Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики

Панюшкин, Александр Игоревич

Автореферат диссертации по теме "Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики"

0И46

¿И70

На правах рукописи

Панюшкин Александр Игоревич

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГМО В СЫРЬЕ, ПРОДУКТАХ И КОРМАХ НА ОСНОВЕ ДНК- И ИММУНОДИАГНОСТИКИ

06.02.05 - Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 3 НОЯ 2010

Москва-2010 г.

004613096

Работа выполнена на кафедре «Товароведение и безопасность сырья и продуктов биотехнологии» ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (МГУПБ).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Светличкин Вячеслав Владимирович (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, доцент Кальницкая Оксана Ивановна (ГОУ ВПО МГУПБ)

доктор ветеринарных наук, профессор Белоусов Василий Иванович (ФГУ ЦНМВЛ)

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится « 26 »ноября 2010 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.149.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» и на веб сайте www msaab. ru

Автореферат разослан «. dl » IЦ 2010 г.

Ученый секретарь, кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

С помощью генной инженерии получены различные трансгенные растения (соя, кукуруза, картофель, хлопчатник, сахарная свекла) с устойчивостью к вирусам, колорадскому жуку и другим насекомым, а также к пестицидам. Производство и оборот трансгенной продукции увеличивается в мире год от года (Дубцова Г.Н. и др., 2003; Мошенский A.A. и др., 2003; Нечаев А.П., 2003; Рогов И.А., 2003; Монастырский O.A., 2004). В настоящее время определенная часть находящихся в обороте в России продуктов и кормов содержат компоненты из генномодифицированных источников (ГМИ). Так как замена трансгенными компонентами белков животных и растений -весьма выгодный бизнес, трансгенные белки постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания и кормах биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур.

Мнения ученых о безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) расходятся. Одни исследователи считают, что генномодифицированный организм безвреден, по мнению других, он является источником биологических и экологических рисков для человека, животных и окружающей среды (Baker В., 1999). Эти риски могут быть связаны как с плейотропным эффектом трансгенного белка, так и со свойствами самой встроенной конструкции, в том числе с регуляторным действием на соседние гены. Введение в пищевую цепочку человека или животных трансгенных структур может привести к непредсказуемому воздействию на их здоровье. В ГМО вместе с целевыми генами могут интегрироваться и другие фрагменты ДНК, несущие гены с нежелательными признаками, например, гены, кодирующие токсины или устойчивость к антибиотикам.

В различных странах, включая Россию, создание, производство, реализация продукции, содержащей трансгенные компоненты, подлежит государственному регулированию. Содержание трансгенных конструкций в продуктах и кормах в соответствии с указаниями Роспотребнадзора и

Россельхознадзора должно быть продекларировано. В соответствии с приказом Минсельхоза Российской Федерации в нашей стране проводится Государственный ветеринарный лабораторный мониторинг остатков запрещенных и вредных веществ в организме животных, продуктах животного происхождения и кормах. В перечень показателей безопасности входят ГМО, которые определяются в сырых и термически обработанных пищевых продуктах животного происхождения, а также в кормах и кормовых добавках.

В системе лабораторного контроля трансгенных продуктов можно выделить два направления. Это методы ДНК-диагностики и методы обнаружения трансгенных белков на основе иммунодиагностики. На основе ДНК-диагностики (ПЦР, ПЦР в режиме «реального времени») определяют как конкретные встроенные гены, так и регуляторные участки ДНК векторных конструкций (35S - промотор, NOS - терминатор). Иммунологические методы позволяют определять непосредственно трансгенные белки. Они основаны на образовании устойчивого комплекса молекулы трансгенного белка (антигена) со специфичными к нему антителами.

В связи с изложенным, весьма важным является разработка и создание высоко эффективных методик для определения трансгенных компонентов в продуктах и кормах. Несмотря на достигнутые в этом направлении значительные успехи, актуальным представляется совершенствование методов в плане экспрессности, оптимизации пробоподготовки, валидации к конкретным объектам и приборам, а также апробация различных модификаций и определение их места в системе скринингового или количественного анализа в соответствии с задачами ветеринарно-санитарного мониторинга продуктов и кормов.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлись разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики.

В задачи исследований входило:

- совершенствование определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе метода иммунохроматографии;

- валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения;

- совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией;

- разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов;

- количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени»;

- проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики.

Научная новизна

Проведены исследования по усовершенствованию методов определения ГМО в сырье, продукции и кормах, с использованием комплекса методов ДНК- и иммунодиагностики.

Проведены исследования по апробации иммунохроматографических тест-систем для определения трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым в растительном сырье, зеленых кормах, в зернофураже. Определены чувствительность и специфичность метода и тест-систем для указанных объектов.

Осуществлена валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в нетермообработанных продуктах и кормах, включающих

компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Определены чувствительность и специфичность вапидированной методики.

На основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией усовершенствована методика выявления ГМО в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах. Определены чувствительность и специфичность модифицированной методики.

Разработана модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов. Определены чувствительность и специфичность методики.

Получены данные мониторинговых исследований по определению содержания ГМО в сырье продуктах питания и кормах и проанализировано соответствие исследуемых проб нормативной документации.

Практическая значимость

На основании результатов исследований для практического использования разработаны:

-Методические рекомендации «Использование

иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)

- Национальный стандарт (проект) «Растительная продукция. Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены

на:

- VII Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения». Москва, МГУПБ, 2008 г.

- Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии». Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008 г.

Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания». Москва, МГУПБ, 2009 г.

Международной выставке «Научно-техническое творчество молодежи (НТТМ)», 2008 г. на ВВЦ. Работа «Совершенствование методов определения ГМО на основе иммунохроматографии», представленная на ВВЦ, была отмечена почетной грамотой.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Совершенствование определения трансгенных белков на основе иммунохроматографии в растительном сырье, зеленых кормах, зернофураже.

2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

3. Разработка модифицированной методики определения ГМО в продуктах и кормах на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией.

4. Разработка модифицированной методики определения ГМО с использованием ДНК-чипов.

5. Количественный анализ содержания ГМО в продуктах и кормах на основе ПЦР в режиме «реального времени».

6. Сравнительный анализ различных методов ДНК- и иммунодиагностики для качественного и количественного определения ГМО при проведении мониторинговых исследований продуктов и кормов.

Публикации Результаты исследований отражены в 7 научных статьях, из них две - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 14 рисунков. Список литературы включает 159 источников отечественных и зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа проводилась на кафедре «Товароведение и безопасность сырья и продуктов биотехнологии» МГУПБ, в Государственном научном учреждении ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, в центральной ветеринарной лаборатории города Москвы, в лаборатории «Соэкс-тест», ООО «Союзэкспертиза» Торгово-промышленной палаты.

Для исследований использовали синтезированные праймеры и зонды, а также готовые тест-наборы на основе ПЦР производства России, предоставленные фирмой ЗАО "Синтол", тест-наборы серии SureFood на основе ПЦР и ИФА производства Германии.

В работе использовались иммунохроматографические тест-системы «AgraStrip GMO RR» фирмы Romer Labs США для определения ГМО с трансгенными белками с устойчивостью к гербицидам и насекомым «Раундап»®. Исследования проводились на приборах отечественного ("Терцик" ДНК-технологии) и зарубежного производства ("ICycler", Bio-Rad, "ABl Prism 7000", Applied Biosystems)

Для обнаружения ГМО использовали не менее 5 повторностей проб. Отбор проб проводили по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.077, 27668-88, 26312.1-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 2914291, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка методов определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе иммунохроматографии

На первом этапе мы проводили исследования по определению трансгенных белков в растительном сырье и кормах на основе иммунохроматографии с тест-полосками «AgraStrip GMO RR» фирмы Romer Labs США.

Конструкция тест-полоски представляет собой мембрану, на которой иммобилизованы моноклональные антитела, соответствующие трансгенным белкам. Внизу подложки располагается зона с наночастицами коллоидного золота. После диффузии белков-антигенов с коллоидным золотом, в случае специфичного взаимодействия антигенов и антител, образуется окрашенный золотом конъюгат, что указывает на присутствие искомых белков, (рис. 1)

Отрицательный результат: трансгенный белок отсутствует или его уровень ннже предела обнаружения

1 шшаадря и i ►

Положительный результат: уровень содержания трансгенного белка больше, чем нижний предел обнаружения

—»■» | Д-......"".....'If'TITIi! 1 j J 1 p>

-to

Рис. 1. Результаты иммунохроматографического определения трансгенных белков.

В своих опытах мы использовали тест-системы для обнаружения трансгенных белков с устойчивостью к гербицидам и насекомым.

Методика определения ГМО включала: отбор проб образца, гомогенизирование, экстракцию белков, осаждение крупных частиц и контактирование тест-полоски с экстрактом трансгенных белков, (рис. 2)

Проба

I

Гомогенизирование проб

I

Элюирование трансгенных белков буфером 1

Осаждение крупных частиц центрифугированием при 500е

1

Иммунохроматографический анализ супернатанта

Рис.2. Схема определения ГМО на основе иммунохроматографии.

Методика и иммунохроматографические тест-полоски для определения различных белков были апробированы на растительном сырье, зеленых кормах и зернофураже. Для определения чувствительности метода составляли искусственные смеси из трансгенного и нетрансгенного зерна, проводили экстракцию и определение белков с помощью иммунохроматографических тест-полосок. Как показали исследования, метод и тест-системы позволяли обнаруживать до 0,5 % примесей ГМО (табл. 1). Время анализа, включая пробоподготовку, составляло не более одного часа.

Таблица 1

Определение трансгенных белков в растительном сырье и кормах

Испытуемые образцы Обнаруживаемый трансгенный белок

СР4ЕР5Р5 ВьСгу 1АЬ/1Ас ВКГгу 1Р БИ-Сгу 9С

Трансгенное зерно линии 1ЧК603 + - - -

Трансгенная соя линии МОЫ88913 - + - -

Трансгенное зерно линии РА5-0625-8 - - + -

Трансгенное зерно линии АС8-Ш004-3 - - - +

Трансгенное зерно 50% -нетрансгенное зерно 50% + - - -

Трансгенное зерно 40 % -нетрансгенное зерно 60 % + + - -

Трансгенное зерно 30 % -нетрансгенное зерно 70 % + + - -

Трансгенное зерно 20 % -нетрансгенное зерно 80 % + + - -

Трансгенное зерно 10%-нетрансгенное зерно 90 % + + - -

Трансгенное зерно 5% -нетрансгенное зерно 95% + + - -

Трансгенное зерно 1 % -нетрансгенное зерно 99% + - - -

Трансгенное зерно 0,5% -нетрансгенное зерно 99,5% + - - -

Трансгенное зерно 0,1% -нетрансгенное зерно 99,9% - - - -

Зернофураж с искусственно добавленной примесью трансгенного зерна кукурузы линии ЫК-603 +

Комбикорм с искусственно добавленной примесью трансгенной кукурузы линии Ж-603 +

+ положительная реакция иммунохроматографии; - отрицательная реакция иммунохроматографии Р < 0,02

2.2.2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения

На следующем этапе нами была вапидирована методика определения ГМО с указанными тест-системами для продуктов и кормов, включающих компоненты животного и растительного происхождения. Схема определения представлена на рисунке 3. Она включает те же этапы пробоподготовки, а также процедуру дополнительной очистки путем центрифугирования при 5000§.

Проба

I

Гомогенизирование проб

Элюирование трансгенных белков буфером 1

Осаждение крупных частиц центрифугированием при 500е

1

Супернатант 1

Отделение фракции жиров центрифугированием при 5000е

1

Иммунохроматографический анализ нижней фракции супернатанта

Рис.3. Схема модифицированной методики определения трансгенных белков на основе иммунохроматографии для продукции и кормов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

Разработанная модифицированная методика давала возможность определять трансгенные белки в смешанных фаршах, содержащих трансгенные растительные компоненты (табл. 2).

Чувствительность модифицированной методики позволяла определять до 0,5 % примеси трансгенных белков (табл. 3).

Таблица 2

Определение трансгенных белков с помощью модифицированной иммунохроматографической методики

№ п/п Испытуемые образцы Обнаруживаемый трансгенный белок

CP4EPSPS Bt-Cry 1АЬ/1Ас

1 Фарш говядина + трансгенная соя линии GTS 40-3-2 с устойчивостью к гербецидам (1:1) + -

2 Фарш говядина + трансгенный картофель с устойчивостью к колорадскому жуку (1:1) - +

3 Фарш свинина + трансгенная соя линии GTS 40-3-2 с устойчивостью к гербецидам (1:1) + -

4 Фарш свинина + трансгенный картофель с устойчивостью к колорадскому жуку (1:1) - +

5 Фарш мясо кур + трансгенная соя линии GTS 40-3-2 с устойчивостью к гербецидам (1:1) + -

6 Фарш мясо кур + трансгенный картофель с устойчивостью к колорадскому жуку (1:1) - +

+ положительная реакция иммунохроматографии; - отрицательная реакция иммунохроматографии.

Таблица 3

Чувствительность модифицированной иммунохроматографической методики

определения трансгенных белков

№ п/п Испытуемые образцы Обнаруживаемый трансгенный белок СР4ЕР5Р5

1 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 50%-говядина 50% +

2 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 40%- говядина 60% +

3 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 30 % - говядина 70 % +

4 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 20 % - говядина 80 % +

5 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 10 % - говядина 90 % +

6 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 5% - говядина 95% +

7 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 1% - говядина 99% +

8 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 0,5% - говядина 99,5% +

9 Искусственная смесь: трансгенная соя линии 40-3-2 0,1% - говядина 99,9 % -

+ положительная реакция иммунохроматографии; - отрицательная реакция иммунохроматографии. Р < 0,02

Таким образом, разработанная модифицированная методика давала возможность обнаружить трансгенные растительные компоненты в смешанных фаршах с чувствительностью 0,5 %. Предложенная методика может быть использована для определения трансгенных ингредиентов в не термообработанных полуфабрикатах и кормах, содержащих животные и растительные белки.

2.2.3. Совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией

Ранее была показана возможность использования тест-систем серии SureFood (Германия) для определения видовой принадлежности мяса в термообработанных и нетермообработанных мясных продуктах (Морозова E.H. и др., 2004; Смирнов A.M. и др., 2005). Схема анализа представлена на рисунке 4.

Выделение ДНК из исследуемого образца

Амплификация фрагментов ДНК с бнотинилированным праймером

Связывание на стрептавидин -покрытом планшет*

Денатурация I щелочной среде

Гибридизация с меченными гибридижационными «ендами

Детекция

(гибридизационные зонды

метятся антителами, связанными с ферментом)

Считывание результатов после развития цветной реакции

В

Рис. 4. Схема определение ГМО с помощью тест-системы серии ЯнгеРосх! (Германия).

Из образцов выделяли ДНК, проводили амплификацию с меченными биотином праймерами на 358-промотор или МОБ-терминатор. Ампликоны иммобилизовали на планшеты, покрытые стрептавидином. Проводили гибридизацию зондами, меченными антителами, связанными с ферментом, и после реакции с конъюгатом и красителем по интенсивности окрашивания гибридных молекул в лунках планшета определяли наличие 358-промотора и ЫОБ-терминатора.

Нами были получены данные по использованию тест-систем серии БигеРоос! для определения ГМО в искусственно приготовленных комбикормах и полуфабрикатах, а также в смешанных мясорастительных фаршах, содержащих ДНК трансгенных растений.

В дальнейшем нами была проведена модификация методики, которая заключалась в выделении матричной ДНК с помощью детергента СТАВ и магнитособции, проведении мультиплексной реакции с праймерами на 355-промотор и ЫОБ-терминатор. В качестве метки использовали меченные биотином дезоксинуклеозидтрифосфаты. Полученные меченные ампликоны гибридизовали с иммобилизованными в лунках плашки ДНК-зондами, проводили реакцию с конъюгатом и субстратом, и конечный результат определяли по иммуноферментному типу с применением вертикального фотометра. В данном варианте, в отличие от классической схемы БигеРоос!, использовалась прямая реакция ИФА. Интенсивность окрашивания гибридных молекул была прямо пропорциональна их концентрации. Чувствительность модифицированной методики так же, как и в методе с применением тест-системы БигеРоос!, позволяла определять до 0,1 % ГМО в искусственно приготовленных смесях, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения. Методика применима как для нетермообработанных, так и для термообработанных продуктов. Полученные результаты дают основание использовать данную модификацию для выявления ГМО в продуктах и кормах, содержащих животные и растительные компонент.

2.2.4. Разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов

На следующем этапе нами разработана модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов. В отличие от известного метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) в качестве подложки нами были использованы мембранные фильтры. Из исследуемых образцов выделяли матричную ДНК с использованием детергента СТАВ и магнитосорбции, проводили мультиплексную амплификацию со специфическими праймерами в присутствии меченых биотином дезоксинуклиозидтрифосфатов, затем проводили гибридизацию с ДНК-зондами, иммобилизованными в виде точек на мембранные чипы, после реакции с конъюгатом (стрептавидинфосфатаза), субстратом и красителем, результаты реакции оценивали визуально по степени окрашивания точек с гибридными молекулами. ДНК-зонды получали предварительно в реакции амплификации, очищали на хроматографических колонках и иммобилизовали на мембранные чипы.

Как показали проведенные исследования, модифицированная методика давала возможность определять ДНК 355-промотора, NOS-терминатора, гена Lee лектина и крахмальной синтазы SSllb. (рис. 5). Чувствительность анализа составляла 10 пг.

2

3

1- отрицательный контроль (чистый фильтр )

2- положительный контроль (ДНК-зонд на 355 промотор)

3- положительный контроль (ДНК-зонд на N О 8 - те р м и н ато р)

Рис.5. Результаты определения ГМО с помощью ДНК-чипов.

Методика давала возможность обнаруживать ГМО, как в нетермообработанных, так и в термообработанных продуктах и кормах (табл. 4).

Таблица 4

Результаты определение ГМО с помощью ДНК-чипов.

Исследуемая проба Результаты гибридизации с ДНК-зондами:

35S-np0M0T0pa NOS-терминатора

ДНК генно-модифицированной сои «Roundup» + +

ДНК не генно-модифицированной сои - -

ДНК говядины - -

ДНК говядины + ДНК генно-модифицированной сои + +

ДНК говядины + ДНК не генно-модифицированной сои - -

Искусственная термообработанная смесь: говядина, трансгенная соя + +

Искусственная термообработанная смесь: говядина, трансгенная кукуруза + +

Искусственная термообработанная смесь: говядина, трансгенный картофель + +

+ наличие гибридизации; - отсутствие гибридизации

2.2.5. Количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме

«реального времени»

В случае обнаружения в образце генов вставки 35S промотор, NOS терминатор и Lee лектина, проводили количественную оценку и идентификацию трансгенной ДНК сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату.

Для этого использовали методику количественного анализа ГМИ в ПЦР в режиме «реального времени».

В количественной методике использовалась усовершенствованная пробоподготовка с использованием детергента СТАВ и магнитосорбции и также мультиплексная реакция.

Первая реакция - ген лектина, присутствующий как в ГМ, так и в обычной сое. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем R6G.

Вторая реакция - фрагмент ДНК специфичный для сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2. Используемый гибридизационный зонд метили флуоресцентным красителем ROX.

В качестве флуоресцентного тушителя использовали BHQ2.

Аналогичным образом проводили количественную оценку трансгенной ДНК по кукурузе линии MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку.

Методика ПЦР в режиме «реального времени» позволяла проводить количественную оценку содержания трансгенной ДНК. Методика количественного анализа была апробирована на трансгенных растениях, а также на искусственно приготовленных мясных фаршах с растительными трансгенными компонентами. Чувствительность анализа - 0,01 %.

2.2.6. Проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- н иммунодиагностики -

На следующем этапе проведено сравнение различных методов определения ГМО при мониторинговых исследованиях продуктов и кормов.

В Российской Федерации для реализации населению и использованию в пищевой промышленности разрешено несколько линий и сортои генномодифицированных растений (кукурузы, сои, картофеля, сахарном свеклы, риса). Кроме того, на мировом рынке в обороте находятся продукция, включающая следующие генномодифицированные источники: томаты, рапс, кабачковые, папайя, дыня.

Проведенные мониторинговые исследования показали соответствие анализируемых продуктов и кормов нормативной документации, стандартам и ТУ, и только в отдельных случаях были выявлены недекларированные продукты и корма, содержащие ГМО.

В мясных изделиях обнаружено от 1 до 3 % продукции, содержащей фальсифицированные примеси растительных компонентов с трансгенной соей или картофелем (котлеты мясокартофельные, полуфабрикаты замороженные в оболочке, котлеты мясорастительные, пельмени замороженные, сосиски, колбаса вареная).

При мониторинге кормов было выявлено от 11 до 25 % продукции, несоответствующей нормативной документации и содержащей ГМО: сочные корма (сенаж, клубнеплоды), зернофураж, полнорационные комбикорма, заменитель цельного молока (ЗЦМ).

Сравнительные исследования известных и разработанных методик показали, что методы на основе иммунохроматографии достаточно эффективны и экспрессны и могут быть использованы в качестве скрининговых тестов для выявления ГМО в растительном сырье, зеленых кормах, комбикормах, ЗЦМ, в нетермообработанных полуфабрикатах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. Разработанные модифицированные методики на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией и ДНК-чипов, сравнимой с классическими методами с применением тест-систем фирмы «БигеРооё» и метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) и могут использоваться для выявления ГМО как в термообработанной, так и не в термообработанной продукции и кормах. Для количественной оценки содержания ГМО использовалась модифицированная методика ПЦР в режиме «реального времени».

ВЫВОДЫ:

1. Экспериментальные данные по апробации иммунохроматографического метода показали его высокую чувствительность (0,5%) и экспрессность (1 час) при определении трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым, что является основанием для применения метода в качестве скринингового теста при ветеринарном мониторинге растительного сырья, зеленых кормов, зернофуража.

2. Проведена валидация иммунохроматографического метода определения ГМО для нетермообработанных продуктов и кормов, включающих компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Чувствительность анализа составляла 0,5 %.

3. Усовершенствованная модифицированная методика выявления ГМО на основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией обладает высокой чувствительностью (0,1 %) и специфичностью и может быть использована для анализа термообработанных и нетермообработанных продуктов и кормов.

4. Разработанная модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов по специфичности не уступает классическому методу с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) и позволяет выявлять трансгенную ДНК в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах с чувствительностью до 10 пг.

5. Проведенные мониторинговые исследования показали соответствие анализируемых продуктов и кормов нормативной документации и только в отдельных случаях были выявлены недекларированные продукты и корма, содержащие ГМО. Фальсификация мясных продуктов составляла от 1 до 3 %, а кормов - от 11 до 15 %. При этом, наибольшие показатели фальсификации были связаны с ЗЦМ.

6. Методики на основе иммунохроматографии достаточно эффективны и экспрессии и могут быть использованы в качестве скрининговых тестов для выявления ГМО в растительном сырье, зеленых кормах, комбикормах, ЗЦМ, и нетермообработанных полуфабрикатах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. Методики на основе амплификации, ДНК-чипов и ПЦР в режиме «реального времени» позволяют определять ГМО в термообработанной и нетермообработанной продукции и кормах, и могут служить, как в качестве скринингового теста, так и для количественного анализа (ПЦР в режиме «реального времени»).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны:

-Методические рекомендации по использованию

иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)

- Национальный стандарт (проект) «Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Панюшкин А.И. / «Определения ГМО в зерне, кормах и продуктах питания» // Материалы сборника VII международной научно-практической конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения»,-М.: МГУПБ, 2008. - С. 272.

2. Аспандиярова М.Т., Черепанова И.И., Панюшкин А.И. / Методы обнаружения ГМ-источников в сырье и комбикормах // Комбикорма. - 2008., № 7,С. 95-96.

3. Писарева В.М., Светличкин В.В., Рощупкина Л.В., Розанов С.Н., Кондратьева М. В., Панюшкин А.И. / «Определение видового состава сырья и продукции животного и растительного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики» // Материалы сборника международной научно-

практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии», - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008. - С.74

4. Светличкин В.В., Панюшкин А.И., Аспандиярова М.Т., Розанов С.Н., Кондратьева М. В., Горяинова Г.М. / «Экспрессное определение трансгенных белков в кормах на основе иммунохроматографических тест-систем» // Материалы сборника международной научно-практической конференции «Достижения молекулярной биологии и биотехнологии в ветеринарии и зоотехнии», - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008. - С.75.

5. Панюшкин А.И., Луцик C.B. / Контроль содержания генно-модифицированных компонентов в продукции животного и растительного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики. // Материалы международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых, «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания», - М.: МГУПБ, 2009. - С. 251.

6. Панюшкин А.И. / Определение ГМО в продуктах и кормах с применением методов и тест-систем иммунохроматографии и ДНК-диагностики // Практик. - 2010, №3, С. - 32-37.

7. Светличкин В.В., Кононенко А.Б., Ярков С.П., Стрелков A.A., Кондратьева М.В., Панюшкин А.И. / Тест-система и технические средства ускоренного контроля безопасности и качества объектов ветеринарного надзора // Сборник ГНУ ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», 2010, № 1, С. - 26 - 32.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Панюшкин, Александр Игоревич

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Генномодифицированная продукция и ее значение

1.2 Вопросы безопасности ГМО, необходимость контроля и маркировки

1.3 Методы определения ГМО

1.3.1 Методы определения ГМО на основе анализа нуклеиновых кислот

1.3.2 Методы определения ГМО на основе анализа белков

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Цель и задачи исследования

2.2 Материалы и методы

2.2.1 Отбор и подготовка проб для исследования

2.2.2 Методика выделение ДНК с использованием детергента СТАВ.

2.2.3 Методика выделения ДНК с использованием сорбента Silica

2.2.4 Методика качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов

2.2.5 Методика качественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени

2.2.6 Методика количественного определения ГМИ с помощью ПЦР в реальном времени

2.2.7 Методика идентификации ГМО с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003)

2.2.8 Методика определения ГМО на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией с использованием тест-систем БигеРоос!

2.2 9 Модифицированная методика определения ГМО с применением ДНК-зондов иммобилизованных на мембранных биочипах

2.2 10 Методика иммунохроматографического определения трансгенных белков

2.2.11 Статистическая обработка результатов

2.3 Результаты исследований

2.3.1. Разработка методов определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе иммунохроматографии

2.3.2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения

2.3.3. Совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией

2.3.4. Разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов

2.3.5. Количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени»

2.3.6. Проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка и совершенствование методов определения ГМО в сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики"

Актуальность темы

С помощью генной инженерии получены различные трансгенные растения (соя, кукуруза, картофель, хлопчатник, сахарная свекла) с устойчивостью к вирусам, колорадскому жуку и другим насекомым, а также к пестицидам. Производство и оборот трансгенной продукции увеличивается в мире год от года (9, 24, 32). В настоящее время определенная часть находящихся в обороте в России продуктов и кормов содержат компоненты из генномодифицированных источников (ТМИ). Так как замена трансгенными компонентами белков животных и растений - весьма выгодный бизнес, трансгенные белки постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания и кормах биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур.

Мнения ученых о безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) расходятся. Одни исследователи считают, что генномодифицированный организм безвреден, по мнению других, он является источником биологических и экологических рисков для человека, животных и окружающей среды (56). Эти риски могут быть связаны как с плейотропным эффектом трансгенного белка, так и со свойствами самой встроенной-конструкции, в том числе с регуляторным действием на соседние гены. Введение в пищевую цепочку человека или животных трансгенных структур может привести к непредсказуемому воздействию на их здоровье. В ГМО вместе с целевыми генами могут интегрироваться и другие фрагменты ДНК, несущие гены с нежелательными признаками, например, гены, кодирующие токсины или устойчивость к антибиотикам.

В различных странах, включая Россию, создание, производство, реализация продукции, содержащей трансгенные компоненты, подлежит государственному регулированию. Содержание трансгенных конструкций в продуктах и кормах в соответствии с указаниями Роспотребнадзора и Россельхознадзора должно быть продекларировано. В соответствии с приказом Минсельхоза Российской Федерации в нашей стране проводится Государственный ветеринарный лабораторный мониторинг остатков запрещенных и вредных веществ в организме животных, продуктах животного происхождения и кормах. В перечень показателей безопасности входят ГМО, которые определяются в сырых и термически обработанных пищевых продуктах животного происхождения, а также в кормах и кормовых добавках.

В системе лабораторного контроля трансгенных продуктов можно выделить два направления. Это методы ДНК-диагностики и методы обнаружения трансгенных белков на основе иммунодиагностики. На основе ДНК-диагностики (ПЦР, ГЕЦР в режиме «реального времени») определяют как конкретные встроенные гены, так и регуляторные участки ДНК векторных конструкций (35 S - промотор, NOS - терминатор). Иммунологические методы позволяют определять непосредственно трансгенные белки. Они основаны на образовании устойчивого комплекса молекулы трансгенного белка (антигена) со специфичными к нему антителами. сг

В связи с изложенным, весьма важным является разработка и создание высоко эффективных методик для определения трансгенных компонентов в продуктах и кормах. Несмотря на достигнутые в этом направлении значительные успехи, актуальным представляется совершенствование методов в плане экспрессности, оптимизации пробоподготовки, валидации к конкретным объектам и приборам, а также апробация различных модификаций и определение их места в системе скринингового или количественного анализа в соответствии с задачами, ветеринарно-санитарного мониторинга продуктов и кормов.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлись разработка и совершенствование методов определения ГМО в- сырье, продуктах и кормах на основе ДНК- и иммунодиагностики.

В задачи исследований входило:

- совершенствование определения трансгенных белков в растительном сырье и растительных кормах на основе метода иммунохроматографии;

- валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих ингредиенты животного и растительного происхождения;

- совершенствование определения ГМО на основе ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией;

- разработка модифицированного метода определения ГМО с использованием ДНК-чипов;

- количественное определение ГМО на основе ПЦР в режиме «реального времени»;

- проведение мониторинговых исследований по выявлению ГМО в ■ продуктах и кормах с использованием различных методов ДНК- и иммунодиагностики.

Научная новизна

Проведены исследования по усовершенствованию методов определения ГМО в сырье, продукции и кормах, с использованием комплекса методов ДНК- и иммунодиагностики.

Проведены исследования по апробации иммунохроматографических тест-систем для определения трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым в растительном сырье, зеленых кормах, в зернофураже. Определены чувствительность и специфичность метода и тест-систем для указанных объектов.

Осуществлена валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в нетермообработанных продуктах и кормах, включающих компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Определены чувствительность и специфичность валидированной методики.

На основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией усовершенствована методика выявления ГМО в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах. Определены чувствительность и специфичность модифицированной методики.

Разработана модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов. Определены чувствительность и специфичность методики.

Получены данные мониторинговых исследований по определению содержания ГМО в сырье продуктах питания и кормах и проанализировано соответствие исследуемых проб нормативной документации.

Практическая значимость

На основании результатов исследований для практического использования разработаны:

-Методические рекомендации «Использование иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)

- Национальный стандарт (проект) «Растительная продукция. Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

- VII. Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения». Москва, МГУIЛЬ, 2008 г.

- Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии». Москва, ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2008 г.

Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и средства переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания». Москва, МГУПБ, 2009 г.

Международной выставке «Научно-техническое творчество молодежи (НТТМ)», 2008 г. на ВВЦ. Работа «Совершенствование методов определения ГМО на основе иммунохроматографии», представленная на ВВЦ, была отмечена почетной грамотой

Основные положения, выносимые на защиту

1. Совершенствование определения трансгенных белков на основе' иммунохроматографии в растительном сырье, зеленых кормах, зернофураже.

2. Валидация иммунохроматографического метода для определения ГМО в продуктах и кормах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.

3. Разработка модифицированной методики определения ГМО в продуктах и кормах на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;

4. Разработка модифицированной методики определения ГМО с использованием ДНК-чипов.

5. Количественный анализ содержания ГМО в продуктах и кормах на основе ПЦР в режиме «реального времени».

6. Сравнительный анализ различных методов ДНК- и иммунодиагностики для качественного и количественного определения ГМО при проведении мониторинговых исследований продуктов и кормов.

Публикации Результаты исследований отражены в 7 научных статьях, из них две - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Панюшкин, Александр Игоревич

4. ВЫВОДЫ

1. Экспериментальные данные по апробации иммунохроматографического метода показали его высокую чувствительность (0,5%) и экспрессность (1 час) при определении трансгенных белков, связанных с устойчивостью к гербицидам и насекомым, что является основанием для применения метода в качестве скринингового теста при ветеринарном мониторинге растительного сырья, зеленых кормов, зернофуража.

2. Проведена валидация иммунохроматографического метода определения ГМО для нетермообработанных продуктов и кормов, включающих компоненты животного и растительного происхождения (мясорастительные полуфабрикаты, комбикорма). Чувствительность анализа составляла 0,5 %.

3. Усовершенствованная модифицированная методика выявления ГМО на основе мультиплексной ПЦР с последующей ДНК-гибридизацией обладает высокой чувствительностью (0,1 %) и специфичностью и может быть использована для анализа термообработанных и нетермообработанных продуктов и кормов.

4. Разработанная модифицированная методика определения ГМО на основе ДНК-чипов по специфичности не уступает классическому методу с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174-2003) и позволяет выявлять трансгенную ДНК в термообработанных и нетермообработанных продуктах и кормах с чувствительностью до 10 пг.

5. Проведенные мониторинговые исследования показали соответствие анализируемых продуктов и кормов нормативной документации и только в отдельных случаях были выявлены недекларированные продукты и корма, содержащие ГМО. Фальсификация мясных продуктов составляла от 1 до 3 %, а кормов - от 11 до 15 %. При этом, наибольшие показатели фальсификации были связаны с ЗЦМ.

6. Методики на основе иммунохроматографии достаточно эффективны и экпрессны и могут быть использованы в качестве скрининговых тестов для выявления ГМО в растительном сырье, зеленых кормах, комбикормах, ЗЦМ, и нетермообработанных полуфабрикатах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. Методики на основе амплификации, ДНК-чипов и ПЦР в режиме «реального времени» позволяют определять ГМО в термообработанной и нетермообработанной продукции и кормах, и могут служить, как в качестве скринингового теста, так и для количественного анализа (ПЦР в режиме «реального времени»).

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании результатов исследований разработаны: -Методические рекомендации по использованию иммунохроматографических тест-систем для выявления ГМО (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 02.06.2008 г.)

- Национальный стандарт (проект) «Экспресс - метод обнаружения специфичных белков», который прошел публичные чтения и получил положительное решение технического комитета.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Панюшкин, Александр Игоревич, Москва

1. Вельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А,Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия, 2003,№ 2, с 74-96.

2. Гинцбург А.Л., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 123-124.

3. ГОСТ Р' 52173-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения"

4. ГОСТ Р 52174-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа"7. Директива ЕС 1829/20038. Директива ЕС 1830/2003

5. Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-говсероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с.166-168.

6. Ю.Иванов A.A., Галкина И.И., Мясникова В.В. Деятельность учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году). // Информационный сборник М. - Федеральный центр Госсанэпиднадзора. - 2004г. - 17 стр.

7. Ивановцев В.В., Светличкин В.В., Каверин A.B. / Идентификация трансгенной сои в продуктах и кормах.// Журнал "Ветеринария и кормление", Москва 2006, №6 стр. 21-22

8. Каверин A.B. / Количественное определение ГМИ методом ПЦР в реальном времени// Труды ВНИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии", Москва, 2006, стр. 34-37

9. Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука в Bt-защищенному картофелю// Arpo XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения., №7 с.22-24

10. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., с. 59-62.

11. Лушников, К.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевойпродукции / Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2,- С. 36-39.

12. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М., изд. «Мир»., 1994, с. 159-172.

13. Методические указания «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной • из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги» МУК 4.2.1917-04

14. Методические указания «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги» МУК 2.3.2.1935-04

15. Методические указания «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного' происхождения в продуктах питания». МУК 4.2.1913-04.

16. Методические указания «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции». МУК 4.2.1902-04.

17. Методические указания «Пищевые продукты и пищевые добавки. Порядок И' организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги» МУ 2.3.2.1917-04

18. Монастырский О.А «На пути к устойчивому развитию России»// Бюллетень Центра экологической-политики России №28 2004 с14-18

19. Пермяков А.Н. /Определение видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики// Ветеринария и кормление, 2009, №3, С. 6-7.

20. Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. Определение содержания и выделение ПЦР-пригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои // Биотехнология, Москва, 2003, № 2, с. 86-94.

21. Постановление № 149 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 16.09.2003

22. Постановление № 36 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 14.11.2001

23. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации «Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из генетически модифицированных источников» от 31 декабря 2004г. № 13.