Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и апробация ДНК зондов для идентификации бруцелл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и апробация ДНК зондов для идентификации бруцелл"

- ДПР 1394

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА И.Ф.ГАМАЛЕИ

на правах рукописи

КУЛАКОВ ЮРИЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

КОНСТРУИРОВАНИЕ И АПРОБАЦИЯ ДНК ЗОНДОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертзпип на геисхагаге ученой степскп кандчгсзм медкинпсюпс пру*

Москва - 1994

Работа выполнена в научно-исследовательском ордена Трудового Краевого Знамени Институте эпидемиологии в микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научный руководитель - кандидат медицинских наук В. Н. Горел аз

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук, академик, проф. Домарадскнй И.Б. доктор биологических вау* Гинцбург АЛ.

Ведущая организация - Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится " (Ь^/--'* ' ■_ 1994 года в

л часов на заседании Специализированного Совета К 001.07.01 в научно-исследовательской Институте эпидемиологии в микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

- С диссертацией мовдо ознакомится в библиотеке ШЩЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. •

Автореферат разослан " _- 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

Актуальность проблемы. Бруцеллез - ипфекционно-аллергичесхое зяболева-ие человека я животных, характеризующееся тяжелым, часто хроническим те-егшем я возможностью эпидемического распространения. Вруцеллез является дной п основных причин заболеваемости в смертности сельскохозяйственных :иво-пшх в работающих с ними людей и представляет собой серьезную угрозу порояыо человека. В системе мероприятий по борьбе с бруцеллезом мятное место знжмяет идентификация в индикация брупелл, которые затрудняются не только гярокой изменчивостью рода Brucella, явлением миграции возбудителя на нети-ичиых хозяев, по также нееояершенством применяемых диагностических методов.

В настоящее время для идентификации в индикации бруцелл применяют бах-гриологический и иммунологический методы исследования. Бактериологический етод из-за длительного срока получения ответ» (1 месяц) не удовлетворяет тре-эватаям, предъявляемым * методам иидихацви. Иммунологические методы в боль-гииитяе случаев в хачесгве диагностккумов используют антигены, в состав которых кодят лппополнеахарид (ЛПС), дающий перекрестные серологические реакции ГССР) с антителами таких видов бактерий как Yersinia enterocolitica 0:9, Fransizella tlarensls, Escherichia coli 0:137, Salmonella typhimurium я др., что не позволяет мать однозначных заключений ж требует дополнительных лабораторных тестов, азработка быстрых я эффективных методов идентификации представляет собой стуальвую проблему, решению которой может способствовать полл-чение специ-ичеехого ДНК-эонда. Известно, что использование ДНК-зондов обеспечивает вижу» чувствительность в специфичность идентификации возбудителя, что делает с применение предпочтительным для оценки эпидемической ситуации по срзв-:нию с другими методами. Специфичность зонда определяется уникальной для ютветствуюшто возбудителя нукдсотидяой последовательностью, используемой }и его конструировании. В связи с этим поиск такой последовательности целесо-5разло вести среда генов, определяющих синтез специфических антигенов или акторов патогенносгв. Для бруцелл такие факторы не охарактеризованы, хотя юиироваиы некоторые гены бруцелл и изучены контролируемые имя белковые гтигены. В этой связи конструирование и апробация новых генетических зондов целью идентификации в равней индикации брупелл в продуктах питания, объ-ггах внешней среды а др. весьма актуальна.

Цель к задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в кояструи->ваиии ДНК-зояда я отработке оптимальных условий его применения для вдея-фихавдш бруцелл. Для достижения этой цели были поставлены следующие дачж

1. Создайте банка гаю в Brucella meliteasr 365 в клетках Escherichia coli КН.

2. Анализ банка геыои; поиск клоног эхспрессируювшх родоспецифичссхив белка бруцелл.

3. Выбор сиецифаческой последовательности клонированной ДНК в кзчестве зонда.

4. Отработка методов гибридизации in situ клеток бруцелл со сковструнро-ва 1шш «ерадноакташю печенным ДНК-зондом; оптимизация условна дда получения спецнфнчсгхого положительного сшнала гибридизации.

5. Разработка метода идентификации бруцелл при помощи шшшераэцой цепкой реакции (ПЦР).

6. Апробация коиш-.ехсного метода идентификации бруцелл (ПЦР плюс гибридизация) в смешанных культурах.

Научила новизна. Впервые клонирована последовательность гена белка наружной мембраны бруцелл с молекулярной массой (м.м.) 38 кшюдальтоц (кД). Показано, что она родоснецифична дла бактерий рода Brucella и может быть использована о качестве лерадиактшнюго ДНК-зонда дм идентмфюсашш этик бактерий. Последовательность клонированного гена бруцелл сспользоваиа дла конструирования и апробации праймеров в ПЦР. Показана высохла эффективность использования указанного метода доя выявления бруцелл в смешанных культурах.

Нзучяо-практнческая значимость. Проведенное исследование позволило разработать и предложить к использованию ДНК-зонд для идентификации бруцелл. Предлагаемый метод сочетает в себе пеналы озание ПЦР и ДНК-зондирование и вьляется основой дня разработки тссх-систсм для индикации возбудителя в деалятше внешней среды, продуктах жизнедеятельности человека в животных в т.д.

Апробация рабош. Результаты работы были представлены на Всесоюзной микробиологической конференции, посвященной актуальным вопросам борьбы с бруцеллезпм (Новосибирск 14KQ r.V на Ясссоюзной конференции "Бактериальные плазмвды" (Нальчик 1990 f.), на 1 Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии* (Самарканд 1991 г.) и на научной конференции отдела генетики в молекулярной биологии (13 мая 1993 г).

Публикации. По теме диссертации опу£Л~.:овано 3 работы, S тезисов в отечественной и зарубежной печати и получено 2 авторских свидетельства.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание методов исследования, результатов и юс обсуждения, выьодов и списка цитируемой литературы. Текст

»

ожен 122 страницах н содержит 4 таблицы и 23' рисунки . Список литера-ы включает 143 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы 19 референсяых штаммов бруцелл, представ-мцие все виды и биокары, из коллекции лаб. бруцеллеза НИИЭиМ им. Н.<Ь. [алей в 12 свежевыделенных австралийских штаммов бруцелл, полученных от .в. Л.В. Лкпустяной (г.Ставрополь), 2 штамма бруцелл от к.м.н. Р.Ж. Ищановой Алма-Ата) а также штаммы и ДНК других видов бактерий, любезно предо-мепиые сотрудниками НИИЭМ им. Гамалеи д.м.и. В.М. Бондарекко, к.б.н. В.Л. гиныи, к.б.н. В.И. Захареяхо, к.б.н. В.И. Демкиным. Штаммы Е. coli с реком-антными плазмидами получены автором в процессе работы.

Бруцеллы выращивали tía триптозном агаре (ТА) "Difco* с добавками для целя описанными в работе (Горелов н др., 1988) Для Е. cotí и других бактерий ачестзе полноценной среды использовали жидкий или агарированный бульон киллер 1976). Антибиотики использовали в концентрациях: карбештаиллнн-50 /мл, тетрациклин- 20 мкг/мл. Селекцию рекомбинанттос клонов E.coli ÍM109 водили ва среде МсСопкеу с лактозой "Di/co".

Выделение хромосомной ДНК проводили посредством феиольной депротеи-ации (Mannиг, 1961) с модификациями.

Препараты клазмидной ДНК получали щелочным методом по (Birnboim, Doli 9). '

Расщепление ДНК рестрикционными эндояуклеазами, электрофорез ДНК , течение фрагментов ДНК из геля, травсфекяию и трансформацию, отбор ре-биваитвых клонов, нкк-трансляцию и гибридизацию с радиоактивно меченным К-зондом как-описано > руководстве по генной инженерии (Маниатис с со-,1984).

Биоткя вводили ■ ЦНК с помощью фотоактивируемого реагента 4-аэядо-2-робевзоил-1,7- диамилогептана (Вейко с соавт., 1989), при гибридизации in с ДНК-зондом, мечесным биотином, использовали разработанный вам» метод.

Определение концевых нухлеотидных последовательностей ДНК-зонда осу-твляяи по методу (Sanger 1977) с использованием пакетов программ DNASIS ROBIS "Pharmacia" Швеция. *

Анализ последовательности нуклеотидо» для еыбора праймеров осуществляли шощыо программы "?С-Сепе".

г

Олигонуклеотидные праймеры синтезировали ва синтезаторе Bloat Biosist с применением фосфамида (Theiя and Wallace 1986).

ПЦР проводили я соответствия с методическим руководством (Ionis et « 1990). *

ExoHIMungBean обработка препарата ДНК про ведалась по инструкции фнр» "Stratagene" США.

Радиальную иммуподиффузяю (РИД) выполняли по (Ouchîerlony 1953). И) муноэлектрофорез (ИЭФ) в иммуноблотнлг проводили как рекомендовано в р, ководетве по иммунологическим методам исследования (Нго, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящая работа ввилась составной частью исследований по молекулярв) генетическому изучению бруцелл, проводящихся в лаборатории генетики бактери НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Будучи частью указавшее исследований, работа предусматривала использ: i.áHKe генетического материала клонированных антвгепов бруцелл для констру! ровани* ДНК-зонда и отработке оптимальных условий его применения дл идентификации бруцелл.

Клонирование генов В. metltensis в клетках Е. coll

Главной задачей первого этапа иастояцего исследования было хлонпрокши i-епов белков наружной мембраны бруцелл. Для решета этой задачи был сков струирован "банк" генов бруцелл н прОЕсрепа возможность экспрессия генов бру целл з клетках Е. coll.

В качестве вектора для клонирования фрагментов хромосомы бруцелл ве пользоьали космидный вектор рНС79, который позволяет клонировать в нем круп иые фрагменты ДНК до 45 т.п.в.

Выбор донора генетического материала проводился с учетом наличия у неп максимального числа характерных для бруцелл аитигсноз в факторов вирулещ но»ти. Этому условию соответствовал наиболее вирулентный ддя человека и зкв потных штамм В. melitensis 565 3 биовара.

В результате последовательных этапов по конструировакнкг "банка" reHOi иолученная "генотеьа" составила 1000 клонов.

Для проверки возможности экспрессии геков бруцелл в клетках ЯсоН былг осущеавлема пронерка способности генов бруцелл комилементировать ауксотроф-лые мутация leu и pro E.coll.

Был обнаружен клоп, который способен растя кз сиятетпческоЗ среде без лейцина, при этом было показано, что комплемептацтл мутация leu являлась результатом присутствия ггнсз ргхомбшгаптясй шгазмиды, несущей соответствующий прототрофвый ген бруцелл, вырзжгющнйся в £. coli

Таким обрззсм, исполъзоваянаг састека елоппрсзаиет геноз бруцелл oócc-печст-ала их адгкватнуга гкспрсссгго, что аозголяло перейти s поиску рексмба-пяятпкгх кяояоз, гкспрессгрукгцях искомые родоепещ;фичгскке белкп бруцелл.

Клим, 3íCtrpeccnpyic!CTe специфические антпггпы бруцелл отбирали по реакции с полив&левтпоЗ аптпбруцеллезпоЗ сывороткой методом РИД по Оухтерлошг я затем з ИЗО. Среди проверенных 100 клоков библиотеки были отобраны б клопоз, лпзати которых давзла полосы преципитация. Из б иммукопозктквкых клелез для дальнейшего анализа был отобран одпя, обозначенный нами GSE 579, дгюшлй с пммузолоНгчесхих реакциях кзнбачее четкие полоса прециюггяшш. В РИД его яязатм продуцировали дзе полосы пргщпштзцпв, а г» ИЭФ в дезннтегратзх данного клопа выяилалось дм armrrei.iiws R0m3CR£ijt2, обладающих рахтичной элеггрофоретической псдвюгностыо. Один образовывал дугу преципитации вокруг сгартопой лупки, а другой, мягргрозал а стсроау аподноЗ частя геля.

В результате комплексного ксследоЕаяяя клонированных антвгеноа было установлено, что овн имеют белковую природу. По данным пкмуяоблотинга, размер одного из Н2Х ссставкл 18 кД, а другого 3S кД.

Сенскбилязирующую актавпоегь полученных препаратов белгов с м.м. 33 я 11! кД изучали Малнхоз В.Е. с соавторами э модельных опытах на по тесту отека гап у мышей.'При этом белок 3S кД обладал более ярко выраженными аллер-рогвнлымя CBoßcTBäfcC!, чем белок 18 гсД-

Затем была изучена ршгь данных белеоя в формировании специфической зл-цкты против заражения вирулентной культурой бруцелл. Бьло показано, что белок 18 кД обладает определенней протгктигной активностью, создавая защиту у 66,7 )(, животных. Белок с м.м. 3S кД се обладал способность к» защищать от заражения, i индекс иифяилромняоета (ИЩ в опытной группе оказллся достоверно выше, :ем в контрольной

группе (ИИ составлял 77,9 и 58,4 соответственно). Такта образом, была определена роль белка 3S кД, как обладающего ctso-обяоетыо увеличивать диссимннащоо возбудителе а организме животных, а также ызывающего вырадевиуго сенсибилизацию организма. » ' Полученные результаты позволила нам выбрать в качестве характерного ро-оспецифнчесхого антигена белок 38 хД. дла использования гена данного белка рп конструировании родоспецифичесхого ДНК-зонда.

• Кокструкгованиа родоспепнфнчесхого ДНК-зонда Источником исковой пссд^до-ителытста гена белка 33 кД слухзыа плазмидд рОУ5?У, выделеннад из ргксибгшлк-шого штамма GSE57V. При рсстрикцаонно;* анализе плазмиды pOV.579 размер с:ставки ДНК бруцелл составил 3S,5 т'.в.ц.

Следующий этап псследогаьвя заключался в разделение совместно клонирование генов дда субклокирогакиа гена белка 3S кД. Цлх этого использовала процедуру субкло'ц.роЕЗкм ЕсеРЛ Фрагментов в составе вектора рНС79 с отбором клонов, дающих одяу линию лрицшщтацик в РИД. Среди 200 проверенных транс-(¡юрмаитов в РИД был обпзруггел клоп, дающий одну лктио преципитации, обозначенный нами CSESD0. В дегантегратах штамма CSBSC0, всследосаняшс в ИЭ®, обнаруживалось наличке одного антигена, а по результатам иммуноблогтиига размер аптагева составил 3S кД. Предг-арителышй рестрцхциояный анализ показал, что размер вставки ДНК бруцедд г-ллз;.:зды pOV £00 составляет 4,0 т.п.м

Для выделения исгавки била использована рестрактаза NruI, выргзакзвдк фрагмент 3,Э т.пл:., большее часть которого 3,3 т.п.а. представлена вставхой ДНК бруцам. Фрагмент бия ведшей кг пул и кспользоьан в качестве ДНК-зонда в гибредй^лцна по Саузериу с фрагментами ДНК бруцелл и другше бактеркС, получезчшми прк дейетика Ыги! релрихтазы. Гибридизация наблюдалась с ДНК B.meUiensis, ¡¡.mis, li.aíortus па одно« уровне в вид: единичной полосы одинаковой молекулярной массы. Это позволяет счзгтать, что участок гомологишшл ДНК-зг чду íivúsr одинаковую локализацию ва хромосоме трех испытанных ввдог. бруцелл. Зонд оказался специфичным для бруцелл. С ДНК бактерий, перекрестно реагирующих с бруцеллами в серологических рег.кцаех (Y.cntercccUtica 0:9, Ktularensis, ¡i.£oli 0:157, V.cholcrac, S.Uiphinu¿rmrn) гибридизации ве отмечали. Длд устранения фр.Н!-.ч1та вектора в удаления из его cccraiy последовательностей, не относящихся к itiiy белка 38 кД иронзаедено рестрвхцвоияге картирование и субклониросаниз фрагментов ьетавки ДНК с агализом продукта экспрессии полученными субкло-вами.

Дм демлььол» рестршыыодшго анализа и построения физическоь карты про-ьида;> был использовав метод одиночного к двойною гидролиза. Рестрихционвая карта нрсдстаьлска на рис 1 (используемые ресгриктазы указаны в подписи к (жсуш.у). После локализации сайтов EcoRI, HindUí, XiwJ, K'rul стало возможным ««■лгазврДАченное суСллоннровавие фрагментов, указанных ь таблиц? 1.

Дп? с;-бклонирования использовали вектор pBlwscrip: $К*, а реципиентом b.-jíiv.H JM ¡09. Су'клови а.^.тлзвромля сначала í ПЭФ, а размер вро-,;а оненввг.~я С вомощ^э вммуиоблотткнга. Из изученных субклоиоя

Та&мца!. Paayi»?»TU промрк* рвкомбяа&втних пдаэияд ив продукцю» смцяфмвекях бруцвдлезяих йятлганов

Обозяачезва Ctfiw, га соторм Размер Продукция йлткгвяов рвяомбЕиаятюЗ хжяярялжя астгавх* _

п*вм"да. »Т.П.И. |S5 й^^по^сдапп.

pOV 800 Eeoll «,0

рОУ 819 ffru 1 3,3 - -

pOV «24 Ecerl ♦ ХЪ» 1 1.9 + +

рОУ >23 Sectt * Bind Ш 0,9 • -

рО? 826 Hind Ш 1,1 - -

pOV 827 Bind 111 .1,0 -

par 828 Hind 111 0,5 w

Р 8 Р KB N а Вт н К хн Но и NB Е

" ' " I'—'—-i—i—11 ' i ," 1

L2222-1—j-}j-j—i j

I I i-1

j j I ¡povg^s !

J I , jpovsza | | |pOVB£_J

fern

I. Ресгркхяаонкая карп плазмах pOVSOO ж се производных. Тонки черта - ДНК рКС79 (дана а уменьшенном,, масштабе), толста« черт® - фрзтент хромосомной ДНК Br.rnclitensij 565; В - EcoRI. Вт - ВаиШ. В * Bgl П, Н - Hind Ш. Ps - Psil. Р - РтП, N - Nrnl, Не - Hindi, X - Xbal ,

только один (GSE824), несущий плазмиду pOV824, в составе которой присутству фрагмент EcoRI-Xbal размером 1,9 т.п.н., обеспечивал продукцию белкового а: тигена бруцелл с м.м. 38 кД- (рис 2. и 3). Это позволяет заключить, что л белка 38 кД локализовав в пределах указанного фрагмента.

Данный фрагмент состоит из последовательностей двух фрагментов ЕсоК HindIll-0,8 тд.н.(плазмнда pOV825) н HindllM.t т.п.н. (плазмида pOV826). О фрагмента при использовании в качестве ДНК-зондов в dot-blot гибридизации ДНК бруцелл в других бактерий оказались специфичными дли бруцелл. По-в димому, отсутствие продукции белкового антигена субхлоаамн GSE8Z5 н GSE8: явилось следствием инактивации структурной части геаа за счет разрыва последов тельвости в области правого сайта Hindlll. Для дальнейшей работы в хачест источника ДНК-зонда была выбрана плазмяда pOV826, нэ которой технологичес: проще выделить фрагмент HindTtI 1,1 т.п.н..

Апробация ДНК-зонда в реакциях гибридизации

Препарат фрагмента Hindlll (1,1 т.п.н.) был использован в качестве ДН' зонда в реакциях Саузера гибридизация с ДНК 19 музейных штаммов бруце; включающих 1-3 бимары B.melitensis, 1-5 биовары B.suls, 1-7 биовары B.aborti референсные штаммы видов B.nectomae, B.canis, B.ovls, а так-зке ДНК следующ видов бактерий: E.coli, Y.entcrocolitica 0F.tularensis, E-coli 0:117, S.typhimuriu P.aerugincsa, P.putida, обработанных рестршстазоЗ Hindlll. Проведенные эхепер менты показали, что у всех проанализированных ДНК бруцелл гибридизация ДНК-зондом ¡шблюдалась в виде единичной полосы на уровне 1,1 т.п.н., что t роятно указывало на отсутствие в хромосоме бруцелл повторов последовательное в идентичную ДНК-зонду локализацию сг на хромосоме всех проанализировашп видов к биоваров бруцелл (рис.4 и 5) Гсбрвдигация с ДИК других вддов бахтер отсутствовала.

Для оценки штамм о в ой специфичности ЦИК-гонга тахже методом габрщ зации по Саузерну проанализировано 14 свежсвыдсленных штаммоз с яеясн таксономической принадлежностью, полученных из различных географическ зон. 8 штаммов выделены в Австралии от грызунов, 1 в СССР от мымевидш грыяуна , 3 ипамма выделены от больных людей в Средней Азии. Картина С узерн-гибршглэацяи так-».в оказалгеь адецтпчкой с ДНК 12 изученных штамп к содержала участок гомологичный ДНК-аопду на уровне 1,1 т.п.п. В тоже вре два штамма B.cbvrtus 66 к В. a tortus 7/13, сыделеюгьге от больных яиг,отньв Средней Азия и злрешпрированкые в ГИСК m-i. Тарлсевича как атипичн (L-формы) бруцелл, в наших опытах ве гибридизовлляеь с ДНК-гокдом. След;

, Щ vvíi^i.

; ,v> } i-.-л;-} .•'ï-f-df

ПО'ИСН о

i • »o 8 . .

f 2 3 4 Ve. 3. f 1 Myi í п г г r.^pyO-*" p - ч г t.'^ ^ у^'.гр^пухоэшс

0 »Ттаж 1 - Е.еаЯ HS-tOI/SK*

? - e.crîl HEMOUpOVG23 з - e.ccti HS-iot/povaie

e - e.toti ив-rei /povs?5

5 • E.ccil H3-iOÎ/pOVïî24

О тр-тчлвг» - ïKTHCbûOpsTrî.

« 2 3 4

33 «Д

ÍJ

~ к- ' M

S 0 >' ï

ООО»»«*??.»-«:

мрркер «ояекуяврчкис масс GSE W4 GSE £25 GSE EIS

1

2

3 ■

«

6 - GSE

О - «IMlOS/pSíueicrípt

ff Un >» ' л; ...s; ^vstyj

> ^ 4

fc J- Г./ "> J

14 им^Г tut »-*. V

itc. 3. Акзли5 p«<cí-H'«WMnjr шгзммм E.eeí¡ кл г.родукцию специфичной« аигнгвмя» и »ммучсблотимгв с бруцеякямой вйтисынороткэй после разделе««* • пааг с ДСН к перенос« на нитроцеллюлозой фильтр.

i

Дорожюс 1 • Е.со<1

2-в - ВдЬопи» 1-7 бмопры С-И • В.п>«Шеп*1з 1-3 Бно»р' tî • B.nootorae

13 • B.onlt

14 • O.ovlj

15 • F.tularentl*

Рис. 4. Бяаг-гибридиици| рвстрмцмроишш* Hindill хромосомны* обр» цен с родоспецифичсским ДНК »охдом 1.1 тли, нмении dCT'

Порох**:

1 - Y.entefocciíilc« 0-.а 2-в - B.iul» 1-5 биовзри 7 - E-Coll 0:157 в - PjerUQlnoM б - S.typhljnurium 10. - P.putlda

11-12 - ß.abortut 1 биомр 13 - POV 57S

Гис. 5. Елсг-гибридипци» рестрицираммиих Hlullll «ромосомни* обра* ио» с р<|дасо{ц«).ич»с«им ДНК 1.1 г.п.к., мечм<им ®Р tiCTP

г™стать, что ваше заключение соответствовало заключению сотрудников лабо-ятории бруцеллеза НИИЭиМ км. Н.Ф.Гамалеи основанном на комплексном ккк-юбиолопгчесхом я серологическом анализе данных штаммов.

Таквы образом, сконструированный вамя ДНК-зонд является родоспецифя-геским для бруцелл, а метод Саузеря гкбрндйззцин может быть использован для сх вдентвфзхацни. Однако этот метод трудоемок, требует выполнения этапоз иа-:ош1еая« значительной клеточзсЗ массы, выделения хромосомной ДНК пригодной 1ла рестрикции в достаточго сложной процедуры переноса образцов ка кнтро-¡сллюлозныг фильтры.

Более простым методом идентификации являэтся гибридизация колоний с ЩК-зондом. Возможность использования сконструированного ДНК-зонда в ре-1КЦЯИ гибридизация с колониями штаммов бруцелл показала, что испытанный ме-•од так-же специфичен и значительно сокращает время проведения анализа.

Следовательно, сконструированный ДНК-зонд показал специфичность при нс-¡олъзоваяик • реакциях гибридизации, однако существенным недостатком кспаль-|уемых методов являлось применение для мечения ДНК радиоактивных изотопов, ¡оторые ограни1 явалн возможность широкого использования метода. Поэтому сле-(уюшкм эталон работы была замена ДНК-зонда, меченного изотопами на «радиоактивно меченный ДНК-зонд.

Нераднпактивное мечение ДНК-зонда

С целью усовершенствования методики ДНК-зондирования, мы апробировали ■спользовяняе ДНК-зонда, меченного биотипом как указано в "Материалах и ме-■одах". Данный способ отличается экономичностью и возможностью длительного гранения меченного ДНК-зонда. По уровню чувствительности этот способ ае ус-■упал другим вариантам введения биотява и успешно применялся для Гибридизации п $!ш.

На практике при использовании ДНК-зонда, меченного бнотнном в гибридизация 1п з!(и возникают трудности, связанные с необходимостью уменьшения ¡есяесяфичесхого фона, обусловленного иеудаляемыми примесями эндогенного неточного биотипа, находящегося в клетках в комплексе с белками.

Клетки бруцелл не чувствительны к действию некоторых лизирующих агентов. Тоэтому были проведены эксперимента дм определения оптимальных условий, «беспечивающвх их лизис и хорошее качество реакции гибридизации лизатов с ЩК-зондом, меченным биопсном. Согласно нашим данным реакция гибридизации |етко регистрировалась при проведении после лизиса клеток этапа депротеиннзации меточных лизатов, который позволяет ДНК эффективно сорбироваться на

шггроцсл.;;. лозной мембране и-удаляет зндегекпый биотип, обеейечивая специфичность реакции.

Для сравнения специфичности и чувстЕвтелмостн метода при нспояьзояавгд радиоактивного п иерадноахтнгяо меченных ДНК-зондоз проседены ерггннтеяыгыг оксперимситы, результаты которых показали, что чувствительность биотЕШплпро-satmoro зопда сопоставима с чувствительностью радаоакттшого зопда в позволяет выявлять десятки ппкограми гомологичной ДНК в реагцке; dot-b!ot гибр'дазашш, сохраняя высох)по специфичность гибридизация только с ДНК бруцелл. При гибридизации in situ в обоях вариантах мечецця чувстантедьиость составила 10J клеток бруцелл, о специфнчцосп, гибридизации достягапгсь за счет подбора у слоен"; лизиса клеточных суспензий г дспротеи!п;ззцга! клеточных лпзатов. Эг.спгримспгы по сз-редслскию времени хранения мечепаого биотипом ДНК-зонда показывают, что оп практически не тергет своих свойств и мозгет бьтть использован в реакциях гибридизации в течении 3 лет без ухудшешы чувствительности метода детекции.

Таким образом, использование мечешюго бнопшом ДНК-зонда с реакциях гибридизации с ДНК бруцелл более экономично, обеспечивает экологическую чистоту и позволяет длительно хранить меченпый ДНК-зопд без синтксигл его качества. Все это представляет возмогшим рекомендовать его для широкого использования.

Использование ПЦР для повьпдеппя чустопелькостп метода ДНК-зопдиро-вакмя

Метод ДНК гибридизации In situ пршщттальпо позволяет идентифицировать возбудителя бруцеллеза прп налнч!ш в изоляте более to3 клеток. Однако в медицинской п ветеринарной практике число клеток бруцелл в образцах, доступный для анализа, может быть существенно меньше. В этом случае прз использовлшщ omicunsoro выше метода появляется необходимость культивирования образца с целью обогащения его клетками возбудителя. Помимо культивирование существует другой подход цпя повышеакя чувствительности метода путем амплификация числа копий регистрируемой последовательности lr. vitro с помощью ПЦР.

Нами были проведены исследования, направленные ва разработку системы ггсиификациЕ la vitro фрагмента пека белка 38 кД с последующей тебридазапней амплифицируемых продуктов со сконструпросашшм ДНК-зондом.

Для осуществления ПЦР прежде всего необходимо была определить последовательности прямо» и обратного праймероз, т.е. стаскать последовательности из 20-22 нуклеотидоа ва флангах специфического фрагмента, способных служить затравками дяа ПЦР. Исходя яз этого яа первом этапе было проведено частичной

секвенированме последовательности вставки ДНК на плазмиде pOVS26, испила.> -метод Сэнгера.

Выбор последовательностей для искомых праймеров из секвенированных последовательностей ДНК осуществляли с помощью протраммы PROBE из пакета PCGene. С учетом расстояния от концов фрагмента (175 иухлеотидов) предполагалось, что выбранная пара праймеров будет амплифицировать участок ДНК размером около 0,7 т.п.н.

Выбранные последовательности праймеров были синтезированы.

На следующем этапе была осуществлена проверка эффективности их работы, на ДНК плазмиды рО\'82б, а так же па ДНК pVC19, pBluescript SK* в качестве контроля. Были подобраны режимы амплификации: температура, время отжига и синтеза, количество циклов.

Выбранная пара праймеров обеспечивала синтез in vitro фрагмента ДНК размером 0,7 т.п.и. при использовании в качестве матрицы ДНК глазмиды pOV826. ДНК векторных плазмяд pUC19 а pBluescript SK+ не служили матрицами для ПЦР, как в ожидалось.

Подобрав режимы амплификации ( выбранными праймерами специфического фрагмента на ДНК pOV826, мы приступили к исследованиям с препаратами хромосомной ДНК бруцелл, ДНК других бактерий и эухариотическон ДНК. Вило покагзпо, что ДНК бруцелл также служит матрицами для синтеза фрагмента амплификации 0,7 т.п.и., в тоже время ДНК бактерий, перекрестно реагирующих в серологических реакциях с бруцеллами и эухариотическая ДНК не служили матрицами длз синтеза указанного фрагмента.

Одним из преимуществ ПЦР как метода диагностики является отсутствии ■необходимости препаративного выделения ДНК для амплификации. В наших исследованиях для получения клеточных лизатов бруцелл а других микроорганизмов был вкбргп простой н быстрый метод кипячения клеток в дистиллированной воде. Как показала проведенные эксперименты в лпзгтах ттаммов б видов бруцелл тах-же змплифянируется фрагмент 0,7 т.п.н. и не происходит амплификации а лнзагак других бактерий.

Для подтвер-^девкя специфичности амшшфицируемих продуктов в реакциях dot-b!ot гибридизация был сконструировав ДНК-зонд, лишенный последовательностей прямого и обргтиогэ прзнмеров.н представляющий собой центральную часть аг-галифилируемого фрагмента. Этому условию соответствовала центральная часть фрягмгнта ДНК-зовда 1,1 т.п.я, из плазмиды pOV826, укороченная на 0,250,3 т.п.н. с какого конца, т.е. фрагмент размером 0,55-0,6 т.п.».. Результаты

картирования фрагмента 1,1 т.п.н. показали, что с помощью реррипаз делегировать его можно только с одного из концов. Поэтому конструирование ДНК-зонда проведено в два этапа (рис 6.). На первом этапе используя рестриктазу HincII был субклслфован фрагмент Hindlll-HtncII 0,8 т.пл.,» составе вектора pBluesaipt SK*, что позволяло удалить последовательность, соответствующей одному из прай-меров. Делегирование другого концевого участка ввиду отсутствия подходящих сайтов для эндоиуклеаз на фрагменте HmdlH-HincII произведено последовательной обработкой рестриктазами НшеШ-PstI, а затем экзонуклеазой Ш н нуклеазой за-' лотистой фасоли (MungBean).

Таким образом был сконструирован делецвонный вариант плазмгды pOV826, обозначенный pOV928, который несет центральную часть амшшфицируемого фрагмента 0,55 т.п.н. к не содержат последовательностей прямого в обратного прай-. меров.

Этот фрагмент отделяли от вектора pBluescript SK* , обрабатывая плазмиду pOV928 ресгриктазами ВашШ в Xhol (сайты на полилинкере вектора), элюировали нз агарозного геля и использовала в качестве ДНК-зонда. Меченный биотином, фрагмент 0,55 т.п.н. гибридизовался только с' имшшфицированнымн образцами ДНК бруцелл в реакциях гибридизации по Саузерну я dot-blot, подтверждая специфичность амштфнютруемого фрагмента.

Отобранная пара праймеров и сконструированный ДНК-зонд 0,55 т.п,н. после подтверждения специфичности реакции были использованы для определения чувствительности метода.

Для этого мы осуществили постановку ПЦР с лизатами клеток бруцелл, полученных кипячением. Использовали бактериальные суспензии в различных разведениях, количество вносимых клеток определяли титрованием суспензий на твердой среде. - _

При использовании ПЦР после 30 циклов амплификации специфический . фрагмент 0,7 т.п.н. визуальиЬ определялся при прямом окрашивании амплафвди-рованной ДНК » 1% агарозпом геле в образцах лизатов, полученных вз 10 клеток / бруцелл. В то»: время дополнение ПЦР dot-blot гибридизацией ДНК-зонда 0,55 т.п.н. с проду)тамн амплификации повышало чувствительность метода идентификации бруцелл на порядок (рис.7). Сигнал гибридизации регистрировался с образцов, содержащих лизаты единичных клеток.

- Таким образом, из представленных данных очевидно, что разработанный на основе ПЦР метод специфичен в идентификации представителей рода Brucella г

обладает высокой чувствительностью, позволаг выявлять едкнпчвыг клетки б целл.

Проверка специфичности и чувствительности метола пдектификацаи бруц на смешанных культурах Л

При идентификации бруцелл в бнологнческях образцах, объектах Бнгш среды в большинства случаев приходятся иметь дело со смешанной. популяц) различных бактерий, в которых бруцгллы могут быть представлены единицам! десятками клеток. В связс с этим мы поставила перед собоЛ задачу выяси каким образом наличие сопутствующих бруцгллам мшероорганизиэз будет шш ; на чувствительность п специфичность метода молекулярного зокднровакпя и п¡и де всего при использования ПЦР. Для этого мы составляли смеси клеток, бруце с клетками бактерий, дающих перекрестные ссролопясскиг реакции с брукелла! . При этом чувствительность регистрации сигнала гибридизации соотБетстЕОвала 1 тестируемых клеток, при меньших концентрациях клеток cr.ni.vra ве на&подзл< с обоими вариантами зондов (0.5 т.гг.п. к 1.1 т.п.п.).

В том случае, когда реакцию гибрпдязацки осуществляла с образадма ДИ амшгифицированныма после предварительного приготовления смешанных лизат различных видов бактерий с бруцгллшкц, оказалось, что примесь друткх мик{ . организмов не оказывает влияния на чусдаггслькостъ метода. В то же ярсмя, п проверке работы амплификации с гсяь-злектрофорегг мы наблюдали спецк^ ческую полосу ДНК, соотсетствующу!«) 0.7 т.п.а.

Итак в реакциях гибрвдиззцкп с ДНК-зондака удается выявлять ве мет клеток бруцелл, при постановке ПЦР -десятки клеток, а комбинация ПЦР последующей гибридизацией -единичные бактерии.

Таким образом, приведенный" данные указывают га перспективность испая зования разработанных методов в на принципиальную возможность вдентяфихац бруцелл в чистых и смешанных культурах. Применение ПЦР наглядно показыва преимущества перед существующими методами идешяфикации за счет быстрот отсутствия необходимости выделения чистой культуры и высокой чувствительное метода.

Полученные результаты позволяют в дальнейшем перейти, к использован» разработанных и описанных вами методов для индикации бруцелл при эпидем • олопгческом обследовании объектов внешней среди- .■ • "

- 1.7 -

ВЫВОДЫ

1. На основе клонированного фрагмента ДНК В. melitensis 565, несущего ген белка наружной мембраны бруцелл с м.м. 38 кД., локализованного в пределах фрагмента EcoRI-Xbal размером 1,9 т.п.н., сконструирован родоспецвфичесхий ДНК-зовд и его варианты.

2. Получена последовательность ДНК, размером 1,1 т.п.н. (ДНК-зонд), специфичность которого дли рода бруцелл установлена в реакциях гибридизации на основании:

а) четких положительных реакций с ДНК всех видов и биоваров бруцелл.

б) отсутствии реакций гибридизации с соответствующим материалом бактерий других таксономических групп, перекрестно реагирующих с антнбруцеллезными сыворотками в серологических реакциях.

3. Чувствительность реакций гибридизации с ДНК-зондом, меченным биотипом составляет 10 пикограмм ДНК или 105 клеток бруцелл. Примеси клеток других бактерий или ДНК иг влияют на чувствительно :ть и специфичность реакций гибридизации. Использование ДНК-зонда с радиоактивной и биотиновой меткой дает сравнимые результаты.

4. Из средней часта зонда 1,1 т.п.я. получена последовательность 0,55 т.п.н., пспользозакпе которой в реакциях гнбридпззции продемонстрировало сохранение этой помедг стельностью сэойсгв гавда, специфичного для рода бруцелл.

. 5. С г мощью выбранных праймеров в полимеразной цепной реакции с ДНК гсех еядсз бруцелл амллифицируется фрагмент размером 0,7 т.п.н.

6. Специфичность амгшифицирсвзнлого фрагмента подтверждена в реакциях гибридизация с ДНК-зондом, представляющим центральную часть амплифициру-емсго фрагмента без последовательностей праймеров.

7. Отр;,5отанный метод ПЦР позволяет выявлять десятки клеток, а сочетание ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации с ДНК-зондом 0,55 т.п.н. выгалгет наличие единичных клеток. ПЦР показывает преимущества перед существующая методами идентификации бруцелл за счет быстрота и высокой чувствительнолц метода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кулаков Ю.К., Горелов В.Н., Скавронская А.Г. Клонирование и экспрессия твое бруцелл с целью создания современных средств диагностики и профилактики -зруцеллеза. // Медицинский Реферативный Журнал,— 1988.—раздел Ш,—N 8,— ; 1убл-305б.

2. Клонирование генов Brucella в клетках Escherichia coli К42 и анализ продуктов клонированных генов. Горелов В.Н., Кулаков Ю.К., Селютина Д.Ф., Токарева Л.Е., Чибисова В.А., Драновская ЕА., Скавронская А.Г.// Молекулярная генетика микробиология и вирусология.-1990.-N9.-Cll 8-24.

3. Высокочувствительная веизототтая система гибридизация ДНК с применением амплификации (ПЦР) дня идентификации в индикации бруцелл. Кулаков Ю.К., Горелов В.Н., Мотив BJI., Брухавский Г.В., Скавронская А.Г., // Моле-, кулярная генетика микробиологи« и вирусология.-1992.-Ы7-8.-С.23-27.

4. Кулаков Ю.К., Горелов В.Н., Скавронская А.Г./ Молекулярный ДНК-зонд для идентификации бруцелл // Всесоюзная конференция "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медиццнской помощи больным. Тезисы докладов. Новосибирск.-1989.-С.80-81.

5. Использование генетического материала рекомбинантной плазмиды для конструирования молекулярного зонда в его применение для идентификации бруцелл./ Кулахов Ю.К., Горелов В.Н., Ляпуспгаа Л.В., Таран Н.Ф., Скавронская А.Г.,// Бактериальные плазмиды. Тезисы докладов. Нальчик.-1990.-С.89-90

6. Использование Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) для повышения чувствительности способа идентификации бруцелл родослецифическим ДНК-зондом./

. Кулаков Ю.К., Мотив ВЛ., Бруханский Г.В., Горелов В.Н., Скавронская А.Г./// Теоретические в прикладные аспекты молекулярной биологии. Тезисы докладов.. Самарканд.-1991.-С.113-114.

7. К вопросу о таксономическом положении бруцелл, выделенных от мышевидных грызунов Австралии./ Ляпустява Л.В., Цыганкова P.E., Таран Н.Ф., Кулаков Ю.К., Горелов В.Н.// Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций .Тезисы докладов. Ставрополь,-1991.-С.36-38.

8. Gorelov B.N., Kulakov Yu.K., Skavronskaya A.C./ The New Tool for Brucella Identificab'on: Genus Specific DNA Probe // Advanse hi Brucellosis Research In Boob Texas. USA.-I989.-P.490. *

9. Горелов B.H., Кулаков Ю.К., Чибисова B.A., Селютина Д.Ф., Токарева Л.Е., Драновская Е.А., Скавронская AT. Рекомбкнантная влазмида pOV579, кодирующая антигены бруцелл с молекулярной массой 31 кД и 15 кд и способ получевня этих антигенов. Авторское свидетельство N 1697423.

10. Кулаков Ю.К., Горелов В.Н., Скавронская А.Г. Рекомбинавтвая глаз-мидная ДНК pOV826 - источник для получения родоспецифического молекулярного зоцда для бактерий рода Brucella. Авторское свидетельство N 1725560.