Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование содержания нуклеиновых кислот и получение низкомолекулярной ДНК из гонад пресноводных рыб байкальского региона

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Исследование содержания нуклеиновых кислот и получение низкомолекулярной ДНК из гонад пресноводных рыб байкальского региона"

На правах рукописи „ '

ЗАХАРОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ГОНАД ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ БАЙКАЛЬСКОГО

РЕГИОНА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 (З М " и......

Улан-Удэ-2012

005042869

Официальные оппоненты:

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ФГБОУ ВПО «ВСГУТУ»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Цыренов Владимир Жигжитович, заведующий кафедрой «Биотехнология» ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» доктор биологических наук, профессор Пронин Николай Мартемьянович, ФГБУ Сибирский институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, лаборатория паразитологии и экологии гидробионтов;

доктор технических наук, профессор Чиркина Тамара Федоровна, ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет

технологий и управления», кафедра «Биоорганическая и пищевая химия»

Ведущая организация:

Институт эпидемиологии и микробиологии государственного учреждения Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН.

Защита диссертации состоится «18» мая 2012 г. в 10 часов 00 минут на заседании диссертационного совета ДМ 212.039.02 при ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления».

Автореферат разослан «16» апреля 2012 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Хамнаева Нина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время достоверно показана биологическая активность нуклеиновых кислот различного происхождения при их применении в качестве лекарственных препаратов и БАД к пище, использовании в косметологии и для специального (детского, лечебного, спортивного) питания, а также для получения нуклеотидов, нуклеозидов, пуринов и пиримидинов. Для получения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) используют различные сырьевые источники: ткани животных, микроорганизмы (биомасса дрожжей и непатогенных штаммов кишечной палочки пригодны и для производства ДНК и РНК для фармации), растения (наиболее богаты ДНК и РНК и содержат мало полисахаридов, полифенольных соединений и пигментов), трех-семидневные этиолированные (выращенные в темноте и лишенные хлорофилла) проростки семян. Для выделения ДНК и РНК для фармации пригодны кровь и мягкие ткани сельскохозяйственных животных и молоки промысловых рыб.

ДНК, из вышеперечисленных источников, может быть выделена в высокомолекулярной и низкомолекулярной формах. Применение высокомолекулярной ДНК в качестве БАД ограничено ее слабой растворимостью в воде, низкой биодоступностью, трудоемкой и многостадийной технологии выделения и требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Низкомолекулярная ДНК (молекулярная масса 2-5x105 Да) является значительно более дешевой и доступной для технологического получения, также разрешена к применению как биологически активная пищевая добавка и обладает целым рядом лечебно-профилактических свойств, таких как повышение физической и умственной работоспособности, иммуномоделирующее, противовирусное, кардиопротекторное и противоопухолевое действие (Беседнова, Эпштейн, 2002). Среди иммуномодуляторов и противовирусных средств, полученных из молок осетровых, особое место занимают коммерческие препараты «Деринат» и «Ферровир». Они эффективны в отношении целого ряда ДНК- и РНК-вирусов. ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой применяется в

3

а

кардиологии при лечении ишемической болезни сердца, в онкологии при профилактике и лечении рака. С 1995 г. применяется препарат «Нуклеоспермат Натрия» для профилактики и лечения лейкопении при агранулоцитозе самостоятельно или на фоне цитостатической терапии в онкологии (Реестр лекарственных средств).

Гонады лососевых, осетровых рыб и кальмаров являются основным источником получения низкомолекулярной ДНК. Молоки промысловых пресноводных видов рыб также могут служить источником нуклеиновых кислот, однако до настоящего времени недостаточно сведений о количественном содержании в них ДНК и ферментов, участвующих в ее деградации. Исследования нуклеолитических ферментов пресноводных видов рыб в основном посвящены изучению ДНК-аз пищеварительных органов и печени (Wu, Wang, Liu, 2008; Mogi, 2003; Yasuda, Takeshita, 2004). Например, ДНК-аза I, расщепляющая нативную ДНК по двуударному механизму, активируемая ионами Са2+ и Mg2+, была выделена из печени карпа и карася, а кислые дезоксирибонуклеазы - из печени и молок некоторых видов пресноводных и морских рыб (Амелина, 2005, 2006). Сведений о протеолитических и нуклеолитических ферментах молок пресноводных рыб в литературе не обнаружено.

Несмотря на большое количество разработок в этой сфере, проблема поиска новых источников сырья остается актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование гонад пресноводных видов рыб Байкальского региона на содержание нуклеиновых кислот как перспективного сырья для получения низкомолекулярной ДНК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести анализ содержания нуклеиновых кислот и белков в молоках пресноводных рыб и определить наиболее перспективный источник для получения комплекса ДНК;

- определить активности эндогенных нуклеаз и протеаз в гонадах пресноводных гидробионтов;

- получить низкомолекулярный комплекс ДНК из молок пресноводных рыб и изучить его фракционный состав;

- определить фармакологическую активность и острую токсичность комплексов ДНК из пресноводных рыб.

Научная новизна. Проведены исследования содержания нуклеиновых кислот в молоках 12 видов гидробионтов Байкальского региона, определены в них нуклеазные и протеолитические активности. Получен комплекс ДНК из молок пресноводных рыб. Проведена оценка на острую токсичность комплекса ДНК и ее безвредность. Выявлена фармакологическая активность одного из исследуемого комплекса ДНК

Практическая значимость. Предложены способы использования гонад пресноводных рыб для получения БАВ и использования их в качестве сырья для БАД.

Разработан проект технической документации по получению комплекса ДНК из молок пресноводных рыб (технический регламент № 1 от 15.11.2011). Получены опытные образцы низкомолекулярной ДНК из молок пресноводных рыб.

Материалы исследований вошли в основу курса лекций для студентов специальности «Биотехнология» по следующим дисциплинам: «Химия БАВ», «Биотехнология лекарственных веществ». Результаты научных исследований внедрены в учебный процесс.

Работа поддержана грантом «Молодые ученые ВСГТУ 2009-2010 гг.».

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены и доложены на: конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); конференции молодых ученых общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); международной научно-практической конференции «Качество как условие повышения конкурентоспособности и путь к устойчивому развитию» (Улан-Удэ, 2009); ежегодной научной конференции преподавателей, научных сотрудников и аспирантов ВСГТУ, секция «Биотехнология» (Улан-Удэ, 2010), Вестник ПГФА (Пермь, 2011), Известия ТИНРО -центра (Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, г Владивосток, 2011 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 2 глав, выводов, заключения и списка использованной литературы, включающего 121 наименования, в том числе и источники иностранных авторов. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 13 таблицами.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами экспериментальных исследований служили гонады 3 - 4 стадии зрелости следующих видов пресноводных рыб: омуля Coregomis migratorius, окуня Perca Linne, широколобки Paracottus (leocottus)kessleri, тайменя Hucho taimen, налима Lota Океп, язя Leuciscus idus, ельца Leuciscus baicalensis, хариуса Thymallus baicalensis, леща Abramis brama, ленка Brachymystax lenok, плотвы Rutilus rutilus, карася Carassius auraris gibelio, гаммарус, которые в замороженном виде доставляли в лабораторию. Образцы рыб вылавливали в осенне-весенний период в реках и озерах Бурятии. Срок хранения замороженного сырья при температуре -18° не превышал 3 мес.

В качестве субстратов для определения протеолитической активности использовали казеин по Гаммерстену («Биолар», Латвия), эфирные субстраты: ТАМЭ, БТЭЭ («Sigma», США), нуклеазной - ДНК («ICN», США). При проведении электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии в качестве маркеров использовали наборы олигонуклеотидов pUC/Msp 1 и pBR 322/Alu 1 («СибЭнзим», Россия).

Для получения низкомолекулярной ДНК использовали метод, разработанный учеными ТИНРО-центра (Патент РФ № 915446).

Идентификацию комплексов ДНК осуществляли с помощью ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100 (США). Определение массовой доли ДНК в готовом комплексе осуществляли методом гель-электрофореза (Остерман, 1981).

Острую токсичность препаратов исследовали в соответствии с требованиями Фармакопеи (ГФ, 1987), а также на простейших тест-организмах (угнетение процессов жизнедеятельности Тесаку тепа руп/оптз).

Анальгетическую активность данных соединений определяли по модели «уксусных корчей», на белых мышах массой 20-26 г в соответствии с требованиями Фармакопеи в Пермской государственной фармацевтической академии (ПГФА) на кафедре «Фармакология» под руководством зав. кафедрой, профессора В.П. Котегова.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика сырья по химическому составу, содержанию ДНК и активности эндогенных ферментов

На первоначальном этапе исследований проведен скрининг по содержанию нуклеиновых кислот в молоках пресноводных рыб (табл. 1).

Таблица 1 - Содержание нуклеиновых производных в гонадах пресноводных рыб

Виды рыб Гонады Содержание Содержание

ДНК,% РНК, %

1 2 3 4

Широколобка молоки 6,27± 0,56 1,65± 0,09

икра 0,59± 0,04 -

Омуль молоки 3,75 ± 0,26 0,67 ±0,03

Окунь молоки 3,73 ±0,18 0,85 ±0,04

икра 0,57 ± 0,03 0,11 ±0,01

Таймень молоки 3,68±0,18 -

Елец молоки 2,56± 0,12 0,52± 0,04

Карась молоки 2,45±0,11 -

икра 0,11±0,01 0,40±0,02

Язь молоки 2,09 ±0,10 1,18 ±0,07

икра 0,14 ±0,01 -

Хариус молоки 1,82±0,09 0,20±0,01

икра 0,15±0,01 0,30±0,02

Плотва молоки . 1,40±0,08 0,09± 0,01

икра 0,15±0,01 -

Окончание таблицы 1

1 2 3 4

Налим молоки 1,25±0.08 0,50±0,03

икра 0,11±0,01 -

Ленок молоки 1,18±0,09 0,09±0,01

икра 0,21±0,02 -

Лещ молоки 0.96 ±0,06 0.16 ±0,01

икра 0,84 ±0,02 0,08 ±0,01

Показано, что наибольшее содержание ДНК обнаружено в молоках широколобки, омуля, окуня и тайменя. Эти данные легли в основу выбора гонад для получения низкомолекулярной ДНК, что основано на прямой зависимости процента выхода комплекса ДНК от содержания ДНК в молоках различных видов рыб.

Из общего химического состава гонад пресноводных рыб (табл. 2) видно, что они являются потенциальными поставщиками ценных белков, из них наибольшее содержание белка наблюдается в молоках тайменя и омуля.

Таблица 2 - Химический состав молок пресноводных рыб

Вид рыб Содержание, в %

Влага Белок Зола ДНК РНК Не идент. в-ва

Омуль* 74,8± 1,5* 16,5± 0,9* 2,7± 0,2* 3,75± 0,26 0,67± 0,03 1,6

Окунь 77,3± 1,4 13,7± 0,8 2,0± 0,2 3,73± 0,18 0,85± 0,04 2,4

Широко лобка 76,8± 1,7 14,3± 0,8 - 6,27± 0,56 1,65± 0,09 1,0

Таймень 68,1± 1,2 24,3± 0,9 2,5± 0,2 2,09± 0,16 1,18± 0,12 1,8

Хариус 80,3± 1,5 14,8± 0,9 1,9± 0,1 1,82± 0,09 0,20± 0,01 0,9

В настоящее время известно, что только в молоках лососей и сельдей обнаружены белки специфического состава -протамины, в то время как у большинства других видов (в

частности тресковых) в молоках содержатся гистоны (Беседнова, 1999).

Эти два основных белка можно различить с помощью реакции Миллона: По результатам проведенной качественной реакции на тирозин, мы определили, что основным белком, составляющим комплекс с ДНК в молоках омуля, язя, налима, является гистон, а в молоках широколобки и окуня - протамин. Это позволяет сделать предварительный вывод о наличии фармакологических свойств у группы «ДНК - протамин», а именно у молок широколобки и окуня.

Исследование активности дезоксирибонуклеаз в гонадах пресноводных рыб

В условиях проведения гидролиза во всех исследуемых сырьевых источниках отметили более высокую активность кислых дезоксирибонуклеаз, которые могут играть определенную роль в деградации ДНК на первых стадиях гидролиза, когда рН гомогенизированной ткани находится в слабокислой или нейтральной области. Наиболее высокую активность кислых нуклеаз отметили в молоках широколобки, омуля, окуня и леща, низкую - в молоках ленка (табл. 3)..

Таблица 3 - Активность дезоксирибонуклеаз в молоках пресноводных рыб

Виды рыб Активность дезоксирибонуклеаз, Е/г

Щелочные Кислые

1 2 3

Широколобка 170,5±5,1 1471,9±34,0

Омуль 191,7±6,7 1717,7±58,7

Окунь 185,0±5,6 1165,5±27,9

Таймень 60,8±2,9 320,0±7,8

Елец Следы* 406,0±8,6

Карась 83,3±3,6 738,4±10Д

Окончание таблицы 3

1 2 3

Язь 429,0±8,1 941,1±15,8

Плотва 144,6±5,9 633,9±9,9

Налим 150,0± 6,3 511,1±9,7

Ленок Следы* 300,0±7,6

Лещ 135,4 ±5,5 1118,3±18,3

При исследовании активности Са, ]\<%-зависимых щелочных дезоксирибонуклеаз отметили наиболее высокую активность в молоках язя, омуля, широколобки и окуня. Активность щелочной нуклеазы при данных условиях не проявлялась у ельца и ленка.

Из рисунка 1 видно, что активность щелочных нуклеаз на порядок ниже, чем кислых, такая разница в активности, по-видимому, связана с физиологическими особенностями объектов исследования.

Рисунок 1 - Сравнительная активность дезоксирибонуклеаз в молоках пресноводных и морских* видов рыб

Сравнительный анализ активности данных ферментов в молоках пресноводных и морских видов рыб (рис. 1) показал, что нуклеолитическая активность в молоках пресноводных рыб в среднем в 1,2 - 2 раза выше, чем в морских объектах. Что позволило ожидать более глубокий процесс деструкции ДНК при ее выделении.

Исследование активности протеолитических ферментов в гонадах пресноводных рыб

Из анализа результатов исследования активности протеолитических ферментов (табл. 4) установлено, что активность щелочных протеаз на порядок выше, чем кислых протеаз. Наиболее высокая казеинолитическая активность отмечена в молоках омуля, тайменя, карася и леща. В остальных молоках активность щелочных протеаз на порядок ниже, возможно, содержащиеся в них протеазы требовали других условий или отличались иной субстратной специфичностью. При исследовании активности кислых протеаз была выявлена наиболее высокая активность в молоках ленка и налима и не проявилась в молоках тайменя, карася и язя.

Таблица 4 - Активность протеолитических ферментов в молоках пресноводных рыб

Виды рыб Активность протеаз, Е/г

Щелочные Кислые

Широколобка 4,07±0,51 0,57±0,03

Омуль 9,05±0,36 0,41 ±0,02

Окунь 2,01 ±0,14 0,61±0,04

Таймень 9,73±0,42 Следы*

Елец 2,74±0,18 0,21 ±0,02

Карась 7,98±0,30 Следы*

Язь 2,46±0,12 Следы*

Плотва 4,48±0,31 0,99±0,06

Налим 3,60±0,40 1,17±0,05

Ленок 1,01 ±0,04 2,93±0,11

Лещ 7,73±0,29 0,42±0,02

В результате сравнительного анализа активности протеолитических ферментов в молоках морских и пресноводных видов рыб (рис. 2) отмечена наибольшая активность в молоках пресноводных рыб как в кислых, так и щелочных зонах рН.

Рисунок 2 - Сравнительная активность протеаз в молоках пресноводных и морских* видов рыб

Получение комплекса низкомолекулярной ДНК из молок пресноводных рыб и исследование их фракционного состава

При выделении ДНК из молок пресноводных рыб, ■растворы молок не устойчивы и быстро образуют гель-раствор, и поэтому для каждого вида подбирали необходимые условия рН, гомогенизации, температуры и длительности кипячения.

молоки

Рисунок 3 - Схема выделения комплекса низкомолекулярной ДНК из молок пресноводных рыб

Выделенная ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и не растворимый в органических растворителях. Содержание ДНК в препарате достигает 68 - 73 %.

Сухой порошок ДНК измельчали в ступке и взвешивали на аналитических весах с абсолютной погрешностью ±0,0002 г. Выход сухого комплекса ДНК из 5 г молок широколобки составил 0,1 г.

Наибольшее содержание нуклеиновых кислот в готовом комплексе ДНК из молок пресноводных рыб обнаружено у широколобки (72,5 %), максимально приближенный к содержанию в ДНК лососевых рыбах (79,02). В комплексах ДНК из молок омуля (69,0) и окуня (68,3) содержание нуклеиновых кислот немного ниже, чем у широколобки и лососевых.

Сравнительная характеристика комплексов ДНК

с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

С целью идентификации выделенного комплекса ДНК использовали метод ВЭЖХ. Регистрацию пиков определяемых веществ осуществляли по времени удерживания и спектральным отношениям (220 и 260 нм) с соответствующими параметрами хроматограмм стандартных ДНК маркеров(«1С№>,США).

Рисунок 4 -

Хроматография комплекса ДНК молок широколобки

Рисунок 5

Хроматография комплекса ДНК молок омуля

время.

шшшшшшшшшш

ашшящшшя

время, г.

В результате проведения исследования были получены хроматографические профили комплексов ДНК молок пресноводных рыб и стандартных ДНК-маркеров. Установлено совпадение пиков определяемых веществ с пиками стандартного набора ДНК, следовательно, исследуемые вещества являются компонентами нуклеиновых кислот. Показано, что в комплексах ДНК омуля, окуня и язя обнаружено по два фрагмента, которые совпали с двумя пиками из стандартного набора ДНК (0,87 и 1,13), в комплексе ДНК широколобки и налима отметили по одному пику, которые совпали с пиком (0,751) стандарта ДНК, а в комплексе ДНК тайменя - три фрагмента, которые также совпали по времени удерживания с тремя пиками стандарта ДНК (пики 0,85, 1,15 и 1,37).

17£ Г> 150

1

& 125

8

х 100

I »

I 50

25

V/

/

А

дяккч* вапиы. и

200 220 240 260 280 300 320 зЗо 350 « длина волны, нм

Рисунок 6 - УФ-спектр пика Рисунок 7 -УФ - спектр

1,123 комплекса ДНК омуля пика 0,751 комплекса ДНК

широколобки

Расшифровку полученных пиков исследовали с помощью УФ-спектроскопии при длине волны 220 и 260 нм. Совпадение пиков при одних и тех же длинах волн свидетельствует о весьма близком количественном соотношении азотистых оснований в ДНК исследованных объектов, а различные величины пиков соответствуют установленной разнице в количественном содержании оснований ДНК в комплексах.

Фракционный состав низкомолекулярных нуклеиновых кислот из гонад различных видов гидробионтов

Молекулярную массу нуклеиновых кислот определяли по калибровочным графикам, построенным в координатах зависимости М от молекулярной массы по значениям, соответствующим наборам стандартных маркерных молекул

риС/Мзр 1: 15,6, 20,4, 40,2, 66,0, 114,0, 145,0, 198,0, 242,4, 302,4 кДа.

Рисунок 8 Денситограмма

«о

200

Мрйуяйрваз масса, «Да

Молекулярная масса. кДа

комплекса ДНК молок омуля

из

Рисунок 9 Денситограмма комплекса ДНК из молок широколобки

На рисунке 8 представлена полученная гель-хроматограмма, которая свидетельствует о присутствии в комплексе ДНК молок омуля одной фракции с молекулярной массой 380 кДа. В нуклеопротеидном комплексе широколобки обнаружено 2 пика с молекулярной массой 260 и 290 кДа (рис. 9). Известно, что низкомолекулярная ДНК с молекулярным весом 270-500 кДа применяется в медицине и фармации.

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ КОМПЛЕКСОВ ДНК ИЗ МОЛОК ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ

В результате исследований установили, что в соответствии с классификацией по К.К. Сидорову комплексы ДНК широколобки, тайменя, окуня, омуля относятся к третьему классу токсичности (умереннотоксичные), а комплекс ДНК налима - к четвертому классу (малотоксичные).

Результаты опытов свидетельствуют о том, что острая токсичность (ЛД50) комплексов широколобки, тайменя, окуня, омуля при пероральном введении превышает 3000 мг/кг.

При оценке безвредности комплекса ДНК с использованием ТеШкутепа руп/огтгэ наблюдали наличие роста инфузорий, отсутствие деформации и угнетения подвижности. В результате чего сделали вывод о нетоксичности комплексов ДНК. Напротив, по приросту инфузорий отметили, что при добавлении в среду комплексов ДНК происходит оптимизация метаболических процессов инфузорий ТеКаЬутепа ругг/огтгя, что способствует лучшему усвоению питательных компонентов и ускорению их роста.

Исследование анальгетической активности комплексов ДНК из молок пресноводных рыб

При проведении экспериментальных исследований на лабораторных мышах нами была обнаружена анальгетическая активность полинуклеотидов выделенных из молок пресноводных рыб Байкальского региона.

Анальгезирующее действие данных комплексов изучали на модели «уксусных корчей», химическим болевым раздражением мышей (табл. 5), которые вызывали однократным внутрибрюшинным введением (через рот) 1 мл 1% уксусной кислоты и подсчитывали корчи в течение 10 минут.

Таблица 5 - Анальгезирующее действие комплексов ДНК из молок пресноводных рыб при введении уксусной кислоты (количество корчей за 10 мин)

Комплекс ДНК Доза, мг/кг Среднее количество корчей после введения 0,75% уксусной кислоты, за 10 мин Средний латентный период, мин

Широколобка 40 7,0±1,1 7,2

Таймень 40 16,6±2,2 6,2

Окунь 40 15,8±1,9 4,4

Омуль 40 13,6±1,4 4,0

Налим 40 18,2±2,3 3,4

Контроль 0 18,4±2,5 2,8

Исследуемые комплексы вводили внутрибрюшинно (через рот) в дозе 40 мг/кг в виде водной суспензии стабилизированной твином-80, за час до инъекции альгогена (уксусной кислоты).

По результатам эксперимента была определена высокая анальгетическая активность у комплексов ДНК, полученных из молок широколобки и омуля. Увеличение латентного периода от введения альгогена в случае применения ДНК широколобки составило 7,2 мин, у омуля - 4,0 мин в сравнении с контролем 2,8 мин. Среднее количество корчей после введения уксусной кислоты мышам составило у ДНК широколобки 7 корчей, у омуля - 13,6 корчей против контроля 18,4 корчей.

По результатам эксперимента была определена высокая активность (более 50%) у комплекса ДНК, полученного из молок широколобки. Это показало целесообразность проведения дополнительных исследований анальгетической активности комплекса ДНК из молок широколобки для определения степени эффективности комплекса при его использовании в разных дозах (30, 40, 50 мг/кг).

Экспериментально изучено влияние различных дозировок комплекса ДНК на торможение уксусных корчей у подопытных мышей. Установлено, что при увеличении дозы вводимого комплекса ДНК молок широколобки (табл. 6) уменьшается количество корчей, соответственно, степень анальгетической активности возрастает.

Таблица 6 - Степень эффективности комплекса ДНК из молок широколобки при его использовании в разных дозах

№ Доза, мг/кг Уменьшение корчей,%

1 30 63,06

2 40 61,96

3 50 78,37

Наиболее высокий показатель торможения уксусных корчей отмечен в дозе 50 мг/кг. Для достоверности анальгетической активности комплекс ДНК молок широколобки сравнили с анальгином (препарат из группы нестероидных противовоспалительных средств - метамизол натрия).

Таблица 7 - Сравнение анальгетической активности комплекса ДНК из молок широколобки с фармакологическим препаратом (анальгином)

Препарат Доза, мг/кг Количество корчей Уменьшение корчей, %

Метамизол-натрия 50 12,2±1,6 52,5

ДНК широколобки 50 6,7±0,6 78,4

Контроль 50 22,2±1,1 0

Согласно полученным результатам, как перспективный для дальнейших углублённых фармакологических исследований отобран один вид байкальских рыб - широколобка (Сойлв), семейство СоИМае - керчаковые.

Полученные результаты исследований фармакологических свойств ДНК позволяют расширить спектр изучения и применения ДНК молок пресноводных рыб Байкальского региона.

Выводы

1. Исследован химический состав молок пресноводных рыб: определены содержания ДНК, белков и некоторых гидролитических ферментов в молоках 12 видов пресноводных рыб Байкальского региона.

2. Установлено, что содержание ДНК в молоках пресноводных рыб колеблется в широких пределах - от 0,96% (лещ) до 6,27% (широколобка). Перспективными биообъектами для получения комплексов ДНК являются молоки широколобки, омуля и окуня.

3. Содержание белка в молоках пресноводных рыб Байкальского региона больше, чем его содержание в молоках морских рыб. Показано, что гистоны являются главным по содержанию белком, составляющим комплекс с ДНК в молоках омуля, язя и налима, а протамины - в молоках широколобки и окуня.

4. В молоках пресноводных рыб имеются активные гидролазы — дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) и протеазы, которые имеют следующие существенные особенности —

активность щелочных эндонуклеаз на порядок ниже, чем кислых, в то время как активность щелочных протеаз на порядок выше, чем кислых. Активность ДНК-аз в молоках пресноводных рыб несколько выше (в 1,2 раза), чем в молоках морских видов рыб и имеют наибольшую активность в кислой зоне рН.

Активность ДНК-аз и протеаз хорошо сохраняется при хранении, вызывая постепенный гидролиз биополимеров.

5. Получены комплексы ДНК из молок пресноводных рыб Байкальского региона, определены молекулярные массы фракций ДНК. Разработан проект технической документации по получению комплекса ДНК из молок пресноводных рыб (технический регламент № 1 от 15.11.2011).

6. Определена фармакологическая активность и острая токсичность препаратов. Установлено, что комплекс ДНК из молок широколобки обладает высокой анальгетической активностью и отличается малой токсичностью.

По материалам диссертации опубликованы следующие

работы:

Статьи в журналах, рецензируемых ВАК:

1. Захарова М.А. Исследование нуклеиновых кислот в гонадах пресноводных рыб Байкальского региона / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева, В.Ж. Цыренов // Вестник ВСГТУ. -Улан-Удэ. - 2010. - №2. - С. 38-45.

2. Позднякова Ю.М. Сравнительный анализ содержания ДНК и ферментного состава в гонадах рыб байкальского региона / Ю.М. Позднякова, Т.Н. Пивненко, М.А. Захарова, В.Ж. Цыренов, C.B. Гомбоева, В.В. Давидович // Известия ТИНРО (Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра). - Владивосток. - 2011,- Т. 164. - С. 432-437.

Сборники научных трудов вузов, материалы конференций:

1. Захарова М.А. К проблеме рационального использования рыбного сырья / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева, O.JI. Дубинина, В.Ж. Цыренов // Приоритетные направления развития науки и технологий - Кн. II - М.; Тула: Изд-во ТулГУ, 2006.-С. 42-44.

2. Захарова М.А. Содержание нуклеиновых производных в пресноводной рыбе // Молодые ученые Сибири. Материалы Всерос. молодежной науч.-техн. конф. - Улан-Удэ. - Изд-во ВСГТУ, 2008. - С. 141-142.

З.Захарова М.А. Анализ содержания нуклеиновых производных в морских и пресноводных рыбах / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева, В.Ж. Цыренов // Биология - наука 21 века. - 12 Пущинская междунар. школа-конф. мол. учен. Сб. тез. - 2008. -С. 206-207.

4. Захарова М.А. Получение биологически активных веществ из Байкальских рыб / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева,

B.Ж. Цыренов // Наука на рубеже тысячелетий. - Тамбов: Изд-во Р.В. Першина- 2008. - С. 361 - 363.

5. Захарова М.А. Содержание ДНК и активность нуклеаз в тканях рыб Байкальского региона / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева, В.Ж. Цыренов // Конф. мол. учен., общ-во биотехн. -М.,-2008.-С. 51-52.

6. Захарова М.А. О биологически активных веществах выделенных из рыб / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева, В.Ж. Цыренов // Конф. мол. учен. ВСГТУ. - Улан-Удэ, 2009. - С. 2930.

7. Захарова М.А. Рыбное сырье как источник БАВ / М.А. Захарова, C.B. Гомбоева, В.Ж. Цыренов // Науч.-практ. конф. «Высокие технологии 21 века». - ЦВК «Экспоцентр»: М., 2009.

8. Захарова М.А. Определение биологической активности ДНК выделенной из молок пресноводных рыб / М.А. Захарова,

C.B. Гомбоева, В.Ж. Цыренов // Междунар. науч-практ. конф. «Качество как условие повышения конкурентоспособности и путь к устойчивому развитию»: Улан-Удэ, 2009. - С. 272-273.

9.Гольдштейн А.Г. Исследование фармакологической активности нуклеиновых кислот и их производных, полученных из гонад рыб байкальского региона / А.Г Гольдштейн, М.А. Захарова, В.П. Котегов, В.Ж. Цыренов // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. -2010. - №6 - С. 76-77.

Подписано в печать 16.04.12. Формат 60x84 1/16 Усл. п. л. 1,16. Тираж 100 экз. Заказ № 109.

Издательство ВСГУТУ 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарова, Марина Александровна, Улан-Удэ

61 12-3/1208

Восточно-ииоирский государственный университет технологий и управления

ЗАХАРОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ГОНАД ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Цыренов Владимир Жигжитович

Улан-Удэ, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений ............................................................... 5

Введение .......................................................................... 6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1, 1 Гидробионты - сырье для получения биологически

активных веществ ................................................... 12

1.2 Рыбы Байкальского региона ....................................... 15

1.3 Описание некоторых видов пресноводных рыб байкальского региона ............................................... 17

1.3.1 Отряд 8а1шош&гте8 Лососеобразные .......................... 18

1.3.2 Отряд Зсограет^мтеБ Корпенообразные ....................... 21

1.3.3 Отряд Сурпшбэппез Карпообразные ............................. 23

1.3.4 Отряд Регайшпез Окунеобразные ............................... 26

1.3.5 Отряд Оа&Аэгтез Трескообразные ................................ 28

1.4 Морфология и факторы, влияющие на химический состав гонад морских и пресноводных рыб ............................. 29

1.4.1 Характеристика химического состава нуклеиновых кислот и

нуклеопротеидов гонад гидробионтов ........................ 31

1.5 Характеристика эндогенных ферментов в мужских гонадах гидробионтов ......................................................... 41

1.6 Препаративное получение нуклеопротеидов и нуклеиновых кислот ................................................................... 49

1.7 Применение нуклеиновых кислот как биологически активных веществ ................................................... 52

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы исследования

2.1.1 Объекты и материалы исследований ............................ 63

2.1.2 Методы исследований .............................................. 66

2.2 ХАРАКТЕРИСТИКА СЫРЬЯ ПО ХИМИЧЕСКОМУ СОСТАВУ, СОДЕРЖАНИЮ ДНК И АКТИВНОСТИ ЭНДОГЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ 78

2.2.1 Оценка сырья по химическому составу и содержанию ДНК 78

2.2.2 Оценка сырья по активности эндогенных ферментов......... 83

2.2.3 Исследование активности дезоксирибонуклеаз в гонадах пресноводных рыб ................................................... 84

2.2.4 Исследование активности протеолитических ферментов в гонадах пресноводных рыб ........................................ 87

2.3 ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА ДНК ИЗ МОЛОК ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО СОСТАВА 90

2.3.1 Получение комплекса ДНК из молок пресноводных рыб 90

2.3.2 Сравнительная характеристика комплексов ДНК из молок пресноводных рыб с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ........................... 95

2.3.3 Фракционный состав комплексов ДНК из гонад различных видов гидробионтов ................................................. 101

2.4 МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ КОМПЛЕКСОВ ДНК ИЗ МОЛОК ПРЕСНОВОДНЫХ РЫБ 106

2.4.1 Пробы на токсичность и безвредность комплексов ДНК из

молок пресноводных рыб ......................................... 106

2.4.2 Исследование анальгетической активности комплексов 110

ДНК из молок пресноводных рыб ................................

ВЫВОДЫ ..........................................................................................................................114

ЛИТЕРАТУРА ..............................................................................................................116

ПРИЛОЖЕНИЕ ............................................................................................................128

Список сокращений

АМФ - аденозин-5-монофосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

АК - акклиматизированный вид

БАВ - биологически активное вещество

Б АД - биологически активная добавка

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГТФ - гуанозин-5-трифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

М.м. - молекулярная масса

НК - нуклеиновые кислоты

НН - нуклеоспермат натрия

НПК - нуклеопротеидный комплекс

РНК - рибонуклеиновая кислота

ЦТФ - цитозин-5-трифосфат

ЭН — эндемик

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В настоящее время достоверно показана биологическая активность нуклеиновых кислот различного происхождения при их применении в качестве лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище, использовании в косметологии и для специального (детского, лечебного, спортивного) питания, а также для получения нуклеотидов, нуклеозидов, пуринов и пиримидинов. Для получения препаратов ДНК используют различные сырьевые источники: ткани животных, микроорганизмы (биомасса дрожжей и непатогенных штаммов кишечной палочки пригодны и для производства ДНК и РНК для фармации), растения (наиболее богаты ДНК и РНК и содержат мало полисахаридов, поли-фенольных соединений и пигментов), трех-, семидневные этиолированные (выращенные в темноте и лишенные хлорофилла) проростки семян [67]. В промышленном масштабе доступны проростки пшеницы (фармацевтическое, косметическое и пищевое сырье) и ячменя (сырье в производстве солода). Для выделения ДНК и РНК для фармации пригодны кровь и мягкие ткани (тимус, печень, мозг, селезенка и др.) сельскохозяйственных животных и молоки промысловых рыб [16].

Установлено, что ДНК из молок лососевых разрешена к применению как биологически активная пищевая добавка и обладает целым рядом лечебно-профилактических свойств: повышает сопротивляемость организма, снижает уровень холестерина в крови, улучшает реологические свойства крови, усиливает репродуктивные функции, является мягким иммунокор-ректором. Среди иммуномодуляторов и противовирусных средств, полученных из молок осетровых, особое место занимают коммерческие препараты «Деринат» и «Ферровир». Они эффективны в отношении целого ряда

ДНК- и РНК-вирусов. С 1995 г. применяют препарат «Нуклеоспермат Натрия» для профилактики и лечения лейкопении при агранулоцитозе - самостоятельно или на фоне цитостатической терапии в онкологии [6].

Основным источником получения низкомолекулярной ДНК являются гонады лососевых, осетровых рыб и кальмаров [15].

ДНК, из вышеперечисленных источников, может быть выделена в высокомолекулярной и низкомолекулярной формах. Применение высокомолекулярной ДНК в качестве БАД ограничено ее слабой растворимостью в воде, низкой биодоступностью, трудоемкой и многостадийной технологии выделения и требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Низкомолекулярная ДНК (молекулярная масса 2-5x105 Да) является значительно более дешевой и доступной для технологического получения, разрешена к применению как биологически активная пищевая добавка и обладает целым рядом лечебно-профилактических свойств, таких как повышение физической и умственной работоспособности, иммуномоделирую-щее, противовирусное, кардиопротекторное и противоопухолевое действия [15]. Например, ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой применяется в кардиологии при лечении ишемической болезни сердца (Патент РФ № 95103961), в онкологии - при профилактике и лечении рака (A.C. 1804852 SU), для профилактики инфекционных заболеваний (Патент РФ № 2063228). Олигонуклеотиды, нуклеозиды и производные тимидина могут использоваться при лечении ВИЧ-инфекции [95].

Молоки пресноводных видов рыб также могут служить источником нуклеиновых кислот. Однако до настоящего времени нет сведений о количественном содержании в них ДНК и ферментов, участвующих в ее деградации. Исследования нуклеолитических ферментов пресноводных видов рыб в основном посвящены изучению ДНК-аз пищеварительных органов и

7

печени [104, 107]. Например, ДНК-аза I, расщепляющая нативную ДНК по двуударному механизму, активируемая ионами Са2+ и была выделена из печени карпа и карася, а кислые дезоксирибонуклеазы - из печени и молок некоторых видов пресноводных и морских рыб [1, 2]. Сведений о про-теолитических и нуклеолитических ферментах молок пресноводных рыб в литературе не обнаружено.

Гидробионты, являющиеся биосырьем, обращают на себя особое внимание. Однако из водного биосырья используется небольшое количество ценнейших соединений. При современном производстве нутриенты гидро-бионтов, обладающие биологической активностью, теряются с отходами. Поскольку их образование при обработке сырья неизбежно, очень важно рационально использовать данные отходы для выпуска разнообразной продукции [98].

Несмотря на большое количество разработок в этой сфере, проблема поиска новых источников сырья остается актуальной. В данной работе проведено исследование содержания нуклеиновых кислот в пресноводных и эндемичных (Эн) видах рыб Байкальского региона. Учитывая положительное воздействие ДНК на организм человека, перспективным считают изыскание дезоксирибонуклеиновой кислоты в пресноводных видах рыб.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование гонад пресноводных видов рыб Байкальского региона на содержание нуклеиновых кислот как перспективного сырья для получения низкомолекулярной ДНК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести анализ содержания нуклеиновых кислот и белков в молоках пресноводных рыб и определить наиболее перспективный источник для получения комплекса ДНК;

- определить активности эндогенных нуклеаз и протеаз в гонадах пресноводных гидробионтов;

- получить низкомолекулярный комплекс ДНК из молок пресноводных рыб и изучить его фракционный состав;

- определить фармакологическую активность и острую токсичность комплексов ДНК из пресноводных рыб.

Научная новизна. Проведены исследования содержания нуклеиновых кислот в молоках 12 видов гидробионтов Байкальского региона, определены в них нуклеазные и протеолитические активности. Получен комплекс ДНК из молок пресноводных рыб. Проведена оценка на острую токсичность комплекса ДНК и ее безвредность. Выявлена фармакологическая активность одного из исследуемого комплекса ДНК.

Практическая значимость. Предложены способы использования гонад пресноводных рыб для получения БАВ и использования их в качестве сырья для БАД.

Разработан проект технической документации по получению комплекса ДНК из молок пресноводных рыб (лабораторный регламент № 1 от 15.11.2011). Получены опытные образцы низкомолекулярной ДНК из молок пресноводных рыб.

Материалы исследований вошли в основу курса лекций для студентов специальности «Биотехнология» по следующим дисциплинам: «Химия БАВ», «Биотехнология лекарственных веществ». Результаты научных исследований внедрены в учебный процесс.

Кроме того, материалы диссертационного исследования способствуют улучшению технологий по использованию отходов переработки рыбного сырья, а также полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований и подготовки обобщающих публикаций по установлению эколого-биохимических особенностей рыб различных районов Байкальского бассейна.

Работа поддержана грантом «Молодые ученые ВСГТУ 2009 - 2010

гг.».

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены и доложены на: Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Молодые ученые Сибири» (Улан-Удэ, 2008); Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); 5 международной научно-практической конференции «Наука на рубеже тысячелетий» (Тамбов, 2008); конференции молодых ученых общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008 и 2009); международной научно-практической конференции «Качество как условие повышения конкурентоспособности и путь к устойчивому развитию» (Улан-Удэ, 2009); ежегодных научных конференциях преподавателей, научных сотрудников и аспирантов ВСГТУ секция «Биотехнология» (Улан-Удэ, 2010), Известия ТИНРО-центра (г Владивосток, 2011), Вестник ПГФА (г. Пермь, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю профессору, доктору биол. наук Цыренову Владимиру Жигжитовичу за консультации и ценные советы; канд. биол. наук Гомбоевой Саяне Владимировне за подробный анализ работы и доброжелательное отношение;

также сотрудникам кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВПО ВСГУТУ; ученым ТИНРО-центра, г. Владивосток, и сотрудникам кафедры «Фармакология» ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, г. Пермь за плодотворное сотрудничество, консультации и ценные советы, способствовавшие совершенствованию работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, двух глав, выводов, заключения и списка использованной литературы, включающего 121 наименования, в том числе и источники иностранных авторов. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 13 таблицами.

и

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гидробионты - сырье для получения биологически активных

веществ

Морепродукты, или гидробионты, сегодня востребованы во многих сферах деятельности человека, накопленный потенциал, включающий результаты фундаментальных и прикладных исследований, актуален для производства на их основе продуктов нового поколения [7].

Биотехнология рассматривает различные части и органы гидробио-нтов в качестве сбалансированного комплекса незаменимых веществ. В отличие от синтезированных биологически активных веществ природный комплекс включает ингредиенты корректирующие действие основных БАВ (антиоксиданты, протекторы, активаторы, модуляторы, синергисты и т.д.), что усиливает суммарный биологический эффект. Отличительной особенностью гидробионтов является генетическое многообразие, уникальный химический состав, высокая жизнестойкость. Рыбы содержат весь комплекс полезных соединений - белки, жиры, углеводы, витамины, ферменты и другие активные вещества, обладают высокой пищевой и биологической ценностью. Внутренние органы гидробионтов богаты катализирующими веществами широкого спектра действия. Из отходов переработки возможно производство высокоэффективных медицинских препаратов, технических продуктов, таких как лецитин, холестерин, жирные кислоты, ДНК, РНК и др. [27].

Важнейшей задачей в развитии рыбоперерабатывающего производства является наиболее полное и глубокое использование природного комплекса функционально значимых нутриентов при утилизация сырья. Особо-

12

го внимания заслуживает направление рационального использования отходов рыб, для чего необходима их классификация, учитывающая особенности их химического состава, обусловливающие способы и сроки хранения их до обработки, возможности использования в выпуске той или иной продукции. По направлениям использования отходы рыбной промышленности могут быть подразделены на: отходы пищевые (головы, плавники с прирезями мяса, крошка и лом при производстве рыб горячего копчения, печень, сердце, икра, молоки), которые могут быть использованы для приготовления консервной продукции, бульонов, наваров и т. д.; непищевые отходы -идущие непосредственно на корм пушным зверям или направляемые на производство различного рода кормовых продуктов (кости, чешуя); специального назначения - предназначенные для получения биологически активных веществ (ганглии кальмара, внутренности лососевых, ламинарии, варочные воды трепангов) [3].

В ряде зарубежных стран (Болгария, Великобритания) рыбные головы используют для получения кормового рыбного силоса. Рыбный силос представляет собой частично гидролизованное химическим способом рыбное сырье. Он может быть использован для кормления свиней, крупного рогатого скота, норок как ценный источник белка [31]. Плавники рыбы составляют от 1,5 до 4,0 % ее массы. По химическому составу они близки к костям. Белковые вещества плавников представлены коллагеном или оссеином. Из плавников можно приготовлять заливки для консервов, но в настоящее время они вместе с костями и другими отходами используются для выработки кормовой муки. Чешуя рыб составляет от 1,0 до 10,0 % массы тела рыбы. Она является пригодным сырьем для комплексной переработки. Из нее получают гуанин, который является ценным сырьем для производства жемчужного пата (искусственного жемчуга). После отделения гуанина чешуя

может использоваться для получения клея, а вываренный остаток - для производства кормовой муки [3].

Содержание гуанина в чешуе сравнительно невысокое - 0,06-0,3 % массы чешуи. В белковых веществах чешуи содержится 80 % коллагена. Кожа составляет 2-7 % общей массы рыбы. Кожа некоторых рыб может быть использована как кожевенное сырье, а покров тресковых используется для производства ценного клея [3]. Плавательный пузырь составляет обычно не более 1 % (у осетровых 0,6 - 0,8 %). Его ценность предопределяется содержанием глютина - клейдающего вещества, образующегося при тепловой обработке коллагена. Плавательный пузырь многих видов рыб является ценным сырьем для получения высококачественного клея. Кожа, плавники, плавательные пузыри, чешуя рыб являются хорошим сырьем для получения рыбного клея. Рыбный клей из отходов выпускаю