Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Практические аспекты использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике бруцеллеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Практические аспекты использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике бруцеллеза"

РГБ ОД

В / ж 2005

На правах рукописи

ШЕСТОПАЛОВ Михаил Юрьевич

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов, 2000

Работа выполнена в Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Балахонов С. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Куличенко А.Н., кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Саяпина Л.В.

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится «_» января 2000 г. в_ч. на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института «Микроб»

Автореферат разослан «_» декабря 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Корнеев Г. А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Эпидемиологическая ситуация по бруцеллезу в России на протяжении последних лет не имеет тенденции к улучшению. В ряде регионов Российской Федерации вследствие эпизоотического неблагополучия по бруцеллезу и нарушений санитарно-гигиенических норм и правил при ведении животноводства, бруцеллез остается широко распространенной инфекцией и основной причиной значительных экономических потерь в животноводческой отрасли сельского хозяйства, что усугубляется заболеванием людей, которое нередко приводит к потере трудоспособности и инвалидности.

Одним из основных направлений в борьбе с бруцеллезом является его своевременная и эффективная лабораторная диагностика. Современная лабораторная диагностика бруцеллеза основана на бактериологическом, биологическом, серологическом и аллергическом методах. Бактериологический и биологический методы являются наиболее достоверными при выяснении этиологии и путей передачи инфекции, однако, они небезопасны для персонала лабораторий, требуют затрат значительного количества труда и времени Для завершения исследований (до 45 дней), нуждаются в высококачественных, дорогостоящих питательных средах и лабораторных животных. При этом положительные результаты бактериологического исследования могут достигать в ряде случаев лишь 30—80 % (Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996; Queipo-Ortuno М. I. et al„ 1997).

Серологические методы лабораторного подтверждения бруцеллеза (им-муносуспензионные, иммуноферментные, иммунофлюоресцентные) являются в настоящее время основными. Однако, необходимо отметить, что выраженность различных иммунологических реакций, их сочетание и степень корреляции с тяжестью проявления и прогнозом развития болезни сугубо индивидуальны. При наличии выраженных иммунологических реакций на бруцеллез можно лишь ориентировочно судить об активности и тяжести инфекционного процесса и о возможности подтвердить этиологию заболевания (Пинигин А. Ф., 1960; Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996). Кроме того, серологические тесты обладают недостаточной специфичностью вследствие структурной общности антигенов бруцелл и ряда других грамотрицатель-ных микроорганизмов (Первушин Б. П., 1962; Желудков М. М,, 1982; Желудков М. М., 1983; Соколова Е. Е. 1986; Кулаков Ю. К. с соавт., 1989; Кулаков Ю. К. с соавт., 1992; Corbel М. J., 1997), а иммунохимические методы обнаружения антигенов бруцелл обеспечивают также и невысокий уровень чувствительности — 104—105 м. к./мл и более (Чернышева М. И., Асланян Р. Г., 1975; Заревина Л. И. с соавт., 1986; Загоскина Т. Ю., 1990).

ВнутрикожНая аллергическая проба в отличие от серологических тестов является более специфичным и чувствительным методом диагностики бруцеллеза, но в 70—85 % случаев она становится положительной только к концу первого месяца заболевания, при этом ее постановка у инфицированного человека вызывает усиление сенсибилизации с возникновением общих и очаговых реакций (Кайтмазова Е. И., Чернышева М. И., 1972).

Принимая во внимание вышеизложенное, становится очевидной необходимость разработки новых методических подходов для лабораторной диагностики бруцеллеза, которые превосходили бы существующие методы по чувствительности, специфичности и быстроте выполнения.

Таким критериям наиболее полно соответствует метод молекулярной диагностики на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время диагностический подход с использованием метода ПЦР является наиболее эффективным средством инфекционного контроля, поскольку позволяет обнаруживать единичные клетки инфекционных агентов посредством заданного ферментативного увеличения специфичного участка генома микроорганизмов, что делает возможным исследование образцов разнообразного диагностического Материала в короткий промежуток времени (4— 6 часов).

Адаптация метода ПЦР для целей детекции и идентификации бруцелл осуществляется с начала 90-х Годов (Кулаков О. К. с соавт., 1992; Кули-ченко А. Н. с соавт., 1994; Fekete A. et al., 1990; Fekete A. et al., 1992; Herman L., De Ridder H„ 1992; Baily G. et al., 1992; Bricker B. J., Hailing S. M., 1994) и продолжается до настоящего времени (Sifuentes-Rincon А. М. et al., 1997; Fox К. F. et al., 1998).

В последнее время рядом исследователей показана возможность успешного применения ПЦР для Подтверждения диагноза острого и хронического бруцеллеза у людей, с использованием в качестве диагностического материала периферической крови (Гаранина С. Б., 1996; Queipo-Ortuno М. I. et al., 1997), мочи и слюны (Гаранина С. Б., 1996), мононукЛеаров периферической крови (Matar G. М. et al., 1996; Morata P. et al., 1998).

Однако, вопросы молекулярной диагностики бруцеллеза с использованием метода ПЦР нельзя считать решенными в полной Мере. Доминирующее число исследований были проведены в области разработки праймеров и изучения потенциальных возможностей метода ПЦР для целей детекции и идентификации бруцелл на основе анализа препаратов ДНК, полученных из чистых культур бруцелл. При этом практически отсутствуют данные, касающиеся использования образцов сывороток крови, которые можно рассматривать в качестве диагностического материала, полученного от людей больных бруцеллезом или с подозрением на бруцеллез. Также во всестороннем изучении нуждаются вопросы молекулярной диагностики посредст-

вом ПЦР острой и хронической форм бруцеллезной инфекции у людей, поскольку исследования в этой области находятся на начальном этапе развития. Таким образом, вышеизложенное свидетельствует об актуальности и перспективности применения ПЦР в качестве метода молекулярной диагностики бруцеллеза и определяет необходимость разработки практических аспектов использования ПЦР для эффективной лабораторной диагностики бруцеллеза.

Цель работы.

Разработать и применить новые методические подходы для осуществления молекулярной диагностики бруцеллеза у людей посредством ПЦР с использованием в качестве диагностического материала образцов сывороток крови.

Задачи работы.

1. Определить оптимальный режим осуществления ПЦР с выбранными праймерами для обнаружения ДНК бруцелл.

2. Применить установленные параметры проведения ПЦР для тестирования препаратов ДНК эпидемиологически значимых видов бруцелл.

3. Разработать эффективные способы экстракции ДНК из бруцелл, присутствующих в модельном диагностическом материале (сыворотке крови), пригодные для осуществления молекулярной диагностики бруцеллеза посредством ПЦР.

4. Тестировать в ПЦР образцы нативных сывороток крови, полученных от людей, предположительно инфицированных вследствие профессионального контакта с больным бруцеллезом крупным рогатым скотом (крс).

5. Изучить возможность применения образцов сывороток крови для молекулярной диагностики острого и хронического бруцеллеза у человека.

6. Применить метод ПЦР с использованием в качестве диагностического материала образцов сывороток крови для молекулярной диагностики хронического и резидуального бруцеллеза у людей.

Научная новизна.

Впервые для молекулярной диагностики бруцеллеза посредством ПЦР разработаны новые и эффективные методы экстракции ДНК из бруцелл, в присутствии сыворотки крови. Методы основаны на щелочном разрушении клеточной стенки бруцелл, но без участия протеолитических ферментов, детергентов и депротеинизирующих агентов (фенол, хлороформ) или этапа нейтрализации кислотой.

Впервые для молекулярной диагностики бруцеллеза с помощью ПЦР в качестве исследуемого материала использованы образцы сывороток крови.

Впервые посредством тестирования в ПЦР образцов сывороток крови установлено, что степень инфицирования животноводов, работающих в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах крс, составляет 77,6 %.

Впервые с помощью ПЦР показана возможность обнаружения ДНК бруцелл в образцах сывороток крови, полученных от больного человека с острой формой бруцеллеза, и от больных людей с хронической формой.

Получены новые данные о информативности метода ПЦР и комплекса традиционных серологических тестов (реакция Хедцльсона, реакция Кум-бса, реакция агглютинации (Райта), реакция пассивной гемагглютинации) при хроническом бруцеллезе у людей.

Практическая значимость.

1. Усовершенствована лабораторная диагностика бруцеллеза у людей.

2. Разработанные нами методы экстракции ДНК посредством щелочного лизиса в Присутствии 0,3 М №С1 и щелочного лизиса-осаждения применяются: в клинико-лабораторной диагностике бруцеллеза, осуществляемой отделом зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ) в сотрудничестве с Инфекционной больницей г. Иркутска; в исследованиях, проводимых в отделе микробиологии чумы с группой подготовки кадров, отделе зоонозных инфекций и эпидемиологическом отделе Иркутского НИПЧИ, а также используются в Молекулярной диагностике различных бактериальных и вирусных инфекций, выполняемой на базе отдела микробиологии чумы с группой подготовки кадров Иркутского НИПЧИ.

3. Составлены «Методические рекомендации по детекции бруцелл в различном биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции», утвержденные Первым заместителем Министра здравоохранения России Г. Г. Онищенко (03.02.97).

4. Решением Российского агентства по патентам и товарным знакам выдан патент на изобретение «Способ выделения ДНК из микроорганизмов и клеток животных, пригодной для постановки полимеразной цепной реакции» № 2129610 от 27 апреля 1999 г. (приоритет от 04.04.97).

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены: на юбилейной Научно-практической конференции, посвященной 75-летию Омского научно-исследовательского института природно-очаговых инфекций (Омск, 1996 г.); на научной конференции по проблемам зоонозных и других инфекционных болезней (Ставрополь, 1996 г.); на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); на научных конференциях Иркутского Научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (1996, 1997 гг.); на конференции, посвященной 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области (Иркутск, 1997 г.).

Публикации.

Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных работах.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Для высокочувствительного и специфичного обнаружения ДНК бру-целл посредством ПЦР с выбранными праймерами Brul и Bru2 оптимален экспериментально установленный режим осуществления реакции.

2. Применение праймеров Brul и Bru2 позволяет осуществлять молекулярную детекцию ДНК бруцелл эпидемиологически значимых видов.

3. Методы экстракции ДНК, основанные на использовании щелочи для лизиса клеточной стенки бруцелл, являются эффективными и доступными способами получения из модельного диагностического материала препаратов ДНК бруцелл, пригодных для исследования в ПЦР.

4. В сравнении с традиционными иммунологическими тестами применение ПЦР позволяет с большей информативностью выявлять инфицированных животноводов из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крс.

5. Для молекулярной диагностики хронического бруцеллеза у человека в качестве диагностического Материала пригодно использование образцов сывороток крови.

6. Исследование образцов сывороток крови, полученных от людей с хроническим бруцеллезом с помощью ПЦР и комплекса серологических тестов (реакция Хеддльсона, реакция Кумбса, реакция агглютинации (Райта), реакция пассивной гемагглютинации) обеспечивает выявление одинакового количества позитивных и негативных образцов (77,8 % и 22,2 % соответственно), но при этом в обоих методах диагностики имеются расхождения в части позитивных результатов (28,5 %).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 128 источников. Работа изложена на 136 страницах, содержит 16 рисунков и 13 таблиц.

Собственные исследования Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов. В работе использовано 44 штамма бруцелл, один штамм Y. enterocolitica 0:9, один штамм V. cholerae и один штамм V. cholerae eltor. Все штаммы получены из музея живых культур Иркутского НИПЧИ.

Питательные среды и условия культивирования. Микроорганизмы рода Brucella культивировали согласно рекомендациям G. G. Alton, L. М. Jones (1967) на плотном агаре Мартена (pH 7,0), при температуре 37 °С, без С02, в течение 2 суток. В. ovis культивировали на плотном агаре Map-

тена с добавлением 10 % нативной лошадиной сыворотки при 10 % содержании С02. V. cholerae и V. cholerae eltor выращивали на плотном (2 %) агаре Хоттингера (рН 8,0), Y. enterocolitica на плотном (2 %) агаре Хот-тингера (рН 7,2) при температуре 28 °С.

Диагностический материал. В качестве диагностического материала в работе использованы образцы 140 сывороток крови, из них: 76 Получены от работников животноводческих хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крс; 2 от человека с подозрением на острую форму бруцеллеза; 26 от людей с документированным диагнозом «хронический бруцеллез» и 2 — «ре-зидуальный бруцеллез»; 34 от здоровых доноров.

Методы серодиагностики бруцеллеза. Серодиагностику осуществляли с применением методов, основанных на выявлении антител к антигенам бруцелл: реакция Хедцльсона (РХ), реакция агглютинации (РА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция Кумбса (РК), согласно «Методическим указаниям по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза у людей» (М., 1980).

Обеззараживание суспензий бруцелл и сывороток. Суспензии клеток бруцелл в физиологическом растворе (1-109 м. к./мл), приготовленные для экспериментов по щелочной экстракции ДНК из бруцелл и образцы сывороток крови обеззараживали мертиолятом натрия в соответствии с «Санитарными правилами СП 1.2.011» (М., 1994).

Выделение ДНК. Выделение высокомолекулярной ДНК бруцелл осуществляли, используя модифицированные методы, предложенные Van Huynh N. et al., (1989) и П. Ф. Р. Литтл (1989), что включало в себя обработку клеток диметилсульфоксидом, их лизис с помощью 1,5 % саркозила и 120 мМ ЭДТА-№2 с последующей депротеинизацией фенолом и хлороформом и преципитацией ДНК этанолом.

Праймеры. В качестве праймеров использовали синтетические дезок-сиолигонуклеотиды, комплементарные участкам гена, кодирующего протек-тивный белок 31 кД (BCSP31) внешней клеточной поверхности В. abortus 19 (Mayfield J. Е. et al., 1988), ограничивающие при ферментативной амплификации участок ДНК бруцелл в 269 п. н. Последовательности праймеров заимствованы нами из опубликованной работы А. Н. Куличенко (1995) и синтезированы по нащему заказу в ТОО «Геногемодиагностика» (Москва) и ООО «Клинбиотех» (Москва). Прямой праймер Brul: 5' — GCA GTC AGA CGT TGC СТА ТТ — 3', обратный праймер Bru2: 5' — GCT ТСА GGT GTT CAG ССТ Т — 3'.

Амплификация. ПЦР осуществляли в полипропиленовых микропробирках объемом 450 мкл, в реакционных смесях с объемами 25 и 30 мкл, состава: 10 мМ Tris-HCl (рН 8,5 при температуре 37 °С), 10 мМ MgCl2, 100 мМ КС1 (Buffer R), 0,2 мг/мл БСА, 30 мкмоль каждого дНТФ, по 10 пико-

молей прямого и обратного праймеров и 1 Ед. Га^-ДНК-полймеразы. Исследуемые образцы в объеме 1—5 мкл вносили в реакционные смеси в последнюю очередь, перемешивали и наслаивали по 30 мкл вазелинового масла. ПЦР проводили в автоматическом режиме на многоканальном тер-моциклере «МС-2» (АО «ДНК технология», Москва) по программе: температура денатурации ДНК-матрицы 94 °С — 35 сек; температура отжига праймеров 52 °С — 35 сек; температура синтеза ДНК 72 °С — 35 сек, с количеством циклов 50. Подготовка используемых в ПЦР компонентов выполнялось в соответствии с общеизвестными правилами работы ПЦР-лаборатории, исключающими контаминацию.

Гель-электрофорез. Результаты амплификации учитывали методом гель-электрофореза в 1,5 % агарозном геле, согласно общепринятым рекомендациям JI. А. Остермана (1981), Т. Маниатиса и соавт. (1984).

Измерение величины рН. Приблизительную величину рН у препаратов растворенных осадков, полученных в ходе экспериментов по щелочной экстракции ДНК из бруцелл, определяли с помощью «рН-бумаги универсальной Индикаторной 1—10» («Реахим», Рига), нанося на нее по 3 мкл раствора каждого осадка. Точную величину рН крайних значений «ПЦР-позитивных» конечных концентраций щелочных лизирующих растворов устанавливали по показаниям цифрового рН-метра («Orion Research», model 211).

1. Оптимизация режима ПЦР с образцами ДНК бруцелл 1.1. Установление оптимальных параметров осуществления ПЦР

С целью наилучшей детекции ДНК бруцелл посредством ПЦР с прай-мерами Brul и Bru2, осуществляемой на модели термоциклера «МС-2» с учетом состава и концентрации компонентов реакционного буфера, объема реакционной смеси и типа используемых микропробирок, мы выполнили ряд экспериментов, позволяющих найти для этого оптимальные параметры осуществления реакции: температуру отжига, продолжительность стадий одного цикла и количество циклов амплификации.

Эксперимент по нахождению оптимальной температуры отжига праймеров Brul и Bru2 с использованием препарата высокомолекулярной ДНК В. abortus 544 показал, что выработка продукта амплификации начиналась при температуре отжига праймеров 49 °С. Максимальный выход продукта амплификации' наблюдался при температуре отжига в интервале 50—54 °С. В интервале температур 55—62 °С происходила пониженная выработка продукта амплификации участка ДНК бруцелл. В качестве оптимальной температуры отжига для проведения дальнейших исследований выбрали 52 °С —

среднее значение среди интервала температур, обеспечивающих максимальный выход продукта амплификации, что согласовывалось с расчетными значениями.

Определение продолжительности трех стадий одного цикла ПЦР (денатурации, отжига, удлинения) показало, что в исследованном интервале времени от 15 до 60 сек, все его значения обеспечивают выработку продукта амплификации, при этом наибольшая интенсивность его выработки наблюдалась в интервале 20—45 секунд. Для дальнейших исследований выбрали среднее значение в этом интервале времени — 35 секунд для всех трех стадий ПЦР.

Оптимальное количество циклов амплификации было установлено нами при проведении ПЦР с количеством циклов 30, 35, 40, 45 и 50 с препаратами ДНК, полученными из 100 клеток штамма В. abortus 544 посредством щелочного лизиса 0,09 М раствором NaOH и содержащих после разведения теоретически количество ДНК, соответствующее одной, Двум И трем клеткам бруцелл. Наиболее высокий уровень образования продукта амплификации происходил при 40, 45 и 50 циклах ПЦР. Для дальнейших исследований мы выбрали в качестве оптимального значения количество циклов амплификации равное пятидесяти.

1.2. Определение специфичности ПЦР с используемыми праймерами

При оценке специфичности ПЦР использовали штаммы микроорганизмов, имеющих антигенное сходство с бруцеллами — Y. enterocolitica 0:9 серовара, V. cholerae, V. cholerae eltor. Экстракцию ДНК из высококонцентрированных взвесей (МО9 КОЕ) этих микроорганизмов осуществляли путем кипячения в течение 5 мин. Результаты оценки специфичности используемых праймеров показали, что праймеры Brul и Вги2 обеспечивают высокую специфичность, что проявлялось отсутствием амплифицированных фрагментов ДНК.

1.3. Анализ образцов ДНК бруцелл разных видов в ПЦР

Параметры, установленные на этапе оптимизации условий осуществления ПЦР, были применены для изучения возможности молекулярной детекции ДНК бруцелл шести видов (В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. rangiferi, В. ovis, В. neotomae) из коллекции, состоящей из 44 штаммов. Часть штаммов (26) была представлена изогенными парами, селекционированными соответственно в S или R-форме. Для осуществления этого этапа исследования мы получили из культур штаммов бруцелл банк геномных ДНК, выделенных и очищенных с помощью модернизированных методов

выделения ДНК, предложенных П. Ф. Р. Литтл (1989) и N. Van Huynh et al. (1989). Все 44 образца высокомолекулярной ДНК бруЦелл обеспечивали синтез специфичного продукта амплификации размером 269 п. н, независимо от видовой принадлежности исходных штаммов бруцелл и стадии диссоциации, следовательно, праймеры Brul и Bru2 являются родоспеци-фическими и пригодны для молекулярной детекции эпидемиологически значимых видов бруцелл.

Таким образом, на первом этапе работы были установлены: наилучшая температура отжига для выбранных праймеров Brul и Вги2; оптимальное время продолжительности трех стадий одного цикла реакции и количество циклов амплификации. Установленные параметры позволяют с высокой специфичностью и чувствительностью осуществлять молекулярную детекцию ДНК бруцелл эпидемиологически значимых видов.

2. Разработка методов щелочной экстракции ДНК из бруцеЛл для молекулярной диагностики бруцеллеза

Известно, что микроорганизмы рода Brucella в отличие от других гра-мотрицательных бактерий имеют в наружной мембране (НМ) клеточной стенки более сильные взаимодействия ее компонентов (белков и липидов) между собой, с липополисахаридом и пептидогликаНом. Это хорошо проявляется при экстрагировании и очистке основных компонентов НМ бруцелл (необходимость предварительной обработки клеток лизоцимом), а также в невозможности получения сферопластов В. melitensis и В. abortus при воздействии на клетку трис-буфера и ЭДТА (Григорьева Г. И., Игнатов П. Е., 1991; Moriyon J., Berman D. Т., 1982).

Особенности строения клеточной стенки бруцелл обусловливают трудность ее лизиса и с целью изоляции ДНК. При поиске оптимального варианта процедуры быстрой экстракции ДНК из бруцелл, для последующей постановки ПЦР наиболее воспроизводимый результат экстракции ДНК, подтвержденный амплификацией ее специфичного участка в ПЦР, был получен нами при использовании для лизиса клеток раствора NaOH, с последующим осаждением ДНК этанолом в присутствии NaCl.

Учитывая то обстоятельство, что в качестве диагностического материала для лабораторной диагностики бруцеллеза наиболее часто используется сыворотка крови, мы выполнили разработку нескольких вариантов метода щелочной экстракции ДНК из бруцелл в присутствии сыворотки крови: 1) экстракция ДНК с помощью щелочного лизиса; 2) экстракция ДНК посредством щелочного лизиса в присутствии 0,3 М NaCl; 3) экстракция ДНК посредством щелочного лизиса-осаждения, в присутствии 0,1 М NaCl и 64 % этанола.

Предполагалось, что в этих методах будут использоваться модельные диагностические образцы объемом 50 мкл, получаемые смешиванием 2 мкл суспензии клеток В. теШепз1з Иеу.1 (2-106 м. к.) и 48 мкл сыворотки крови, а экстракция ДНК будет осуществляться посредством воздействия различных концентраций ИаОН без или в присутствии ЫаС1 и этанола. Разрабатываемые методы должны состоять из минимума этапов и выполняться без дополнительного использования детергентов, депротеинизирующих агентов (фенол, хлороформ) или стадии нейтрализации рН кислотой. Получаемые при таких подходах препараты ДНК заведомо не будут высокоочи-щенными, поскольку должны содержать в своем составе часть денатурированных белков сыворотки и остатки клеточного дебриса. Все эксперименты по разработке методов щелочной экстракции выполняли в трех повторно-стях.

2.1. Метод щелочного лизиса

Для осуществления экстракции ДНК методом щелочного лизиса смешивали модельные диагностические образцы объемом 50 мкл с 50 мкл растворов, создающих в конечном объеме при лизисе концентрацию №ОН от 0,2 до 3,0 М, с интервалом в 0,1 М. Выдерживали полученные смеси при комнатной температуре в течение 15 мин. После лизиса в каждый образец вносили по 6 мкл 5 М ЫаС1 и по 200 мкл 96 % этанола, перемешивали и выдерживали при комнатной температуре 10 мин. После этого пробы центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин, супернатант сливали, остаткам раствора давали стечь на фильтровальную бумагу. Осадок промывали 800 мкл 80 % этанола, центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, супернатант сливали, остаткам этанола давали стечь на фильтровальную бумагу. Осадок подсушивали при температуре 37 °С в течение 20 мин (до полного высушивания) и растворяли в 16 мкл дистиллированной воды (рН 6,6). После растворения и перемешивания осадков измеряли приблизительную величину рН каждого из них, нанося его в количестве 3 мкл на бумагу для определения рН. В ПЦР анализировали 5 мкл каждого препарата из растворенных осадков.

Результаты экстракции ДНК методом щелочного лизиса показали, что «ПЦР-позитвными» являлись только несколько молярных концентраций №ОН: 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 0,9; 1,0 М, при этом образцы ДНК, полученные посредством 0,4 и 0,8 М ИаОН, обеспечивали выход очень малого количества ПЦР-продукта, а при концентрации 0,7 М наблюдался негативный результат амплификации. Начиная с концентрации ИаОН 1,1 М и до 3,0 М в образце при лизисе, во всех случаях результаты амплификации определяемого фрагмента ДНК бруцелл в ПЦР являлись отрицательными.

После окончания выполнения процедуры экстракции мы отметили, что в образцах с концентрациями щелочи 0,6—1,0 М при лизисе, после осаждения этанолом и центрифугирования наблюдался небольшой осадок денатурированных белков сыворотки. После растворения осадков, полученных при лизисе с концентрациями №ОН от 0,2 до 1,0 М, величина их рН составила 8,0.

2.2. Метод щелочного лизиса в присутствии 0,3 М №С1

Экстракцию ДНК методом щелочного лизиса в присутствии 0,3 М №С1 осуществляли, смешивая модельные диагностические образцы объемом 50 мкл с 50 мкл растворов, создающих концентрацию МаОН при лизисе 0,07 —0,1 М, с интервалом в 0,01 М и 0,1—4,4 М, с интервалом в 0,1 М, а также обеспечивающих концентрацию 0,3 М №С1 в конечном объеме каждого лизирующего раствора. Смеси выдерживали при комнатной температуре 15 мин. После лизиса к каждой смеси добавляли по 200 мкл 96 % этанола, перемешивали и выдерживали при комнатной температуре 10 мин. Этапы центрифугирования, промывание полученных осадков, их высушивание, растворение и определение величины рН выполняли, также как для щелочного лизиса. В ПЦР анализировали 5 мкл каждого из растворенных осадков.

В результате экстракции ДНК методом щелочного лизиса в присутствии 0,3 М ЫаС1 установлено, что препараты осадков, полученных с помощью растворов с концентрациями ЫаОН 0,5—3,1, 3,3—3,9 и 4,3 М, обеспечивают выработку специфичного для бруцелл ПЦР-продукта.

При лизисе с концентрациями щелочи 0,07—0,09 М, после преципитации этанолом и центрифугирования осаждалось значительное количество белка сыворотки, который повышал рН растворенных осадков до 9,0—10,0. При 0,5—1,1 М ИаОН осаждалось равное и не очень большое количество белка, величина рН растворов этих осадков составила 8,0. Начиная с 1,2 М и до 4,4 М ЫаОН в лизирующей смеси, осаждалось минимальное количество белка, но при этом пришлось увеличить количество воды до 26 мкл (вместо 16 мкл) для растворения осадков, полученных с концентрациями №ОН от 2,1 до 4,4 М, чтобы снизить рН у этих растворов с 9,0 до 8,0.

В отличие от щелочного лизиса, лизис в присутствии 0,3 М №С1 показал гораздо более эффективный результат экстракций ДНК из бруцелл, при этом , среди всего ряда концентраций №ОН имелись несколько групп значений, обеспечивающих стабильный и наиболее выраженный ПЦР-позитивный результат экстракции ДНК: 0,5—1,5 М; 1,8—2,3 М; 3,7—3,9 М №ОН.

2.3. Метод щелочного лизиса-осаждения, в присутствии 0,1 М ЫаС1 и 64 % этанола

Экстракцию ДНК посредством щелочного лизиса-осаждения выполняли, смешивая модельные диагностические образцы объемом 50 мкл с 250 мкл лизирующе-осаждающих растворов, создающих при лизисе концентрации ЫаОН 0,1—1,4 М (с интервалом в 0,1 М), 0,1 М ЫаС1 (6 мкл 5 М ЫаС1) и 64 % этанола (200 мкл 96 % этанола) в каждой смеси. Полученные смеси выдерживали при комнатной температуре 15 мин. Этапы центрифугирования, промывание полученных осадков, их высушивание, растворение и определения величины рН выполняли так же, как для щелочного лизиса. В ПЦР анализировали 5 мкл каждого из растворенных осадков.

В результате экстракции ДНК методом щелочного лизиса-осаждения определено, что ПЦР-позитивный результат, подтверждающий извлечение геномной ДНК из бруцелл наблюдался только в пробах, полученных с концентрациями ЫаОН от 0,2 до 0,5 М. При этом наибольший выход продукта амплификации отмечен при концентрации щелочи 0,4 М, а количество осажденного белка сыворотки оказалось при этом наименьшим. Величина рН у растворов осадков, полученных с концентрациями ЫаОН 0,1—0,9 М, составляла 8,0, а у растворов осадков, полученных посредством 1,0—1,4 М ЫаОН 9,0—10,0.

Значения рН лизирующих растворов. Для определения величины рН у лизирующих растворов, обеспечивающих ПЦР-позитивные результаты во всех разработанных методах щелочной экстракции, точную величину рН измеряли только у их крайних значений, увеличив объемы определяемых растворов до 7 мл и используя при получении конечных концентраций вместо сыворотки физиологический раствор (рН 7,0). Границы значений рН находились в следующих пределах: при щелочном лизисе — от 12,9 (0,2 М ЫаОН) до 13,3 (1,0 М ЫаОН); при щелочном лизисе в присутствии 0,3 М соли — от 13,3 (0,5 М ЫаОН), до 14,0 (4,3 М ЫаОН); при щелочном лизисе-осаждении — от 13,63 (0,2 М ЫаОН) до 13,73 (0,5 М ЫаОН).

2.4. Чувствительность ПЦР в зависимости от метода экстракции ДНК

Определение чувствительности для разработанных методов щелочной экстракции ДНК из бруцелл выполняли только для метода щелочного лизиса в присутствии 0,3 М ЫаС1 и щелочного лизиса-осаждения, как наиболее приемлемых вариантов щелочной экстракции для молекулярной диагностики бруцеллеза. Для щелочного лизиса в присутствии 0,3 М ЫаС1 выбрали несколько средних значений среди групп стабильных «ПЦР-позитивных» концентраций ЫаОН: 0,7 М, 1,4 М, 2,1 Ми 3,8 М. Чувстви-

тельность метода щелочного лизиса-осаждения определяли только для концентрации NaOH 0,4 М. Экстракцию ДНК во всех случаях выполняли, используя 10-кратные разведения суспензии клеток штамма В. abortus 19 ВА в 50 мкл физиологического раствора.

Экстракция ДНК методом щелочного лизиса в присутствии 0,3 М NaCl обеспечивала обнаружение следующего теоретического количества клеток бруцелл в реакционной смеси: 0,7 М NaOH — 140 м. к.; 1,4 М NaOH — 865 клеток; 2,1 М и 3,8 М NaOH — 86 клеток.

Экстракция ДНК методом щелочного лизиса-осаждения 0,4 М NaOH в присутствии 0,1 М NaCl и 64 % этанола обеспечила чувствительность 1406 м.к.

Таким образом, на втором этапе работы нами установлено, что использование щелочи для целей экстракции ДНК из бруцелл в присутствии сыворотки очень эффективно: во-первых, благодаря денатурирующему воздействию щелочи на белки клеточной стенки бруцелл успешно достигается ее разрушение, что обеспечивает извлечение геномной ДНК, пригодной для ферментативной амплификации в ПЦР; во-вторых, высокие значения рН во время преципитаций этанолом препятствуют осаждению большей части денатурированных этанолом белков сыворотки, что не мешает, затем, растворению осажденной ДНК и не создает щелочного значения рН в препарате растворенного осадка НК.

Метод щелочного лизиса показал неравномерные позитивные результаты экстракции ДНК из бруцелл в условиях присутствия сыворотки, что делает его недостаточно пригодным для молекулярной диагностики бруцеллеза. Метод щелочного лизиса в присутствии 0,3 М NaCl обеспечил экстракцию ДНК из бруцелл в широком диапазоне молярных концентраций NaOH, что делает его более приемлемым для использования в диагностике бруцеллеза с помощью ПЦР. Метод щелочного лизиса-осаждения позволял получить препараты геномной ДНК из бруцелл только в узком интервале молярных концентраций NaOH. Необходимо отметить, что результаты, полученные при разработке методов щелочной экстракции ДНК из бруцелл, являлись воспроизводимыми, при условии, что срок использования исходного 10 М NaOH, применяемого для приготовления лизирующих растворов не превышал трех недель от момента приготовления.

Среди трех разработанных нами методов щелочной экстракции геномной ДНК из бруцелл в присутствии сыворотки крови наиболее эффективным и пригодным для получения ДНК является метод щелочного лизиса в присутствии 0,3 М NaCl, который показал высокую чувствительность и воспроизводимость при концентрациях NaOH 0,7 М и 2,1 М.

3. Изучение возможности применения образцов сывороток крови для молекулярной диагностики бруцеллеза у людей

3.1. Исследование сывороток крови животноводов из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота

Известно, что в животноводческих хозяйствах, неблагополучных по бруцеллезу крс, регистрируется высокая степень инфицирования персонала, обслуживающего животных (но в то же время, клинически выраженные случаи бруцеллеза единичны), и от 30 до 70 % работников имеют положительные результаты серологических реакций на бруцеллез. В таких очагах бруцеллеза, инфекция у людей часто протекает в виде так называемой латентной формы бруцеллеза, со стертыми клиническими проявлениями заболевания (Вершилова П. А., Голубева А. А., 1972; Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996).

Мы исследовали с помощью ПЦР и серологических методов диагностики бруцеллеза (РХ, РА, РПГА) 76 образцов сывороток крови, полученных от работников нескольких животноводческих хозяйств Иркутской области, неблагополучных по бруцеллезу крс, из них две сыворотки имели выраженный гемолиз, а одна высохла при транспортировке и хранении. В качестве контрольной группы использовали 20 образцов сывороток крови, полученных от здоровых доноров. Исследование образцов сывороток крови посредством ПЦР выполняли в трех повторностях.

При тестировании в ПЦР сывороток крови, полученных от животноводов, мы установили, что использование нативных сывороток без этапа экстракции ДНК приводит к выработке специфичного продукта амплификации участка ДНК бруцелл размером 269 п. н.

Для определения оптимального количества нативной сыворотки, которое не оказывало бы ингибирующего влияния на осуществление ПЦР, мы провели амплификацию с возрастающим количеством сыворотки — от 1 до 5 мкл с интервалом в 0,5 мкл, вносимой в реакционную смесь с конечным объемом 30 мкл. В результате чего мы установили, что оптимальное количество тестируемой нативной сыворотки составляет 1 мкл на 30 мкл реакционной смеси.

Последующее тестирование сывороток крови осуществляли посредством использования в ПЦР 1 мкл нативных сывороток.

При тестировании в ПЦР образцов нативных сывороток крови, полученных от животноводов, установлено, что ПЦР-негативными являлись 17 (22,4 %) образцов. ПЦР-позитивными являлись 59 (77,6 %) образцов, они обеспечили выработку специфичного для бруцелл фрагмента ДНК размером 269 п. н. с различной степенью интенсивности, при этом 2 образца

сыворотки с гемолизом эритроцитов и 1 высохший, после его растворения в ТЕ-буфере, являлись ПЦР-позитивными. Тестирование образцов нативных сывороток крови из контрольной группы, состоящей из здоровых людей, показали, что выработки продукта амплификации не происходит ни в одном случае. Результаты тестирования образцов сывороток крови, полученных от животноводов, работающих в хозяйствах крс, неблагополучных по бруцеллезу, являлись воспроизводимыми трижды.

Из 76 образцов в серологических реакциях тестировали только 73, поскольку два образца были гемолизированными, а один высохшим (4 %). Результаты серодиагностики показали, что 50 (65,7 %) образцов сывороток имели негативный результат во всех трех реакциях. Серопозитивными являлись 23 (30,3 %) образца.

Тестирование в ПЦР образцов нативных сывороток крови, полученных от животноводов из очагов бруцеллеза крс, продемонстрировало большую информативность метода ПЦР в отличие от таких серологических тестов как РХ, РА, РПГА — 77,6 % и 30,3 % случаев соответственно.

Настолько значительное отличие в эффективности ПЦР и серологических тестов, по-видимому, может быть объяснено тем, что при серологическом исследовании образцов сывороток крови животноводов применяли только три теста (РХ, РА, РПГА) и не использовали реакцию Кумбса, специфичность и информативность которой при хроническом бруцеллезе у людей высока (Кайтмазова Е. И., Чернышева М. И., 1972; Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996).

На наш взгляд в качестве предположения нельзя исключить и существование серонегативного периода у части (65,7 %) инфицированных работников животноводства из очагов бруцеллеза крс, когда с помощью традиционных серологических методов, основанных на обнаружении антител к антигенам бруцелл (РХ, РА, РПГА) невозможно выявление антител, а с помощью высокочувствительного метода ПЦР в 33 из 50-ти серонегативных образцов сывороток выявляется присутствие ДНК бруцелл.

Тестирование методом ПЦР образцов нативных сывороток крови животноводов, работающих в хозяйствах крс, неблагополучных по бруцеллезу, продемонстрировало, что информативность ПЦР превосходит каждый из применяемых в нашем исследовании серологических тестов в отдельности.

Результаты тестирования в ПЦР образцов сывороток крови, полученных от животноводов, работающих в хозяйствах крс, неблагополучных по бруцеллезу, являлись воспроизводимыми трижды.

3,2. Изучение возможности применения образцов сывороток крови для диагностики методом ПЦР острого и хронического бруцеллеза у людей

Для изучения возможности применения образцов сывороток крови в качестве материала для диагностики методом ПЦР острой и хронической форм бруцеллезной инфекции мы располагали: двумя образцами сывороток (сыворотка № 1 и № 2), полученными от человека с клинической картиной острого бруцеллеза, и характерным эпидемиологическим анамнезом (вынужденный убой свиньи и разделывание ее туши в домашних условиях), сыворотки взяты через один месяц после заражения с интервалом в две недели; одним образцом сыворотки крови (сыворотка № 3), полученным от человека с документированным диагнозом «хронический бруцеллез», с давностью заболевания более десяти лет. В качестве контрольной группы использовали 3 образца сывороток крови, полученных от здоровых людей. Все исследования, проводимые по изучению пригодности образцов сывороток для метода ПЦР, выполняли в трех повторностях.

При исследовании сывороток крови № 1 и № 2 в серологических тестах на бруцеллез обе сыворотки являлись позитивными в РХ, РА (1:1600) и РПГА (1:6400).

Исследование в ПЦР образца нативной сыворотки № 1 в количестве 1 мкл показало, что выхода продукта ферментативной амплификации не происходит. С целью дальнейшего исследования образцов сывороток № 1 и № 2 мы применили к ним процедуру экстракции ДНК, основанную на щелочном лизисе-осаждении.

Полученные с помощью процедуры щелочного лизиса-осаждения препараты ДНК из 10 мкл сывороток № 1 и № 2 обеспечили выработку специфичного продукта ферментативной амплификации фрагмента ДНК бруцелл в ПЦР размером 269 п. н.

Для изучения возможности применения образца сыворотки крови для диагностики методом ПЦР хронической формы бруцеллезной инфекции у человека мы исследовали один образец сыворотки крови (сыворотка № 3).

Серологическое исследование показало, что сыворотка № 3 обеспечивает положительный результат в РХ и РК (1:200) и сомнительный в РА (1:50) и РПГА (1:50).

При тестировании в ПЦР образца нативной сыворотки крови № 3 происходила выработка специфичного ПЦР-продукта, но с низким уровнем амплификации.

С целью повышения уровня амплификации фрагмента ДНК бруцелл из образца сыворотки крови № 3 мы применили два дополнительных методических подхода.

1. Получение из образца сыворотки № 3 препарата осадка, содержащего ДНК бруцелл. Первый подход основывался на том, что в нативной сыворотке крови человека с хронической бруцеллезной инфекцией присутствует ДНК бруцелл, как показало тестирование в ПЦР нативной сыворотки, и с помощью преципитации этанолом из образца этой сыворотки удастся получить более очищенный от белков сыворотки препарат ДНК бруцелл, что выразилось бы и в более интенсивном образовании ПЦР-продукта. Для реализации этого подхода из 5 мкл сыворотки № 3 с помощью преципитации этанолом в присутствии №С| получили препарат осадка, который растворили в 20 мкл буфера ТЕ (рН 8,0). Исследование в ПЦР 3 мкл препарата растворенного осадка сыворотки действительно привело к ожидаемому повышению выхода специфичного для бруцелл ПЦР-продукта.

2. Дополнительная экстракция ДНК из препарата растворенного осадка, полученного из сыворотки № 3. Второй подход строился на предположении о том, что применение дополнительного этапа щелочной экстракции к препарату осадка из сыворотки № 3 позволит добиться предельной денатурации остатка сывороточных белков, имеющихся в препарате осадка, и, таким образом, максимально повысить выход специфичного для бруцелл ПЦР-продукта. С этой целью мы применили к оставшимся 15 мкл препарата осадка из сыворотки № 3 процедуру щелочного лизиса-осаждения. Полученный в результате процедуры щелочного лизиса-осаждения осадок растворили в 15 мкл буфера ТЕ (рН 8,0). Исследование в ПЦР 3 мкл препарата растворенного осадка продемонстрировало, что выход ПЦР-продукта значительно увеличился, что выражалось более насыщенной и гомогенной флюоресцирующей зоной ДНК в агарозном геле.

Результаты исследования трех образцов сывороток крови из контрольной группы, состоящей из здоровых людей, показали, что выработки продукта амплификации не происходит ни в одном случае.

Возможность применения образцов сыворотки в качестве диагностического материала для метода ПЦР в случае острого бруцеллеза у человека исследована только на одном случае, что, безусловно, нуждается в дополнительных подтверждениях. Однако, учитывая известные характерные особенности острой фазы бруцеллеза у человека: патогенетические — прорыв инфекции из региональных лимфатических узлов (Вершилова П. А., 1972); бактериологические — гемокультура (Первушин Б. П., 1947; Кайтмазова Е. И., Чернышева М. И., 1972; Таран И. Ф., Лямкин Г. И., 1996) и клинические — температурная реакция (Пандиков Г. А., 1947; Руднев Г. П., 1970; Ходжаев Ш. X., 1972), можно предположить, что обнаружение ДНК бруцелл в сыворотке крови не будет являться редкостью в этот период заболевания.

Исследование образца сыворотки крови в случае хронической бруцеллезной инфекции у человека также продемонстрировало пригодность данного диагностического материала длй молекулярной диагностики бруцеллеза посредством ПЦР. При этом использование предложенных нами методических подходов обеспечило успех амплификации специфичного участка ДНК бруцелл, и, как и в случае острого бруцеллеза у человека показало присутствие ДНК бруцелл в сыворотке крови в период хронической инфекции.

3.3. Применение образцов сывороток крови для молекулярной диагностики хронического и резидуальНого бруцеллеза методом ПЦР

С целью применения разработанных нами методических подходов для молекулярной диагностики хронического И резидуального бруцеллеза у людей методом ПЦР с использованием в качестве диагностического материала образцов сывороток крови мы исследовали 27 образцов сывороток, из которых 25 получены от людей с документированным диагнозом «хронический бруцеллез», а два от людей с диагнозом «резидуальный бруцеллез». Диагноз установлен на основании клинико-эпидемиологических данных, позитивных результатов серологических исследований и аллергической пробы. Давность заболевания бруцеллезом составляла период от четырех до сорока семи лет. По профессиональному фактору больные люди относились в прошлом или в настоящее вре^я к работникам животноводства (ассимена-торы, доярки), мясокомбината (бойщики скота, грузчики) и ветеринарной службы.

В качестве контрольной группы применяли 10 образцов сывороток крови, полученных от здоровых доНоров.

Исследование образцов сывороток крови посредство^ ПЦР осуществляли трехкратно.

Серологическое исследование образцов выполняли с использованием комплекса традиционных тестов — РХ, РА, РПГА и РК.

При осуществлении молекулярной диагностики бруцеллеза и исследовании образцов сывороток из контрольной группы здоровых людей выполняли экстракций ДНК посредством метода щелочного лизиса 0,7 М ЫаОН в присутствии 0,3 М ЫаС1 из 50 мкл образцов сыворотки. Длй этого каждый образец сыворотки смешивали с 50 мкл Щелочного визирующего раствора (7 Мкл 10 М №ОН, 6 мкл 5 М ЫаС1, 37 мкл дистиллированной воды) и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее этапы экстракции ДНК выполняли, как представлено в разделе 2.1. «Метод щелочного лизиса», но прй этом полученный после преципитации и отмы-

вания 80 % этанолом осадок растворяли в 50 мкл дистиллированной воды. В ПЦР исследовали 5 мкл полученного препарата ДНК.

Результаты ПЦР показали, что из 27 образцов сывороток б (22,2 %) образцов являлись ПЦР-негативными. В 21 (77,8 %) случае, включая обе пробы от людей с резидуальным бруцеллезом, зарегистрирована выработка специфичного участка ДНК бруцелл.

Исследование образцов нативных сывороток крови из контрольной группы, состоящей из здоровых людей, показало, что выработки специфичного для бруцелл продукта амплификации не происходило ни в одном случае.

Результаты исследования методом ПЦР образцов сывороток крови, полученных от людей с хроническим и резидуальным бруцеллезом, являлись воспроизводимыми трижды.

Серологического исследование обнаружило, что 6 образцов сывороток (22,2 %) являлись негативными во всех четырех тестах, в 21 (77,8 %) случае образцы сывороток являлись позитивными в одном или нескольких тестах.

Однако, среди общего количества как ПЦР-, так и серопозитивных образцов в шести случаях (28,5 %) отмечено несовпадение результатов, когда образцы сывороток, позитивные в ПЦР, являлись отрицательными во всех применяемых серологических тестах и, наоборот, у такой же части серопозитивных образцов (28,5 %) результаты ПЦР оставались негативными. Такое распределение результатов позволило нам сделать предположение о существовании при хроническом бруцеллезе, периодов, по всей видимости, связанных с ремиссиями, когда присутствие или специфических антител или ДНК бруцелл невозможно определить в сыворотке крови.

Исследование образцов сывороток крови у людей с хроническим и резидуальным бруцеллезом показало, что информативность метода ПЦР превосходит любой из используемых в нашем исследовании серологических тестов в отдельности.

Выводы

1. Экспериментально установлен оптимальный режим осуществления ПЦР с праймерами Вги1 и Вги2 (температура отжига 52 °С, продолжительность стадий одного цикла 35 сек, число циклов амплификации 50), позволяющий специфично и с высокой чувствительностью обнаруживать ДНК бруцелл.

2. Показана пригодность праймеров Вги1 и Вги2 для молекулярной детекции ДНК эпидемиологически значимых видов бруцелл, в том числе находящихся в стадии диссоциации.

3. Предложены новые эффективные методы экстракции ДНК из бруцелл, находящихся в модельном диагностическом материале (сыворотке крови), основанные на использовании щелочи, но без участия детергентов и депротеинизирующих агентов, позволяющие получать препараты геномной ДНК, пригодные для ферментативной амплйфикации.

4. Тестирование в ПЦР образцов нативных сывороток крови, полученных от животноводов из хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крс, продемонстрировало большую Информативность метода ПЦР перед серологическими тестами (реакция Хеддльсона, Райта, РПГА) и позволило выявить присутствие ДНК бруцелл в образцах сывороток в 77,6 % случаев, в серологических тестах противобруцеллезные антитела обнаружены в 30,3 % случаев.

5. Использование образцов сывороток крови в качестве диагностического материала пригодно для молекулярной диагностики методом ПЦР хронического бруцеллеза; у людей.

6. При лабораторном подтверждении диагноза хронического бруцеллеза у людей метод ПЦР и комплекс серологических тестов (реакция Хеддльсона, реакция Кумбса, реакция агглютинации (Райта;), реакция пассивной гемагглютинации) информативны в равной степени, однако, при этом среди общего количества ПЦР-позитивных и серопозитивных случаев в 28,5 % наблюдаются расхождения в результатах, что дает основания предполагать о возможности Существования при хронической форме бруцеллеза у людей либо серонегативного, либо ДНК-негативного периода.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шестопалов М. Ю., Балахонов С. В., Токарева Л. Е., Калиновский А. И. К использованию полимеразНой цепной реакции для Детекции бруцелл / / Мат. науч. конф. «Природно-очаговые болезни человека», — Омск, 1996. — С. 239—241.

2. Шестопалов М. Ю., Балахонов С. В., Токарева Л. Е., Калиновский А. И. Разработка методов генетического анализа бруцелл / / Мат. науч. конф. по проблемам зоонозНых и других инфекционных болезней. — Ставрополь, 1996. — С. 235—237.

3. Балахонов С. В., Шестопалов М. Ю., калиновский А. И. Оптимизация детекции бруцелл с помощьй полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиологии и вирусология. —1996. — № 4. — С. 33—35.

4. Шестопалов М. Ю., Балахонов С. В., Калиновский А. И., Голубинский Е. П. Результаты исследования сывороток крови животноводов на бруцеллез с помощью ПЦР и иммунологических методов // Мат. научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, — Саратов, 1997. — Т. 1. — С. 257.

5. Шестопалов М. Ю., Балахонов С. В., Калиновский А. И., Голубинский Е. П. Полимеразная цепная реакция в лабораторной диагностике бруцеллеза // Материалы конференции, посвященной 75-летию образования санитарной службы в Иркутской области, — Иркутск, 1997. — С. 134—136.

6. Шестопалов М. Ю., Балахонов С. В., Калиновский А. И., Голубинский Е. П. Разработка методов щелочной экстракции хромосомной ДНК из бруцелл для ПЦР-диагностики бруцеллеза // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 1999. — № 1. — С. 30—37.

7. Шестопалов М. Ю., Балахонов С. В., Калиновский А. И., Голубинский Е. П. Способ выделения ДНК из микроорганизмов и клеток животных, пригодной для постановки полимеразной цепной реакции / / Патент на изобретение № 2129610, приоритет от 04.04.97, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации, М., 27.04.99.

Подписано в печать 01.12.99. Бумага офсетная. Формат 60x84'/ Гарнитура Антиква. Усл. печ. л.1.4/ Тираж 100 экз. Зак.2580-10000-99.

АООТ «Ангарская типография», ул.Мира, 18. Лицензия Плр № 040324.