Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фолдинг, стабильность и активность рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента и моноклональных антител к ферритину

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фолдинг, стабильность и активность рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента и моноклональных антител к ферритину"

о

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ БИООРГЛНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

УДК 577.322.7 + 577.27

РГб од

- 5 МДР 2300

ЧУМАНЕВИЧ Александр Александрович

Фолдинг, стабильность и активность рекомбинантного одноцепочечного Ру фрагмента и моноклональиых антител к ферритину

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Минск - 2000

Работа выполнена в Институте биоорганической химии HAU Беларуси

Научный руководитель: кандидат химических наук,

ведущий научный сотрудник И BOX НАНБ Марцев С.П.

доктор химических наук, главный научный сотрудник ИБОХ НАНБ Свиридов О.В.

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры биохимии Белорусского государственного университета Курченко В.П.

Оппонирующая организация: Международный экологический университет

им. А.Д. Сахарова

Защита состоится "_2_" марта 2000 г. в часов на заседании

совета по защите диссертаций Д.01.21.01 в Институте биоорганической химии HAH Беларуси по адресу: 220141 г. Минск, ул. акад. Купревича, 5/2, тел.: 26485-53.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии HAH Беларуси.

Автореферат разослан " " февраля 2000 г.

Ученый секретарь Совета по защите диссертаций кандидат химических наук

Официальные оппоненты:

Н.М. Литвин ко

ВОЧЧ.М, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Одной нз основных задач звременной структурной биологии является исследование принципов и еханизмов белкового фолдинга, т.е. сил, стабилизирующих уникальную ативную структуру белка, способную к выполнению биологических функций.

Согласно общепринятой на сегодняшний день точке зрения на процесс глкового фолдинга, конформационный переход белка из полностью гнатурированного (развернутого) в натишгое (компактное) состояние гуществляется, как правило, последовательно через набор промежуточных но гепени структурной упорядоченности коиформаций (интермедиатов олдинга). Интермедиаты фолдинга в настоящее время обнаружены для олыпинства исследованных белков, включая простые однодоменные оиструкции. Таким образом, выяснение механизмов белкового фолдинга годится к установлению набора интермедиатов и их характеристике, прежде зего определению их стабильности и динамики переходов между груктурными состояниями. При этом основополагающей характеристикой груктурных состояний является их термодинамическая стабильность, пределенная в терминах энергетических параметров перехода между ^стояниями (энтальпия денатурации или свободная энергия стабилизации).

Основными объектами для изучения фолдинга в настоящее время вляются одно- и двухдоменные белки. Иммуноглобулины, или антитела, грающие основную роль в системе гуморального иммунитета, среди риродных белковых структур являются одними из наиболее сложно рганизованных молекул. Первостепенная роль антител в обеспечении ммунной защиты организма обуславливает актуальность и масштабность груктурно-функциональных исследований иммуноглобулинов. Однако на ггодняшний день еще больший интерес к проблеме обусловлен широким пектром практического использования антител в иммуноферментном и адиоиммунном анализах, для цитотоксической иммунотерапии и ммуковнзуализации раковых опухолей.

Для такой сложной молекулы как иммуноглобулины получение счерпывающих характеристик фолдинга невозможно без анализа двух групп кспериментальных объектов - "полноразмерных" иммуноглобулинов и екомбинаптных "укороченных" антител со сниженным числом доменов.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа была выполнена в лаборатории химии белка [нститута биоорганической химии ПАН Беларуси. Часть исследований была ыполнена в рамках темы "Исследование принципов формирования, габилизации и активации природных и рекомбинантных антител для создания а их основе новых средств иммунодиагностики и иммунотерапии", ыполняемой в период с 1996 - 2000 гг. в соответствии с Государственной рограммой фундаментальных исследований п области биологических наук Органический синтез, структура и функция биополимеров и

низкомолекулярных биорегуляторов" (№ госрегистрации 19961101). Кроки этого, частично исследования проведены в рамках следующих научно исследовательских программ Фонда фундаментальных исследовзтп Республики Беларусь: "Принципы стабилизации молекулы, динамикг структурных состояний и функциональная активность иммуноглобулинов v рекомбинантных антител" (проект Б95-211), № госрегистрации 19961092: "Новый класс химерных лммуногокснноо - энзимо-иммунотоксины экспрессия, стабильность и активность" (проект Б98-221), № госрегистрацш 19992578; "Рекомбинантный VL домен моноклонального иммуноглобулинг IgG2a: экспрессия, очистка и структурно-функциональное исследование' (проект Б98М-080), № госрегистрации 19992576; программы Министерства здравоохранения: "Изучить структурные изменения иммуноглобулинов G с помощью разработанных новых тест-систем на основе белка А у детей с онкогематологическими заболеваниями", № госрегистрации 19982881.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования состоит в установлении корреляции между конформацией, стабильностью и активностью моноклональных антител в сравнении с рекомбинантным укороченным аналогом - одноцепочечным Fv фрагментом - комбинацией структурно-физического и функционального подходов. В соответствии с этим в настоящей работе ставились следующие задачи: 1) исследование термодинамической стабильности моноклональных антител субклассов IgGl и IgG2a в широком диапазоне концентраций денатурантов, рН и температур; 2) полифункциональный анализ моноклональных антител для характеристики взаимодействия пространственно разобщенных структурных элементов молекулы иммуноглобулинов; 3) разработка эффективного метода экспрессии, очистки и фолдянга рекомбинантного одноцепочечного scFv фрагмента моноклонального антитела F11 (субкласс IgG2a) в растворимом и активном виде; 4) исследование термодинамической стабильности рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования являлись три мышиных моноклональных антитела двух субклассов, IgGl и IgG2a, и двухдоменный рекомбинантный scFv фрагмент моноклонального антитела субкласса IgG2a, экспрессированный в клетках Escherichia соЧ. Моноклональные антитела несут идиотипические различия (по строению антигенсвязывающего центра в вариабельных доменах) и изотипические (по строению константных доменов тяжелой цепи). Основным предметом исследования стали промежуточные по степени упорядоченности молекулы структурные состояния белков.

Гипотеза. Анализ литературных данных и предшествующих результатов лаборатории позволил предположить, что: 1) существуют стабильные п реальном времени промежуточные структурные состояния иммуноглобулинов, не описанные ранее и потому представляющие интерес с точки зрения механизмов фолдинга и функционирования иммуноглобулинов в процессе их практического применения; 2) рекомбинантные одноцепочечные Fv фрагменты

в принципе могут обладать конформационными свойствами, отличными от нативных иммуноглобулинов.

Методология II методы проведенного исследования. Целенаправленное получение и изучение различных конформационных состояний и структурных вариантов иммуноглобулинов комбинацией структурно-физического и функционального подходов представляет основной методологический подход. Использованная комбинация методов включала дифференциальную сканирующую калориметрию, круговой дихроизм и флуоресцентную спектроскопию для анализа вторичной и третичной структуры, а также иммунохимический анализ для определения функциональной активности и характера взаимодействия активных центров исследованных молекул.

Научная повнзна и значимость полученных результатов. Практически Rce полученные в рамках настоящей работы результаты, включая экспериментальные данные и сделанные на их основе заключения, отвечают требованиям новизны.

Впервые получен весь значимый набор термодинамических параметров, описывающих конформационную стабильность "полноразмерных" моноклоналышх антител и рекомбинаптного одноцепочечного Fv фрагмента в широком диапазоне рН, стабилизирующих различные структурные состояния. Установлена общая схема фолдингатрех иммуноглобулинов субклассов IgGl и IgG2a мыши, включающая между нативным (N) и полностью развернутым (U) состояниями, в порядке снижения структурной организации, декооперированные N^i и NA2 состояния, частично развернутое I-состояние, а также "альтернативно свернутое" А-состояние.

На примере взаимодействия иммуноглобулинов субкласса JgG2a мыши с белком А из Staphylococcus aureus впервые обнаружено, что аффинность связывания белка А как функционального аналога Fcy-рецепторов иммуноглобулинов может изменяться в зависимости от индивидуальных структурных особенностей вариабельных доменов иммуноглобулинов. Показано, что особенности строения гинервариабельных участков антител способны оказывать влияние на термодинамическую стабильность иммуноглобулинов одного субкласса и осуществлять тонкую "подстройку" механизмов взаимодействия пространственно разобщенных функциональных центров иммуноглобулинов.

Разработан высокоэффективный метод экспрессии, очистки и рефолдинга рекомбинаптного одноцепочечного Fv фрагмента в растворимой форме из бактериальных тел включения. Метод основан на оптимизации условий экспрессии целевого белка с высоким удельным содержанием в телах включения, а также протокола очистки в денатуранте и рефолдинга. Применение контролируемого ступенчатого диализа очищенного рекомбинаптного белка позволило добиться близкого к 100% выхода рефолдинга рекомбинаптного Fv фрагмента в высокой концентрации.

Впервые на примере рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента

показана функциональная активность промежуточного структурного состояния белка, подобного "расплавленной" глобуле. Такие промежуточные конформации традиционно относились к группе компактных денатурированных состояний. Установлено, что конформация функционально активного зсру фрагмента при физиологических условиях характеризуется значительно измененной вторичной и дестабилизированной третичной структурой. Этот результат представляет собой новые данные о механизмах фолдинга и стабилизации молекулы эсРу фрагментов иммуноглобулинов и полиглобулярных белков в целом.

Практическая и социальная значимость полученных результатов. Полученные в настоящей работе экспериментальные данные о конформационном состоянии и динамике фолдинга моноклональных антител имеют прямое отношение к ряду физиологических процессов. Такими процессами являются, например, транслокация иммуноглобулинов через клеточные мембраны, направляемая конформационными переходами в условиях снижения рН внутри и вне клетки, а также взаимодействие с клеточными рецепторами. Кроме того, наши данные позволяют предложить адекватные модели поведения иммуноглобулинов во многих современных иммунобиотехнологических процессах (например, широко применяемые аффинные хроматографии на стафилококковых белках А и в, на иммобилизованном антигене, а также методы модификации антител). В соответствии с этим, результаты работы могут быть использованы для модификации существующих и разработки новых усовершенствованных методов получения иммуноглобулинов и их структурных аналогов для практического использования в иммунодиагностике и иммунотерапии. Социальная значимость представленного исследования определяется, прежде всего, возможностью конструирования и использования улучшенных иммунотерапевтических и диагностических агентов нового поколения на основе рекомбинантного одноцепочечного Бу фрагмента, высокоэффективный метод получения которого разработан в рамках представленного исследования.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Характеристика рН-индуцироваиных конформационных переходов моноклональных антител субклассов ^01 и ^02а с помощью комбинации термодинамического и спектроскопических подходов, что позволило установить общую схему фолдинга, включающую, по меньшей мере, четыре макроскопических состояния, промежуточных по степени структурной организации между нативным (И) и полностью развернутым (и) состояниями.

2. Выявление особенностей связывания белка А стафилококка с двумя моноклональными антителами одного субкласса 1цв2а мыши, находящихся в комплексе с антигеном, позволило установить, что аффинность связывания белка А как функционального аналога Рсу-рецепторов иммуноглобулинов может изменяться в зависимости от индивидуальных структурных особенностей антител, которые локализованы в гипервариабельных участках

штигенсвязывающего центра.

3. Установление (информационных характеристик рекомбинантного эдноцепочечного Fv фрагмента (scFv) с помощью дифференциальной :канирующей калориметрии, КД и флуоресцентной спектроскопии позволило показать, что scFv фрагмент при физиологических условиях обладает свойствами частично структурированного состояния, характерного для зелковых структур в условиях неполной денатурации, однако обладает функциональной активностью.

4. Оптимизация условий экспрессии, очистки, рефолдинга и применение контролируемого диализа для разработки высокоэффективного метода получения рекомбинантного Fv фрагмента моноклонального антитела F11 (субкласс JgG2a мыши) в растворимом и активном виде, обеспечивает близкий к 100% выход рефолдинга рекомбинантного белка.

Личный вклад соискателя. Все исследования, связанные с физико-химическими структурными исследованиями фолдинга и стабильности моноклопальных антител к ферритину и рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента, их термодинамическим анализом, разработкой аналитических систем и проведением функционального анализа объектов исследования с помощью конформационных "зондов", выполнены автором самостоятельно. При проведении калориметрических исследований соискатель пользовался консультациями к.б.н. А.П. Власова. Плазмида, несущая геи рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента предоставлена к.х.н. И.А. Беспаловым и д.б.н. С.М. Деевым (последний - ИМБ РАН, Москва), а плазмида с геном V(, домена получена к.х.н. С.П. Марцевым и докторами А. Коцци и П. Арозио (Институт Сан-Рафаэле, Милан). Полистирольные шарики с активированными фенальдегидными группами предоставлены В.В. Шманаем, ИФОХ НАНБ. Экспрессия, очистка и рефолдинг изолированного Vl домена осуществлены к.х.н. С.П. Марцевым, к.х.н. З.И. Кравчук и аспирантом А.П. Дубновицким, секвенирование очищенного рекомбинантного Fv фрагмента проведено в ИБХ им. М.М. Шемякина н Ю.А. Овчинникова РАН, Москва. На стадиях планирования работы и критического обсуждения полученных результатов соискатель пользовался консультационной помощью к.х.н., в.н.с. ИБОХ НАНБ С.П. Марцева.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертационной работы были представлены на II Европейском симпозиуме Protein Society ¡Cambridge, 1997), на 17-ом Международном Конгрессе биохимиков и молекулярных биологов (San Francisco, 1997), на международной конференции "Protein structure, stability and folding: fundamental and medical aspects (Moscow, 1998), на II и III съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1996, 1998). Результаты диссертации неоднократно обсуждались на заседаниях лаборатории химии белка ИБОХ HAH Беларуси.

Онубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 статьи и тезисы 6 докладов. Общий объем опубликованных материалов составляет 32 страницы.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы. В главе 1 приводится обзор литературных данных о структурно-функциональных исследованиях рекомбинантных одноцепочечных Гу фрагментов и "полноразмерных" иммуноглобулинов; обзор содержит анализ методов изучения стабильности белков, данные о стабильности одноцепочечных ру фрагментов и 1цО. В главе 2 представлены результаты исследований, в главе 3 - обсуждение полученных результатов, а в главе 4 -экспериментальные методы. Работа изложена на 119 страницах рукописного текста, содержит 30 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 184 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фолдииг, стабильность и функциональная активность моноклональных

антител к ферритииу

Для изучения фолдинга "полноразмерных" природных иммуноглобулинов (рис. 1) проводили рН-индуцированное разворачивание моноклональных антител (мАт) субклассов и ^(}2а мыши в условиях снижения рН от 7 до 2. Согласно существующему на сегодняшний день общему подходу к исследованию механизмов фолдинга белков, эти же превращения молекулы, "прочтенные" в обратном порядке, отражают последовательные стадии фолдинга иммуноглобулинов. Изменения третичной структуры анализировали с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), которая является наиболее мощным из современных инструментов исследования структурной организации белков в растворе, поскольку позволяет непосредственно измерить как теплоемкость, так и теплоту, и температуру термодинамических переходов. Кроме того, конформационные переходы мАт при различных значениях рН были дополнительно охарактеризованы методами кругового дихроизма (КД) и флуоресценции. Спектры КД позволяют охарактеризовать вторичную структуру (для иммуноглобулинов характерно наличие максимума молярной эллиптичности при 217-218 нм) и оценить компактность третичной структуры (по наличию отрицательного максимума при 280 нм).

При снижении рН калориметрическое исследование мАт показало последовательную дестабилизацию и декооперацию молекул, что привело к формированию ряда термодинамически стабильных промежуточных состояний, характеризующихся постепенным снижением стабильности структуры и ослаблением взаимодействия между доменами (рис. 2, 3). Два

состояния мАт, обозначаемые как ЫЛ| (при рН 5) и Н\г (при рН 3,5), характеризуются преимущественно энтальпшшой дестабилизацией. При этом инициатором конформационных переходов в молекуле выступают

наименее стабильные структуры, к которым относятся зоны междоменных контактов, прежде всего включающие Сц2 домен, а в молекуле 1ц02а -наиболее термостабильные структуры. Данные КД-спектроскопии (рис. 4) и флуоресценции АНС (Я-аиилияопафглл-1 -сульфокислота) (рис. 5) обнаруживают отсутствие значительных изменений третичной и вторичной структуры мАт в этих состояниях. Состояние Ыл2 отличается от Мд| большим (10-20 °С) снижением температуры полуперехода и более глубокой декооперацией мультидоменной структуры, что выражается в заметном экспонировании междоменных гидрофобных остатков в растворитель (по данным связывания АНС) у трех изученных моноклональных антител двух различных субклассов. Следует отметить, что АНС является общепринятым гидрофобным "зондом" для идентификации частично структурированных конформационных состояний белков, а также междоменных гидрофобных участков: он не связывается ни с полностью свернутыми нативными, ни с денатурированными (развернутыми) состояниями. В то же время, АНС активно связывается с частично структурированными промежуточными состояниями белков.

При дальнейшем снижении рН до 3 происходит разворачивание наименее, стабильных доменов (у субкласса 1ц01 - Сц2 домена) при сохранении компактной структуры остальной части молекулы. Согласно данным КД и флуоресценции АНС при этом формируется промежуточное структурное I-состояние. Энтальпия денатурации в 1-состоянии приблизительно в 3 - 5 раз меньше, чем в физиологических условиях, и находится в диапазоне 1,8 - 2,3 кал/г (рис 3). Тем не менее, рассчитанное значение свободной энергии стабилизации в 20 - 50 раз превышает энергию теплового движения и достаточно для стабильного существования этого состояния. В значительной мере дестабилизированное 1-состояиие иммуноглобулинов характеризуется разрушением третичной структуры наименее стабильных структурных блоков (доменов) при сохранении третичной структуры более стабильных кооперативных блоков и видоизмененной, но близкой к нативной вторичной структурой.

Дальнейшее снижение рН до 2 индуцирует конформационный переход всей молекулы трех исследованных мАт в состояние, подобное "расплавленной глобуле", что сопровождается образованием "альтернативно свернутой" компактной структуры (А-состояние). Для этого состояния характерно наличие двух "калориметрических" доменов с аномально высокой термостабильностью (см. рис. 2), благодаря взаимодействию между доменами, находящимися в конформации подобной "расплавленной" глобуле. В этом диапазоне рН амплитуды спектров КД в дальней ультрафиолетовой области увеличиваются, а в ближней уменьшаются приблизительно в два раза (см. рис. 4).

РаЬ

всБу

V,.

V,,

Лмикериый пептид

Рис, 1. Общая схема строения иммуноглобулина в V

рекомбинаптного одноцепочечного Г\ фрагмента (бсЯу).

о

X 0) 3" о

Е

о с о

с; с

05

ь

рН 3,5

20 40 60 80

Температура, °С

а2

8

7 6

• 5 Ц

Ш 4

хГ 3

<1

2 1 0

-

Р11 о

• /О ею ©

С5 □

% « •

2 3 4 5 6 7

рн

Рис. 3. Зависимость удельной энтальпии (ЛИ) денатурации моноклональных антител Р11, в10 (оба - субкласс !д62а) и С5 (субкласс 1дС1) от рН.

100

Рис. 2. Температурная зависимость теплоемкости моноклонального антитела Р11 (субкласс 1д62а) при различных значениях рН. Сплошная линия - экспериментальная кривая, пунктирная линия - результат деконволюции.

1 -F11, рН 7

2 - F11, рН 3

3 - F11, рН 2

4 - scFv, рН 7

Ф 80

X

о

60

К s

zr Ân х 40 о =r о

g. 20

О >»

с;

е

о

7/л • F11 " scFv

/ 6 • К

J/ 4

, Л? ,

200 210 220 230 240 250 X, нм

Рис. 4

400 450 500 550 600 Л,, нм

Рис. 5

Рис. 4. Спектры кругового дихроизма моноклонального антитела FJ1 (IgG2a) и рекомбинантного фрагмента scFv(Fll) в дальней и ближней (на вставке) ультрафиолетовой областях при различных значениях рН.

Рис. 5. Спектры флуоресценции АНС в присутствии моноклонального антитела Fil (IgG2a) или scFv фрагмента при различных значениях рН: 1, 6 -рН 7; 2 - рН 5; 3 - 7 M гуанидингидрохлорид, рН 7; 4 - рН 3,5; 5 - рН 3; 7 - рН 2.

Интенсивность флуоресценции АНС возрастает в 10 - 15 раз по сравнению с нативным состоянием мАт и в 2 - 3 раза по сравнению с частично развернутым 1-состояиием белков при рН 3 (см. рис. 5). Такая повышенная доступность гидрофобных участков молекулы белка к связыванию с АНС подтверждает данные калориметрии и КД, свидетельствующие о том, что частично развернутые структурные участки антител находятся в состоянии, напоминающем "расплавленную" глобулу.

Описанные состояния характерны для трех исследованных нами иммуноглобулинов двух субклассов мыши, 1^01 и ^02а, и в силу этого могут считаться общими закономерностями фолдинга для этого класса белков. Индивидуальные особенности фолдинга мАт связаны, прежде всего, с разной стабильностью нативного состояния белков (см. рис. 3), следствием чего является различное число выявляемых "калориметрических доменов", а также с различиями в рН-стабильности междоменпых контактов и во взаимодействии доменов. Различия в стабильности исходного состояния и междоменных контактов приводят к разной динамике перехода между структурными состояниями при сохранении общей схемы фолдинга.

Другим результатом особенностей структуры мАт и особенностей междомеиной кооперации является изменение функциональной взаимосвязи центров узнавания биоспецифических лигандов и функциональных последствий такого узнавания, как это показано для моноклональных антител Fl 1 и G10. Мы установили, что аффинность связывания белка А с комплексом антиген-мАт увеличивается для мАт G10 и уменьшается для антитела Fl 1 (рис. 6). При этом оба антитела относятся к одному субклассу и имеют близкие аффинности связывания антигена и идентичную аффинность связывания белке А. Таким образом, данная работа является первым экспериментальным свидетельством того, что функционально значимые взаимодействия межд> удаленными функциональными центрами молекулы антител с одним и тем же изотипом тяжелой цепи могут модулироваться относительно небольшими структурными вариациями, возможно, в гипервариабельных участках, связанными с различной стабильностью. Эти результаты, вероятно, свидетельствуют о тонкой "подстройке" механизмов взаимодействия пространственно разобщенных функциональных центров иммуноглобулинов.

Таким образом, в данной части работы исследованы термодинамическая стабильность доменов и доменных блоков IgG, закономерности переходов между структурными состояниями и функциональная активность в реакции взаимодействия с биоспецифическими лигандами. Полученные результаты позволили предложить модель фолдинга иммуноглобулинов, включающую описанные выше состояния, формируемые в следующей последовательности:

N-» Nai -> NA2 -»■ I ->...-» А ->...-> U,

с наибольшей детализацией его поздних этапов, а также описать новые механизмы регуляции стабильности и функциональной активности молекулы антител, значимые в условиях in vivo.

Фолдинг, стабильность н функциональная активность рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента

Как и для всякого мультидоменного белка, стабильность структурного состояния и функциональные свойства иммуноглобулинов определяются двумя факторами: степенью упорядоченности структуры индивидуальных доменов и характером их взаимодействия. Относительный вклад этих факторов определяет индивидуальные особенности фолдинга различных белков и варьирует в широких пределах - от 1) значительной стабилизации доменов за счет их контакта до 2) дестабилизации доменов при таком контакте либо 3) полной автономии фолдинга невзаимодействующих доменов. Нами проведены исследования фолдинга, стабильности и активности рекомбинантного двухдоменного фрагмента (антитела) scFv(Fll), в котором два домена, формирующих единый антигенсвязывающий центр, соединены между собой

Рис. 6. Функциональная активность моиоклональных антител G10 и F11 субкласса IgG2a мыши: аффинность связывания антигена (Аг), белка А (БАС) и белка А комплексом Ат-Ат (А) и соотношение констант аффинности (Б).

линкером из 15 аминокислот (см. рис. 1). Для этого был разработан высокоэффективный метод экспрессии, очистки и рефолдинга рекомбинантного фрагмента scFv. Экспрессия гена scFv фрагмента в клетках Е. coli, штамм DE3pLysS, приводит к накоплению рекомбинантного scFv фрагмента в нерастворимом виде в бактериальных телах включения. Метод очистки заключался в солюбилизации тел включения гуанидингидрохлоридом и проведении очистки на DEAE-целлюлозе в мочевине (для отделения мешающих рефолдингу примесных белков, нуклеиновых кислот и непроцессированпого белка-предшественика одноцепочечного Fv фрагмента). На заключительной стадии рефолдинга нами был применен контролируемый ступенчатый диализ, что позволило добиться близкого к 100% выхода рефолдинга очищенного белка в высокой концентрации (0,3 - 0,7 мг/мл).

При калориметрическом исследовании рекомбинантного Fv фрагмента при pH 7 на термограмме отсутствует выраженный пик теплоемкости (рис. 7). Вместо этого выявляется широкий низкокооперативный необратимый переход с низкой энтальпией - около 1,1 ±0,2 кал/г. Такое низкое значение удельной энтальпии не характерно для нативного состояния белков. В диапазоне температур, предшествующих конформационному переходу, значение удельной теплоемкости рекомбинантного scFv фрагмента было промежуточным: оно превышало значение теплоемкости "родительского" антитела F11 и изолированного "Vi домена того же антитела F11, однако не

Температура, °С

Рис. 7. Температурная зависимость теплоемкости рекомбинантного фрагмента 5сР>(Р1 1) (3) в сравнении с изолированным Уь доменом (2) и "родительским" мопоклональным антителом Р11 при рН 7. 4 - теплоемкость рекомбинантного фрагмента есТЧ'(['1 1) в развернутом (и) состоянии (теоретический расчет). 5 - результат повторного нагревания 5сРу(Р11) после предварительного охлаждения образца.

достигало значения теплоемкости, полученного для денатурированного состояния эсру, как следует из повторного сканирования рекомбинантного белка во всем диапазоне температур после охлаждения образца (см. рис. 7). Эги результаты свидетельствуют о том, что гидрофобные аминокислотные остатки в составе рекомбинантного белка частично экспонированы в растворитель. Интересно, что температура полуперехода, Тт, рекомбинантного бсРу фрагмента оказалась неожиданно высокой (около 60 °С). В сумме калориметрические данные свидетельствуют о частично структурированном состояний всБу фрагмента. Следует отметить, что сочетание низкой величины ДЬ и высокой Тт, характерно для так называемого "альтернативно свернутого состояния" (А-состояние), относящегося к группе компактных денатурированных конформаций.

Термодинамические данные, свидетельствующие о частично структурированном состоянии scFv фрагмента, полностью согласуются со спектроскопическими исследованиями. Вторичная структура двухдоменного антитела scFv согласно данным спектров КД в дальней ультрафиолетовой области представляет собой в значительной степени разупорядоченный р-складчатый слой и напоминает вторичную структуру частично структурированного А-состояния "родительского" моноклонального антитела Fl 1 при рН 2 (см. рис. 4).

Отличительной особенностью полученного нами рекомбинантного scFv фрагмента является его ярко выраженная способность, в отличие от "родительского" моноклонального антитела F11, связывать гидрофобный "зонд" АНС при физиологических условиях (см. рис. 5). Связывание белка с АНС подтверждает данные о неполном фолдинге фрагмента scFv(Fll) и свидетельствует о флуктуирующей третичной структуре, что позволяет АНС достигать гидрофобного ядра молекулы, которое недоступно в нативном состоянии или отсутствует в развернутом состоянии. Подобное увеличение связывания с АНС мы наблюдали также для А-состояния "родительского" моноклонального антитела F11 при рН 2.

Еще одним подтверждением частично структурированного конформационного состояния рекомбинантного scFv фрагмента при физиологических условиях являются данные исследования собственной флуоресценции одноцепочечного Fv фрагмента в денатуранте (рис. 8), позволившие выявить пространственное разобщение ароматических флуорофоров и внутренних "тушителей" флуоресценции. Наряду с этим, утрата асимметрического окружения ароматических флуорофоров, обнаруженная с помощью КД спектров в ближней ультрафиолетовой области, является дополнительным подтверждением частичной потери и реорганизации третичных взаимодействий в молекуле scFv (см. рис. 4).

Таким образом, на основании комплекса спектроскопических и калориметрических данных следует сделать вывод о том, что рекомбинантный одиоцепочечный Fv фрагмент обладает физико-химическими свойствами, характерными для белковых структур в частично структурированном, или промежуточном, состоянии. Достаточно компактная пространственная структура двухдоменного scFv фрагмента обнаруживает частичную потерю третичных взаимодействий, следствием чего является частичное экспонирование растворителю гидрофобных аминокислотных остатков, скрытых в нативном белке.

Обладая частично структурированной конформацией, Fv фрагмент, тем не менее, неожиданно оказался способным связывать антиген. Константа аффинности (Ка) связывания антигена (ферритина) рекомбинантным фрагментом scFv, определенная методом радиоиммунологического анализа РИА) с использованием [1251]ферритлна, оказалась лишь в 8 раз ниже, чем Ка 'родительского" мАт Fl 1: Ка = 5,1 • 108 М"1 и Ка = 4,3 • 109 М"1, соответственно

320 340 360 380 400

X, НМ

Рис. 8. Спектры собственной флуоресценции рекомбинангного ясРу фрагмента и "родительского" моноклонального антитела Б11 при рН 7. Длина волны возбуждения - 278 нм.

для бсРу и Р11. Стехиометрия активных антигенсвязывающих центров, для различных препаратов бсРу находилась в диапазоне от 0,93 - 0,98, что свидетельствует о незначительном количестве неактивного белка в препаратах бсРу фрагмента, очищенного до гомогенного состояния.

Альтернативным объяснением уникального сочетания функциональной активности веру, а также калориметрических и спектроскопических свойств, присущих промежуточному состоянию белка, может быть структурная гетерогенность исследуемых препаратов зеру за счет присутствия активной "правильно" свернутой и "неправильно" свернутой неактивной форм белка. Однако эта гипотеза не нашла своего экспериментального подтверждения, прежде всего, учитывая стехиометрию активных антигенсвязывающих центров, а также хроматографические и электрофоретические данные.

Таким образом, полученный нами рекомбинантный одноцепочечный Ру фрагмент на сегодняшний день является первым примером белка, который при физиологических условиях демонстрирует уникальное сочетание частично структурированной конформации и функциональной активности. В современной литературе отсутствует упоминание о наличии функциональной активности у белковых структур, обладающих частично упорядоченной конформацией.

Заключение

1. На примере рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента впервые обнаружена функциональная активность промежуточного структурного состояния белка, которое традиционно относилось к группе компактных денатурированных состояний [3, 6-9]. Комбинацией дифференциальной сканирующей калориметрии, КД и флуоресцентной спектроскопии показано, что рекомбинантный одноцепочечный Fv фрагмент антитела F11 при физиологических условиях обладает свойствами частично структурированного состояния, характерного для белковых структур в условиях неполной денатурации, со значительно разупорядоченной вторичной и дестабилизированной третичной структурой [3, 7,9].

2. Разработан высокоэффективный метод экспрессии, очистки и рефолдинга рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента в растворимой форме из бактериальных тел включения [3, 6, 7, 9]. Метод включает оптимизированную схему экспрессии и очистки рекомбинантного белка в денатуранте с последующим рефолдингом с помощью контролируемого ступенчатого диализа. Разработанный метод обеспечивает близкий к 100% выход рефолдинга рекомбинантного Fv фрагмента [3].

3. Установлена общая схема фолдинга моиоклональных иммуноглобулинов субклассов IgG2a и IgGl, включающая между нативным (N) и полностью развернутым (U) состояниями, по меньшей мере, 4 состояния, промежуточных по степени структурной организации: декооперированные Nai и Na2 состояния, частично развернутое I-состояние, а также "альтернативно свернутое" А-состояние [4, 5]. С помощью калориметрического и спектроскопического подходов определены параметры стабильности этих промежуточных состояний.

4. На примере взаимодействия двух антител субкласса IgG2a с антигеном и белком А из Staphylococcus aureus впервые показано, что аффинность связывания белка А как функционального аналога Fcy-рецепторов иммуноглобулинов можег изменяться в зависимости от индивидуальных структурных особенностей антител [1, 2, 4]. Эти особенности связаны с гипервариабельными участками антигенсвязывающего центра и в случае антител G10 и Fl 1 приводят к различиям в термодинамической стабильности и в механизме взаимодействия вариабельных и константных доменов [1,2, 5]. Различие во взаимодействии доменов проявляется в экспериментально показанном увеличении аффинности белок А-связывагощего центра антитела G10 и снижении аффинности аналогичного центра антитела F11 после связывания ферритина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Kravchuk Z.I., Chumanevich А.А., Vlasov А.Р., Martsev S.P. Two high-affinity monoclonal IgG2a antibodies with differing thermodynamic stability demonstrate distinct antigen-induced changes in protein A-binding affinity // J. Immunol. Meth. - 1998. - Vol. 217, № 1-2. - P. 131-141.

2. Чуманевич A.A., Кравчук З.И., Власов А.П., Жоров О.В., Марцев СЛ. Термодинамическая стабильность иммуноглобулинов и аллостерические взаимодействия с ферритином и белком А: различие двух моноклональных антител субкласса IgG2a // Биохимия. - 1998. - Т. 63, № 4. - С. 563-572.

3. Martsev S.P., Kravchuk Z.I., Chumanevich А.А., Vlasov A.P., Dubnovitsky A.P., Bespalov I.A., Arosio P., Deyev S.M. Single-chain anti-ferritin antibody: functional active protein with incomplete folding? // FEBS Lett. - 1998. - Vol. 441, № 3. - P. 458-462.

Тезисы докладов

4. Чуманевич A.A., Власов А.П., Кравчук З.И., Марцев С.П. Стабильность и функциональная активность моноклональных иммуноглобулинов: роль структуры доменов и междоменных участков // II Симпозиум Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл., Минск, 25-27 июня 1996 г. -С. 139.

5. Martsev S.P., Vlasov А.Р., Kravchuk Z.I., Chumanevich A.A. Folding intermediates of immunoglobulins // Second European symposium, 12-16 April, 1997, Cambridge, England, Protein Science: Abstr. - Vol. 6, № 1. - P. 74.

6. Martsev S.P., Kravchuk Z.I., Chumanevich A.A., Vlasov A.P., Komeva I.N., Deyev S.M. Single-chain antibody against human ferritin: purification, refolding, and stability studies И 17lh International Congress of Biochemistry and Molecular Biology: Abstr., San Francisco, August 24-29, 1997. - P. A904.

7. Martsev S.P., Vlasov A.P., Kravchuk Z.I., Chumanevich A.A., Dubnovitsky A.P., Paskhin A.I., Deyev S.M., Cozzi A., Arosio P. Folding and stability of recombinant single- and two-domain antibodies: spectroscopic and calorimetric study // Protein structure, stability and folding: biomedical aspects: Abstr., Moscow, Russia, June 21-27 1998. - P. 69.

8. Власов А.П., Кравчук З.И., Чуманевич A.A., Дубновицкий А.П., Деев С.М., Пасхин А.И., Коцци А., Арозио А., Марцев С.П. Фолдинг и стабильность рекомбинантных одно- и двухцепочечных антител: спектроскопическое и калориметрическое исследование // III Симпозиум Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл., Минск, 21-23 октября 1998 г. - С. 94.

9. Чуманевич А.А., Кравчук З.И., Власов А.П., Деев С.М., Пасхин А.П., Марцев С.П. Рекомбинантное одноцепочечное антитело к ферритину: очистка, рефолдинг и исследование стабильности // III Симпозиум Белорусского общества фотобиологов и биофизиков: Тез. докл., Минск, 21-23 октября 1998 г. -С. 159.

17

РЕЗЮМЕ

Чуманевич Александр Александрович Фолдинг, стабильность и активность рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента и моиоклональных антител к ферритину

Ключевые слова: фолдинг, иммуноглобулин G, моноклональные антитела, рекомбинантный одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), дифференциальная сканирующая калориметрия, круговой дихроизм, флуоресцентная спектроскопия, стабильность, конформационный анализ, белок А.

Целью работы явилось установление корреляции между конформацией, стабильностью и активностью моноклональных антител субклассов IgGl и IgG2a в сравнении с рекомбинантным Fv фрагментом комбинацией структурно-физического и функционального подходов. При моделировании процесса фолдинга иммуноглобулинов путем рН-индуцированных конформационных переходов трех моноклональных антител субклассов IgGl и IgG2a установлена общая схема фолдинга, включающая между нативным (N) и полностью развернутым (U) состояниями, по меньшей мере, 4 макроскопических состояния, промежуточных по степени снижения структурной организации: декооперированные NA| и Нчг состояния, частично развернутое I-состояние, а также "альтернативно свернутое" А-состояние. На примере взаимодействия двух антител субкласса IgG2a мыши с антигеном и белком А стафилококка впервые показано, что аффинность связывания белка А как функционального аналога Fcy-рецепторов иммуноглобулинов может изменяться в зависимости от индивидуальных структурных особенностей антител, которые локализованы в гипервариабельных участках антигенсвязывающего центра и связаны с различиями в термодинамической стабильности. Разработан высокоэффективный метод получения рекомбинантного Fv фрагмента моноклоналыюго антитела F11 (субкласс IgG2a мыши) в растворимом и активном виде из бактериальных "тел включения". С помощью комбинации методов, включающей сканирующую калориметрию, круговой дихроизм, флуоресцентную спектроскопию и иммунохимический анализ обнаружено, что конформация функционально активного рекомбинантного одноцепочечного Fv фрагмента при физиологических условиях существенно отличается от нативного иммуноглобулина и характеризуется значительно разупорядоченной вторичной и дестабилизированной третичной структурой. Этот результат представляет собой новые данные о механизмах фолдинга и стабилизации молекулы scFv фрагментов иммуноглобулинов и полиглобулярных белков в целом.

Результаты работы могут быть использованы для модификации существующих и разработки новых усовершенствованных методов получения иммуноглобулинов и их структурных аналогов, в том числе рекомбинантных одноцепочечных Fv фрагментов, для практического использования в целях иммунодиагностики и иммунотерапии.

18

РЭЗЮМЭ

Чуманев1ч Аляксандр Аляксандрав1ч Фолдынг, стаб1льнасць i актыунасць рэкамбшантнага адналанцуговага Fv фрагмента i манакланальных антыцелау да ферыцшу

Юпочавыя словы: фолдынг, ¡мунаглабулш G, манакланальныя антыделы, адналанцуговы Fv фрагмент (scFv), дыферэнцыяльная скашруючая каларыметрыя, кругавы дыхра^зм, флуарэсцэнтная спектраскашя, стабшьнасць, канфармацыйны аналЬ, бялок А.

Мэтай работы з'яв'шася вызначэнне карэляцьй нам ¡ж канфармацыяй, стабшьнасцю i актыунасцю манакланальных антыцелау субкласау IgGl i IgG2a У параунанш з рэкамбшантным Fv фрагментам камбшацыяй структурна-фЫчнага i функцыянальнага падыходау. Пры мадэляванш працэсу фолдынгу 1ммунаглабулшау шляхам рН-шдуцыраваных канфармацыйных пераходау трох манакланальных антыцелау субкласау IgGl i IgG2a выяулена агульная схема фолдынгу, уключаючая нам ¡ж натыуным (N) i поунасцю разгорнугым (U) станам! сама меней 4 макраскашчныя станы, прамежкавых па ступеш зшжэнпя структурнай арганЬацьп: дэкаапераваныя Nai i NA2 станы, часткова разгорнуты I-стан, а таксама "альтэрнатыуна згорнуты" А-стан. На прыкладзе узаемадзеяння дзвух антыцелау субкласу IgG2a мышы з антыгенам i бялком А стафшакока уисршышо паказана, што афшнасць звязвання бялка А як функцыянальнага аналага Fcy-рэцэптарау ¡мунаглабулшау можа змяняцца у заЛежнасщ ад шдьшдуальных структурных асаб;нвасцей ¡мунаглабулшау, яюя лакал!заваны у гшерварыябедьных участках антыгензвязываючага цэнтра i звязяны з адрозненням! у тэрмадьшалп чнай стабшьнасць Распрацаваны высокаэфектыуны метад атрымання рэкамбшантнага Fv фрагмента манакланальнага антыцела F11 (субклас IgG2a мышы) у растваральным i актыуным стане з бактэрыяльных "целау уключэння". 3 дапамогай камбшацьн метадау, уклгочаючай скашруючую каларыметрыю, кругавы дыхра1зм, флуарэсцэнтную спектраскагшо i ¡ммунах!м1чны аншпз выяулена, шго канфармацыя функцыянальна актыунага рэкамбшантнага адналанцуговага Fv фрагмента у ф1з1ялапчных умовах ктотна адрозшваецца ад натыунага ¡мунаглабулша i характэрызуецца значна разупарадкаванай другаснай i дэстабшзаванай тращчнай структурай. Тэты вышк уяуляе сабой новыя звестю аб механЬмах фолдынгу i стабшзацьй малекулы scFv фрагментау ¡мунаглабулшау i пол1глабулярных бялкоу у цэлым.

Вынш работы могуць выкарыстоувацца для мадыфшацьн кнугочых i распрацоую новых удасканаленых метадау i тэхпалогш атрымання ¡ммупаглабулшау i ix структурных аналагау, у тым л1ку рэкамбшантных адналапцуговых Fv фрагментау, для практычнага выкарыстання у мэтах ¡мунадыягностыю i ¡мунатэрапи.

19

SUMMARY

Chumanevich Alexander Alexandrovich Folding, stability and activity of a single-chain Fv fragment and monoclonal anti-ferritin antibodies

Key words: folding, immunoglobulin G, monoclonal antibodies, single-chain Fv fragment (scFv), differential scanning calorimetry, circular dichroism, fluorescence spectroscopy, stability, conformation, protein A.

The work was aimed at establishing inter-relationships between conformation, stability and activity of monoclonal antibodies of mouse IgGl and IgG2a subclasses in comparison with the single-chain Fv fragment; a combination of structural and functional approaches was used. When analyzing pH-induced conformational transitions as a model for the folding process of immunoglobulins of the IgGl and lgG2a subclasses, the general scheme of folding was demonstrated. This scheme involved, besides the native (N) and completely unfolded (U) states, at least four macroscopic intermediate states that displayed a gradual decrease in structural organization: decooperated NAi and NA2 states, partially unfolded 1-state, and alternatively folded A-sfate. Using two IgG2a antibodies to analyze their interaction with the antigen and staphylococcal protein A, we obtained the first demonstration that binding affinity of the protein A as a functional analog of immunoglobulin Fcy-receptors can be modulated by individual structural features of antibodies. These individual features are attributed to hypervariable loops of an antigen binding site and associated with differences in thermodynamic stability of antibodies. A high-efficiency method was develop that provide extraction from inclusion bodies and obtaining in a soluble functional conformation the single-chain Fv fragment of the full-length monoclonal antibody Fll (IgG2a subclass). By using a combination of methods comprising differential scanning calorimetry, CD and fluorescence spectroscopy, and immunoassay, it was found that a conformation of the functional single-chain Fv fragment under physiological conditions is distinct from that of the full-length immunoglobulins and is characterized by a significantly distorted secondary and destabilized tertiary structure. These findings represent new data that provide further insight into mechanisms of folding and stability of immunoglobulin single-chain Fv fragments and polyglobular proteins in general.

The results obtained can be employed for improvement of current methods and development of the new advanced techniques for preparations of immunoglobulins and their structural analogs including scFv fragments to provide an applications of molecules in immunodiagnostics and immunotherapy.

/