Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фитофторозные корневые гнили древесных и кустарниковых растений и их диагностика

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Фитофторозные корневые гнили древесных и кустарниковых растений и их диагностика"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

СУРИНА Татьяна Александровна

ФИТОФТОРОЗНЫЕ КОРНЕВЫЕ ГНИЛИ ДРЕВЕСНЫХ И КУСТАРНИКОВЫХ РАСТЕНИЙ И ИХ ДИАГНОСТИКА

03.02.12 - микология

1В MAP 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2015

7

005560843

005560843

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник кафедры микологии и альгологии МГУ имени М.В. Ломоносова Еланский Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кафедры защиты растений ФГБОУ ВПО РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева Смирнов Алексей Николаевич

доктор биологических наук, заведующий отделом защиты растений ФГБУН Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН Ткаченко Олег Борисович

Ведущая организация:

ФГАОУВО «Российский Университет Дружбы Народов»

Защита состоится «24» апреля 2015 г. в 17 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, ауд. Ml. Факс: (495) 939-43-09, e-mail: shch а w@rnail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, --^ikP^

доктор биологических наук ^ А.В. Щербаков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Оомицеты рода Phytophthora de Вагу поражают широкий спектр видов древесных и кустарниковых растений, обладают высокой вредоносностью, пластичностью и хорошо приспосабливаются к новым климатическим условиям. Для успешной борьбы с фитопатогенными оомицетами необходимо правильно провести их идентификацию в пораженном материале и подобрать эффективные фунгициды.

Традиционно идентификация возбудителей фитофторозов древесных растений проводится на питательной среде после выделения изолята возбудителя в чистую культуру. Определение по морфолого-культуральным признакам занимает длительное время и требует хороших знаний биологии и морфологии видов рода Phytophthora.

Экспресс-диагностика возбудителей фитофторозов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) может проводиться быстро (за несколько часов) и не требует выделения возбудителя в чистую культуру. В нашей работе мы провели оценку и сравнительный анализ тест-систем (в том числе мультиплексных, разработанных за рубежом, а также созданных в нашей лаборатории), на штаммах из собственной коллекции изолятов Phytophthora sp., выделенных с пораженных растений в разных регионах, а также переданных зарубежными коллегами (из коллекций «FERA», Англия, EVIRA, Финляндия, «DSMZ», Германия).

Другой задачей, которую мы ставили в данной работе, был поиск эффективных препаратов для борьбы с фитофторозами древесных растений. Фунгициды против грибов не всегда эффективны против оомицетов рода Phytophthora. У зарегистрированных в России препаратов, как правило, изучали эффективность по отношению к Р. infestons (Mont.) de Вагу — возбудителю опасного заболевания картофеля и томата.

Цель п задачи исследования. Целью проводимых исследований являлось уточнение видового состава оомицетов рода Phytophthora, вызывающих поражения древесных и кустарниковых растений, разработка и испытание систем их диагностики на основе ПЦР, а также изучение эффективности используемых против них химических фунгицидных препаратов.

Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить видовой состав фитопатогенных оомицетов рода РЬуЮрЫкога, вызывающих поражения древесных и кустарниковых растений в питомниках и лесопосадках.

2. Разработать и оптимизировать тест-системы и протоколы пробоподготовки и проведения ПЦР (обычного и «в реальном времени») для экспресс-идентификации возбудителей фитофторозов древесных растений.

3. Разработать метод диагностики возбудителей фитофторозов в воде с помощью комбинации метода биоприманок и ПЦР.

4. Определить наиболее эффективные фунгицидные препараты для борьбы с фитофторозами древесных растений.

Научная новизна. Научная новизна работы состоит в том, что впервые были проведены обследования лесопосадок, питомников и водоемов на наличие фитофторозных корневых гнилей древесных растений с использованием как традиционных методов, так и современной экспресс-диагностики. Для выявления видов рода РкуЮрЫкога в воде был применен метод биоприманок, которые ранее на территории России не применялся. Применение этого метода позволило выявить 3 вида рода РкуЮрЫЬога (Р. gonapodyides, Р. ро1отса, Р. те^ахрегта) и РкуШруМит Шога1е. О выявлении двух из этих видов в России ранее сообщений не было.

Впервые была проверена специфичность зарубежных тест-систем диагностики Р. гатогит с использованием набора российских и зарубежных штаммов грибов рода РкуЮркЛога, проведена сравнительная оценка разных систем выделения ДНК.

На основании нуклеотидных последовательностей, полученных в результате мониторинга и из базы данных СепВапк были разработаны праймеры и зонды для идентификации Р. гатогит в пораженном растительном материале.

Впервые было изучено влияние на Р. гатогит некоторых фунгицидов, зарегистрированных в России для борьбы с фитофторозом картофеля и томата.

Практическая значимость. Разработанные тест-системы показали высокую специфичность и чувствительность и могут применяться для выявления и идентификации Р. гатогит в пораженном растительном материале. Метод диагностики возбудителей фитофторозов в воде с помощью биоприманок перспективен для применения при обследовании водоемов.

Результаты изучения эффективности фунгицидов в отношении Р. гатогит могут быть использованы при разработке защитных мероприятий с этим патогеном.

Положения, выносимые на защиту:

1. Видовой состав возбудителей фитофторозных корневых гнилей древесных и кустарниковых растений в питомниках и лесопосадках.

2. Разработка и оптимизация молекулярно-генетических методов идентификации возбудителей фитофторозов древесных растений (методы выделения ДНК, праймеры и зонды для ПЦР и ПЦР «в реальном времени»).

3. Разработка метода диагностики фитофторозов в воде с помощью комбинации биоприманок и ПЦР.

4. Определение наиболее эффективных препаратов для борьбы с фитофторозами древесных растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5 всероссийских и международных научных мероприятиях: Втором съезде микологов России (Москва, 16-18 апреля 2008 г.), Третьем съезде микологов России, (Москва, 10-12 октября, 2012 г.); Всероссийской научной конференции «Роль ботанических садов и охраняемых природных территорий в изучении и сохранении разнообразия растений и грибов (Ярославль, 13-16 октября 2011г.), Шестой встрече IUFRO «Phytophthora в лесах и природных экосистемах», (Кордова (Испания), 9-14 сентября 2012 г.); Десятом Международном конгрессе по фитопатологии (Пекин (КНР) 25 - 30 августа 2013 г.).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи в российских рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ, 2 статьи в иностранных изданиях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы и четырех приложений. Материал изложен на 163 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы и 26 рисунков. Список литературы включает 155 источников, в том числе146 на иностранных языках.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность и признательность научному руководителю С.Н. Еланскому за помощь в написании и определении основных направлений работы; заместителю директора ФГБУ ВНИИКР Е.С. Мазурину за консультации по научным вопросам; начальнику научно-экспериментального отдела

ФГБУ ВНИИКР И.О. Камаеву за помощь по статистической обработке данных; сотрудникам лаборатории микологии ФГБУ ВНИИКР О.В. Скрипка, М.Б. Копиной, И.П. Дудченко за помощь в проведении исследований; сотрудникам Пятигорского филиала В.В. Петиной и М.С. Чернову, сотрудникам Карельского и Ивановского филиалов ФГБУ ВНИИКР за помощь в проведении мониторинга, а также сотрудникам кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова за поддержку и помощь в проведении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Обзор литературы

В обзоре литературы освещены вопросы распространения и вредоносности наиболее опасных фитофторозов древесных и кустарниковых растений. Рассмотрены систематическое положение, биология и симптоматиках этих видов. Приведено описание методов их выявления и идентификации, мер борьбы с фитофторозными корневыми гнилями.

Глава II. Материалы и методы

Работа была выполнена в 2010-2014 гг. в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова на кафедре микологии и альгологии биологического факультета; часть работы выполнена на базе ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ ВНИИКР).

Мониторинг проводился в 2011-2014 гг. в 6 субъектах Российской Федерации в питомниках и лесопосадках. Всего было отобрано и проанализировано 720 образцов вегетативных частей астений и почвы.

Для диагностики фитофтороза декоративных и кустарниковых культур использовали методы микроскопирования и морфометрии, влажных камер, выделения чистых культур с использованием питательных сред, ПЦР-диагностики.

При выявлении фитофторозов в водоемах использовали метод биоприманок.

Изучение культурально-морфологических признаков культур проводили на четырех питательных средах (морковная (CPA), синтетическая (SNA), овсяно-глюкозная среда и V8).

Выделение ДНК проводили следующими методами: с использованием набора «Проба ГС» кат. № Р-003/1 (ООО «Агродиагностика», Москва); согласно методике описанной J.J. Doyle,

J.L. Doyle (1990); с использованием фосфатно-солевого буфера Дулбеско (DPBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline); с помощью станции выделения нуклеиновых кислот Tecan Freedom EVO с использованием набора на основе магнитных частиц "М-Сорб-Туб" (ЗАО «Синтол»).

С выделенными образцами ДНК проводили классическую ПЦР. Для амплификации ДНК использовали праймеры ITS4/ITS5 (White, 1990), YPhlF/YPh2R (Schena et al., 2008), Phyto 1/Phyto 4(Hayden et al., 2004) и Pram Fl/Pram RI (Lane et al., 2003b). Состав реакционной смеси и температурно-временные показатели изменяли в зависимости от использованных праймеров.

Результаты амплификации регистрировали после проведения электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в гель-документирующей системе Quantum-ST-4-1500 (Япония).

Амплификацию и детекцию в реальном времени проводили на амплификаторе iCycler iQ 5 (Bio-Rad, США) с специфичными к Р. гатогит праймерами и зондами (Pram 114-FC/Pram 1527-190-R, зонд: Pram 1527-134-Т; Pram-5/Pram-6, зонд: Pram-7). Состав реакционной смеси и температурно-временные показатели изменяли в зависимости от использованных праймеров.

В работах по оценке эффективности выявления ДНК и сравнении тест-систем для идентификации оомицетов рода Phytophthora использовали 13 изолятов фитопатогенных оомицетов, выделенных с пораженных растений в разных регионах, а также переданных зарубежными коллегами (из коллекций «FERA», Англия, EVIRA, Финляндия, «DSMZ», Германия).

Реакцию секвенирования проводили с применением реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems).

Определение эффективности фунгицидных препаратов проводили на твердой питательной среде CPA и на листьях рододендрона. Для опыта использовали 8 препаратов в 3-х концентрациях (таблица 1). Концентрация препарата в питательной среде (в растворе для опыта на листьях) соответствовала концентрации рабочего раствора препарата применяемого в соответствии с нормами рекомендованными Списком пестицидов и агрохимикотов разрешенных к применению на территории РФ. Каждый препарат и его концентрации в опыте на питательной среде оценивали, измеряя диаметр колоний. Затем, проводили расчет биологической эффективности. В опыте с листьями

сначала проводили опрыскивание листьев рабочим раствором препарата, а затем искусственно заражали лист рододендрона суспензией культуры Р. гатогит в концентрации 1.3x105 клеток в 1 мл методом укола в центральную жилку листа. Потом отмечали степень развития некрозов по 5-ти бальной шкале и рассчитывали развитие болезни и биологическую эффективность препарата (Методы мониторинга вредителей и болезней леса, Том III, Справочник, М., 2004). Чашки Пети с питательной средой и листьями инкубировали пи комнатной температуре на свету.

Таблица 1.

Препараты и их концентрации, использованные для оценки их

эффективности в отношении Р. гатогит.

JV» п/п Название препарата (действующее вещество) Концентрация препарата в среде, % Концентрация препарата в рабочем р- ре в опыте на листьях, %

1. Бордоская смесь (Си304 х 5Н20 + Са(ОН)з) 2; 1; 0,5 2; 1;

2. Превикур (пропамокарб гидрохлорид) 0.4; 0.2; 0.1 0,4; 0,2

3. Топаз (пенконазол) 0,1; 0,05; 0,025 0,1; 0,05

4. Скор (дифеноконазол) 0,04; 0,02; 0,01 0,04; 0,02

5. Браво (хлороталонил) 1; 0,5; 0,25 I; 0,5

6. Ридомил Голд (мефеноксам + манкоцеб) 1; 0,5; 0,25 1; 0,5

7. Фарма Иод (водорастворимый комплекс йода) 1; 0,5; 0,25 1; 0,5

8. Танос (фамоксадон + цимоксанил) 0,3; 0,15; 0,075 0,3; 0,15

Глава III. Обследование на выявление фитофторозных корневых гнилей древесных и кустарниковых астений в питомниках и естественных насаждениях.

3.1. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов, выявленных в питомниках.

Обследования проводились в питомниках Московской и Ивановской областей, Республики Карелия и Ставропольского Края. Всего было отобрано 313 образцов почвы и вегетативных частей растений с наиболее характерными признаками. Мониторинг питомников показал

отсутствие фитофторозных корневых гнилей на обследованных растениях.

3.2. Видовой состав грибов и грибоподобных организмов, выявленных при обследованиях лесопосадок древесных и кустарниковых культур.

Обследования древесных и кустарниковых культур проводились в Ставропольском крае. В 2013 году из образцов почвы, отобранных в Кировском районе Ставропольского края в лесонасаждениях дуба, была выделена P. citricola методом биоприманок. В почве, отобранной в прикорневой зоне каштана в Ботаническом саду г. Пятигорска была обнаружена P. cactorum, а в почве, отобранной около тиса и дуба, была выявлена P. citricola.

В 2014 году при обследовании лесного массива на горе Машук (г. Пятигорск) в образцах почвы, отобранных от дуба и клена, была обнаружена P. phirivora Т. Jung & T.I. Burgess. В городском парке г. Кисловодск в образцах почвы, отобранных от каштана и клена, также была выявлена P. plurivora (таблица 2).

Таблица 2.

Виды Phytophthora и количество их случаев обнаружения в результате лабораторной экспертизы образцов древесных и

Регион России Вид растений Количество исследованных образцов Выявленные виды, количество случаев обнаружения*

Ставропольский край Цуб, Тис, Каштан, 167 P. citricola - 3 P. cactorum - 1

Ставропольский край Дуб. Ель, Клен. Каштан, Сирень 120 P. cactorum -1 P. plurivora - 8 P. pini - 2

Республика Дагестан Цуб 50 -

Карачаево - Черкесская Республика Бук, Ольха, Клен, Сирень, Каштан, Азалия, Калина 70

Итого: 10 видов растений 407 P. citricola - 3 P. cactorum - 2 P. plurivora — 8 P. pini - 2

* - в скольких ооразцах патоген оыл оонаружен

В городском парке г. Ессентуки основными породами являлись ель и каштан, произрастающие рядом. В образцах почвы от таких деревьев в результате лабораторной экспертизы была выявлена Phytophthora pini (таблица 2).

В ботаническом саду г. Ставрополь в образцах почвы, отобранных от усыхающих растений сирени, были найдены Phytophthora cactorum, Phytophthora plurivora (таблица 2).

В результате мониторинга питомников и естественных насаждений было отобрано и проанализировано 720 образцов. В питомниках фитофторозов выявлено не было. В естественных насаждениях было выделено и идентифицировано 4 вида Phytophthora: P. cactorum, Р. citricola, P. plurivora и P. pini.

Глава IV. Разработка и усовершенствование методов диагностики фитофторозов древесных и кустарниковых растений

4.1. Изучение морфологических характеристик Р. гатогит, Р. cactorum, P. cinnamomi, P. cryptogea, P. syringae на различных питательных средах

При культивировании отобранных культур рода Phytophthora было выявлено, что наилучшими для роста всех патогенов являлись естественные среды: морковная (CPA) и овсяно-глюкозная (ОГА). Изучение культуральных признаков изолятов Р. гатогит показало, что по характеру роста (фенотипу) на различных средах они отличались от других видов рода Phytophthora.

Обильное спороношение (зооспорангии) формировалось у Р. гатогит и P. cactorum и умеренное - у P. cinnamomi только на естественных средах. На синтетической и полусинтетической средах (SNA и V8) у всех изученных видов грибов спороношение не отмечали.

4.2. Оптимизация методов выделения ДНК из зараженной растительной ткани.

Оценку эффективности методов выделения ДНК проводили с помощью классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени».

Наилучшими методами выделения ДНК для классической ПЦР являются метод Doyle и метод выделения ДНК с набором "М-Сорб-Туб"(таблица 3).

При постановке ПЦР «в реальном времени» наилучшими методами были Проба ГС, методика Doyle и набор "М-Сорб-Туб".

Таблица 3

Сравнение разных способов выделения ДНК_

Вариант Классический ПЦР ПЦР в реальном временн, Ct

1 2 3 4 5

Проба ГС - - 24 21 29

Doyle + + 24 22 30

DPBS - - 31 28 N/A

"М-Сорб-Туб" + + 25 21 31

+ наличие продукта амплификации (положительный результат); - отсутствие продукта амплификации (отрицательный результат); N/A- отсутствие сигнала флуоресценции (отрицательный результат); цифры — значения Ct (значение порогового цикла); 1 - классическая ПЦР с праймерами Phytol/Phyto4; 2 - классическая ПЦР с праймерами PramFl/PramRl; 3 - ПЦР в реальном времени с праймерами и зондом Pram 114-FC/Pram 1527-190R, Pram 1527-134Т; 4 - ПЦР в реальном времени с праймерами и зондом Ргат5/Ргат6. Ргат7; 5 - ПЦР в реальном времени с праймерами и зондом - PramF/PramR, PramP

Дополнительную очистку ДНК следует проводить только при постановке классической ПЦР и в случае выделения ДНК набором Проба ГС. Для проведения ПЦР в реальном времени дополнительная очистка нецелесообразна (таблица 4).

Таблица 4

Использование неочищенной ДНК и ДНК, очищенной PVPP

Вариант Проба ГС Doyle DPBS "М-Сорб-Туб"

/ 2 3 4 5 / 2 3 4 5 / 2 3 4 5 / 2 3 4 5

Не очнщ. ДНК - - 24 21 29 +- 24 22 30 - - 31 28 N/A + + 25 21 31

Очнщ. PVPP + -н 33 22 30 + 27 27 31 - - 28 23 33 + ¥ 26 21 32

Наиболее оптимальной зоной для выделения ДНК является граница между здоровой и пораженной тканью. При использовании набора «М-Сорб Туб» можно использовать полностью некротизированную ткань (таблица 5).

Таблица 5

Влияние места отбора образца в зараженной биоприманке на достоверность диагностики Р. гатогчт методом ПЦР «в реальном

времени»

Проба ГС Dovle DPBS "М-Сорб-Туб"

/ 2 3 4 5 1 2 3 4 5 / 2 3 4 5 / 2 3 4 5

Г P - - 24 21 29 + + 24 22 30 - - 31 28 N/A + + 25 21 31

н - - 26 25 29 - - 28 27 N/A - - N/A N/A N/A + + 27 21 31

ГР - граница пораженной и здоровой ткани; Н — полностью некротизированная ткань;

При выделении ДНК из некротизированной ткани следует проводить очистку ДНК РУРР, особенно при постановке классической ПЦР (таблица 6).

Таблица 6

Использование неочищенной ДНК и ДНК, очищенной РУРР, __выделенной из некроза__

Вариант Проба ГС Doyle DPBS "М-Сорб-Туб"

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

Без РУРР - - 26 25 29 - - 28 27 N/A - - N/A N/A N/A + +- 27 21 31

С РУРР + + 26 23 29 + + 28 26 33 - - N/A N/A N/A + + 25 21 31

4.3. Комбинирование методов биоприманок и ПЦР «в реальном времени» для выявления видов рода Риу1орЫ1юга.

Выявление возбудителей фитофторозов древесных и кустарниковых растений в воде проводили путем закладки биоприманок в водоемы Московской области и г. Пятигорска (рисунок 1).

А. Биоприманки с В. Некрозы на листьях С. Образование листьями рододендрона. мицелия на

рододендрона питательной среде

Рисунок 1. Метод Биоприманок для выявления видов рода РкуЮрЫкога

Для определения наиболее подходящих растений в качестве приманок использовали листья рододендрона, калины и сирени. На листьях калины и сирени некрозы не образовывались.

После проведения ПЦР и секвенирования образцов из Московской области был выявлен оомицет Р1гу1орупМит Шога1е. В озере Дубовом Московской области была выделена РИуЮр/гЖога megasperma. Из водоёмов г. Пятигорска были идентифицированы и выделены в чистую культуру следующие виды оомицетов: Р. megasperma, Р. ро1отса и Р. gonapodyides (таблица 7).

Таблица 7

Результаты применения метода биоприманок для выявления _оомнцетов рода Рку^ор/нИогя в воде_

Регион России Растение -приманка Кол-во приманок Выявленный вид, количество случаев выявления

Московская область пруд на территории ФГБУ ВНИИКР Калина 4 -

Сирень 4 -

Рододендрон 4 Phvtopythium Utorale - 3

Московская область озеро Дубовое Рододендрон 2 Р. megasperma - 2

Г. Пятигорск, 6 водоемов в черте города Рододендрон 12 Р. megasperma - б Р. gonapodyid.es -1 Р. polonica - 1

4.4. Достоверность идентификации Р. гатогит при использовании ранее разработанных методов классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени».

Праймеры Phyto l/Phyto4 показывали положительный результат только с образцами Р. гатогит (таблица 8).

При постановке классической ПЦР с праймерами PramF 1 /PramR 1 были получены продукты для всех вариантов кроме 4 и 8 (таблица 8), т.е. эта пара праймеров показывала ложноположительные результаты.

Таблица 8

Специфичность ранее разработанных праймеров и зондов._

№ Виды Phytophthora Праймеры

Phyto 1 Phyto4 PramF 1 PramR 1 Praml 14-FC Praml527-190-R Pram 1527-134-T Pram5 Pram6 Pram7

1. Р. гатогит + + 23,45 21,04

2. Р. гатогит + + 22,78 21,02

3. Р. citricola - + 36,83 N/A

4. Р. megasperma - - N/A N/A

5. Р. syringae - + 37,50 N/A

6. Р. infestans - + 36,54 N/A

7. Р. cactorum - + 36,69 N/A

8. Р. cinnamomi - - 36,32 N/A

9. Р. cryptogea - + 34,45 N/A

10. Р. erythroseptica - + N/A N/A

+ наличие продукта амплификации (положительный результат); - отсутствие продукта амплификации (отрицательный результат); М/А- отсутствие сигнала флуоресценции (отрицательный результат); цифры - значения СI (значение трешхолд цикла)

При постановке ПЦР «в реальном времени» с праймерами и зондом Praml 14-FC/Praml527-190-R, Pram 1527-134-Т наблюдались перекрестные реакции с другими видами фитофтор.

Вторая пара праймеров Pram5, Ргашб и зонд Pram7 для ПЦР в реальном времени были специфичны к Р. гатогит и не давали перекрёстных реакций с другими видами фитофтор.

4.5. Разработка тест-систем для диагностики Р. гатогит и близких видов с использованием ПЦР «в реальном времени».

4.5.1. Подбор праймеров и зондов.

Для подбора праймеров и зондов использовали нуклеотидные последовательности гена Yptl возбудителей фитофторозов из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), а также последовательности ДНК чистых культур Phytophthora sp. из коллекции ФГБУ «ВНИИКР».

На основании выровненных последовательностей были подобраны праймеры: PramF/PramR и меченый флуоресцентным красителем FAM зонд PramP, специфичные к Р. гатогит.

Подбор универсальных праймеров для нескольких видов рода Phytophthora был основан на принципе комплементарности участков гена Yptl данных фитофторозов (рисунок 2).

J00 ГТДТГАСС

yt орл» Г.ОГ • С

ytophthor» q ytophthогщ ^ ytophtbcra fc

IPhytcpntnora !»t«rali» Phytophthore laterali« Phytophthore eitcieola ¡PhyiophtAar• cittiieli

.C. .C ■ C. -C

,c. ,c

.....с

'.'.с. .с

Рисунок 2. Подбор прямого и обратного праймеров для мультиплексной диагностики Phytophthora sp. в режиме реального

времени.

Затем были подобраны зонды, специфичные для каждого вида возбудителя фитофтороза: Р. гатогит, P. kernoviae, P. cinnamomi, Р. quercina, P. citricola, Р. lateralis (рисунок 3).

Phytophthora ranorua sti Phytophthora ramorum et« Phytophthora cir.r.amo»i t Phytoohthora ci

160 170 iao

CCTCTOCCTrcccccccccccj

220 230

OACATGCAGCTAACATCT

-.с.COT..TATT.G.C. ..G.GOT..TATT.G.C. ..G.GT..GTGTA.??.. .G.GT. .G~GTA.Tr. . GTGA.AG.:f.C3S« . GTGA GGAGA G3AGA

CG? CGT G.G. Т. G.G. Т. - . TGA - . TGA . СААА . СААА

% ..TT TT . . ТАА . .All G . . . А G. . . А

iCTT.A..-G.ACGT...TAATT.G.TG...Г.Т

CA AC.AAAG7TTAAGA.T CA AC.AAAGTTTAAGA AT.TGA.OTT.A.T.AG. . .T<

hibk'i'.'.iiiili'.'Aiii o.'"?üie:i: 'aüc'.i*

__АТССД.С. -ДОГ&Аа. . TGCT G.-.TUTG.T. GTCC.AA

¿¿Л . ■ ift. üintibUr ■ a . '. CTC..TC.TI .Т..«!

Рисунок 3. Подбор специфичных зондов для диагностики видов РкуЮрквгогч в режиме реального времени.

На основе выровненных нуклеотидных последовательностей Yptl гена были подобраны два варианта праймеров и зондов MGB (Minor groove binder), меченых разными флуоресцентными красителями (FAM, VIC, NED).

4.5.2. Оптимизация ПЦР «в реальном времени».

Для оптимизации ПЦР «в реальном времени» были учтены следующие факторы: температура отжига каждого из зондов и его концентрация необходимая для реакции.

Определение оптимальных условий ПЦР «в реальном времени» для Р. гатогит проводили изменяя следующие параметры: температуру отжига зонда (от 50°С до 68°С); концентрацию зонда (от 5 пМ до 15 пМ на реакцию, объемом 25 мкл). После проведения ПЦР определили, что наиболее подходящей является температура 51 °С, а концентрация зонда от 10 до 15 пмоль на реакцию.

4.5.3. Определение специфичности ПЦР «в реальном времени» при диагностике Р. гатогит и близких видов.

При определении специфичности зонда PramP установлено, что флуоресценция по красителю FAM (Р. гатогит) регистрировалась только в образцах ДНК чистых культур этого возбудителя (таблица 9).

Таблица 9

Специфичность ПЦР «в реальном времени» с зондом PramP (Р.

гатогит).

Краситель ДНК возбудителя Пороговый цикл (Ct)

FAM Р. гатогит 27,39

FAM Р. гатогит 28,70

FAM P. citricola N/A

FAM P. megasperma N/A

FAM P. syringae N/A

FAM P. infestans N/A

FAM P. cactorum N/A

FAM P. cinnamomi N/A

FAM P. cryptogea N/A

FAM P. erythroseptica N/A

FAM P. nicotiana N/A

FAM F. oxysporum N/A

FAM Pyt. intermedium N/A

FAM вода N/A

N/A— отсутствие сигнала флуоресценции (отрицательный результат)$цифры -значения Ct (значение трешхолд цикла)

При определении специфичности зондов PhytoYptRamP и Phyto2YptCitP установлено, что флуоресценция по красителю FAM (для Р. гатогит) и HEX (для P. citricola) регистрировалась только в образцах ДНК чистых культур этих возбудителей.

При тестировании зондов PramP и Phyto2YptCitP в одной пробирке флуоресценция по красителю FAM - для Р. гатогит и HEX - для Р. citricola регистрировалась только в образцах с ДНК чистых культур этих возбудителей, даже если она находятся в смеси (таблица 10).

Таблица 10

Специфичность ПЦР «в реальном времени» с зондами PramP и

Phyto2YptCitP.

ДНК возбудителя Пороговый цикл (Ct)

PramP Phyto2YptCitP

Вода N/A N/A

Вода N/A N/A

Р. гатогит 32.44 N/A

Р. гатогит 31.50 N/A

P. citricola N/A 29.33

P. citricola N/A 32.29

Р. гатогит + Р. citricola 31.09 30.38

Р. гатогит + Р. citricola 36.65 29.16

N/A— отсутствие сигнала флуоресценции (отрицательный результат)$ цифры — значения Ct (значение трешхолд цикла); ■ - краситель FAM; т - краситель HEX.

ГЛАВА V. Изучение эффективности фунгицидов в отношении Р. гатогит

5.1. Определение эффективности фунгицидов на питательной

среде.

На питательной среде с препаратами Бордоская смесь (в концентрации 0,5% и более), Ридомил Голд (более 0,25%), Фарма йод (более 0,25%) и Танос (0,3%) рост культуры полностью отсутствовал. Препарат Превикур не оказал статистически достоверного влияния на рост колоний Р. гатогит, Топаз и Браво достоверно замедляли рост колоний патогена, но не существенно (таблица 11). Скор слабо замедлял рост колоний, но имел обратную зависимость эффекта от концентрации: при концентрации препарата в среде 0,01% фунгистатический эффект был выражен сильнее, чем при концентрации 0,04%.

Таблица 11

Среднее значение диаметра колоний Р. гатогит на 3-е, 5-е, 7-е и 10-е __сутки инкубации._

Препарат, Среднее значение диаметра колоний ш 5

концентрация повторностен , мм ± стандартное отклонение

препарата 3-е сутки 5-е сутки 7-е сутки 10-е сутки

Контроль 27,4 ±2,1 35,4 ±2,5 40,6 ±2.5 55,8 ±2,8

Бордоская 2% 0 0 0 0

смесь 1% 0 0 0 0

0,5% 0 0 0 0

Превикур 0.4% 22 ±2 32,2 ± 1,96* 39.6 ± 1,5* 53,4 ± 2,2*

0.2% 21 ± 1,9 28 ± 1,3 [38.2 ± 1,5* 51 ±2,45

0.1% 18,4 ±0,8 26.4 ± 0,7 34.8 ± 0,2 46,6 ± 2,6

Гопаз 0,1% - 12,2 ± 0,5 15.2 ± 1,07 16,4 ± 1,1

0,05% 10 ±0 15 ±0,45 17,2 ± 0,8 122,6 ± 0,7

0,025% 13,8 ±0,5 18,8 ±0,4 22.4 ± 0,7 32,8 ± 1,4

Скор 0,04% 16 ±0,7 25 ± 0,8 31,6 ±0,98 47,8 ± 0,97

Э,02% 14,8 ± 0,7 20,4 ± 0,7 25 ± 0,95 38,2 ± 1,7

3,01% 11,8 ±2,7 19,8 ± 0,6 24.8 ± 0,2 36± 1,3

Браво 1% - 8,2 ±2,1 11,6 ±0,2 17,2 ± 1,3

0,5% 9,2 ±2,3 12 ±0,3 12.8 ± 0,2 17,6 ±0,5

3,25% 6,6 ± 2,7 11,4 ±0,25 13 ±0,3 18 ±0,45

Ридомил 1% 0 Э Э 0

Голд 0,5% 0 0 0 0

0,25% 0 э э 0

Фарма йод 1% 0 0 0 0

0,5% 0 0 0 0

3,25% 0 0 0 0

Ганос 0,3% 0 0 0 0

0,15% 0 0 10 ± 0,0 11 ± 0,0

0,075% 10 ±0,0 10 ±0,0 11 ±0,0 16 ±0,45

"0" — означает отсутствие роста; *- ошибка более 0,05; % - концентрация препарата в среде

5.2. Определение эффективности фунгицидов на листьях.

Для определения эффективности исследуемых фунгицидных препаратов на листьях рододендрона отмечали степень развития некрозов на 5, 7, 9 и 12 сутки после инокуляции, оценивая их по 5-ти бальной шкале. Данные по степени развития некрозов приведены в таблице 12.

Таблица 12

Развитие некрозов на 5-е, 7-е, 9-е и 12-е сутки (в баллах)_

Препарат, концентрация препарата Размер некроза (баллы1") ± стандартное отклонение

5 сутки 7 сутки 9 сутки 12 сутки

Контроль 1,0 ±0,6 1,3 ±0,3 1,7 ±0,3 2,7 ± 0,3

Ганос 0,15% 3,0 ± 0* 0,3 ± 0.3* 0,3 ± 0,3 0,3 ± 0,3

Э,3% 0,0 ± 0* 0,0 ± 0* 0,0 ± 0* 0,0 ±0

Скор 0,02% 1,0 ±0,6* 1,0 ±0,6* 1,0 ±0,6* 1,3 ± 0,9

Э,04% 3.7 ± 0.3* 1,3 ±0.3* 1.3 ±0.3* 2,0 ± 0,6*

Бордоская смесь 1% 0,0 ± 0* 0.3 ±0.3* 0,3 ± 0,3* 3,7 ± 0,3

2% 0,3 ± 0.3* 0,7 ± 0.3* 0,7 ±0.3* 1,3 ± 0,7

Фарма Иод 0,5% 0,3 ± 0.3* 1,3 ± 0.3* 1,7 ±0.3* 2,7 ± 0,3*

1% 1,0 ±0* 1,3 ±0,3* 1,7 ±0,3* 2,7 ±0,3*

Превикур 0.2% 0,3 ± 0.3* 0,3 ±0.3* 0,3 ± 0.3* 3,7 ± 0.7

0.4% 0,3 ± 0,3* 0,3 ± 0,3* 0,3 ± 0,3* 0,7 ± 0,7

Ридомил Голд 0,5% 0,0 ± 0* 0,0 ± 0* о,о ±0 0,0 ±0

1% 0.0 ± 0* 0,0 ± 0* 0,0 ±0 0,0 ±0

Браво 0,5% 0,3 ± 0,3* 0,3 ± 0,3* 0,3 ± 0,3* 0,7 ± 0,7

1% 0,3 ± 0,2* 0,3 ± 0.3* 0,7 ± 0.7* 0,7 ± 0.7

Топаз 0,05% 0,7 ± 0.3* 0,7 ± 0.3* 1,3 ±0.7* 1,7 ±0,9*

0,1% 1,0 ±0* 1,0 ±0* 1,7 ±0,3* 2,7 ± 0,3*

*- ошибка более 0,05; % - концентрация раствора препарата; Баллы: 0-отсутствие некрозов. 1- поражено от 1% до 25% листовой поверхности. 2- от 26% до 50%, 3- от 51% до 75%. 4 - от 76% до 100%.

Наибольшей фунгицидной эффективностью обладали препараты Ридомил Голд, который полностью подавлял развитие патогена в концентрации 0,5% и Танос, сильно подавлявший развитие Р. гатогит в концентрации 0,15% и полностью - при 0,3%. Браво и Превикур во всех исследованных концентрациях оказывали ингибирующее действие на патогена, но не подавляли полностью его развитие. Бордоская смесь снижала развитие некрозов, но менее эффективно, чем предыдущие препараты. Фунгициды Скор, Топаз и Фарма йод не показали статистически достоверного подавляющего эффекта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенная работа показала, что возбудители фитофтороза в южных регионах России поражают такие хозяйственно важные породы, как дуб и каштан. Для предотвращения массового развития фитофторозов необходим постоянный мониторинг зеленых насаждений, уничтожение источников инфекции и контроль инфекции в привозном материале.

В результате данной работы разработаны праймеры и зонды для ПЦР «в реальном времени», протестированы на российских штаммах импортные диагностические системы, отработаны подходы к идентификации опасных возбудителей фитофторозов по морфолого-культуральным признакам. В целом, созданы методические подходы к проведению мониторинга фитофторозов в зеленых насаждениях, питомниках, посадочном материале.

Мы считаем, что мониторинг развития фитофторозов древесных растений должен быть продолжен; это единственно возможный путь избежать огромных потерь от массовой гибели самых ценных пород деревьев, как это уже было в некоторых странах мира.

ВЫВОДЫ

1. В результате мониторинга 19 питомников было отобрано и проанализировано 313 образцов вегетативных частей растений и почвы. В исследуемых образцах было выявлено 24 вида грибов; возбудителей фитофторозов выявлено не было. Также было проанализировано 407 проб из 24 лесопосадок в 3 южных областях России. Всего было выявлено 47 видов грибов, из них 4 вида фитопатогенных оомицетов рода Phytophthora: Р. cactorum, Р. citricola, Р. plurivora и Р. pini.

2. Подобраны праймеры и зонды для ПЦР «в реальном времени», которые позволяют идентифицировать Р. гатогит и Р. citricola как по отдельности, так и вместе в одной пробирке. Разработанные зонды не дают ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Оптимальным местом в образце растительной ткани для выделения ДНК является зона между здоровой и некротизированной тканями. Наилучшими методами для выделения ДНК из растительной ткани являются метод Doyle и метод выделения ДНК на основе магнитных частиц.

3. Для выявления оомицетов рода Phytophthora в воде наиболее эффективным является метод биоприманок с последующим выделением на селективные питательные среды с антибиотиками. Применение листьев рододендрона в качестве биоприманок позволило выявить Р. gonapodyides, Р. polonica, Р. megasperma и Phytopythium litorale в водоемах естественных насаждений.

4. Наиболее эффективными препаратами, подавляющими развитие патогена на листьях и в питательной среде, были Ридомил Голд МЦ и Танос. Бордоская смесь и Фарма-Иод полностью ингибировали рост патогена на питательной среде, но в опыте на листьях были

малоэффективны. Превикур, напротив, не оказывал ингибирующего действия на питательной среде, но был эффективен в опыте с листьями. Препарат Браво оказал среднее ингибирующее действие на развитие патогена на питательной среде и на листьях рододендрона. Скор и Топаз не оказывали подавляющего действия на Р. гатогит.

НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты могут быть использованы в фундаментальных научных и прикладных исследованиях в профильных лабораториях, отделах и институтах системы Российской академии наук.

Данные, полученные в ходе работы, могут использоваться при проведении фитосанитарных мониторингов древесных растений, а также для проведения карантинной лабораторной экспертизы растительного материала в ФГБУ ВНИИКР и могут быть рекомендованы для использования в других лабораторий и научно-исследовательских организациях. Кроме этого, они могут быть полезны Российским фирмам, разрабатывающим тест-системы для диагностики фитопатогенов.

Результаты оценки эффективности фунгицидов в отношении Р. гатогит могут использоваться при планировании системы защиты растений от этого патогена, а также при разработке фитосанитарных мер в очагах заболевания. Также они могут быть использованы компаниями, занимающихся производством, регистрацией и реализацией пестицидов в РФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах из перечня ВАК

Шероколава H.A. Усыхание дуба в Орловской области / Шероколава H.A., Сурина Т.А., Скрипка О.В., Дудченко И.П., Александров И.Н. // Защита и карантин растений. - 2007. - №10. - С. 33-35.

Александров И.Н. Фитофтороз земляники / Александров И.Н., Скрипка О.В., Дудченко И.П., Сурина Т.А., Никифоров C.B. // Защита и карантин растений. - 2007. - №5. - С. 32-34.

Сурина Т.А. Мониторинг на выявление фитофтороза древесных и кустарниковых растений / Сурина Т.А., Еланский С.Н., Мазурин Е.С. // Защита и карантин растений. - 2015. - №1. - С. 42-43.

Статьи в других периодических изданиях и сборниках

Александров И.Н. К вопросу об усыхании дуба на Русской Равнине / Александров И.Н., Сурнна Т.А., Скрипка О.В., Дудченко И.П. // Международная организация по биологической борьбе с вредными животными и растениями. Бюллетень № 7. Пушкино, 2007. - С. 9-11.

Избранные тезисы и материалы конференций

Сурина Т.А. Диагностика возбудителей рода Phytophthora методом ПЦР «в реальном времени» / Сурина Т.А., Копина М. Б. // Современная микология России. ТЗ. Материалы 3-го Съезда микологов России. - 2012. -С. 318.

Скрипка О. В. Микромицеты посадочного материала сосны и дуба / Скрипка О. В. Сурина Т. А., Дудченко И. П., Никифоров С. В. // Материалы всероссийской научной конференции с международным участием «Роль ботанических садов и охраняемых природных территорий в изучении и сохранении разнообразия растений и грибов. 13-16 октября 2011г., Ярославль, 2011. - С .97-99.

Шероколава H.A. Патогенная микофлора древесных культур в Европейской части России / Шероколава H.A., Скрипка О.В., Александров И.Н., Дудченко И.П., Сурина Т.А., Никифоров C.B. // Современная микология в России. Т.2 Тезисы докладов II съезда микологов России. - 2008. - С. 213.

Kopina M. Development molecular markers and probes for P. ramorum, P. nicotianae, P. citricola, P. fragariae, P. cactorum detection / Kopina M., Surina T. // The Sixth Meeting of the IUFRO Working Party 7-02-09. Phytophthora in Forts and Natural Ecosystems, Córdoba (Spain), 2012. -P. 94-95.

Surina T. A combination of baits and molecular genetic methods for detection and identification of Phytophthora spp / Surina T., Kopina M., Mazurin E.S. // 10th International Congress of Plant Pathology, Beijng, 2013 P.-288.

Отпечатано в копицентре «Cl ПРИН1 » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495) 939-33-38 Тираж 70 экз. Подписано в печать 14.02.2015 г.