Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени"

На правах рукописи

OU347Э67Ь

Гудов Владимир Петрович

Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

1 5 ОКТ ?009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003479675

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель:

академик РАМН,

доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, доцент Позмогова Галина Евгеньевна

доктор биологических наук Шилов Илья Александрович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Диссертационного сое )1 при Московской государственной академии

тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Защита состоится

2009 г. в 15 часов на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность работы.

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка диагностических наборов реагентов для выявления генетически модифицированных источников (ГМИ) в семенном материале, кормах животных, пищевых продуктах, лекарственном сырье и т.д. Принцип работы современных приборов для анализа ДНК базируются на количественном определении ДНК, используя метод ПЦР в реальном масштабе времени. Зарубежные приборы и реактивы для них, разработанные для осуществления данной методологии достаточно дороги. В настоящее время существуют отечественные аналоги приборной и реагентной базы; доступные по ценовым и качественным характеристикам, для лабораторий, проводящих массовые исследования.

В цели настоящей работы входило создание отечественной методической и компонентной базы для создания зондов для ПЦР в реальном масштабе времени, необходимых для решения различных биотехнологических задач с применением данного метода. В качестве модельной системы нами был выбран широко использующийся компонент для создания векторных систем экспрессионной кассеты трансгенных растений - МОЭ-терминатор.

В настоящий момент невозможно полностью исключить ошибки в сертификации ГМР. Продукты, полученные с использованием ГМИ, по международным нормам и согласно санитарным нормам РФ должны нести на себе информацию в виде маркировки, из которой явно следовало бы, что продукт был получен из генетически модифицированных организмов. Пищевой продукт маркируется соответствующим образом, если соотношение трансгенного продукта к генетически не модифицированному - более 0,9%.

Для анализа необходимы микроколичества исследуемого образца, содержащего целевой фрагмент ДНК.

В настоящее время ПЦР в реальном масштабе времени широко используются в биологии, медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Являясь количественным методом, он обладает высокой точностью, специфичностью и надежностью.

Одним из ключевых моментов для повышения эффективности ПЦР в реальном масштабе времени является планирование и синтез флуоресцентных зондов, являющихся источником информационного сигнала в данном методе анализа.

Существуют несколько важных критериев при создании зонда для ПЦР в реальном масштабе времени. Эффективность работы зонда определяется:

*В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий лабораторией биологически активных наноструктур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамапеи РАМН, к.б.н. В.Г. Лунин.

Список принятых сокращений: ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени; ГМИ - генетически модифицированный источник.

1) Длиной олигонуклеотида, связывающего донор и акцептор;

2) Комбинацией доноров и акцепторов флуоресценции;

3) Дислокацией гибридизованного зонда на матрице;

4) Влиянием близкорасположенных к донору или акцептору флуоресценции нуклеотидов в зонде; пуриновые и пиримидиновые основания, являясь ароматическими гетероциклами, наводят помехи на флуоресцентный сигнал.

Цель работы: Создание методологической и компонентной базы, а также оригинальных схем синтеза флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции для синтеза зондов ПЦР-РВ. Разработка подхода для эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1) Создание отечественной компонентной и методологической базы для синтеза зондов ПЦР-РВ;

2) Обоснование выбора математического аппарата на основе Форстеровской теории переноса энергии, необходимого для планирования зондов ПЦР в реальном масштабе времени;

3) Проведение математического расчета Фостеровского радиуса, оптимального с точки зрения используемой системы.

4) Синтез зондов ПЦР-РВ с различной длиной нуклеотидной части, включая зонды с расчетной длиной олигонуклеотидного спейсера согласно Форстеровской теории. Проверка синтезированных зондов на объекте растительного происхождения, с целью определения в нем NOS-терминатора - широко распространенного маркера генетически модифицированных растений;

Научная новизна. На сегодняшний день информация о планировании зондов для ПЦР в реальном масштабе времени скудна и противоречива, которая говорит о создании флуоресцентных зондов исходя только из эмпирических данных [Nasarabadi S., BioTechniques, 1999, Vol.27(6), р 1116-1117, Holland P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, Vol.88, p.7276-7280, Bernard P.S., Analytycal Biochemistry, 1999, № 273, p. 221-228]. В данной работе была предпринята попытка подготовить практическую и теоретическую базы для планирования зондов, обладающих хорошими характеристиками, как по возрастанию флуоресцентного сигнала, так и низкому уровню флуоресцентного шума. Результаты работы показали, что с помощью универсальной методологической базы можно создать диагностические наборы для выявления ГМИ в различных сельскохозяйственных культурах, генетически модифицированных груше, сое и кукурузе. Спектральные характеристики красителей, встроенных в зонды, имеют высокий уровень разгорания флуоресценции, а также высокий квантовый выход, и имеют те же спектральные характеристики, что и зарубежные аналоги.

Осуществлена проверка теоретического подхода для планирования флуоресцентных зондов, основанного на эффекте Форстера с правками, учитывающих вероятностную пространственную ориентацию красителя и гасителя

молекул флуоресценции. Задача подобного плана была поставлена и осуществлена впервые.

Практическая значимость работы.

Показана перспективность использования математического аппарата, основанного на теории Форстера, что позволит эффективно планировать зонды ПЦР-РВ. Данный шаг несомненно уменьшит число экспериментальных итераций, зачастую необходимых для создания корректно работающей системы в ПЦР-РВ. Результаты работы позволят работать с компонентами собственного производства, что позволит уменьшить материальные и временные затраты на создание флуоресцентных зондов для ПЦР-РВ.

Публикации по теме диссертационной работы.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Основные результаты исследований были представлены на III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 19 октября, 2004), II Меэдународном конгрессе «Биотехнология; состояние и перспективы развития» (Москва 10-14 ноября, 2003) а также на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 29 мая - 1 июня, 2007).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на //¿- страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 121 источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез компонентов для создания флуоресцентных зондов.

Одним из важнейших компонентов зонда являются - флуоресцентный краситель и гаситель флуоресценции. Их комбинация определяет полноту переноса энергии внутри зонда. На сегодняшний день из наиболее распространенных флуоресцентных красителей можно выделить две обширные группы - ксантеновые и цианиновые флуоресцентные красители. Данные группы различаются по молекулярному строению и по флуоресцентным свойствам.

Все методики синтеза флуоресцентных красителей и их производных, являются результатами проведенной работы по созданию материальной компонентной базы флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции для синтеза зондов для ПЦР-РВ, в частности для мультиплексных анализов.

1.1. Синтез флуоресцентных красителей.

Замещенные фенолы (26,3,4,5) конденсируются с циклическими ангидридами (1) в присутствии катализатора кислоты Льюиса хлорида цинка II при температуре от

180 °С до 200 °С. Конденсирующие средства влияют на тип образующихся веществ и их количества. Заместители входящие в состав фенола также влияют на выход продуктов реакции. Таким образом чем больше элетронодонорных групп входит в состав фенолов, тем выше выход целевых продуктов реакции.

мгмоо'с

гпс!г

4 •

* Получение 8-гидроксиюлолидина, прекурсора 5(6)-1?ОХ, компонента 2 6.

ОН он

С|-*ч^чВг

2а

Темп.

1 -70 град, О часа) 2-110град. (15часов) 2 ф

Мол. сита-Заиг.

Р

о о V

оЗг"

-он г р -

]г -511— ]°>-он

Л 8 а б Ь Г/(ЧДч11ТРА-5{6)-Р!6С

/ 8В,Г ^

0,0'-<«Р]у-5(6)-РАМ ОЭв,г

Схема 1. Синтез флуоресцентных красителей ксантенового ряда, введение защит на 5(6)-РАМ и 5(6)-Р?66.

Соответственно больший выход при одном и том же типе взаимодействия для родаминовых красителей был достигнут при синтезе 5'(6')-карбоксиродамина X (6 а, б), следует отметить, что данный краситель из четырех ксантеновых красителей, синтезированных в этой работе потребовал дополнительного синтеза прекурсора (2 б), в виду высокой стоимости последнего. Сам синтез (см. Схема 1) имеет две стадии, где переход от первой стадии ко второй заключается в повышении температуры с 70 °С до 110 °С. Результатом явилась методика, основанная на двухступенчатом синтезе, дающем продукт с высоким практическим выходом продукта из доступных и недорогих предшественников. Максимум спектра поглощения 5(6)-КОХ* сдвинут достаточно далеко в красную зону видимого света, а максимум флуоресценции приходится на 650 нм. В синтезе зондов для нашей работы он не был применен, так как давал сравнительно малую область перекрывания собственного спектра флуоресценции с соответствующим гасителем флуресценции - ВНО-З. Для нашей работы была необходима пара красителя и гасителя флуоресценции, в которой краситель бы обладал высоким квантовым выходом и имел бы максимальную область перекрывания спектров флуоресценции флуорофора и поглощения гасителя флуоресценции. Необходимо указать, что спектрально 5(6)-ТАМЯА (5) почти полностью соответствует красителю цианинового ряда - Су 3. Очевидно, работая над синтезом новых ксантеновых красителей можно получить более дешевые аналоги дорогостоящих цианиновых красителей, также работающих в красноволновой области спектра.

Таблица 1. Синтез флуоресцентных красителей ксантенового ряда.

Смесь изомеров ксантеновых флуорофоров Выход, %

6 (а,б) 72

7 (а,б) 65

8 (а,б) 60

9 (а,б) 77

Флуоресцентный краситель 5(6)-Р*6в по спектральным свойствам наиболее приближен к карбоксифлуоресцеину (РАМ), но имеет более низкий квантовый выход и меньшую площадь перекрывания собственного спектра флуоресценции и спектра поглощения тушителей флуоресценции, таких как ВНО-1 и ШСМ.

На стадиях очистки флуоресцентных красителей была применена адсобционная хроматография на силикагеле с размером частиц от 40 до 60 мкр, отдельных слов заслуживает вопрос изомерной чистоты полученных флуоресцентных красителей на данной стадии. Разделить на изомеры полностью на данном этапе невозможно, их сукцинимидные эфиры подвергаются полному разделению на изомеры посредством проточной эффективной хроматографии среднего давления (РР1.С, 10-50 атм., см. пункт 1.2). Для дальнейшего синтеза необходимо было также внести защитные группы на 5(6)-РАМ и 5(6)-Я66, с этой целью обработали в основных условиях

трифторуксусным ангидридом и пивалоилхлоридом соответственно. И далее продолжали работу с защищенными соединениями (8 в,г и 9 в,г), поставленные защиты удаляются в результате аммонолиза на стадии деблокирования при синтезе зондов.

1.2. Синтез активированных сукцинимидных эфиров флуоресцентных красителей.

На момент проведения работы фосфорамидитный способ введения флуоресцентных красителей еще не был широко используем и красители на олигонукпеотиды вводились постсинтетически с помощью их активированных сукцинимидных эфиров. Это касается введения флуорофоров или гасителей флуоресценции на 5'-конец растущей цепи олигонуклеотида.

Таким образом были синтезированы сукциимидные эфиры 0,0-дипивалоил-5'(6')-карбоксифлуоресцеина (13 а, б), 5'(6')-карбоксиродамина X (10 а, б), N,N' -дитрифторацетил-М,№-дизтил-2,10-диметил-5'(6')-карбоксиродамина (12 а, б), N,N'-Тетраметип-5'(6')-карбоксиродамина (11 а, б).

Для получения сукцинимидных эфиров нами был использован метод карбодиимидной активации карбоксильных групп с последующим взаимодействием с N-гидроксисукцинимидом.

Вначале из карбоксикомпонента и карбодиимида получается очень реакционноспособное О-ацилпроизводное изомочевины. Оно очень быстро реагирует с N-гидроксисукцинимидом и переходит в соответствующий активированный эфир. Нами были использованы два карбодиимида - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлорид (EDAC) и 1-циклогексил-3-(3-1М-этилморфолин)-карбодиимид л-толуолсульфанат (тозилат) (CMC). Выбор карбодиимида продиктован условиями растворимости компонентов реакции в используемом растворителе.

Для более простой обработки реакционной смеси был применен водорастворимый активатор карбоксильной группы самого флуоресцентного красителя, что позволило эффективно избавиться от диизопропилэтилмочевины, образовавшейся в результате конденсации гидроксисукцинимида с флуоресцентным красителем.

Список принятых сокращений: 5(6)-FAM - 5'(6')-карбоксифлуоресцеин; 0,0'-diPiv-5(6)-FAM - 0,0-дипивалоил-5'(6')-карбоксифлуоресцеин; 5(6)-TAMRA - М,М'-тетраметил-5'(6')-карбоксиродамин; 5(6)-R6G - Ы,Ы'-диэтал-2,10-диметил-5'(6')-карбоксиродамин; N,N'-diTFA-5(6)-R6G - Ы^'-дитрифторацетил - ЫД-диэтил-2,10-диметил-5'(6')-карбоксиродамин; 5(6)-ROX - 5'(6')-карбоксиродамин X; Су 3 - 1,1'-(3-дигидроксипропил)-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианин; BHQ-1 - 4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-4"-(М,М-дигидроксиэтил)-5'-ме-тилазобензол; BHQ-3 - 3-диэтиламино-5-фенилфеназин-4"-(М,М-дигидроксиэтил)-7-диаэо-бензол; RTQ-1 - 4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-4""-(р-М,Ы-дигидроксиэтил)фенил-5'-метилтетразобензол.

Схема 2. Синтез активированных сукцинимидных эфиров ксантеновых флуоресцентных красителей - 0,0'-сЛРм-5(6)-РАМ, 5(6)-ИОХ, N,N'-diTFA-5(6)-R6G1 5(6)-ТАМРА.

Таблица 2. Синтез сукцинимидных эфиров ксантеновых флуорофоров.

Смесь изомеров сукцинимидных эфиров ксантеновых флуорофоров Выход, %

10 (а,б) 80

11 (а,б) 68

12 (а,б) 60

13 (а,б) 66

Как уже отмечалось, важна изомерная чистота вводимых в состав зонда флуоресцентных красителей. При очистке методом электрофореза флуоресцентно-

меченые зонды, как и другие меченые биологически активные молекулы, например белки имеют разную электрофоретическую подвижность в геле, в зависимости от того с каким изомером ксантенового флуорофора они связаны. Это обстоятельство усложняет процесс очистки и интерпретации результатов.

Использование РР1_С системы позволило разделить 5 и 6 изомеры активированных эфиров, как флуоресцеиновых так и родаминовых ксантеновых флуоресцентных красителей. С целью предотвращения гидролиза сукциниимидных эфиров на силикагеле в результате хроматографии силикагель был прогрет до температуры 160°С для удаления остаточной влаги. В качестве элюентов были использованы абсолютизированные апротонные растворители (ацетон, толуол, ацетонитрил). Использование в составе элюента спирта не допустимо из-за переэтерификации на хроматографической колонке. Полученные эфиры обладали хорошей способностью к кристаллизации и хорошей растворимостью в водных буферных растворах (рН 7-9) и органических растворителях, таких как ацетон, этилацетат, 1^,М'-диметилформамид.

1.3. Синтез молекул прекурсоров на основе флуоресцентных красителей для иммобилизации их на стекле с контролируемым размером пор (СРв).

Для введения флуоресцентной метки на З'-конец конец олигонуклеотидов используется специальный сорбент СРв с иммобилизированными на него флуорофорами с якорными группами, по которым продолжается фосфорамидитный синтез олигонуклеотидов.

Рис 1. Прекурсоры флуоресцентных красителей, необходимые для их мобилизации на сорбент - СРв

Для всех красителей модель получения амида, и работа с защитными группами ведется по единому сценарию, который представлен ниже на схеме 4.

Р(*п =

В", [0,0'-<№№5-РАМ] _ 0 Я*2 !5-ТАМВД]

Я*, [М,М'-с1!ТРА-5^6С] /~Х Н\,[5-Р!ОХ]

14, 15, 16,17

3-(Аминопропил)-1-салкеталь

10 6 116 *^=ОДМФА, 30 мин., 20°С .

о 7-0

12 6,13 6 I „ Ох 1

О

26,27,28,29 О—/

рмтю

018,19,20,21

ДМФА

!саа

Схема 4. Синтез производных флуоресцентных красителей для иммобилизации на сорбент - СРв.

Сначала нами были получены производные флуоресцентных красителей с линкером - 3-(аминопропил)-1-солкеталем, который очень быстро реагирует с сукциниимидными эфирами флуорофоров с образованием соответствующих амидов карбоновых кислот (14,15,16,17), выход на данной стадии количественный.

Продукты реакции были подвергнуты колоночной хроматографии при атмосферном давлении. Очищенные амиды повергли гидролизу в 80% уксусной кислоте с целью снятия изопропилиденовой защиты и получения двух гидроксильных функциональных групп (18,19, 20, 21), выход на данном этапе также количественный. На первичную спиртовую группу поставили тритильную защитную группу, использовав 4,4'-диметокситритилхлорид в пиридине (22, 23, 24, 25). Тритилированные амиды флуорофоров подвергли хроматографии на колонке под атмосферным давлением. Для функционализации оставшейся вторичной гидроксильной группы нами был применен янтарный ангидрид в присутствии 4-диметиламинопиридина (ОМАР). Полученные карбоксилированные соединения (26, 27, 28, 29) были иммобилизованы на аминомодифицированный СРв с образованием пептидной связи модифицированным карбодиимидным методом.

В качестве активатора карбоксильной группы нами был использован ЕйАС, а в качестве добавки - гидроксибензотриазол (НОВ!) для уменьшения О -> N ацильной миграции, тем самым увеличив плотность загрузки.

Для иммобилизации, аминомодифицированный СРв и карбоксилированный флуорофор инкубируют вместе при перемешивании в абсолютизированном диметилформамиде. На данной стадии необходимо деликатное перемешивание без использования магнитной мешалки, для предупреждения физического истирания твердой стеклянной фазы. Следует отметить о возможности использования фосфорамидитов флуоресцентных красителей для иммобилизации на СРв, но в этом случае сорбент будет модифицирован свободной гидроксильной группой, таким образом открывается химический алгоритм, позволяющий получать модифицированными сорбенты с другой основой, такие как сефадекс, сефароза, целлюлоза, модифицированный полистирол.

Таблица 3. Создание библиотеки модифицированных сорбентов.

Яп* компонент Выход %

ЯАМ 22 65

ТАМ1ЧА 23 72

Ибв 24 70

ИОХ 25 75

ЯАМ 26 65

ТАМЯА 27 59

Я60 28 60

ЯОХ 29 67

Индивидуальность и структура соединений были подтверждены данными ТСХ, электронной и 1Н-ЯМР-спектроскопии. Метод двухмерного 1Н-ЯМР позволил различить мевду собой 5 и 6 -карбоксиизомеры сукцинимидных эфиров ксантеновых флуорофоров. Также для исследования чистоты полученных соединений был применен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (НР1.С), который позволил оченить чистоту полученных сукцинимидных эфиров ксантеновых флуоресцентных красителей.

1.4 Синтез гасителя флуоресценции ВНСМ и его амидофосфита.

Гаситель флуоресценции ВНСМ был синтезирован в результате реакции азосочетания 4'-(2-нитро-4-фенилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-бензилдиазония

хлорида (34) и Ы,Ы-дигидроксиэтиланилина (35).

Затем одну гидроксильную группу защитили 4,4'-диметокситритильной (ОМТг) защитой, в данном случае требуется строгий контроль за температурой и скоростью добавления 4,4'-диметокситритилхлорида, поскольку для следующей стадии необходим монотритилированный продукт (37).

4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-5'-метилазобензил-4"-^-етил-2-0-(4,4| - диме-токситритил))-М-2-цианоэтил-(М,М-диизопропил)-амидофосфит (39) необходим для использования в автоматических синтезаторах олигонуклеотидов для введения

непосредственно в течении синтеза на 5' -конец растущей цепи олигонукпеотида, также данный компонент может быть использован для модификации сорбента для твердофазного синтеза, имеющего свободную аминолинкерную якорную группу, таким образом можно синтезировать зонды имеющие модификацию гасителем флуоресценции на З'-конце олигонуклеотидной цепи.

он

Схема 5. Получение амидофосфита BHQ-1. Таблица 4. Синтез фосфорамидита BHQ-1.

Компонент Выход, %

36 52

37 75

39 86

Синтез олигонуклеотидов вели, используя амидофосфитный метод на автоматических синтезаторах ASM-800 (ООО "Биоссет", Новосибирск). Флуоресцентные красители вводили на З'-конец олигонукпеотида, используя колонки с модифицированным сорбентом CPG (500 А), имеющим готовые якорные группы с 0,0'-дипивалоил-5-флуоресцеином. Гаситель флуоресценции вводили посредством полученных амидофосфитов BHQ-1 и RTQ-1. Для синтеза олигонуклеотидов использовались 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-дезоксинуклеозид фосфорамидиты (Glen Research, USA). Твердофазный фосфорамидитный метод синтеза олигонуклеотидов, широко используемый в автоматических синтезаторах является стандартизованной операцией описанной в литературе [S. A. Kates, F.

Albericio, Marcel Dekker Inc. (USA), New York, 2000, p. 475-529]. Полученные зонды обессоливали и чистили методом гель-электрофореза в полиакриламиде. Первичную структуру полученных зондов подтверждали секвенированием по Максаму-Гилберту [Maxam А.М., Gilbert W„ Meth. Enzymol. 1980.65. p. 499].

Пары красителей и гасителей флуоресценции, а именно FAM-BHQ-1, ROX-BHQ-2, R6G-BHQ-1, TAMRA-BHQ-2 были проанализированы согласно площади перекрывания спектров флуоресценции и поглощения соответственно флуорофора и гасителя флуоресценции, что влияет на базовый уровень флуоресценции зонда. Также нами был учтен такой фактор, влияющий на перенос энергии, как экстинкция флуорофора и его квантовый выход. Площадь перекрывания спектров флуоресценции и поглощения флуорофора и гасителя флуоресценции должна быть максимальной и квантовый выход флуорофора должен быть высоким (97% для FAM). Среди вышеперечисленных комбинаций флуорофоров и гасителей флуоресценции лучшим для нашего эксперимента являлась пара, состоящая из флуоресцеина, как флуоресцентного красителя и гасителя флуоресценции BHQ-1 (Black Hole Quencher, Àabs=534 нм). Гаситель флуоресценции RTQ-1 (Âabs-=520 нм) также взятый нами для эксперимента является непатентованным спектральным аналогом BHQ-1, тоже имеет высокую площадь перекрывания спектра флуоресценции флуорофора (FAM) и своего спектра поглощения, содержащие его зонды необходимой длины были синтезированы на базе ЗАО «Синтол» для проведения работы. Для сравнения функциональности близких по спектральным характеристикам BHQ-1 и RTQ-1 было решено провести работу с двумя сериями зондов, содержащих оба вышеперечисленных гасителя флуоресценции, где флуорофор оставался неизменным.

Таким образом, на данной стадии был обоснован выбор флуорофоров и акцепторов флуоресценции, на базе которых были синтезированы зонды для нашей работы. Для эффективного переноса энергии с донора флуоресценции на акцептор флуоресценции нами был предложен подход для оптимизации зондов для ПЦР-РВ, базирующийся на теории Форстера, согласно которому можно с высокой точностью спланировать расстояние между донором и акцептором флуоресценции. Таким образом, для планирования зондов для РТ-ПЦР провели предварительный расчет дистанции между донором и акцептором флуоресценции, для оценки расстояния между двумя этими молекулами и синтеза зондов для работы.

2. Решение уравнения Форстера.

Для моделирования зондов необходимо было решить вопрос расстояния между флуорофором и гасителем флуоресценции, с этой целью необходимо было узнать Форстеровский радиус для выбранных пар флуоресцентного красителя и гасителя флуоресценции, что являлось бы отправной точкой в вопросе длины нуклеотидного звена в составе зондов для ПЦР-РВ. С этой целью было рассмотрено и подвергнуто математическим преобразованиям базовое уравнение Форстера, для возможности решения уравнения, используя имеющиеся в наличие возможности получения

данных согласно спектральным характеристикам флуорофоров и гасителей флуоресценции, в программной среде дифференциального вычисления - MATLAB.

Теория нерадиоактивного переноса энергии впервые была исследована Форстером [Т. Forster, Annalen der Physik (Leipzig) 1948, 2, 55.], который использовал квантовые механизмы для описания переноса энергии в течение резонансного межмолекулярного взаимодействия. Взаимодействие обратно пропорционально расстоянию между двумя молекулами-флуорофорами и энергетический переход можно описать следующим образом [F. Е. Auzel, Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758.]:

Н5а - функция Гамильтона (Гамильтониан), Е - Энергия электронного состояния состоящая из суммы энергии колебательных движений электронов и их энергии электронных переходов

Волновые функции рассмотрены для элементарной матрицы описывающей начальный уровень системы с донором в возбужденном состоянии и акцептора в невозбужденном состоянии, конечное состояние показывает переход донора в исходное энергетическое состояние и возбуждение акцептора. Теоретически, этот переход можно записать так:

s - истинное время жизни донора в возбужденном состоянии, Ro - критическое расстояние между донором и акцептором энергии.

Ro можно также записать следующим образом [G. Blasse, Materials Chemistry and Physics 1987,16, 201.]:

где К - длинна волны излучения, Sa (А) - коэффициент молярной экстинкции, S° -коэффициент квантового выхода донора излучения в отсутствии акцептора энергии, п - коэффициент преломления среды, N - число Авогадро, подынтегральное выражение показывает полноценность энергетического взаимодействия излучения донора и поглощения акцептора энергии.

Теория Форстера переноса энергии, выражавшаяся межмолекулярным взаимодействием была развита и расширена Декстером, который добавил к теории Форстера полимолекулярное взаимодействие [D. L. Dexter, Journal of Chemical Physics 1953, 21, 836.]. По факту, для каждого атома изолированной молекулы, он

(1)

(2)

(3)

может учитывать энергетический переход. Однако, процесс переноса энергии зависит от близко лежащих взаимодействий, переходы маловероятны на удалении, так (ао/ )2п - разделение, взаимодействующих ионов, может быть также близки к третьей группе л-взаимодействия меньшей чем X, так что эффект переноса энергии стремиться к запрещенным энергетическим переходам. Перенос энергии для полймолекулярных систем можно записать как:

где s - положительное целое число, которое может принимать следующие значения: s = 6 двухмолекулярного взаимодействия, s = 8 двухмолекулярного-квадромолекулярного взаимодействия s = 10 для квадромолекулярного-квадромолекулярного взаимодействия.

Инокути и Хирояма [М. Inokuti, F. Hirayama, Journal of Chemical Physics 1965, 43, 1978.] развили теоретические расчеты Декстера, касательно обменных взаимодействий, экспериментально подтвердив данное явление. Они обнаружили зависимость между квантовым выходом и временем люминисценции донора как функцию количества акцептора [М. Inokuti, F. Hirayama, Journal of Chemical Physics 1965, 43, 1978.].

Когда две молекулы вовлечены в процесс переноса энергии находятся в возбужденных состояниях, интеграл перекрывания стремится к нулю и соответственно к выражению (3) возможно для энергии перехода должно также быть равно нулю [F. Е. Auzel, Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758]. Однако на практике, это говорит, что энергия переноса может занимать место между нерезонирующими молекулами настолько долго насколько разница энергий будет скомпенсирована появлением и аннигиляцией фононов в системе. Слияние матриц вибрационных состояний молекул называемых фононами разрешает энергию перехода пока общая энергия стабильности системы не изменяется. Энергия одного фононзависимого переноса энергии между молекулами в системе равна к d или кТ, где d - температура Дебая [F. Е. Auzel, Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758.]. Если энергия переноса между молекулами больше чем Дебаевская отсеченная частота, перенос описывается в рамках многофотонного процесса.

Для теоретического расчета дистанции, на которой перенос энергии будет наиболее эффективным между парами флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции 5-FAM-BHQ-1 и парой FAM-RTQ-1 рассчитывается согласно теории Форстера.

Уравнение Форстера имеет следующий вид:

Ro=(8.8 х 1023 х к2 х п"4 х QYd Х J(A))1'6 А,

где к2 - фактор дипольной ориентации (от 0 до 4; к2 = 2/3, для различно ориентированных молекул донора и акцептора)

QYd - квантовый выход флуорофора

п - коэффициент преломления

J (А) - спектральный интеграл, вычисляется по формуле: J(A) = / gA(A) х Fd(A) х A4d А см3М\

где gA = молярный коэффициент экстинкции акцептора (см3М'1). Fq = излучение донора, как фракция от общего испускания света системы FRET, доля излучения при данной длине волны, в случае максимума он равен 1.

Само уравнение было разбито на две смысловые части: А = 8.8 х 10" х кг х п4 х QYd,

B = J(A)= JgA(A)xFD(A)xA4dA;

Получаем следующий вид уравнения:

Ro=(A х В)1'6 А,

Коэффициент А имеет обычное скалярное решение. Представляет собой произведение величин, которые являются табличными данными. Коэффициент В, в результате преобразования [J. of biochemistry, Vol. 256. No. 20, Issue of October 25, pp 10485-10489,1981], можно представить в виде -

ÍF(A)*E(A)*A4dA

JM= —%-■

JF(A)dA

где F(A) - флуоресценция донора, выраженная в произвольных еденицах, е(А) -коэффициент экстинкции акцептора, выраженный в М"'ст"1, А - длина волны, выраженная в см. Данный интеграл был решен при помощи встроенной функции программного пакета MATLAB 7.

График спектров излучения и поглощения флуоресценции имеет вид:

1.0 0,8 0,в 0.4 0,2

4M 4SI) «О 550 т

X (нм)

- - максимум флуоресценции FAM

---- максимум поглощения RTQ-1

........ - максимум поглощения BHQ-1

Рис 1. Графики флуоресценции FAM и поглощения RTQ-1 и BHQ-1.

Для решения такого вида интегралов применимы следующие два метода:

1. Метод трапеций, когда известны величина длины волны и соответствующего ей интенсивности флуоресценции или величины поглощения для гасителя флуоресценции. Данная функция реализуется в MATLAB 7 посредством оператора -trapz(...,dim) — возвращает интеграл по строкам или по столбцам для входной матрицы в зависимости от значения переменной dim. В данном случае создаются две матрицы, состоящие из одного столбца, где между нумерованными ячейками имеется зависимость значения оси абсцисс и оси ординат. То есть для точного решения достаточно дискретного массива данных, с шагом, на пример, в 1 нм по оси абсцисс. Данные массивы предоставлены в базах данных MolProbes и Applera Inc (США). Также эти данные можно получить, используя результаты измерения обычного спектрофотометра с любой величиной шага дискретизации. Нами были проделаны такого рода измерения и сняты спектры флуоресценции и поглощения.

2. Метод квадратур, когда известна функция, площадь которой нам необходимо узнать.

jAWdA

Подынтегральное выражение fun задается как стандартная функция. С помощью функции quad(fun.a.b), можно решить такого вида интеграл, которая возвращает численное значение определенного интеграла от заданной функции fun на отрезке длин волн [Ло, А] . Используется значительно усовершенствованный в MATLAB 7 адаптивный метод Симпсона.

Нами был использован первый метод, так как данные с зависимостью функции (А- интенсивность флуоресценции) от аргумента (Л - длина флуоресценции флуорофора и поглощения гасителя флуоресценции) являются легко доступными при снятии спектра флуоресценции. Второй метод требует нахождения функции А(А), что является лишним и сложным шагом в нашей задаче, так как численная зависимость А от А нам известна для каждого флуорофора и гасителя флуоресценции.

Матрица, составленная на основе спектра флуоресценции FAM, где длина волны выражена в нанометрах. Эта матрица представляет собой таблицу, где указаны дискретные значения относительной величины флуоресценции от соответствующей ей длины волны. Форма ввода массива соответствующих значений в виде матрицы принята в среде MATLAB.

Для подсчета коэффициента экстинкции акцептора для различных длин волн воспользуемся законом Бугера-Ламберта-Бера:

С=Аа/(£л*1),

где С - концентрация зонда, моль/литр,

А\ - оптическая плотность раствора при определенной длине волны А нм,

I - длина оптического пути, см,

ел - молярный коэффициент экстинции при А нм, М"1см"1.

Выразив £д, получаем:

с

£Л С*1

А общий интеграл будет иметь вид:

ÍF(A) * Аа * A4dA

JM = "-v-

C*IJF(A)dA

Таким образом, нам необходимы еще две матрицы, построенные на результатах измерения оптической плотности гасителя флуоресценции в составе зонда для ПЦР в реальном масштабе времени. Выразив величину экстинкции гасителя флуоресценции через величину его оптической плотности для определенных, интересующих на длин волн - были записаны еще две матрицы для двух гасителей флуоресценции BHQ-1 и RTQ-1.

Имея величину на оси абсцисс и соответствующую ей значение ординаты в области перекрывания спектров можно использовать метод трапеции. Рассчитав площади трапеций с шагом, выраженным в матрице, используя расчетные мощности математической среды MATLAB, нам удалось решить этот интеграл и уравнение в целом.

Для пары флуоресцентного красителя 5-FAM и BHQ-1 это расстояние составило 55 ангстрем, что соответствует длине олигонуклеотидной цепочки в 24 звена, а для пары FAM-RTQ-1 данная величина равна 50 ангстремам, что соответствует длине цепочки в 21 нуклеотид.

На следующем этапе работы сравнили соответствие расчетных и практических результатов касательно длины зонда для ПЦР-РВ.

3. Проверка теоретических результатов, на практике, методом ПЦР в реальном масштабе времени.

В цели настоящей работы входила оптимизация флуоресцентно-меченого зонда для ПЦР-РВ. Исходя из вышеизложенного, был выбран широко использующийся компонент для создания векторных систем экспрессионной кассеты трансгенных растений - NOS-терминатор.

Для анализа на присутствие ГМИ источников была выбрана соя (Soy-18). Для оценки оптимальной длины олигонуклеотидного спейсера нами было синтезировано два набора зондов, различающихся как по длине олигонуклеотидного участка, так и по гасителю флуоресценции, входящего в состав зондов (рис. 2).

Для работы были синтезированы следующие праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени (табл. 2):

Вопрос о выборе участка, где зонд специфично связывается с матрицей, решается методом подбора последовательности зонда (рис. 2), сайт гибридизации должен обладать высокой специфичностью, зонд необходимо располагать как можно ближе по возможности к праймеру без взаимного перекрывания, избегая

повторов больше чем в 4 нуклеотида в последовательности и комлементарности между зондом и праймерами. Олигонуклеотидная последовательность праймеров для амплификации была выбрана согласно методическим указаниям Министерства здравоохранения РФ [5], NOS - UP 5' - ТТА ТСС TAG ТТТ GCG CGC ТА - 3', NOS -LOW 3' - GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG - 5'. В качестве мишени для анализа на присутствие ГМИ источников была выбрана соя (Soy-18).

Табл. 2. Последовательности праймеров и зондов для проведения ПЦР в реальном времени.

Название Последовательность

NOS-40-RT 5'-3' RTQ1-CGT CAT GCA ТТА CAT GTT ААТ TAT TAC ATG CTT AAC GTA A- FAM

NOS-40-BH 5-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC GTA A- FAM

NOS-37-RT 5'-3' RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC G- FAM

NOS-37-BH 5'-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT AAC G- FAM

NOS-34-RT 5'-3' RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT A- FAM

NOS-34-BH 5-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG CTT A- FAM

NOS-31-RT 5'-3' RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG C- FAM

NOS-31-BH 5'-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC ATG C- FAM

IMOS-28-RT 5-3' RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC A- FAM

NOS-28-BH 5'-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT TAC A- FAM

NOS-25-RT 5-3' RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT T- FAM

NOS-25-BH 5'-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT TAT T- FAM

NOS-22-RT 5'-3' RTQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT T- FAM

NOS-22-BH 5'-3' BHQ1 -CGT CAT GCA TTA CAT GTT AAT T- FAM

Nos - terminator (fragment) + probes

FAM -fi

FAM

-^^I3¡CGTi^:m/WMTTX3TACATTACGTA3TC С- RTQ-1 rACGTTA^GCATGTMTMTrMCATGTMTGCATC/saSTTATTT,

OTAACATGTMTGCA-TG/SCGTTATTTATCSAGAT

FAM -TOCGT?K^rrAlTMTraTACATTAœTACTl3G-Fa"Q-1 MTnurGTTGMTTAœTTAAGCATÔ^^

FAM <»ТЖШТ«ЩАТТТЗТАСАТГАгаТАСГОС^етО-1 MmCTGTTGMTrAœTTAAGCATGÎMT^

>■

FAM HÍ0mÉ/®lATTGTAOATTAOGTACTGC-RfrQ-1 MTTTCTGTTGMTTA03TTAÄ3C^^^

>'

FAM -TTATTAATTGTACATTACGTACTG C- RTQ-1 МТГГСТСПТСМТГАаЗТТААСОТСТ^^

FAM ^TTGÍTACATTACGTACTGC-RTQ-1 MTTTCTGTTCMTTAaSTrAASCATGTMTMTTMCATGTMTGCATGAœTTAmATGAGAT

Рис 2. Нуклеотидная последовательность NOS - terminator, положение зондов на матрице.

Эффективность работы флуоресцентного зонда складывается из ряда факторов:

1) Величина разгорания зонда после расщепления ДНК-полимеразой;

2) Воспроизводимость результатов ПЦР в реальном времени;

3) Низкий уровень начальной флуоресценции зонда.

Таким образом, в результате оптимизации мы предполагали, что наши зонды, согласованные с расчетными данными будут обладать всеми этими вышеперечисленными качествами.

Начало полимеризации

Ф- Флуорофор (донор флуоресценции) А - Гаситель флуоресценции (акцептор)

Прямо* прапмер

Ш

3-

Смещение зонда

„и I,

Обратный

прэйшр

5f-3' Экзонукпеаз- | . ная активность ^ф __ ДНК полимеразы "/«Ч * *

-—:—>-.

Окончание репликации

> _ \

Рис 3. Схема ПЦР в реальном масштабе времени.

Работа была осуществлена в два этапа. На первом этапе были использованы зонды с применением флуоресцентного гасителя BHQ-1(NOS-37-BH, NOS-34-BH, NOS-31-BH, NOS-28-BH, NOS-25-BH, NOS-22-BH). Эта работа была выполнена на приборе ¡Cycler (BIO-RAD, USA). Где была возможность использовать градиент температуры отжига, с целью определения оптимального значения.

Оптимальная температура отжига для зондов различной длины составила 60°С.

Второй этап опыта был проведен на приборе АНК-32 (Санкт-Петербург, Россия). В данном опыте были задействованы все зонды, указанные в табл. 2. Целью данного эксперимента являлось сравнение эффективности работы всех зондов, выделение из них лучших и сравнение длины их спейсерной части с рассчитанной в предыдущей главе.

В результате анализа стало понятно, что этим требованиям отвечают зонды с длинной линкера в 22-25 нуклеотидных звеньев, что соотносится с данными, полученными при расчете радиуса Форстера. Также была подсчитана величина Е, характеризующая эффективность переноса энергии с флуорофора на гаситель флуоресценции. Данная математическая модель может быть применена для дизайна флуоресцентно-меченых зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.

На рис. 4 и рис. 4.1 показаны результаты ПЦР-РВ с зондами различающимися как по длине, так и по температуре отжига, таким образом можно выделить зонды с длиной спейсера в 22 и 25 нуклеотидных звеньев с температурой отжига в 55,7 °С, с целью уменьшения неспецифичной гибридизации для следующего эксперимента

была взята температура в 60°С. Таким образом следующая часть работы была приведена к данному общему условию. И останется только один фактор для вариации - длина олигонуклеотидного спейсера, который необходимо оптимизировать.

О г 4 6 8 10 12 И 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52

Cycle

Рис 4. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, общий вид (¡Cycler, BIO-RAD Laboratories Inc.).

PCR AmpJCycle Graph for FAM-490

Cycle

Рис 4.1. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, с отдельными, выделенными значениями (¡Cycler, BIO-RAD Laboratories Inc.).

4 РасчбтЛвтомат>,чес>гнй( 1 -ГМ!)

Каналы;^ Цции

¡7 1 |Г5ГэГ! 100 000 ----

•у г 1[М1.;

я э ЦШЗ »000,

У4.1-Щ7П.: юсао'

У 5 | [шз '

»6 ип^п 85 000

* 1СИЕ] во ООП |

»§1Щ ■

* 5 ШГШ) 75 000 !

УюП .

9 11 1СЖЮ то соо

*1г В ШШ :

85 000

я и Ирв^Г] во 000

Г> 15 РГЖ52П '

е 1Б ШПГае! 55000

£0 000

«С ООО

40 ООО

35000

30 соо

?5 осе

Л ООО

15000

юоос

5000

Б ? « 6 1011 12 13 14 16 1817 18 19 30 21 22*3 2« 25 35 27 23 23 30 31 33 3314 X 32 37 38 33 «041 «3 43 « 45 46 47 <0*3 50

Рис 5. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, общий вид (АНК-32, Россия).

Рис 5.1. График зависимости интенсивности флуоресценции от циклов ПЦР в реальном времени, с отдельными, выделенными значениями (АНК-32, Россия).

На рис. 5 и рис. 5.1 показаны результаты ПЦР-РВ со всем спектром синтезированных зондов, среди полученных результатов стоит выделить зонды с длиной спейсерной части в 22 и 25 нуклеотидов.

Табл. 3. Результаты ПЦР в реальном масштабе времени, полученные на ¡Cycler (BIO-RAD, USA), где Ct - значение нулевого цикла, Т0Тж*га - температура отжига, F0TH - относительная величина флуоресценции, количество звеньев - количество нуклеотидных звеньев между флуорофором и гасителем флуоресценции в зонде.

Расчетная величина Форстера для пары FAM-BHQ-1 - 24 звена

Зонд et Тотжига f*OTH Кол-во Звеньев Е

NOS-37-BH 27,9 67 125 37 0,0693

NOS-34-BH - 67 - 34 0,1101

NOS-31-BH 37,9 67 134 31 0,1772

NOS-28-BH - 67 - 28 0,2840

NOS-25-BH - 67 - 25 0,4391

NOS-22-BH 38,9 67 140 22 0,4992

NOS-37-BH 27.3 66 120 37 0,0693

NOS-34-BH 29,2 66 210 34 0,1101

NOS-31-BH 35,2 66 80 31 0,1772

NOS-28-BH - 66 - 28 0,2840

NOS-25-BH - 66 - 25 0,4391

NOS-22-BH 43,5 66 115 22 0,4992

NOS-37-BH 25,8 64,3 180 37 0,0693

NOS-34-BH 27,2 64,3 190 34 0,1101

NOS-31-BH 28,1 64,3 95 31 0,1772

NOS-2B-BH 33,2 64,3 45 28 0,2840

NOS-25-BH 46,0 64,3 38 25 0,4391

NOS-22-BH 35,2 64,3 35 22 0,4992

NOS-37-BH 26,8 61,5 230 37 0,0693

NOS-34-BH 27,1 61,5 275 34 0,1101

NOS-31-BH 27,6 61,5 400 31 0,1772

NOS-28-BH 27,8 61,5 175 28 0,2840

NOS-25-BH 29,7 61,5 140 25 0,4391

NOS-22-BH 29,9 61,5 110 22 0,4992

NOS-37-BH 25,8 57,7 350 37 0,0693

NOS-34-BH 26,8 57,7 250 34 0,1101

NOS-31-BH 27,0 57,7 260 31 0,1772

NOS-28-BH 27,1 57,7 297 28 0,2840

NOS-2S-BH 27,1 57,7 300 25 0,4391

NOS-22-BH 27,2 57,7 305 22 0,4992

NOS-37-BH 26,2 55 210 37 0,0693

NOS-34-BH 26,7 55 225 34 0,1101

NOS-31-BH 26,8 55 440 31 0,1772

NOS-28-BH 27,0 55 280 28 0,2840

NOS-25-BH 27,0 55 290 25 0,4391

NOS-22-BH 27,0 55 435 22 0,4992

NOS-37-BH 26,3 53,1 238 37 0,0693

NOS-34-BH 26,5 53,1 245 34 0,1101

NOS-31-BH 26,6 53,1 320 31 0,1772

NOS-28-BH 26,7 53,1 350 28 0,2840

NOS-25-BH 26,7 53,1 420 25 0,4391

МОЗ-22-ВН 26,8 53,1 475 22 0.4992

1Ч03-37-ВН 26,2 52 325 37 0,0693

Ы03-34-ВН 26,6 52 255 34 0,1101

N03-31-ВН 26,7 52 550 31 0,1772

N05-28-84 26,8 52 295 28 0,2840

ИОЗ-25-ВН 27,0 52 340 25 0,4391

иов-гг-вн 26,7 52 500 22 0,4992

Табл. 4. Результаты ПЦР в реальном масштабе времени, полученные на АНК-32 (Санкт-Петербург, Россия), где С( - значение нулевого цикла, Тотаога - температура отжига, Яо™ - относительная величина флуоресценции, количество звеньев -количество нуклеотидных звеньев между флуорофором и гасителем флуоресценции в зонде.

Расчетная величина Форстера для пары РАМ-ВНСМ - 24 звена Расчетная величина Форстера для пары РАМ-КТО -21 звено

Зонд а Тотжига ^отн. Кол-во Звеньев Е

М0&40-вн 26,86 60 270 40 0,0446

Ы03-37-ВН 26,50 60 345 37 0,0693

Ш5-34-ВН 26,71 60 420 34 0,1101

Ы03-31-ВН 26,72 60 600 31 0,1772

МОЗ-28-ВН 27,61 60 700 28 0,2840

КЮЗ-25-ВН 26,24 60 710 25 0,4391

ыов-гг-вн 26,47 60 790 22 0,4992

N03-40-^ 26,34 60 240 40 0,0205

N03-37-^ 28,72 60 290 37 0,0323

ЫОБ-^Т 26,34 60 350 34 0,0526

N03-31-^ 26.71 60 360 31 0,0881

МОЭ-28-РТ 26,72 60 460 28 0,1511

N03-25-^ 25,52 60 490 25 0,2600

моэ-гг-ят 25,52 60 530 22 0,4307

При анализе таблиц 3 и 4 обратили внимание на результаты ПЦР-РВ с зондами, имеющих длину 22 и 25 нуклеотидов, и на расчет для них теоретической эффективности, выраженной в долях (Е=1 - наилучшая эффективность), таким образом, наблюдается строгое соответствие между расчетными данными и результатами ПЦР-РВ.

Уровень флуоресценции 5-РАМ измерялся относительно флуоресценции 5-Я6Б. Эксперимент проводили при эквивалентных значениях флуоресценции у внешнего контроля и флуорофора, входящего в состав зонда.

В ходе работы были созданы оригинальные схемы синтеза и очистки флуоресцентных красителей ксантенового ряда, гасителей флуоресценции их активированных производных с целью получения зондов для ПЦР-РВ. Это позволит получать ПЦР-диагностикумы для обнаружения различных ДНК-мишеней.

Спектральные характеристики синтезированных красителей, встроенных в зонды, имеют хорошую динамику повышения флуоресцентного сигнала и высокий квантовый выход и имеют те же спектральные характеристики, что и зарубежные

аналоги. Также была применена и подтверждена математическая модель для создания зондов, имеющих минимальный уровень стартовой флуоресценции, что объясняется наиболее эффективным переносом энергии с донора на акцептор в системе переноса флуоресцентной энергии.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны оригинальные схемы синтеза флуоресцентных красителей (ROX, TAMRA,. R6G, FAM) и гасителей флуоресценции (BHQ-1, RTÛ-1) и их активированных производных, для создания зондов ПЦР-РВ.

2. Предложен новый математический подход для планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени. Предложен доступный и универсальный метод расчета величины Форстеровского радиуса для любых линейных зондов.

3. Разработан алгоритм расчета Форстеровского радиуса для систем зондов с флуорофором - FAM и гасителями флуоресценции BHÛ-1 и RTQ-1 с помощью программной среды для математических вычислений - MATLAB.

4. Подтверждена эффективность математического подхода планирования зондов для ПЦР-РВ. Обнаружена корреляция между значениями связанных с расчетом величины Е, эффективностью работы системы с переносом энергии по Форстеру, и величины флуоресцентного сигнала, полученного в результате протекания ПЦР в реальном масштабе времени. На практике данный подход позволит в лабораторных условиях с высокой степенью точности и надежности планировать зонды для ПЦР-РВ для решения любых диагностических задач.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гудов В.П.. Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Лунин В.Г., Харченко П.Н. Разработка подхода эффективного планирования флуоресцентно-меченых зондов для ПЦР в реальном времени. II Доклады РАСХН. 2007 г. № 6. с. 7 -11.

2. Гудов В.П.. Лунин В.Г., Швец В.И. Создание модифицированных сорбентов для твердофазного синтеза зондов для ПЦР в реальном масштабе времени // Вестник МИТХТ. 2009 г. Т. 4, № 5, с. 28-33.

3. Гудов В.П. Создание зондов для диагностикума трансгенных растений. Изучение подходов эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени. II Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Рязань. 29 мая -1 июня 2007 г., с. 209-211.

4. Гудов В.П.. Алексеев Я.И., Лунин В.Г. Синтез флуоресцентно-меченых зондов и их составляющих для проведения ПЦР реальном времени. Il II Международный конгресс «Биотехнология; состояние и перспективы развития», Материалы конгресса, часть 1, с. 192, Москва 2003 г, 10-14 ноября.

5. Goodoff P. Vladimir Preparation of succinimidyl active esters of N,N'-Tetramethyl-5(6)-Carboxyrhodamine and 5(6)-Carboxy-X-Rhodamine. // The Book.

Biotechnology in Agriculture and the Food Industry. Editor Zaikov G.E. pp. 35-38, Nova Publishers, Inc, New York 2004.

6. Карзанова M.E. Кунда M.C., Гудов В.П.. Лунин В.Г., Воронина О.Л. «Разработка диагностических наборов для выявления трансгенных растений» // III Международная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», материалы конференции, Москва 2004 г., 19 октября, с. 127-128.

7. Гудов В.П. Новые методы синтеза флуоресцентных красителей для создания зондов, использующихся в ПЦР в реальном времени. // IV Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», Сборник работ конференции, Москва 2004 i., 31 марта, с. 8-11.

8. Гудов В.П.. Создание флуоресцентных красителей и их активированных производных, с целью синтеза зондов для ПЦР в реальном времени. II III Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», Сборник работ конференции, Москва 2003 г., 10 апреля, с. 23-25

9. Гудов В.П., Новые методы синтеза флуоресцентных красителей и их модификаций для секвенирования ДНК и создания зондов для ПЦР в реальном времени. // II Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии», Сборник работ конференции, Москва 2002 г., 3 апреля, с. 24-25.

Подписано в печать: 06.10.2009

Заказ № 2643 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwW.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Гудов, Владимир Петрович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Генетически модифицированные организмы.

1.1.1. Обоснование необходимости создания трансгенных растений.

1.1.2. Проблемы использования ГМ-продукции.

1.1.3. Актуальность диагностики трансгенных культур.

1.1.4. Методы обнаружения ГМО.

1.2. Полимеразная цепная реакция.

1.2.1. Принцип метода полимеразной цепной реакции.

1.2.1.1. Компонентная база.

1.2.1.2. Циклический температурный режим.

1.2.1.3. Эффект "плато".

1.2.2. Амплификация.

1.2.3. Оценка результатов реакции.

1.2.3.1. Метод горизонтального электрофореза.

1.2.3.2. Метод гибридизационных зондов.

1.2.3.3. Метод ПЦР в реальном масштабе времени.

1.2.3.4. Химические реагенты, необходимые для обеспечения проведения ПЦР в реальном времени.

1.2.3.5. Неспецифическое детектирование.

1.2.3.6. Специфическое детектирование.

1.2.3.7. Зонд (Scorpion probe), имеющий праймерную часть вместе с системой FRET.

1.2.3.8. Молекулярные маяки (Molecular Beacon probes™).

1.2.3.9. Линейные зонды, содержащие два красителя (TaqMan™).

1.2.4. Понятие порогового цикла.

1.2.5. Полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени.

1.2.6. Приборы для ПЦР в реальном времени.

1.3. Люминофоры, теория флуоресценции.

1.3.1. Важнейшие характеристики люминесцентных веществ.

1.3.2. Возбужденные состояния молекул.

1.3.3. Пути дезактивации возбужденного состояния. Сенсибилизация и тушение флуоресценции.

1.3.4. Ксантеновые флуоресцентные красители.

1.3.4.1. Строение и свойства

1.3.4.2. Разнообразие ксантеновых красителей.

1.3.5. Системы с переносом энергии (ШЕТ системы).

1.3.5.1. Гасители флуоресценции.

1.3.5.2. Сравнение механизмов переноса энергии от донора к акцептору флуоресценции

Глава 2. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Синтез компонентов для создания флуоресцентных зондов.

2.1.1. Синтез флуоресцентных красителей.

2.1.2. Синтез активированных сукцинимидных эфиров флуоресцентных красителей

2.1.3. Синтез молекул прекурсоров на основе флуоресцентных красителей для иммобилизации их на СРО.

2.1.4. Синтез гасителя флуоресценции ВНС>-1 и его фосфорамидита.

2.2. Решение уравнения Форстера.

2.2.1. Теоретическая база.

2.2.2. Преобразование и решение модифицированного уравнения Форстера

2.3. Проверка теоретических результатов, на практике, методом ПЦР в реальном масштабе времени.

2.3.1. ПЦР в реальном масштабе времени и анализ результатов.

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и приборная часть.

3.2. Общие методики.

3.2.1. Приготовление растворителей.

3.2.2. Определение концентрации олигонуклеотидов и зондов.

3.3. Синтез ксантеновых флуоресцентных красителей и их активированных производных.

3.3.1. Синтез 8-гндроксиюлолидина (26) из 3-аминофенола.

3.3.2. Синтез 5'-карбокси-Х-родам1ша (6 а,б).

3.3.3. Синтез 14,>Г-тетраметил-5'(6')-карбоксиродамина (7 а,б)

3.3.4. Синтез 5'(6')-карбокси-6С-родамина (8 а,б).

3.3.4.1. Получение Ы,Ы'-дитрифторацетил-5'(6')-карбокси-60-родамина (5(6)

Кбв, Т£а) (8 в,г).

3.3.5. Синтез 5'(6')-карбоксифлуоресцеина (9 а,б).

3.3.5.1. Синтез 0,0'-дипивалата-5'(6')-карбоксифлуоресцеина (0,0'-Рп?-5(6)

БАМ) (9 в,г).

3.3.6. Сукцинимидный эфир 0,0'-дипивалата-5'-карбоксифлуоресцеина (13 б)

3.3.7. Сукцинимидный эфир Ы,1чГ'-тетраметил-5'-карбоксиродамииа (11 б)

3.3.8. Сукцинимидный эфир М,Ы'-дифторацетил-Ы,Ы'-диэтил-2,7-диметил-5'-карбоксиродамина (12 6).

3.3.9. Сукцинимидный эфир 5'-карбоксиродамина X (10 б).

3.3.10 0,0'-<ШЧу-5-РАМ, АРОМТг 3-(3'-0-диметокситритил-(пропа11-2,,3'диол))-пропиламнд 0,0'-дипивалоил-5'-карбоксифлуоресцеина (22)

3.3.11. 5-ТАМЯА, АРОМТг 3-(3'-0-диметокснтритил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламид К,№-тетраметил~5'-карбоксиродамина (23).

3.3.12. 5-Ы6С, ТБА APDM.Tr 3-(3'-0-диметокситритил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламид Ы,Ы'-дифторацетил-К,К'-диэтил-2,7-диметил-5'-карбоксирод амина (24).

3.3.13. 5-1ЮХ, АРОМТг 3-(3'-0-диметокситритил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламид 5'-карбоксиродамина X (25).

3.3.14. 3-(3'-0-Диметокситритнл-2'-0-сукцинил-(пропан-2',3'-диол))-пропи-ламида 0,0'-днпивалоил-5'-карбоксифлуоресцеина (26).

3.3.15. 3-(3'-0-Диметокситритил-2'-0-сукцинил-(пропан-2',3'-диол))-пропиламида 1чГ,М'-тетраметил-5'-карбоксиродамина (27).

3.3.16. 3 -(3 '-О-Диметокситритил-2 '-0-сукцинил-(пропан-2' ,3 ,-диол))-пропи-ламида К,№-дифторацетил-^М'-диэтил-2,7-диметил-5'-карбоксирода-мина (28).

3.3.17. 3-(3 '-О-Диметокситритил-2' -0-сукцинил-(пропан-2' ,3 ,-диол))-пропиламида 5'-карбоксиродамина X (29).

3.4. Синтез гасителя флуоресценции ВН(2-1 и его активированного производного

3.4.1. Синтез 4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-4',-(ЫД<Г'-дигидроксиэтил)-5'-метилазобензола (ВНС>-1) (36).

3.4.2. Синтез монотритил производного ВНС>-1 - (4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-5'-метилазобензил-4м-(^етил-2-0-(4,4'-диметокситритил))-М-этан-2-ола (37).

3.4.3. Синтез монотритил производного ВН<3-1 фосфорамидита - (4'-(2-нитро-4-толуолдиазо)-2'-метокси-5'-метилазобензил-4"-(М-етил-2-0-(4,4'-диме-токситритил))-Ы- 2-цианоэтил-(ЪГ^,-диизопропил)-фосфорамидита (39)

3.5. Синтез и очистка зондов.

3.6. ПЦР в масштабе реального времени.

3.7. Расчет эффективности работы зондов для ПЦР-РВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка подхода к планированию зондов для эффективной ПЦР в реальном масштабе времени"

Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка диагностических наборов реагентов для выявления генетически модифицированных источников (ГМИ) в семенном материале, кормах животных, пищевых продуктах лекарственном сырье и т.д. Принцип работы современных приборов для анализа ДНК базируются на количественном определении ДНК, используя метод ПЦР в реальном масштабе времени. Зарубежные приборы и реактивы для них, разработанные для осуществления данной методологии достаточно дороги. В настоящее время созданы отечественные аналоги приборной и реагентной базы; доступные по ценовым и качественным характеристикам, для лабораторий, проводящих массовые исследования.

Для тестирования трансгенных растений применяют те же жесткие стандарты по параметрам токсичности и аллергенности, что и для традиционных новых сортов культурных растений или новых видов продуктов питания.

В настоящий момент невозможно полностью исключить ошибки в сертификации генетически модифицированных растений (ГМР). Продукты, полученные с использованием ГМР, по международным нормам и согласно санитарным нормам РФ должны нести на себе информацию в виде маркировки, из которой явно следовало бы, что продукт был получен из генетически модифицированных организмов. Пищевой продукт маркируется соответствующим образом, если соотношение трансгенного продукта к генетически немо-дифицированному более 0,9% .

Особую актуальность приобретают проблемы идентификация и оценки количественного содержания модифицированной ДНК пищевых продуктов, полученных из ГМР. Для выполнения этой задачи необходимо создание простой, воспроизводимой и доступной широкому кругу лабораторий, систему диагностики трансгенных растений и продуктов питания.

На сегодняшний день существует два основных подхода, которые позволили бы решить вышепоставленную задачу.

1 - Иммуноферментный анализ.

Данный метод использует специфичность антител к интересующему белковому материалу, содержащемуся в ГМР. Он показывает наличие и количество белка в исследуемой пробе с высокой специфичностью.

Основным недостатком является невозможность тестирования белков в образцах, прошедших термическую и биохимическую обработку.

2 - метод ПЦР.

Предпосылкой для ГМО детекции является наличие информации о типе генетической модификации, последовательность нуклеотидов введенного гена и регуляторных элементах (промотор и терминатор). Для анализа необходимы микроколичества исследуемого образца, содержащего ДНК материал, включающий целевой ДНК фрагмент. Генетический материал остается стабильным.

Достоинствами ПЦР диагностики является:

1. Высокая чувствительность, способность детектировать от одной до нескольких у копий искомого гена в рамках генетического материала организма или в смесях пищевых продуктов.

2. Меньшее время, затрачиваемое на производство реагентов для анализа

3. ПЦР-диагпостика способна различить несколько различных вариантов генетической модификации в геноме трансгенного растения, тем самым повышая точность анализа.

4. Генетичесий материал не претерпевает качественных изменений в процессе превращения трансгенного растения в продукт, употребляемый в пищу. Тогда как белок, как мишень анализа менее устойчив, что может привести к недостоверным результатам анализа

Целью данной работы являлось создание методологической и компонентной базы, а также оригинальных схем синтеза флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции, разработка подхода для эффективного планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.

Задачи данного исследования:

1. Синтез флуоресцентных зондов для ПЦР в реальном времени на основе собственной оригинальной методологической с варьированием длины олигонуклеотидной части и взаимном расположении флуорофора и гасителя флуоресценции;

2. Проверка синтезированных зондов на объекте растительного происхождения, с целью определения в нем ЫОЗ-терминатора - широко распространенного маркера генетически модифицированных растений;

3. Формирование критериев и математического аппарата планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени;

4. Проведение математического расчета Фостеровского радиуса, оптимального с точки зрения используемой системы.

В результате выполненной работы впервые была создана отечественная методологическая база для получения наборов реагентов для осуществления ПЦР в реальном масштабе времени. Созданы оригинальные схемы синтеза и очистки флуоресцентных красителей ксантенового ряда, гасителей флуоресценции их активированных производных с целью получения зондов для ПЦР-РВ. Это позволит получить новый ПЦР-диагностикум, для обнаружения различных смысловых ДНК-фрагментов в генах растений, что дает основание для дальнейших исследований в данной области с целью создания новых наборов, или их модификации с целью дальнейшей оптимизации и адаптации под новые задачи.

Научная новизна заключается в проверке теоретического подхода для планирования флуоресцентных зондов, основанного на эффекте Форстера с правками, учитывающих вероятностную пространственную ориентацию красителя и гасителя молекул флуоресценции, задача подобного плана была поставлена и осуществлена впервые.

На практике данные наборы позволят в лабораторных условиях с высокой степенью точности и надежности исследовать растения и продукты питания на предмет генетической модификации, что позволит их идентифицировать как трансгенные.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гудов, Владимир Петрович

Выводы

1. Разработаны оригинальные схемы синтеза и очистки флуоресцентных красителей (ЯОХ, ТАМИЛ, ЯбО) и их активированных производных, меченных ими зондов. Был предложен новый математический подход для планирования зондов для ПЦР в реальном масштабе времени.

2. Предложен доступный и универсальный метод расчета величины Форстеров-ского радиуса для любых линейных зондов. Обнаружена корреляция между значениями связанных с расчетом величины Е, эффективностью работы системы с переносом энергии по Форстеру, и величины флуоресцентного сигнала, полученного в результате протекания ПЦР в реальном масштабе времени.

3. Разработан алгоритм расчета Форстеровского радиуса для систем зондов с флуорофором - БАМ и гасителями флуоресценции ВН<3-1 и КТС>-1 с помощью программной среды для математических вычислений — МАТЬАВ.

4. Подтверждена эффективность математического подхода планирования зондов для ПЦР-РВ. На практике данный подход позволит в лабораторных условиях с высокой степенью точности и надежности планировать зонды для ПЦР-РВ для решения различных диагностических задач.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Гудов, Владимир Петрович, Москва

1. Conner A.J, Jacobs J.M. "Genetic engineering of crops as potential source of genetic hazard in the human diet". // Mutat Res. 1999, Jul 15, 443(1-2), pp. 223-234.

2. Hammond J. "Overview: the many uses and applications of transgenic plants". // Сип-Тор Microbiol Immunol. 1999, 240, pp. 1-19.

3. Гончаров Ю.Л. «Общие положения опытов в оценке биобезопасности трансгенных растений» Серия "Генетическая инженерия и экология". // М.: Центр "Биоинженерия" РАН, 2001. Т.2. с. 120.

4. Vaitilingom М., Pijnenburg Н., Gendre F., Brignon P. «Real-time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready soybean in some representative foods». //J. Agric. Food Chem. 1999, Dec, 47(12), pp. 5261-5266.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. // Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. с. 589.

6. Маниатис Т. "Молекулярное клонирование". //М.: Мир, 1984.

7. Holland P., Abrainson R.D., Watson R. and Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction products by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of thermos acuaticus. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1991, Vol.88, pp. 7276-7280.

8. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. // Analytycal Biocliemistry.-1999. -№273,- p. 221-228.

9. Tyagi S., Marras A.E., and Kramer F.R., Wavelength-shifted molecular beacons. // Nature Biotechnology, 2000, Vol.18, pp.1191-1196.

10. Nasarabadi S., Milanovich F., Richards J. and Belgrader P. Simultaneous detection of TaqMan probes containing FAM and TAMRA reporter fluorophores. // BioTechniques, 1999, Vol.27 (6), pp. 1116-1117.

11. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. //Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030.

12. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. // Analytycal Biochemistry.-1999.-№273,- p. 221-228.

13. Berlman B. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules. // N. Y. — London, Academic Press, 1965, p. 258.

14. Нурмухамстов P. И. Поглощение и люминесценция ароматических соединений. М„ Химия, 1971.216 с.

15. Эльдерфильд Р. ред., Гетероциклические соединения, том 2. // Издатинлит, Москва, 1954 г.

16. Forster Т. Fluoreszenz organischer Verbindungen. Gottingen,Vandenhoeck Ruprecht, 1951.320 с.

17. Теренин A. H. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. JL, Наука, 1967. 616 с.

18. Berlman I. В. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules. N. Y. — London, Academic Press, 1965. 258 p.

19. Снагощенко JI. П., Богданова JI. И., Григорьева В. И. — В кн.: Сцинтилляторы и органические люминофоры. Харьков, ВНИИ монокристаллов, 1973, вып. 2, с. 9—15.

20. Chardonncrs, Schlapbach, // Hoiv. Chim. Acta, 1940, V. 29, p 1413.

21. Мигге1 J. N. The Theory of the Electronic Spectra of Organic Moleculs. London, Chapman a. Hall, Ltd., 1971. 328 p.

22. Wilkinson F. Advances in Photochemistry. — N. Y. etc., 1964, v. 3, p. 241—263.

23. Vencataraman V. The chemistry of synthetic dyes .: N.Y. — London, Academic Press, 1971. p. 1441.

24. Mitchell R.H. A novel reaction of a-chlorosulfides. A new synthesis of diarylethyl-enes (stilbenes) // Tetrahedron Lett., 1973, № 44, p. 4395-4398.

25. Pete Theisen, Christie McCullum, Krishna Upadhya, Karen Jacobson, Huynb Vu, Alex Andrus Fluorescent dye phosphoramidite labelling of oligonucleotides // Tetrahedron Letters, Volume 33, Issue 35, 25 August 1992, pp. 5033-5036

26. J. Woodland Hastings Bioluminescence : Cell Physiology Source Book (Third Edition), 2001, Pages 1115-1131.

27. Forster, T. Intermolecular energy migration and fluorescence. // Ann. Phys. (Leipzig) 1948, 2:55-75.

28. Auzel F.E. // Proceedings of the IEEE 1973, 61, 758.

29. Dietrich et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and competing processes in donor-acceptor substituted DNA strands: a comparative study of ensemble and single-molecule data. // Reviews in Molecular Biotechnology, 1996, vol. 82, p 221-231.

30. Dale, R. E., J. Eisinger and W. E. Blumberg. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. // Biophys. J. 1979 26:161-93.

31. Van der Meer, B. W., G. Coker and S. Y. S. Chen. Resonance energy transfer : theory and data. // 1994, New York: Vch. x, 177 p.

32. Blasse G. // Materials Chemistry and Physics 1987, 16, 201.

33. Dexter D.L.// Journal of Chemical Physics 1953,21,836.

34. Inokuti M., Hirayama F. // Journal of Chemical Physics 1965, 43, 1978.

35. Lois M. Geren and Francis Millett // J. of biochemistry, 1981, Vol. 256. No. 20, Issue of October 25, pp. 10485-10489.

36. Сергиеико А., Цифровая обработка сигналов. // Санкт-Петербург, изд. Питер. 2002.

37. Мэтьюз Д., и Финк К. Численные методы. Использование MATLAB. // Вильяме, Москва 2001.

38. Дьяконов В., Абраменкова И. MATLAB. Обработка сигналов и изображений. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2002.

39. Дьяконов В., Вейвлеты. От теории к практике. // Солон-Р, Москва 2002.

40. Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Анисимова О.В. Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полиме-разной цепной реакции. // Методические указания МУК 4.2. 1902 -04. Минздрав России. Москва 2004.

41. Steven A. Kates, Femando Albericio Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide / Marcel Dekker Inc., USA, New York, 2000, p. 475-529.

42. Förster T., Fluoreszenz organischer Verbindungen. // Göttingen, Vandenhoeck Ruprecht, 1951.320 S.

43. Гинцбург A.JT., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса « Здоровое питание населения России» Москва, 2003, с. 123-124.

44. Степанов Б.И. В кн.: Волысенштейн М.В. Строение и физические свойства молекул. // М.-Л., Изд-во АН СССР. 1955, с. 560-576, 579-581.

45. Терепин А. И. Фотоника молекул красителей и родственных органических соединений. // Л., Наука, 1967. 616 с. 7.

46. Чен К., Джиблин П., Ирвинг A. MATLAB в математических исследованиях. // Мир, Москва 2001.

47. Ануфриев И., Самоучитель MatLab 5.3/б.х. // Санкт-Петербург, 2002.

48. Божевольнов Е. А. Люминесцентный анализ. // М., Химия, 1966. 415 с.

49. Вест В. Применение спектроскопии в химии. // М., Издатинлит, 1959. 659 с. 5.

50. Мартынов Н., Введение в MATLAB 6. // Кудиц-образ, Москва 2002.

51. Гультяев А., MATLAB 5.3. Имитационное моделирование в среде Windows. // Корона принт, Москва 2001.

52. Данилов А. Компьютерный практикум по курсу "Теория управления". Simulink-моделнрование в среде Matlab. // МГУИЭ, Москва 2002.58. Директива ЕС 1430/94/ЕС.

53. Дьяконов В. Компьютерная математика. Теория и практика. // Нолидж, Москва 2000.60. Директива ЕС 89/622/ЕС.61. Директива ЕС 90/425/ЕС.

54. Haughland, R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. // Molecular Probes, Eugene , OR, 1992.

55. Медведев В., Потемкин В. Нейронные сети. MATLAB 6. // Диалог-МИФИ. Москва 2002.

56. Дьяконов В. MATLAB: Учебный курс. // Санкт-Петербург, изд. Питер, 2000.

57. Haughland, R.P., Wise D.L., and Wingard D. Biosensors with Fiberoptics. // Humana Press, Clifton, NJ 1991, p. 85 -109.

58. Heid С.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

59. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

60. Глушаков C.B., Жакин И.А., Хачиров Т.С. Математическое моделирование. Mathcad 2000. Matlab 5.3. // ACT., 2001.

61. Гультяев А. MATLAB 5.2. Имитационное моделирование в среде Windows. // Корона принт, Москва 1999.

62. Lakowicz, J. R. Energy Transfer. // Principles of Fluorescence Spectrosopy. 2nd ed. Plenum, New York. 1999, 367-394.

63. Дорф P., Бишоп P., Современные системы управления. // Перевод с английского. Лаборатория базовых знаний, Москва 2002.

64. Дьяконов В. MATLAB 6: Учебный курс. // Санкт-Петербург, изд. Питер, 2001.

65. Дьяконов В., Абраменкова И., Круглов В. MATLAB с пакетами расширений. // Нолидж, Москва 2001.

66. Wolfenbarger LL, Phifer PR."The ecological risks and benefits of genetically engineered plants". // Science. 2000, Dec 15; 290(5499), pp.2088-2093.

67. Дьяконов В., Круглов В. Математические пакеты расширения MATLAB. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2001.

68. Дьяконов В., Круглов В., MATLAB. Анализ, идентификация и моделирование систем. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2001.

69. Кондратов В., Королев С., Matlab как система программирования научно-технических расчетов. // Мир., Москва 2002.

70. Дьяконов В. Simulink 4. // Санкт-Петербург, изд. Специальный справочник. Питер, 2001.

71. Королев A.A. «Медико-биологическая оценка качества и безопасности генетически модифицированных источников пищи» Серия "Генетическая инженерия и экология". // М.: Центр "Биоинженерия" РАН, 2001. Т.2. с. 165.

72. Круглов В., Дли М., Голунов Р. Нечеткая логика и искусственные нейронные сети. // Физматлит, Москва 2001.

73. Левенко Б.А.'Ъиотехнология растений: сегодня и завтра" // Физиология и биохимия культурных растений, 1999, т. 31, № 3, с. 163-172.

74. Потемкин В. Система Matlab 5 для студентов. // Диалог-МИФИ, Москва. 1998.

75. Мартынов Н., Иванов A. Matlab 5.x. Вычисления, визуализация, программирование. // Кудиц-образ, Москва 2000.

76. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., Петухов A.PL, Королев А.А., Аксюк II.Н., Сорокина Е.Ю. «Современные подходы к оценке безопасности генетически модифицированных источников пищи. Опыт изучения соевых бобов линии 40-3-2» // Вопросы питания, Москва 1999.

77. Патрушев JI. И. Искусственные генетические системы. // М.: Наука, 2005, 2 т. pp. 458-486.

78. Потемкин В. Введение в MATLAB. // Диалог-МИФИ, Москва 2000.

79. Orndorff, Purdy // J. Am. Chem, Soc. 48, 2212 (1926).

80. Owens, M.A., Loken M.R. Flow Cytometry: Principles for Clinical Laboratory Practice // Wiley-Liss, New York, 1995, pp. 28-29.

81. Rogers S.O. & Bendich A.J. «Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues». // Plant Molecular Biology. 1985, 5, pp. 69-76.

82. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. // BioTechniques.-1995.-№ 13.- p.444-449.

83. Потемкин В. Инструментальные средства Matlab 5.x. // Диалог-МИФИ, Москва 2000.

84. Потемкин В. Система MATLAB. Справочное пособие. // Диалог-МИФИ, Москва 1997.

85. Потемкин В. Система инженерных и научных расчетов MATLAB 5.x (в 2-х томах). //Диалог-МИФИ, Москва 1999.

86. Романов Г.А. "Генетическая инженерия растений и пути решения биобезопасности" // Физиология растений, 2000, т. 47, № 3, с. 343-353.

87. Рудаков П., Сафонов В. Обработка сигналов и изображений Matlab 5.x. // Диалог-МИФИ, Москва 2000.

88. Wei-Chuan Sun, Kyle R. Gee, Dieter H. Klaubert and Richard P. Haugland. J. Synthesis of fluorinated fluoresceins. // Org. Chem., 1997, 62, pp. 6469-6475.

89. Wilkinson F. — In; Advances in Photochemistry. // N. Y. etc., 1964, v. 3, p. 241— 268.

90. Семененко M., Введение в математическое моделирование. // Солон-Р, Москва 2002.

91. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. // Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004, с. 496.

92. Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. // Москва, Мир 1985.

93. Adamczyk M., Jeffrey R. Fishpaugh and Kevin J. Heuser. Preparation of suc-cinimidyl and pentafluorophenyl active esters of 5- and 6-carboxyfluoresccin. // Bioconjugate Chem., 1997, 8, pp. 253-255.

94. Bodanszky, M. The Peptides. // Academic Press, New York, 1979, Vol. 1, pp. 106175.

95. Bright F.V. Bioanalytical Applications of Fluorescence Spectroscopy. // Anal. Chem. 1998, 60, 1031A-1039A.

96. Clegg ct al. Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer. // PNAS vol. 90, 1993, pp.2994 2998

97. Clegg, R. M. Fluorescence Resonance Energy Transfer. // Fluorescence imaging spectroscopy and microscopy. X.F. Wang, B. Herman, editors. John Wiley, New York. 1996, 179-252.

98. Edwards K, Johnstone C, Thompson C. "A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis". // Nucleic Acids Res. 1991, Mar 25, 19(6), pp. 1349.

99. Gressel J. "Molecular biology of weed control". // Transgenic Res. 2000, 9(4-5), pp.355-382.

100. Lee D.K., Seok S.J., Jang I.C., Nahm B.H., Kim J.K. «Triprimer-PCR method: rapid and reliable detection of transgenes in transgenic rice plants». // Mol Cells. 1998, Feb 28, 8(1), pp. 101-106.113. Директива 2000/418/EG.

101. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. // 1978, Annu. Rev. Biochem. 47:819-846.115. Директива 2000/766/EG.116. Директива EC 06/23/EC.

102. Lin J.J., Fleming R., Kuo J., Matthews B.F., Saunders J.A. "Detection of plant genes using a rapid, nonorganic DNA purification method". // Biotechniques. 2000, Feb, 28(2), pp.

103. Murrel J. N., The Theory of the Electronic Spectra of Organic Moleculs. // London, Chapman a. Hall, Ltd., 1971. p. 328.

104. Мартынов H., Иванов A. Matlab 5.x. Пособие по программированию в системе MATLAB. // МГУ, Москва 2000.

105. Андриевский Б., Фрадков А. Элементы математического моделирования в программных средах MATLAB 5 и Scilab. // Наука. 2001.

106. Tyagi S., and Kramer F.R., Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. // 1996 Nature Biotechnology Vol.14, pp. 303-308.346.350.