующих, моющих, дезинфицирующих и нейтрализующих веществ, стимуляторов роста животных (в том числе гормональных препаратов), лекарственных средств (в том числе антибиотиков), применяемых в животноводстве в целях откорма, лечения скота и (или) профилактики его заболеваний [72,80].

Молоко, получаемое от разных видов сельскохозяйственных животных, за исключением коровьего молока, должно соответствовать показателям, установленным стандартами, нормативными документами федеральных органов исполнительной власти. Показатели качества должны

также соответствовать нормативным требованиям. Массовая доля сухих обезжиренных веществ в коровьем сыром молоке должна составлять не менее чем 8,2 процента. Плотность коровьего молока, массовая доля жира в котором составляет 3,5 процента, должна быть не менее чем 1027 килограммов на кубический метр при температуре 20 градусов Цельсия или не менее чем эквивалентное значение для молока, массовая доля жира в котором другая[80].

К сырому молоку, используемому для производства пищевых продуктов с определенными потребительскими свойствами, могут предъявляться следующие дополнительные требования:

-сырое молоко сельскохозяйственных животных, предназначенное для производства продуктов детского питания на молочной основе, должно соответствовать определенным требованиям [10,67, 80]:

- показатель чистоты должен быть не ниже первой группы, показатель термоустойчивости по алкогольной пробе должен быть не ниже третьей группы в соответствии с требованиями национального стандарта[80];

- количество колоний мезофильных аэробных микроорганизмов и факультативно анаэробных микроорганизмов не должно превышать допустимый уровень, установленный для сырого молока высшего сорта и сырого молока первого сорта[80];

- количество соматических клеток не должно превышать допустимый уровень, установленный для сырого молока высшего сорта [80];

- хранение и перевозка сырого молока, предназначенного для производства продуктов детского питания на молочной основе, осуществляются в отдельных емкостях с соблюдением ветеринарно-санитарных требований[80];

- использование сырого молока, показатели идентификации которого не соответствуют, виду сельскохозяйственных животных, от которых получено молоко, и (или) показатели безопасности которого не соответствуют требованиям Федерального закона, не допускается[80].

и

Важным является соблюдение требований для молока, которое в дальнейшем будет использоваться как сырье для получения продукции.

Сырое коровье молоко, предназначенное для производства молока стерилизованного, в том числе молока концентрированного или молока сгущенного, должно соответствовать таким требованиям, как показатель термоустойчивости по алкогольной пробе не ниже третьей группы, как это указано в национальном стандарте[80].

Сырое коровье молоко, предназначенное для производства сыра, должно отвечать следующим требованиям[80]:

-сычужно-бродильная проба -1 и II классов;

- уровень бактериальной обсемененности по редуктазной пробе I и II классов в соответствии с требованиями национального стандарта, количество колоний мезофильных аэробных микроорганизмов и факультативно анаэробных микроорганизмов должно составлять не более чем 1*106 колониеобразующих единиц в кубическом сантиметре;

Количество спор мезофильных анаэробных лактатсбраживающих маслянокислых микроорганизмов составляет для:

сыров с низкой температурой второго нагревания не более чем 13000 спор в кубическом дециметре;

сыров с высокой температурой второго нагревания не �