Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР"

На правах рукописи

КУКЛЕВ Василий Евгеньевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ, ТУЛЯРЕМИИ И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПЦР

03 00 07 - микробиология 03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03174096 1

Саратов - 2007

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители-

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Кутырев Владимир Викторович Куличенко Александр Николаевич

Официальные оппоненты*

доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

доктор медицинских наук, старший Саяпина Лидия Васильевна

научный сотрудник

Ведущая организация:

ГУ "НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи" РАМН

Защита состоится « » UXLfi/^ 2007

■Г?

часов на заседании

диссертационного совета Д 208 078 01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г Саратов, ул Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан « ^f » Р&Р^Ж

2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В настоящее время эпидемиологическая обстановка по чуме, туляремии и сибирской язве во всем мире остается достаточно сложной Это обусловлено активностью природных очагов чумы и туляремии, возможностью заноса возбудителей с эндемичных территорий на эпидемически благополучные в связи с хозяйственной деятельностью человека [Онищенко Г Г с соавт, 2003] Кроме того, Yersinia pest is, Francisella tularensis и Bacillus anthracis отнесены к наиболее опасным из возможных агентов биотерроризма, благодаря их высокой контагиозности, а для сибиреязвенного микроба - вследствие возможности образования спор [Воробьев А А, 2002] Поэтому остается актуальным разработка и совершенствование методов специфической индикации и ускоренной идентификации чумного, туляремийного и сибиреязвенного микробов в биологическом материале и объектах окружающей среды

В последние годы все большее распространение получают генамплификационные технологии, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая обладает высокой чувствительностью - 1x102 - 1x103 КОЕ/мл, специфичностью и позволяете течение 3-6 ч выявить ДНК патогенного биологического агента (ПБА) в нативном материале без этапа культивирования микроорганизмов и охарактеризовать его по интересующим признакам таксономия, вирулентность и эпидемическая значимость, устойчивость к антибактериальным препаратам [Rolfs A eta/, 1993]

На сегодняшний день имеются многочисленные данные о применении ПЦР для индикации и идентификации возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы, однако в лабораторную практику в России внедрены только два диагностических препарата «ГенСиб - Тест-система для выявления ДНК В anthracis pXOl методом ПЦР» [ТУ 8895007-01898109-2007] и «ГенПест - Тест-система для выявления ДНК Y pestis методом ПЦР» [ТУ 8895-005-01898109-2007] Опыт проведения генодиагностических исследований с данными ПЦР-тест-системами указывает на необходимость решения ряда проблем

Во-первых, увеличение продолжительности и трудоемкости анализа при исследовании проб, подозрительных на зараженность неизвестным ПБА, а также материала, собранного на территории сочетанных природных очагов чумы и туляремии Связано это с тем, что разработанные диагностические препараты с одной стороны направлены на детекцию лишь одного возбудителя, а с другой - имеют многоэтапную технологию подготовки реакционной смеси для ПЦР и длительное время реакции амплификации (от 2 до 4,5 ч)

Во-вторых, трудности организации исследований методом ПЦР в полевых условиях и мобильных лабораториях специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ), учитывая противоконтаминационный режим работы, поскольку в существующих ПЦР-тест-системах учет результатов проводится с помощью электрофореза в агарозном геле и для его постановки требуется оборудование изолированного рабочего места

В-третьих, сложность ускоренной идентификации Y pestis, так как имеющийся препарат для генной диагностики чумы основан на амплификации генов, расположенных на видоспецифичных плазмидах pFra и pPst, и, следовательно, направлен только на детекцию возбудителя без определения его свойств В тоже время такие системы созданы для характеристики штаммов сибиреязвенного и туляремийного микробов [Тучков И В с соавт, 1994, Leal N С et al, 1999, Versage J L et al, 2003, Levi К et al, 2003, Шевченко О В с соавт, 2004, Тучков И В , 2005, Осина Н А с соавт, 2006]

Решением обозначенных проблем может быть разработка качественно новых препаратов для генной диагностики чумы, туляремии и сибирской язвы на основе технологий мультилокусной ПЦР (МПЦР) и гибридизационно-флуоресцентного учета результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) Принципиальной особенностью мультилокусной ПЦР (МПЦР) является введение в состав системы двух и более пар праймеров, которые обеспечивают одновременную амплификацию сразу нескольких ДНК-мишеней разных возбудителей или одного патогена В тоже время ПЦР-РВ позволяет детектировать реакцию амплификации автоматически по накоплению флуоресцентного сигнала в пробирках, не открывая их и не используя для этих целей метод электрофореза в агарозном геле

Цель работы — создание тест-систем для выявления и генетической характеристики штаммов возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Основные задачи исследования

1 Провести анализ геномов возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии на наличие специфичных регионов, выбрать оптимальные ДНК-мишени для мультилокусной ПЦР

2 Подготовить и охарактеризовать обширную выборку штаммов Y pestis, F tularensis, В anthracis, и гетерологичных микроорганизмов для оценки специфической активности (чувствительности) и специфичности мультилокусной ПЦР

3 Подобрать к выбранным фрагментам ДНК олигонуклеотидные праймеры и зонды TaqMan, оптимизировать условия проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

4 Разработать схему подготовки биологического материала и объектов окружающей среды для одновременной детекции У ре5Ш, Р Ыагепня и В апЛгаси с помощью мультилокусной ПЦР

5 Сконструировать и апробировать при исследовании полевого материала тест-системы для одновременного выявления ДНК У рги/;.?, Р иЛагетхя и В ашИгаск методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, охарактеризовать их диагностическую ценность

6 Разработать методический подход для характеристики штаммов возбудителя чумы по вирулентности с помощью мультилокусной ПЦР

Научная новизна работы

Впервые на основе анализа структуры геномов возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии определены оптимальные ДНК-мишени для создания МПЦР, направленной на одновременное выявление указанных возбудителей хромосомный локус За У реяШ, гены С F 1и1агет1$, ген ра%К В амИгаси

Впервые на основе подобранных праймеров и зондов TaqMan сконструированы тест-системы для одновременного вьивления в одной реакции ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

Установлена возможность эффективной детекции с помощью усовершенствованной методики выделения ДНК и разработанных тест-систем возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы в пробах биологического материала и объектах окружающей среды

Продемонстрирована эффективность методического подхода для одновременной детекции и характеристики возбудителя чумы с помощью мультилокусной ПЦР, основанной на выявлении видоспецифичного локуса За и ассоциированных с вирулентностью генов хромосомного ОВП и плазмиды рСа<1, а также возможность дифференцирования авирулентных штаммов чумного микроба от вирулентных

Практическая значимость работы

По результатам проведенных исследований созданы экспериментальные серии тест-систем для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методами мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (тест-системы «ЧТС-ЭФ» и «ЧТС-

РВ»), а также экспериментальные серии тест-системы «Мульти-Ур» для детекции штаммов чумного микроба и их характеристики по генам, ассоциированным с вирулентностью Разработаны инструкции по изготовлению и контролю сконструированных тест-систем

При межлабораторных испытаниях подтверждена диагностическая ценность тест-систем специфическая активность (чувствительность) - 1 х 103 мк/мл, специфичность -100 %, воспроизводимость результатов - 100 % (акт № 9 от 24 11 2006 г, утвержден директором ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб")

Разработаны методические рекомендации "Применение многофакторного генетического анализа для детекции и характеристики возбудителей особо опасных инфекций бактериальной и вирусной природы", одобренные на заседании Ученого Совета (протокол № 9 от 24 11 2006 г ) и утвержденные директором ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий на курсах повышения квалификации специалистов "ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов" при РосНИПЧИ "Микроб"

Основные положения, выносимые на защиту

1 На основе специфических нуклеотидных последовательностей генов У резиз (видоспецифичный хромосомный локус За), /•" Ыагеюи (гены щШС, кодирующие белок 23 кДа) и В апАгаск (ген pagA плазмиды рХ01, отвечающий за синтез протективного антигена), определенных в результате анализа геномов чумного, туляремийного и сибиреязвенного микробов, возможно создание эффективных праймеров и зондов ТаяМап для конструирования тест-системы, обеспечивающей одновременную детекцию возбудителей указанных инфекций методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов

2 Разработана схема подготовки проб, которая обеспечивает эффективное выделение и концентрирование ДНК из биологического материала и объектов окружающей среды для одновременного выявления возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР, и соответствует требованиям нормативной документации по биологической безопасности работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности

3 Разработанные тест-системы для одновременного выявления ДНК У рехих, Р Шагетк и В амИгася методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов позволяют проводить одномоментную специфическую индикацию возбудителей в пробах биологического

материала и объектах окружающей среды (специфическая активность lx 103 мк/мл и специфичность 100%)

4 Предложенный методический подход для детекции и характеристики возбудителя чумы обеспечивает дифференцирование штаммов Y pestis по генетическим маркерам, ассоциированным с вирулентностью (хромосомный ОВП и плазмида pCad), и обнаружение авирулентных штаммов чумного микроба Апробация работы

Материалы диссертации представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология - XXI век" (Саратов, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (Волгоград, 2005), Российской научно-практической конференции (Новосибирск, 2005), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им С М Кирова (Санкт-Петербург, 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита "Группы восьми" и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств" (Оболенск, 2006), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2007) Публикации

Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них 1 - в рекомендованном ВАК издании

Струю-ура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 241 цитируемую работу Общий объем диссертации 152 страницы Текст иллюстрирован 18 таблицами и 14 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы В качестве исследуемого материала использовали бактериальные взвеси чистых культур микроорганизмов, пробы биологического материала (суспензии органов грызунов), объектов внешней среды (почва), эктопаразитов (блохи, клещи, комары), а также искусственно контаминированные возбудителями чумы, туляремии и сибирской язвы пробы крови, органов белых мышей, почвы и воды

Работа выполнена на 211 штаммах микроорганизмов, из них 31 -У pestis (17 основного подвида, 14 - неосновных), 15 - У pseudotuberculosis, 3 - Y enterocolittca, 33 -В anthracis, 20 - Bacillus spp ,33—F tularensis, 8 - Staphylococcus spp, 7 - Escherichia coli, 6 - Shigella spp, 5 — Salmonella spp, 4 - Proteus spp, 4 - Pseudomonas spp, по 3 - Aeromonas spp, Alcaligenes faecalis, Brucella spp, Comamonas spp, Corynebacterium diphteriae, Listeria monocitogenes, Plesiomonas shigelloides, Pneumococcus, Serracia marcescens, Vibrio cholerae eltor, 2 - Enterococcus spp, по 1 - Citrobacter freundu, Erysepelotrix rhusiopthiae, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Sarcina aurantica, Streptococcus pyogenes (таблицы 2 125)

Методы.

Микробиологические методы

Для культивирования микроорганизмов применяли общепринятые среды и методы [Дяченко С С, 1962, Лабинская А С, 1963] Работу с культурами возбудителя чумы проводили в соответствии с МУ 3 1 1098-02 «Методические указания по организации и проведению эпидемиологического надзора в природных очагах чумы Российской Федерации», возбудителя туляремии - в соответствии с МУ 3 1 2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией», возбудителя сибирской язвы - в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды»

В экспериментах использованы беспородные белые мыши, весом 18-20 г Все манипуляции с животными, включая эвтаназию, осуществляли согласно рекомендациям Карпенко В В , Сачкова В И [1985] Генетические методы

Анализ геномов микроорганизмов проводили с использованием нуклеотидных последовательностей генетической базы данных NCBI GenBank, программы Mega3 1 алгоритмов AlignX для выравнивания последовательностей и UPGMA - для кластерного анализа Подбор праймеров осуществляли с помощью программы PnmerExpress,

алгоритма BLAST Подбор зондов TaqMan проводили в онлайн-режиме на интернет-сайте www genscnpt com

Праймеры и зонды синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК " ASM-800" (ТОО "Биоссет", Россия)

Выделение ДНК осуществляли с помощью метода нуклеосорбции [Boom R et al, 1990] Лизирующий раствор содержал одно из указанных веществ D-дитиотрейтол, лаурилсаркозин натрия, меркаптоэтанола (коммерческий комплект GenPak, Биоком)

Полимеразную цепную реакцию проводили в микропробирках объемом 0,6 и 0,2 мл на программируемых термоциклерах Терцик МС 2 ("ДНК-технология", Россия), БИС-2 ("Вектор", Россия), MJ Research РТС-100 (США), RotorGene 3000 (Corbett Research, Австралия)

Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 2-2,5 %-ном агарозном геле, который выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах Л А Остермана [1981] иТ Маниатиса с соавт [1984] Для документирования полученных результатов гелевые пластики сканировали с помощью системы "GelDoc 2000" ("BioRad",CLLLA)

Секвенирование полученных в ПЦР ампликонов проводили на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer»

Результаты исследований

На первом этапе разработки мультилокусной ПЦР для выявления ДНК Y pestis, F tularensis, В anthracis был проведен анализ представленных в базе данных NCBI GenBank нуклеотидных последовательностей чумного, туляремийного и сибиреязвенного микробов, изучены отечественные и иностранные публикации На основании проведенного анализа для каждого возбудителя была определена видоспецифичная ДНК-мишень, присутствующая в геномах всех изученных штаммов данного вида и отсутствующая у гетерологичных микроорганизмов

Для чумного микроба в качестве такой мишени вы бран локус За, входящий в состав стабильной хромосомной области размером 41,7 т п н (№ AF350075), и который, по данным Radnedge et al [2001], отсутствует у других представителей рода Yersinia Поскольку данный локус хромосомы чумного микроба никогда ранее не использовался при разработке генодиагностических препаратов, нами было проведено секвенирование его фрагмента размером 522 п н у 19 штаммов Y pestis, выделенных в различных природных очагах Установлена 100 % степень гомологии изученных последовательностей с сиквенсом За-локуса, представленным в NCBI GenBank (№

AF350075) У двух штаммов Y pestis отмечен полиморфизм по 2 нуклеотидам Основой для подбора праймеров стали полностью гомологичные участки секвенированной области данного фрагмента хромосомы

Для сибиреязвенного микроба в качестве ДНК-мишени нами был выбран ген pagA (№ NC_001496 1, AF065404 1), определяющий синтез протективного антигена. Литературные данные свидетельствуют о его высокой консервативности и специфичности [Robertson D et al, 1990, Okinaka R T et al, 1999], благодаря чему он широко использовался при создании монолокусных ПЦР-тест-систем для выявления ДНК В anthracis [Тучков И В, 1991, 1994, Куличенко А Н, 1992 1995, Beyer W. et al, 1995, Robertson J M etal, 1999]

Высокая степень гомологии генетического материала у представителей рода Francisella послужила причиной для проведения углубленного анализа литературных данных и нуклеотидной последовательности отдельных генов (с известной функцией) возбудителя туляремии, представленных в базе NCBI GenBank. Установлено, что большинство изученных локусов специфичны для F tularensis, однако вариабельны либо на уровне подвида (galE, mdh, sghA, trpE), либо изолятов (иир, tpi, pgm, parC, atpA, aroA, полиморфные участки fopA) Гены 16S pPHK и Ipn, кодирующий предшественник белка Ти14, имеют гомологию с генами F philomiragia и эндосимбионтов клещей

В ходе дальнейшего анализа полных геномов туляремийного микроба было установлено, что оперон iglABC, отвечающий за синтез белка внешней мембраны молекулярной массой 23 кДа, имеет высокий процент гомологии у штаммов F tularensis всех подвидов (99,03 %) Изменчивость выражена полиморфизмом единичных нуклеотидов (21 сайт), двумя делециями (4 и 16 п н) у F novicida и одной (Юпн)-у F tularensis nearctica Определенная вариабельность не препятствует подбору видоспецифичных праймеров, в связи с чем мономорфные участки данного локуса были выбраны нами для дальнейшей работы

На основании нуклеотидных последовательностей хромосомного локуса За чумного микроба, генов iglBC возбудителя туляремии и pagA - сибирской язвы, с помощью программы Primer Express подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента размером 177 пн для У pestis, 268 пн для F tularensis и 368 п н для В anthracis Подбор праймеров проводился с учетом минимизации вероятности образования термодинамически значимых вторичных структур (димеры, внутренние петли, шпильки) Специфичность набора праймеров проверена по базе данных NCBI GenBank с использованием алгоритма BLAST Установлено специфическое соответствие праймеров YYpls.a с ДНК чумного микроба, праймеров

YFtls.a с ДНК F tularensis, праймеров YBalsa с ДНК возбудителя сибирской язвы Выбранные размеры ампликонов обеспечивают наиболее удобную визуализацию результатов методом электрофореза в 2 - 2,5 % агарозном геле

Определение оптимальных условий проведения ПЦР осуществляли на программируемом термоциклере "Терцик" (ЗАО "ДНК-Технология", Россия), используя активный и матричный способы регулирования температуры, изменяя сочетано один или несколько из указанных ниже параметров температура отжига праймеров (от 54 °С до 64 °С), концентрация праймеров (от 2 до 14 пмоль), концентрация MgCb (от 2 до 3 ммоль), концентрация Гад-полимеразы (от 1 до 1,5 ед), время каждого шага цикла амплификации (5-15/30-60 секунд в зависимости от режима активный/матричный), количество циклов (от 30 до 40), время предварительной денатурации (от 1 до 5 минут), время завершающей элонгации (от 1 до 7 минут)

В качестве материала для исследования использовали препараты ДНК, выделенные из бактериальных суспензий вакцинных штаммов Y pestis EV НИИЭГ, F tularensis 15 НИИЭГ, В anthracis СТИ-1 в концентрациях 1хЮ3 - 1х105 мк/мл при содержании в пробе одного вида возбудителя или их смеси Оценку специфичности разработанной МПЦР проводили с использованием подготовленной и охарактеризованной по основным для каждого возбудителя признакам выборки изолятов 31 штамма Y pestis, 15 -Y pseudotuberculosis, 3 — Y enterocolitica, 33 - В anthracis, 14 - Bacillus spp, 33 -F tularensis, 65 штаммов 14 родов гетерологичных микроорганизмов, а также интактных проб биологического материала (кровь, суспензии органов белых мышей)

В результате ряда экспериментов установлено, что оптимальным является проведение реакции амплификации по принципу "Touch-down" 95 °С — 5 мин (1 цикл), 95 °С - 10/40 сек, 62 °С - 10/40 сек, 72 "С - 10/40 сек (5 циклов), 95 °С - 7/30 сек, 60 °С - 7/30 сек, 72 °С - 7/30 сек (35 циклов), 72 °С - 5 мин (1 цикл) Определены оптимальные концентрации праймеров YYpls а — по 7 пмоль каждого, YFtls а - по 9 пмоль, YBals.a - по 11 пмоль, ионов Mg2+ - 2 мМ, фермента Taq-полимеразы - 1,25 ед Для осуществления ПЦР был использован принцип «горячего старта», т е разделение 40 %-ным парафином двух реакционных смесей, в состав одной из которых входили растворы праймеров и дНТФ (объем 5 мкл), а второй — 10-кратный буфер, деионизованная вода, Taq-полимераза (объем 10 мкл) Подобранные условия проведения МПЦР обеспечивали высокую чувствительность реакции 1 х 103 м к /мл и специфичность при исследовании как чистых культур возбудителей, так и интактных проб биологического материала (кровь человека, суспензии органов белых мышей) (Рис 1 )

12 34567 89 10

368 п.н. 268 п.н. 177 п н.

Рисунок 1. Специфическая активность и специфичность мультилокусной ПЦР для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы: 1 - Y.pestis EV НИИЭГ- 1х103 м.к./мл; 2 - Y.pestis EV НИИЭГ - 1х104 м.к./мл; 3 - F. tularensis 15 НИИЭГ - 1х103 м.к./мл; 4 - F. tularensis 15 НИИЭГ - IxlO4 м.к./мл; 5 - В. anthracis СТИ-1 - IxlO3 м.к./мл; 6 - В. anthracis СТИ-1 - 1*104 м.к./мл; 7 - положительный контроль для Y. pestis; 8 -положительный контроль для F. tularensis; 9 - положительный контроль для В. anthracis, 10 -отрицательный контроль.

Для стандартизации ПЦР нами была проведена работа по определению оптимального варианта объединения отдельных реагентов для ПЦР в реакционные смеси, а также условий и сроков их хранения. Проведенные исследования показали, что наиболее перспективен способ комплектации, при котором реакционная смесь № 1 (праймеры и дНТФ) хранилась при 4 °С в отдельных микропробирках под слоем парафина, а реакционная смесь № 2 (2,5-кратный буфер) и раствор фермента Taq-полимеразы — в отдельных микропробирках объемом 1,5 мл при -20 °С. Добавление фермента в РС2 в данном случае осуществляется ex tempore. Полученные нами результаты указывают на возможность предварительной подготовки РС-2 с ферментом на 20-30 или более реакций и её хранении при +4 °С в течение 1 месяца. Укомплектованный по такому способу набор для амплификации сохранял свою специфичность - 100 % и специфическую активность -1хЮ3 м.к./мл в течение 6 месяцев.

При организации диагностических исследований методом ПЦР-ЭФ, особенно при работе в условиях мобильных формирований (СПЭБ), проведение анализа осложняется необходимостью оборудования отдельного помещения (изолированного рабочего места) для учета результатов реакции методом электрофореза в агарозном геле, а также организацией противоконтаминационного режима работы при движении материала. Избежать усложнения организации ПЦР-лаборатории, а также ускорить проведение анализа и повысить его специфичность позволяет использование ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

При разработке мультилокусной ПЦР для одновременного выявления ДНК чумного, туляремийного и сибиреязвенного микробов с учетом результатов в режиме реального времени использованы зонды TaqMan и 5'-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Выбор этого формата зондов был продиктован тем, что они стабильны при хранении, имеют низкий уровень фонового свечения и наиболее часто используются при разработке диагностических систем Подбор зондов осуществляли с использованием onlme-программы на сайте "www genscnpt com" При помощи алгоритма BLAST и генетической базы данных NCBI GenBank установлено специфическое соответствие зондов ДНК-матрицам и отсутствие комплементарное™ с ДНК гетерологичных микроорганизмов Мишени для амплификации и праймеры в данной системе были такими же как в разработанной нами ранее ПЦР-ЭФ

Для учета результатов реакции в мультилокусном формате к 5'-концу зондов пришивали флуоресцентные метки, испускающие сигнал при различных длинах волн, а на 3'-конец соответствующую им молекулу гасителя флуоресценции на За-локус Y pestis -JOE и RTQ1, на iglBC гены F tularensis - ROX и BHQ2, на рад А ген В anthracis - FAM и RTQ1

В результате проведенных экспериментов был подобран оптимальный состав реакционной смеси для мультилокусной ПЦР-РВ концентрации праймеров YYpls а - по 6 пМ, зонда YP - 3 пМ, концентрации праймеров YFtls.a - по 8 пМ, зонда FT - 5 пМ, концентрации праймеров YBals_a — по 9 пМ, зонда ВА — 5 пМ Амплификацию проводили по следующей программе I этап (наработка специфических ампликонов) - 10 циклов, включающих 95 °С — 10 сек, 60 °С — 25 сек, 72 °С — 10 сек, И этап (учет флуоресцентного сигнала) - 35 циклов, включающих 95 °С - 10 сек, 56 °С - 25 сек, 72 °С - 10 сек Учет результатов осуществляли отдельно по каждому из каналов, в соответствии с инструкцией к термоциклеру "RotorGene 3000" (Corbett Research, Австралия)

Определение специфичности разработанной ПЦР-РВ также проводили на подготовленной ранее выборке специфичных и гетерологичных штаммов Установлена комплементарность зондов соответствующим ДНК-мишеням и отсутствие флуоресценции при исследовании штаммов гетерологичных микроорганизмов в мультилокусном формате реакции, а также при исследовании интактных проб крови и суспензий внутренних органов белых мышей Специфическая активность реакции составила 1x102-1x103 мк /мл (Рис 2, 3,4)

Рисунок 2 Специфическая активность мультилокусной ПЦР-РВ для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы при исследовании чистых культур Y pestis по каналу JOE

1 - Отрицательный контроль, 2 - У pestis EV НИИЭГ 1х105 м к/мл (С, - 20,23), 3 - Y pestis EV НИИЭГ 1х104 м к/мл (С, - 22,92), 4 - У pestis EV НИИЭГ lxlO3 м к/мл (С, - 26,75), 5 - У pestis EV НИИЭГ 1 х 102 м к /мл (Ct - 28,07)

Norm Fkjoro

1) 's Чо Ts "aj 5 55 Cyc«

Рисунок 3 Специфическая активность мультилокусной ПЦР-РВ для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы при исследовании чистых культур F ш1агет1$ по каналу ГЮХ

1 - Отрицательный контроль, 2 - F 1и1агеп$ч 15 НИИЭГ 1х105 мк/мл (С, - 22,53), 3 -Р шШгети 15 НИИЭГ 1х104 м к/мл (С, - 26,09), 4 - Р Магежк 15 НИИЭГ 1х103 м к/мл (С, -30,47)

Рисунок 4 Специфическая активность мультилокусной ПЦР-РВ для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы при исследовании чистых культур В anthracis по каналу FAM

1 - Отрицательный контроль, 2 - В anthracis СТИ-1 1х106 м к/мп (С, - 18,32), 3 - В anthracis СТИ-1 1х105 м к/мл (С, - 19,93), 4 - В anthracis СТИ-1 1хЮ4 м к/мл (С, - 22,37), 5 - В anthracis СТИ-1 1 х 103 м к /мл (С, - 32,09)

Важными показателями, необходимыми для учета результатов РВ-ПЦР, являются значение так называемой пороговой линии ("threshold") и порогового цикла (Ct) Пороговая линия отражает минимальный уровень флуоресценции, который во всех проведенных с одним ПЦР-набором реакциях соответствует началу экспоненциальной фазы кривой накопления флуоресцентного сигнала Значение Ct означает цикл амплификации, во время которого кривая, соответствующая определенной пробе, пересекает пороговую линию На основании полученных результатов для разработанной МПЦР-РВ определены значения пороговой линии по каждого из каналов 0,05 - для FAM, 0,15 - для JOE и ROX Также определена максимальная величина Ct, при которой результат реакции считается положительным для каналов JOE и ROX - 32, для FAM - 33

Специфическая активность и специфичность ПЦР при анализе клинического материала и объектов окружающей среды во многом определяется эффективностью этапа подготовки проб и выделения ДНК Традиционно используемая методика, представленная в МУ 1 3 1794-03 "Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности", заключается в лизисе исследуемой пробы гуанидинизотиоцианатом и осаждении нуклеиновых кислот на сорбенте с последующей их элюцией При ее применении вместе с разработанными мультилокусными ПЦР-наборами отмечено снижение специфической активности реакции при исследовании проб, искусственно контаминированных У pestis, F tularensis, В anthracis Одним из способов повышения эффективности выделения ДНК методом нуклеосорбции является введение в состав лизирующего раствора на основе 6 М

гуанидинизотиоцианата веществ, способствующих разрушению клеточной стенки I}-дитиотрейтола, меркаптоэтанола, лаурилсаркозина натрия

Для изучения влияния указанных веществ на эффективность выделения ДНК нами были подготовлены пробы крови, суспензий органов белых мышей, почвы и воды, искусственно инфицированные У реяг« ЕУ НИИЭГ, ш!агегка 15 НИИЭГ, В аШИгаск СТИ-1 в концентрациях 1х103, 1х104 и 1х105 м к /мл Пробы контаминировали либо одним из видов указанных возбудителей, либо смесью двух или трех видов микроорганизмов в различных комбинациях и концентрациях Выделение ДНК проводили с традиционным комплектом, добавляя в состав лизирующего раствора О-дитиотрейтол, лаурилсаркозин натрия Кроме того, использовали коммерческий набор 'ЧЗепРак", содержащий в составе лизирующего раствора меркаптоэтанол

Установлено, что во все вводимые в состав лизирующего раствора агенты увеличивают эффективность выделения ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы вне зависимости от количества и комбинации возбудителей, присутствующих в пробе Немаловажным также является то, что в ходе этого эксперимента было установлено, что чувствительность ПЦР-анализа на чуму и туляремию при исследовании проб, обеззараживание которых проводили по режиму, регламентирующему работу с возбудителем сибирской язвы, оставалась такой же, как с пробами, которые обрабатывали по методике для микроорганизмов, не образующих споры (только мертиолятом и гуанидинизотиоцианатом)

На основании полученных результатов нами сконструированы экспериментальные серии тест-систем для одновременного выявления ДНК У реяМ, ¡иЬгетя, В апЛгаса методом ПЦР-ЭФ и ПЦР-РВ («ЧТС-ЭФ» и «ЧТС-РВ») Препарат «ЧТС-ЭФ» включал 3 набора для выделения ДНК, проведения ПЦР и учета результатов методом гель-электрофореза, тогда как «ЧТС-РВ» - два набора для выделения ДНК и проведения ПЦР На тест-системы подготовлены инструкции по изготовлению и контролю

Экспериментальные серии ПЦР-тест-систем были апробированы при исследования полевого материала, отбор которого проводили в 2005-2006 гг на территории Ямало-Ненецкого автономного округа (пробы почвы, крови грызунов, блох и комаров) В качестве контроля изготовленных экспериментальных тест-систем использовали выпускаемые в РосНИПЧИ "Микроб" тест-системы "ГенПест", "ГенСиб", а также экспериментальные серии тест-системы "ГенТул" для выявления ДНК РгапскеИа 1и1агетк методом ПЦР При исследовании проб почвы полученные данные сравнивали с результатами бактериологического и биологического методов

Амплификация в ПЦР-ЭФ фрагментов, специфичных для туляремийного микроба, и наличие флуоресценции по каналу ROX в ПЦР-РВ зафиксировано при тестировании 11 (12 %) проб крови млекопитающих (полевка Мидцендорфа, полевка узкочерепная, бурозубка обыкновенная, водяная полевка, ондатра) и 15 (25 %) проб комаров При исследовании блох положительных ответов в ПЦР ни в одном случае отмечено не было Возбудителей чумы и сибирской язвы в исследуемом материале не выявлено Достоверность полученных результатов подтверждена при использовании всех трех ПЦР-тест-систем ("ГенПест", "ГенСиб" и экспериментальные серии "ГенТул"), выявляющих различные ДНК-мишени

Таким образом, во всех случаях наблюдалось совпадение результатов анализа, полученных с разными препаратами Эти данные указывают на высокую чувствительность и специфичность разработанных мультилокусных ПЦР-тесг-систем

Важным этапом идентификации возбудителей особо опасных инфекций является определение их вирулентности и эпидемической значимости, поскольку эти признаки определяют объем необходимых противоэпидемических мероприятий Существующая сертифицированная тест-система для выявления чумного микроба методом ПЦР основана на использовании праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям генов cafl (pFra) и pía (pPst), что позволяет осуществить лишь детекцию чумного микроба Повышению информативности и специфичности генной диагностики чумы будет способствовать создание ПЦР, выявляющей гены, ассоциированные с вирулентностью, расположенные на хромосомном острове высокой патогенности (ОВП) и плазмиде pCad

Установлено, что на проявление патогенных свойств чумного микроба значительное влияние оказывает наличие в их хромосоме полноценного гена irp2, локализованного в >'Ь/-региопе ОВП и отвечающего за синтез высокомолекулярного белка 2 (190 кДа) [Carmel Е et al, 1999] Это послужило основанием для его выбора в качестве одной из ДНК-мишеней Исследования, проведенные Leal-Balbino et al [2004] показали, что плазмида pCad и, в частности, ген IcrV, обладают высокой стабильностью как у вновь выделяемых штаммов чумного микроба, так и у культур, подвергавшихся длительному хранению Представленные результаты указывают на перспективность использования гена IcrV в качестве второй ДНК-мишени Однако плазмида pCad присутствует и у других патогенных представителей рода Yersinia, а ОВП имеется в геноме целого ряда микроорганизмов Е coli, С diversus, К pneumoniae, К rhmoscleromatis, К ozaenae, К oxytoca и др Маркером, определяющим принадлежность исследуемых культур к виду Y pestis, может являться хромосомный локус За, использованный нами ранее при

разработке МПЦР для одновременного выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы.

На основании представленных в базе данных NCBI GenBank нуклеотидных последовательностей выбранных нами генов (№ AF350075, NC_003143.1, NC_003131.1) с помощью программы PrimerExpress, алгоритма BLAST и разработанной на базе Visual Basic 6.0 программы по расчету праймеров для мультилокусной ПЦР подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента хромосомного локуса За размером 151 п.н., гена irp2 - размером 266 п.н., и гена IcrV- размером 489 п.н.

В процессе оптимизации условий мультилокусной ПЦР изменяли сочетано один или несколько из указанных ниже параметров: температура отжига праймеров (от 50 °С до 64 °С); концентрация праймеров (от 4 до 16 пмоль); время каждого шага цикла амплификации (от 20 до 5 секунд при активном режиме регулирования температуры); количество циклов (от 35 до 40); время предварительной денатурации (от 1 до 5 минут); время завершающей элонгации (от 1 до 7 минут). В экспериментах использовали ДНК, выделенную из проб, содержащих Y. pestis 231, С-624 и М-641 в концентрациях от 1 х 102 до 1 х Ю5 м.к./мл.

В ходе ряда экспериментов установлены оптимальные параметры амплификации и состав реакционной смеси: 95 °С - 5 мин (1 цикл); 95 °С - 10 сек, 62 °С - 10 сек, 72 °С - 10 сек (5 циклов); 95 °С - 7 сек, 60 °С - 7 сек, 72 °С - 7 сек (35 циклов); 72 °С - 7 мин (1 цикл), с концентрацией праймеров Y3as_a — по 6 пмоль каждого, Y;>p2s.a - по 8 пмоль, YlcrVs.a - по 16 пмоль; 2,5 мМ MgCl2; 1,5 ед. Taq-полимеразы. Для проведения ПЦР использована методика «горячего старта», аналогичная описанной выше. Разработанная мультилокусная ПЦР обеспечивает чувствительность реакции 5Х103 м.к./мл и сбалансированную амплификацию всех фрагментов (Рис. 5.).

_ 489 п.н.

-4- 266 п.н.

4- 151 п.н.

Рисунок 5. Специфическая активность разработанной МПЦР для детекции и характеристики штаммов возбудителя чумы:

1 - У. 231 в концентрации 1 х 103 м.к./мл; 2 - У. резШ 231 в концентрации 5Х 103 м.к./мл; 3 -У. резНя 231 в концентрации 1х]04 м.к./мл; 4 - положительный контроль; 5 — отрицательный контроль.

Для определения специфичности разработанной МПЦР исследовали 31 штамм У. pestis, 15 штаммов У. pseudotuberculosis, 3 штамма У. enterocolitica и 68 штаммов гетерогенных микроорганизмов. Амплификация фрагмента, соответствующего хромосомному локусу За, отмечена только со штаммами чумного микроба. Положительный ответ в ПЦР с праймерами, фланкирующими участок гена irp2, наблюдался при исследовании 27 культур У. pestis, 4 - У. pseudotuberculosis, и 6 - Е. coli. Специфичность ПЦР подтверждена путем секвенирования ампликонов.

Полученные результаты согласуются с литературными данными по распространенности хромосомного ОВП среди представителей семейства Enterobacteriaceae и возможности его элиминации [Hacker J., et al., 1997; Perry R. D., 1993; Schubert S., et al., 1998; Carniel E., 1999]. Амплификация в ПЦР фрагмента гена lcrV отмечена при исследовании 31 штамма чумного микроба, 2 штаммов У. pseudotuberculosis (III эталонный и 837) и 1 штамма У. enterocolitica 121. С изолятом У. pseudotuberculosis III-5 наблюдалось формирование ампликонов, размер которых отличался от таковых для других штаммов Yersinia spp (Рис. 6.).

1 2 3 4 5 6 7 8

489 п.н. 266 п.н. 151 п.н.

Рисунок 6. Исследование с помощью разработанной МПЦР штаммов представителей семейства Enterobacteriaceae'.

1 - У. pseudotuberculosis П1-5; 2 - У. pseudotuberculosis 837; 3 - У. pseudotuberculosis W\-l\, 4 -У. pseudotuberculosis 847; 5 - У. enterocolitica 121; 6 - У. enterocolitica И-27; 1-Е. coli 18; 8 -положительный контроль.

Результаты секвенирования полученных ампликонов показали, что у штамма У. pseudotuberculosis III-5 имеется замена 21 нуклеотида в позиции 292-313 на фрагмент размером 72 п.н., который включал 11 тандемных повторов "ТСС CAT" и заканчивался последовательностью "ТСТ TCG". Установленная вставка в 51 п.н. и привела к увеличению размера ампликонов, образуемых в ПЦР. В настоящее время механизм этой вставки, ее природа и возможное влияние на синтез V-антигена неясны и представляют интерес для дальнейший исследований.

Для оценки диагностической эффективности разработанной МПЦР был исследован 31 штамм чумного микроба основного и неосновных подвидов, выделенных за период

1938-1984 гг из различных источников на территории 11 природных очагов чумы Дополнительно пробы анализировали с помощью выпускаемой в РосНИПЧИ "Микроб" тест-системы "ГенПест"

Из 31 изученного штамма чумного микроба у 28 (90,3 %) наблюдалась одновременная амплификация фрагмента Ja-локуса, генов irp2 и IcrV, а также cafl и pía локусов, за исключением двух культур Y pestis С-533 и Y pestis 1146, выделенных на территории Закавказского высокогорного очага, у которых отсутствовал фрагмент гена pía Полученные результаты согласуются с известным фактом утраты возбудителем чумы кавказского подвида плазмиды pPst Все штаммы Y pestis, имевшие по данным проведенного исследования гены irp2 и IcrV, были высоковирулентны для белых мышей -LD50 от 6 до 398 м к и DCL от 102 до 104 м к

У трех изолятов чумного микроба (9,7 %) EV НИИЭГ (вакцинный штамм), 300 (Волго-Уральский степной очаг), 293 (Прикаспийский песчаный очаг) не происходило амплификации фрагмента гена irp2 (у6/-регион ОВП) в мультилокусной системе При исследовании этих же культур в монолокусной ПЦР с праймерами к гену hmsH (hms-регион ОВП) также отмечен отрицательный результат, что может свидетельствовать о полной потере этими штаммами ОВП Для биопробных животных эти штаммы были авирулентны (DCL > 1X Ю7 м к )

Полученные результаты указывают на 100 % совпадение факта отсутствия irp2 и IcrV генов у исследуемых штаммов чумного микроба и их авирулентности по данным биологической пробы на чувствительных животных

Разработанный нами методический подход, основанный на одновременной амплификации в условиях мультилокусной ПЦР генов irp2 (ОВП), /crF(pCad) и локуса За (видоспецифичный фрагмент хромосомы), позволяет одновременно с детекцией чумного микроба, охарактеризовать его по маркерам вирулентности и, следовательно, определить эпидемическую значимость, независимо от наличия видоспецифичных плазмид pFra и pPst Предлагаемый подход эффективен для дифференцирования авирулентных штаммов возбудителя чумы от вирулентных

Таким образом, итогом нашей работы стало конструирование экспериментальных серий новых тест-систем для индикации и идентификации возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы на основе технологий мультилокусной ПЦР и ПНР в режиме реального времени Для созданных тест-систем установлена высокая специфичность и специфическая активность, как при исследовании чистых культур, так и биологического материала и объектов окружающей среды

Предлагаемый нами алгоритм конструирования генамплификационных систем для проведения индикации и идентификации возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы универсален и может быть применим по отношению к другим микроорганизмам I-II групп патогенности

ВЫВОДЫ

1 На основании анализа геномов возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы выбраны специфические фрагменты для одновременного выявления указанных микроорганизмов методом мультилокусной ПЦР видоспецифичный для Y pestis хромосомный локус За, гены iglBC F lularensis, кодирующие белок внешней мембраны 23 кДа, ген pagA плазмиды pXOl В anthracis, отвечающий за синтез протективного антигена.

2 Подготовлена обширная выборка типичных по культуральным, морфологическим, биохимическим, серологическим и генетическим свойствам штаммов

Y pestis, F tularensis, В anthracis и гетерологичных микроорганизмов (всего 211 штаммов), позволяющая эффективно определить специфическую активность и специфичность мультилокусной ПЦР

3 Подобраны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие специфическую амплификацию фрагментов локуса За Y pestis размером 177 п н , генов iglBC F tularensis - 268 п н , гена pagA плазмиды pXOl В anthracis - 368 п н, а также зонды TaqMan для учета результатов реакции в режиме реального времени Разработаны оптимальные параметры проведения мультилокусной ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, обеспечивающие специфическую активность реакции 1 х 102 - 1X 103 м к /мл при 100 % специфичности

4 Разработана схема подготовки проб биологического материала и объектов окружающей среды, обеспечивающая высокую чувствительность анализа при детекции

Y pestis, F tularensis и В anthracis с помощью мультилокусных ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов Схема соответствует требованиям нормативной документации по биологической безопасности работ при проведении ПЦР-исследований материала, подозрительного на зараженность возбудителями особо опасных инфекций

5 Сконструирована и апробирована при исследовании полевого материала тест-система для одновременного выявления ДНК Y pestis, F tularensis, В anthracis методом мультилокусной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов, включающая наборы для выделения ДНК, проведения ПЦР и учета результатов Специфическая активность -1х103мк /мл, специфичность - 100 %

6 Разработана и апробирована при исследовании полевого материала качественно новая генодиагностическая тест-система для одновременного выявления ДНК У pestis,

^ Магепзк, В амкгааз методом мультилокусной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, включающая наборы для выделения ДНК и проведения ПЦР Специфическая активность - 1 * 103 м к /мл, специфичность - 100 %

7 Для одновременной детекции и характеристики штаммов возбудителя чумы по признакам патогенности предложен методический подход, основанный на одновременной амплификации фрагментов видоспецифичного для У ре$Ш хромосомного локуса За и генов, ассоциированных с вирулентностью чумного микроба 1гр2 (хромосомный остров патогенности) и 1сгУ (плазмида рСа<1) Показана возможность дифференцирования авирулентных штаммов У рехГи Специфическая активность тест-системы - 5 х 103 м к /мл, специфичность - 100 % Наличие или отсутствие генов 1гр2 и 1сгУ в геноме исследованных штаммов чумного микроба совпадало в 100 % случаев с результатами определения вирулентности на модели белых мышей

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Шевченко О В , Ильина Е Н, Куклев В Е , Куличенко А Н, Плотникова Е А , Говорун В М, Кутырев В В Разработка мультилокусной ПЦР-тест-системы для выявления ДНК В апЛгаси (рХ01, рХ02) с применением гибридизационного метода учета результатов амплификации // Медицинская микробиология — XXI век Мат Всеросс науч -практ конференции (28-30 сентября 2004 г) - Саратов, 2004 г - С 237 - 238

2 Куклев В Е, Куличенко А Н Разработка мультилокусной ПНР для детекции фрагментов хромосомы возбудителя чумы // Мат VI Межгосуд науч -практ конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (13 - 14 сентября 2005 г) — Волгоград, 2005 г - С 252 - 253

3 Куклев В Е , Куличенко А Н, Кутырев В В Метод детекции и характеристики эпидемической значимости штаммов У реяш с помощью мультилокусной ПЦР Мат Российской науч -практ конференции (25 - 27 октября 2005 г) - Новосибирск, 2005 г -С 124-125

4 Карнаухов И Г, Куклев Е В , Куличенко А Н, Шевченко О В , Плотникова Е А, Куклев В Е , Абакшин О В , Абрамов Е П, Курбанов И А Исследование проб почвы с территорий Песцового и Северо-Уренгойского месторождений углеводородного сырья Ямало-Ненецкого автономного округа на наличие возбудителя сибирской язвы // Проблемы ООИ -2005 -Вып 2(90) - С 65-67

5 Куклев В Е, Осина Н А Мультилокусная ПЦР для одновременного обнаружения ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы // Мат юбилейной

научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней военно-медицинской академии им С М Кирова (22-24 марта 2006 г) - Санкт-Петербург , 2006 - С 155 -156

6 Куклев В Е , Портенко С А , Яшечкин Ю И, Осина Н А, Куличенко А Н Метод детекции и характеристики по признакам патогенности штаммов Yersinia pestis с помощью мультилокусной ПЦР // Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита "Группы восьми" и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств" (3 - 5 октября 2006 г) -Оболенск - С 214 — 215

7 Куличенко А Н, Осина Н А , Портенко С А, Куклев В Е, Кутырев В В Алгоритм многофакторной генной диагностики особо опасных инфекций // Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита "Группы восьми" и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств" (3-5 октября 2006 г ) - Оболенск -С 215-216

8 Ивашенцева JI Н, Шарова И Н, Куклев В Е , Осина Н А , Плотникова Е А , Щербакова С А, Куличенко А Н Использование ПЦР-анализа при мониторинге природных очагов туляремии в Ямало-Ненецком автономном округе // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации (26-27 апреля 2007 г) - Москва, 2007 - С 39

9 Куклев В Е , Ивашенцева Л Н, Шарова И Н, Осина Н А, Плотникова Е А, Портенко С А , Щербакова С А, Куличенко А Н Оптимизация методов выделения ДНК возбудителей особо опасных инфекций из биологического материала и объектов внешней среды для исследований методом ПЦР // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации (26-27 апреля 2007 г ) - Москва, 2007 - С 52

10 Куклев В Е , Осина Н А , Яшечкин Ю И , Куличенко А Н Характеристика штаммов Yersinia pestis по вирулентности методом мультилокусной ПЦР // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации (26-27 апреля 2007 г) - Москва, 2007 - С 53

Формат 84x108 1/6 Печать лазерная Бумага финская Гарнитура Тайме Объем 1,1 услпл Тираж 100 экз Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 410005 г Саратов, ул Университетская, 46