Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование гена одноцепочечных антител к ферритину человека и его экспрессия в бактериальных клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование гена одноцепочечных антител к ферритину человека и его экспрессия в бактериальных клетках"

РОССИЙСй А Я. А К А Д Б М И 3 Н А У К '

ГБ Ой

' Институт малекудярмон биологии

£ 1: и Н 'I. -им. В.А. Энгельгардта 3

На правах рукописи

ПШЯНОЗ Павел Анатольевич

УДК 577.21:577.27

КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНА ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ К ФЕРРИТИНУ ЧЕЛОВЕКА II ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В. Энголъгардта Российской Академии Наук

11АУЧШЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических, наук кандидат винческих наук

С.М. ЛЕЕВ И.Л. БЕСПАЛОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор Б.Б. Дэантиев

доктор химических наук А.Г. Габибов

ВЕДУЩАЯ ОРГАШЗАЦИЯ - Институт биоорганической химии да. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

„Л? „ ^¿'ри/^_ л994 г. в //

Защита состоится "ь " , .1994 г. в .'.: .час

заседании диссертационного совета Д 002,79.01 по завдгге диссертац на соискание ученой степени доктора наук при Институте молекулярн биолог1Ш им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук по адрес 117984, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Циститу молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАИ.

Автореферат разослан

„ ¡¿>„ . 1994 г.

Учений секретарь днссертациошюго совета кп^лид^т химических наук

А.М. КРПННН

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Почти 20 лат успешно используются а фундаментальных исследованиях и для медицинской диагностики коноклональные антитела. Однако, при использовании nsTiíaiaíZ мышиных моноклональных антител для ln vivo диагностики и терапии онкологических заболеваний возникает иммунной ответ у пациента при введении этих реагентов. Современный анализ использования одноцепочечных антител для обнаружения раковых образований показал значительные преимущества их использования в клинике по сравнению с интактними антителами и Fab-фрагментами. Эти преимущества состоят в следушем: а) небольшой период жизни Fv-фрагментоэ, вводимых в организм, что особенно важно, когда к ним присоединены изотопы или токсические агенты; б) одноцепочечныэ Fv не аккумулируются в почках, как это происходит с РаЬ-фрагнентами; в) маленький размер одноцепочечных Fv облегчает их проникновение к раковым клеткам или другим мишеням; г) они имеют значительно меньшую иммуногенность, т.к. не содержат константных доменов иммуноглобулинов; д) могут быть получены в значительных количествах в бактериях и, следовательно, не могут быть загрязнены эукариотическими вирусами; е) собственный малый размер таких антител позволяет присоединять к ним различные другие агенты (токсины , изотопы, ферменты, связывающие участки различных лекарственых молекул и т.д.).

В качестве объектов для работы били выбрани антитела к ферритину из селезенки человека и к белку р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ—1). По опубликованным данным, меченные изотопами антитела к ферритину были с высокой эффективностью использованы для лечения карциномы печени, не поддающейся хирургическому вмешательству, а также при болезни Ходжкина (Hoeínagol, 1991). Многие злокачественные клетки человека экспонируют на своей поверхности ферритин. В настоящее время меченные иаотопами антитела к ферритину человека находят очень широкое применение в диагностике и терапии онкологических заболеваний (Langmulr, 1992), никоим образом нэ уступая в этом антителам к другому маркеру злокачественных образований - раково-эмбриональному антигену. Белок р24 ВИЧ-1 выявляется в крови зараженных лиц за Я-9 недель до появления антител к вирусу (Goudsmit flt al., 1988). Переход инфекции в активную форму характеризуется антигенемивй по белку р24 и может служить

прогностическим признаком (Rosenberg et al., 1989). Антитела, специфически узнающие определенные эпитопы вирусных белков, являются тонкий, инструментом для изучения их структуры и функций, и могут оказать существенную помощь В разработке противовирусной вакцины.

Настояадя работа посвящена экспрессии в клетках E.coli гена, кодирующего одноцепочечные антитела к ферритину человека, могущих найти па фоков применение в терапии к диагностике онкологических заболеваний человека.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении и исследовании экспрессии гена, кодирующего одноцепочечные антитела к ферритину человека в клетках E.coli. В задачи исследования входило:

1 - клонирование V-сегментов генов иммуноглобулинов из клеток гибридом мыши, секретирупцих антитела к ферритину человека и к белку р34 ВИЧ-1

2 - клонирование последовательности, кодирующей, сигнальный пептид пектатлиазы В E.carotovora, который используется для направления секреции рекомбинантннх антител в периплазматическое пространство бактериальных клеток

3 - создание конструкции для экспрессии в клетках E.coli гена одноцепочечных антител к ферритину человека

4 - экспрессия гена, кодирупцэго одноцепочечные антитела к ферритину человека, в клетках E.coli

5 - получение и исследование связывапдих ' характеристик рекомбинантннх антител к ферритину человека

Научная новизна и практическая ценность. Клонированы и определена структура четырех новых экспрессируемых иммуноглобулиновых генов мыши. Разработан способ ориентированного объединения фрагментов ДНК о помощью полимеразной цепной реакции (ГП1Р) для сборки конструкции, кодирующей одноцепочечные антитела. Сконструирован ген одноцепочечных антител к ферритину человека. Осуществлена экспрессия этой конструкции в клетках E.coli BL2HDE3) (Studler et al., 1987). Клонирована и использоване для экспрессии гена одноцепочечных антител последовательность, кодирующая лидерный пептид пектатлиазы В ' E.carotovora. Лидерный пептид направляет экспрессируемые белки в периплазматическое пространство бактериальных клеток, что способствует правильной укладке экспрессируекой полипэптидной цени. Изучено влияние

условий выращивания экспрессирупцих клеток на выход функционально активных рекомбинантных антител. Очищены и изучены иммунохимические характеристики одноцепочечных антител к ферритину человека.

Аппробация работы.

Представленные в диссертации результаты были доложены и обсуждены на международном симпозиуме "Каталитические антитела и инженерия антител" (Москва, 1993), на 12-м европейском конгрессе по иммунологии (Барселона, 1994) и на заседаниях коллоквиума лаборатории молекулярно-генетической иммунологии ИМВ РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Материал изложен на 121 странице машинописного текста, включает 23 рисунка и библиографический список иэ 133 названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клонирование генов иммуноглобулинов из клеток гибридомы F11■

Исходным материалом для выделения мРНК служили клетки гибридомы F11, предоставленные В.Е. Луневым (Институт биоорганической химии АН Беларуси). Гибридомная линия F11 (Лунев и др., 1993) получена в результате слияния клеток миеломы Х63-Ag8.653 со спленоцитами■ мыши линии BALB/c, иммунизированной ферритином, который был выделен из селезенки человека.

Для выделения РНК из клеток антиферритшговой гибридомы был выбран один иэ наиболее быстрых и несложных методов выделения РНК (Chonacaynakl et al., 1987). Клетки солюбилизировали в растворе, содержащем гуанидинизотиоцианат, анион и катион которого обладают сильным хоатрогшым действием, а затем в одну стадия освобождались от белков и ДНК путем экстракции фенолом в кислой среде.

Фракцию поли(А)-содержавдх РНК получали в результате двух циклов аффинной хроматографии на олиго(с1Т)-целлюлозе и кДНК синтезировали, как описано в Manlatla et al. (1982). После обработки нуклеазой S1 двухцепочечную кДНК фракционировали по размеру гель-фильтрацией на Bio-Gel A-(5m. В качестве элюента использовали буфер для проведения реакции с терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, инкубация с которой была следующим этапом в процедур© клонирования кЯШ. Для клонирования были взяты

кДИК раамером более 400 и.о.

В качестве вектора для клонирования полученной кДНК использовали плазмиду pBR322, расщепленную рестриктазой Pstl и содержащую на 3'-концах по 12-18 dG-остатков. Такая длина (dG)-последовательности является оптимальной для клонирования с помощью dO-dC коннекторов (Peacock et al., 19Э1).

В результате клонирования кДНК, синтезированной с мРНК из клеток гибридомы F11, была получена библиотека, которая содержала более 180000 клонов.

В лаборатории молекулярно-генетичеокой иммунологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН имеется большой набор векторов, содержащих различные гены и фрагменты генов 1шмуноглобулинов мыши. Для поиска 6 библиотеке клонов, содержащих тяжелые цепи, был использован Xbal - Kpnl фрагмент клона Р2 (Ураков и др., 1987; Uracov et al., 1989). Этот фрагмент содержит три экзона константных доменов Г)гЦепей. Для поиска легких цепей использовали фрагмент плаэмиды р8.1 (Деев и др., 1982), содержащий часть константной и З'-нетранслируемую область гена х-цепи мыши. Библиотеку последовательно скринировали меченными 32Р зондами для поиска тяжелых и легких. цепей. Анализ рекомбинантных клонов проводили в соответствии с процедурой "гибридизации колоний4 (Grurratein and Wallis, 1979).' Подбор зондов обусловлен предварительным определением типа секретируемых цепей антител Р11.

Вставки из клонов, дающих положительный ответ после гибридизации в жестких условиях отмывки, реклонировали в pUC18 по Pstl-сайтам и определяли нуклеотидную .последовательность методом Sanger в модификации Tabor and Riohardson (1987). Было секвенировано по несколько клонов, содержащих легкие и тяжелые цепи.

Следует отметить, что среди клонов, содержащих гены легких цепей, были обнаружены клоны, несущие последовательности двух рваных генов. Определение нуклеотидной последовательности одного из них и сопоставление её с известными структурами V^-цепей (Rabat et al., 1987) выявило генетический дефект: делецию четырех нуклеотидов в точке V-J рекомбинации, приводящую к возникновению терминиругацих кодонов. Сопоставление определенной вами структуры вариабельного домена этого гена с литературными данными позволило установить, что это, тек называемый, "аберрантный транскрипт" к-138, состоящий из V-гена с <7к2-сегмвнтом и участка константной

части х-гена. Секвенированная нами последовательность V-сегмента гена х-138 полностью совпадает с приведенной в работе Cabilly et al. (1985). Этот ген ведет происхождение иэ клеток миеломной линии X63-.Ag8.653, использованных для получения гибридомной линии. На основании этого мы сделали вывод, что он не может отвечать за синтез легкой цепи, участвующей в формировании функционально активных антител в гибридоме Fl1.

Анализ ДНК клонов, несущих другой вариант гена легкой цепи, также как и клонов, содержащих вставку гена тяжелой цепи, не выявил каких-либо генетических дефектов.

Таким образом, были отобраны клоны размером 1500 и 960 и.о., которые содержали почти полные копии мРНК, кодирующих обе цепи антиферритиновнх моноклональных антител. Последовательности нуклеотидов, а также транслированные аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител F11, приведены на рис. 7 в составе рекомбинантного гена анти^рритиновых одноцепочечных антител.

Клонирование иммуноглобулиновых генов иэ клеток гибридомы

IIV44.

Исходным материалом для выделения РНК служили клетки гибридомы IIV44, предоставленные A.A. Кущ (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН России). Линия IIV44 секретирует моноклональные антитела к белку р24 вируса иммунодефицита человека (Кущ A.A. и др., 1991s Шумай Е.П. и др., 1992) и была получена слиянием клеток миеломы sP2/0-Ag14 со спленоцитами мыши линии ВА1В/С, иммунизированной экстрактом белков ВЙЧ-1.

Лизис клеток осуществляли по методу Huang and High (1990) додецилсульфатом натрия. ДНК и белки осаждали добавлением кислого ацетата аммония, а затем осаждали РНК изопропиловым спиртом.

Для получения кДНК использовали общую клеточную фракцию РНК, которую предварительно подвергали денатурации перед обратной транскрипцией. Синтез кДНК' легких и тяжелых цепей в реакции обратной транскрипции эатравляли с помощью олигонуклеотидных праймеров, выбранных на основе данных Rabat et al. (1987). Праймеры представляют собой последовательности, комплементарные участкам константных областей, примыкающих к 3'-концу вариабельных генов тяжелых (ri) или легких (*) цепей. Для V-гена х-цепи использовали "праймер сх" - 5'-4>G/VÂCATGGATACAQÎTGGÎGCAGC, а для

V-гена тj-цепи - "праймер cyi" - 5'-CGATAGACAGATGGGGGTGTCGTT. Подбор затравок обусловлен предварительным определением типа секретируемых цепей клетками гибридомы IIV44 с помощью иммуноферментного анализа.

По окончании реакции обратной транскрипции РНК расщепляли РНКаэой А, а полученную одноцепочечную кДНК Использовали для достройки олигоШС)-последовательностей (10-20 остатков) на 3"-концах с помощью терминальной деэоксинуклеотидилтрансферазы.

кДНК, содержащая олиго(сЮ) -последовательности была использована для амплификации с помощью ПЦР V-генов лёгкой и тяжелой цепей моноклональных антител к белку р24. Б качестве З'-праймеров использовали соответственно "с и "с„,-праймер"

д J1

(см. табл. 2), а в качестве Б1 - олиго((10)12_1в. Когда в реакцию амплификации Орали 0,3-0,4 мкг кДНК, удавалось воспроизводимо получать ПЦР-продукты постоянного размера для каждой цепи (рис. 1). Размер ПЦР-фрагментов составил приблизительно 540 и 650 п.о. для тяжелых и легких цепей, соответственно.

Фрагменты ДНК - продукты ПЦР - выделяли из агарозного геля и клонировали в pUC18. Затем методом Sanger были определены нуклеатидные последовательности трех клонов х-цепей и трех клонов тяжелых цепей. На рис. 2 приведены последовательности нуклеотидов вариабельных сегментов тяжелой и легкой цепей моноклональных антител IIV44, а также их транслиробанные аминокислотные последовательности.

I 2 М

Г. aiHilw«V*»

i-iy & А

^MUtiui

1454

736 476

Рис. 1. Электрофоретический анализ в 1,2%-тм агарозном геле фрагментов ДНК, полученных амплификацией с помощью ПЦР специфичной кДНК, несущей информацию о 5 *-нетранслируемых и У-областях генов легта (1) и тяжелых (2) цепей антитител К белку р24 ЗИЧ-1. Маркеры молекулярной массы (1) -TaqI-гидpoлизaт ДНК плаэмиды риС18 (слева приведены размеры фрагментов в п.о.).

о1т!

2 аоаг 1ваао1тоотаттоаооо1аААот(юоттоггта1тагтттт1*солАоатата НК1ли1^1у1ли1огеХгрУа1Р>юР>»Уа1Уа1Р|1вТуг01па1уУа1

62 сАттотодсютооАаоттаттсАатотаатооАОАлттоатлсласотллАОоатсАТта Н1вСу801иУа101п1лиУа101иЗег01у01у01и1яиУаШпРго1ува1уЗег1яи

1гг АААОтотоАтатооАвсстоиаАттоАсоттсААХАсотАсаосАтаААотааатссао 1уяЬаи5егС.уаА1аА1аВагд1у№еТ1тгРЬеЙапТЬгТ>тА1аМдЦепТгсУа1Агя

182 САааОТСОАООАААаааТТТОаААТССаТТООТСХЮАТААОААаТААААОТААТААТТАТ

242 аСААОАТАСТАТОООААХТОАОТОАААОАСАООТТОАОСАТСТОСАаАОАТОАТТСАСАА

302 АаОАТОСТОТАТСТаОАААТаААСААСИаААААОТОАООАОАОАООСАТаТАтСТОХ

БвН1в11я1Ля"1лЛ1гЛв1АяпАя1^и1^в1)1г01иАврТЛгА1аНаШх111й1а

362 ОМХАТООТААОТТСаоатТТОСТТАСТаоааСОААОООАОТСТОаТОАСЮТСТСТООА УаПугС1уАапРЬед1уРЬаА1аТугТгрд1уд1п01уТИг1>виУа1ТИгУа15дгА1а

I ваа1в88аа8Ввоаеаоио1оав81оН181а1ао1х0ТТ0СТСТ00ТТ0ТСТ0СТ0ТТ

МйЬеиЬоиТгрЬеиЕеИНуЧа!

61 ОААОО^АСАТТОИАТОАСССАОТОТСАОАААТХОАТаТСОАСАТСАОТТООЛОАОАСО О1иа1уА0р11в7а1Яв11ЬгО1пЗвгН1в1увРЬв11в18вгТЬгЗвгУа1В1уАврАгв

121 отсАаолтоАсстаоАлоассАагоАООАтатооотАОтосмтАасиоотАТСААаАа

»81 АААсоАаааошстсстААА01АотаАГП'АсюоаоАТсОАСооааоАОАстааАото

241 сстаАтсасттсАСАассАаюаАТстаоаАСАоттоАстсиАссАдаосшата ' РгоАярАгвРЬвТЬг01уЗвг01у5вг01уТИтАврРЬвТЬг1ви111Г11вЗвгАапУа1

301 ОАаТСТаААаАСТТаоаАОАТТтТСТОТОАООААХАТАОСАОМАТССОТАОАСгаИО

361 саАООоасоАсСААастоаАААтлАА« а1у01уа1уТЬг1^в1ви01и11в1ув

Рио. 2. Последовательности нуклеотидов кДНК .. транслированные аминокислотные последовательности вариабельных доменов! а - тяжелой и б - легкой цепей моноклональных антител 11У44 К р24 ВИЧ-1. Выделены нуклеотидные и аминокислотные последовательности лидерных пептидов (I) и вариабельных доменов (У-О-^ или У-<1). Малыми буквами показаны б • -нетранслируемые нуклеотидные последовательности. Сплошной линией подчеркнуты гипервариабельные области (СОЮ.

Клонирование пектатлиазных генов Erwinla carotovora.

Штамм Erwinia oarotovora 1-88 был получен от С.С Трибуш (Институт микробиологии АН Беларуси). Хромосомную ДНК Е.oarotovora 1-88 подвергали ограниченному щеплению рестриктазой Alul, фракционировали с помощью электрофореза в агароэном геле и извлекали фрагменты размером 4-10 т.п.о. Наиболее простым и эффективным методом клонирования таких фрагментов оказался классический вариант "dG-dC коннекторов". Для этого 0,5 мкг выделенной из геля . ДНК инкубировали с терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой в присутствии dCTP и использовали для отжига с обработанной рестриктазой Pstl плазмидой pBR322, З'-концы которой содержали олигоШО)-последовательности. После трансформации E.coli HHI и селекции на устойчивость к тетрациклину было получено приблизительно 7000 независимых рекомбинантных клонов, которые тестировали на наличие экспрессируемых пектатлиазных генов. Известно, что регуляторные последовательности ДНК Е.carotovora распознаются системой экспрессии филогенетически близкой бактерии E.ooll, а синтезированные молекулы пектатлиаз секретируются в периплазму (Lei et al., 1988s Yankovsky et al., 1989). Присутствие функционирующих пектатлиазных генов легко обнаруживается при выращивании .бактерий на твердых средах, содерщащих пектаты, которые являются субстратами для ферментов. Секретированные пектатлиазы разрушают компоненты твердых сред, что приводит к заметному "погружению" колоний в агаровый слой (Евтушенков и др., 1984). Анализ полученной библиотеки на "погружение" колоний позволил отобрать свыше 30 клонов, которые затем выращивались в виде жидких культур и повторно тестировались на наличие и уровень пектинолитической активности спектрофотометрическим методом (Yankovsky et al., 1989). Из клонов с наиболее высокой ферментативной активностью была выделена плаэмидная ДНК и проведен рестриктный анализ.

По данным Лей и соавт. (Lei et al., 1988s Lei et al., 1987), в хромосоме E.oarotovora имеется несколько тандемно расположенных пектатлиазных генов, обозначенных в случав штамма ЕС - pelA, pelB, pelC и т.д. Характерной особенностью этого пектатлиазного кластера являются участки узнавания рестриктазы Bglll внутри каждого из структурных генов, а также рестриктазы Aval в межгенном пространстве (Lei 'et al., 1988). Один из отобранных по результатам ферментативного анализа клонов - клон PL32, содержал

рекомбинантный фрагмент XtíSt размером 6 т.п.о. Растриктний анализ -щэпление рестриктазами Aval и BglII - дал основание полагать, что в PI32 имеется, по крайней мере, два пектатлиазных гена. ' Чтобы идентифицировать гены, были установлены нуклеотидше последовательности вблизи участков узнавания BglII. С этой целью планмиду pPL32 расщепляли рестриктазой BglII, метили с помощью ("pidATP и фрагмента Кленова, после чего обрабатывали рестриктазой Aval. Меченые фрагменты ДНК разделяли в 4% ПААГ и секвенировали по методу Максама и Гилберта в модификации Чувпило и Кравченко (1983). Сравнение полученных нуклеотидннх последовательностей с опубликованными (Lel et al., 1987) показало, что плазмида pPL32 включает гены пектатлиаз, соответствуицие pelA-и ре1В-генам E.carotovora. Щепление плазмидной ДНК клона PL32 рестриктазами Aval и BglII и последующий рестриктный анализ этой ДНК щеплением рестриктазами Aval и EcoRI одновремено и по отдельности позволил предположить взаимное расположение фрагментов в плазмиде pPL32 (рис. 3).

Фрагмент Aval - BglII размером 0,8 т.п.о., который содержал 5'-некодирующую область и участок, несущий информацию' об аминокислотной последовательности лвдерного пептида гена pelB, бил субклонировач в векторе pUC18 (pUCPLB).. Секвенирование втого

Рис. 3. Строение плазмидн pPL32, несущей участок ДНК Е. earotovora 1-88 с пектатлинз-ными генами pelА и pelB.

фрагмента по Sanger с использованием модифицированной ДНК-полимеразы фага Т7 (Tabor and Rlchardaon, 1987) еще раз подтвердило правильность идентификации гена и позволило установить 5'-концевую последовательнсть гена pelB, не приведенную Lei et al. (1987) (рио. 4).

Aval *

CCCGACTGAATCTATTCTCTOCAAAAAAAATAACTTTATGATTTCCGOTTACTTTAAAAriAA

TTTAAAAGGA

Рис. 4. Последовательности нуклеотидов 5'-концевой области гена pelB E.carotovora. Вверху - установленная в данной работе, внизу - приведенная Lei et al. (1987). Знаком (») обозначена нуклеотидная замена в штамме E.carotovora t-88. Показан участок узнавания эндонуклеазы рестрикции Aval.

Получение рекомбннантного гена одиоцепочечных антител к

Ферритину человека.

Для того, чтобы собрать "мозаичный" ген одноцепочечных антител, необходимо тандемно расположить по крайней мере четыре фрагмента ДНК, которые кодируют сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию белка в периплазму, вариабельный домен тяжелой Цепи, пептид-линкер и вариабельный домен легкой цепи. При решении этой задачи для антиферритиновых антител был разработан способ объединения фрагментов ДНК, основанный на амплификации с помощью полимераэной цепной реакции продуктов ДНК-лигазной инкубационной смеси, который отличается от подобных опубликованных методов (Shyamala and Ames, 1989). Рис. 5 является иллюстрацией этого способа. При инкубации с ДНК-лигазой двух фрагментов (рис. 5а), один из которых фосфорилиройан (Р>, а другой не содержит 5'-концевых фосфатных групп (ОН) должны образоваться сложны* конкатемерные продукты, в которых случайным образом чередуются оба фрагмента (рис. 56). Затем проводят ПЦР о использованием двух олигонуклеотидов, 01 и 02, которые ограничивают необходимый участок объединенных фрагментов. В том случае, когда амплифицируемые фрагменты ДНК отличаются по размеру, а также при оптимальном соотношении фосфорилированного и дефосфорилированного фрагментов необходимый продукт ПЦР (рис. Бв) можно легко отдалить

от побочных продуктов амплификации при электрофорезе в arapoüu^.i геле.

Ol et

Рис. 5. Схематически изображение ориентированного объединения двух Фрагментов ДНК путем специфической амплификации продуктов

лдаазной реакцга. Стрелками

(->) на схеме обозначены

олигонуклеотиды и задаваемое, ими направление синтеза ДНК,

знаками ( -> • ) отмечены

корректные ориентации

олигонуклеотидов, приводящие к образованию требуемых

фрагментов ДНК. (Пояснения в тексте).

Последовательность сборки гена одноцеиочвчных

антиферритиновнх антител показана на рис. 6.

(а). Фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные домены тяжелой (VH> и легкой (VL) цепей, получали с помощью ПНР, используя пары олигонуклеотидов 03, 04 и 05, 06 (последовательности всех затравок приведены в табл. 1), а также плазмиды pBRF11(H) и pERF11(L) с соответсвуюцими клонированными кДНК. Тем же способом получен фрагмент гена pelB, содержащий последовательность сигнального пептида, а также 51 -областьвключающую участок связывания о рибосомой. ПЦР проводили, используя олигонуклеотиды 01, 02 и плаэмиду pUCPLB. Фрагменты ДНК очидали с помощью электрофореза в агарозном геле и обрабатывали фрагментом Кленова для удаления 3'-концевых нуклеотидов, ■ которые неспецифически добавляет ДНК-полимераза T.aquaticua (Clark, 1988). Фрагмент V(| фосфорилировали с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4.

(б). Фрагмент гена pelB и фосфорилированный вариабельный сегмент тяжелой цепи инкубировали о ДНК-лигааой фага Т4, а затем проводили ПЦР в присутствии олигонуклеотидов 01 и 04. Требуемый продукт ПЦР, фрагмент ЬрLBVH. после извлечения из агарозного геля обрабатывали фрагментом Кленова и объединяли с линкерннм сегментом, который был клонирован в плаэмиду pUC18 (plJClÖLlnk). Нуклеотидная последовательность,, кодирующая линкерный пептид iOlyGlyClyGlySer), (Huston et al., 1988), была спроектирована

- константные фрагменты генов легкой (Ь) и тяжелой (Н> цепей окти^вррятиновыЕ. антител; 1,1п1: - последовательность, кодирующая линкерный пептид; - последовательность, кодирующая сигнальный

пептид пектатлиачы В; Т7 - промотор РНК-полимеразы Т7; Т универсальный терминатор трансляции. (Дополнительные пояснения и тс? кете).

таким образом, ".то перзий глициновый кодой (GGS) входил в состав участка узнавания ростриктаэы. Smal.

Таблица 1. Затравки, используемые для сборки рексмбинантшго гена гР11

Затравка

Участок гена, которому комплементария затравка

01 TGACCACACTCCCCTTGGT 5' '-конец гена ро1В

02 GGCCATCGCTGGTTCGGC 3' '-конец лидзрной последовательности гена ро1В

03 CAGGTCCACCTGAACCAG 5' '-конец У-сегмента тяжелой цепи

04 TGAGGAGAC1GTGAGAGTGG 3' '-копец У-сегмента тяяелой цепи

05 GACATCCAGATGACACAG б1 -конец У-сегмшгга легкой цепи

06 CCGTTTTATTTCCAAOT 3' -конец У-сегмонта легкой Ц^эпи

07 GGATCCGCCOCCACCAO 3" -конец линкевного сегнонта

Последовательности нуклэотидов приведены в направлении от 5'- к 31—концу .

(в). Плазкиду pUC181,ink, щэпленную рестриктазаки Smal и PstI, инкубировали с ДНК-лигазой фага ТД и фрагментом Ь„,„ v„, после чего проводили ПЦР с олигонуклеотидами 01 и 07 (GGATCCGCCC-CCACCAG). В результате был получен фрагмент ДНК, который содеряал в одной рамке счютвания кодоны сданального пептида, V^-демепа и пептида-линкера (L , V.Link).

PLp И

(г). В заключение фосфорилировашшй фрагмент bpLB V^Linli инкубировали в лигазной реакционной смеси с вариабельным сегментом легкой цепи и амшпфицировали с олигонуклеотидами 01 и Об. ПолучеЕшый фрагмент размером 898 п.о. Lpj ^/.Llrtk'^ включали в плазмиду pBlusscript(Тег) (рис. 6д), содержавшую последовательность универсального термжатора трансляции (GOTTAATTAATTAAGC), и проводили трансформацию клеток E.coli Ш5а.

Последовательность, кодирующая универсальный терминатор трансляции имеет участок щепления рестриктазой Vapl (рис 7), Таким обрпасм, наличие на 3'-конце объединенного rem рекомбинэнтных

ÏGACCACACTGGCCXTGGTTXXXCACCAAAACÎGAGTTÎCATXXXXQXTGAAAAATl'XGX

61 ACCTGCGACAXCGGCCAXATUGAACGATAAAXiiCCCATGAAAAITCXATTXC AAGGAG

I-----------------------------t pelB-------------

119 AGAGICAXAAIGAAAIAOOTAITGCCTAOGacAGOOaOTUaATTarTATTACrCOCTOOG UEII^BTyrLouLeuProIlirAlaAlaAlsaiyLeuteuIeuLeuAlaAla

I-

179 CAACCACGGAXCGCCCAGGTGCAGCTOAAGCAGTCAGGACGXCOCGXAGTGCAGCCGroA GlnProAlaHetAlaiîlnVaiainleulysainSeraiyProGlyleuValOJnPixiSer

239 CAQAGOCIUTCCATCAOCTGCACAQTCTCTGOTtTCIOAITAACTAGCTAXGniGTACAO ainSerLauSerlleTln-CyoIlirValSerOlyPhaSerLsirthrSerlyraiyVallllB

299 TûainOGCOAGTOTCCÀGGAAAOCaiCXCGAGTGGOIGOCAGIGAIATGOAOTGGIQGA Ii-pValArgainSorProaiyLyoOlylouOliiTrpleuaiyVaHleTrpSerOlyOly

359 AGGACAGACTATAAXGGAGGXXXGATATCCACACTOAGCATCAGGAAGGACAATTCCAAG SerTbrAa[/ryrAsnA)ajUaPlïoneSorArgLeuSerIleSarLynAapAanSerLya

419 AGCOAAGXTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGGAAGCTAAXGACACAGCCAXAXAXTACTGT Soi4ilnV>iiriioriialiaMotAanS0rLeuainAlaAaiiAa|^hrAlaneTyrTyi'Cye

479 GOOAOAGÎACTnGIOTACTAOTrrUACIACTGOCOCCAAOGCAOCACTCTCAGAOICIOO AlaArgOlulauValTyrlyrPhBAflpTyrlrpOlyOlrClyltirThrLeuIhrValSer

539 XCAGGCGGCCGXCOCTCCGGCCOTGOTGGQTCTCQXGGCGGCCGAXCCGACATCCAGAXG SorOlyOJyOlyOlySerOlyfllyOlyOlySarOlyOXyalyGlySerAapIleGlliHot

БЭ9 AGTCAGTGTCCAGCCXCCCTAXCTGCATCTGTCGGAQAAACTaTCACCAICACATQTCOA ThrOluSerProAlaSerLeuSarAlaSerValaiyCluThrValrhrlleThrCyaAre

Б6Э GCAAGIOAGAATArTTACAOTTAtTTAGCATGGIATGAGCAGAAAGAGGGAAAAIOTCCT AlaSarGluAanlloTyrSerTyrLeuAlalnJTyrClriGlriyqOlnaiyLyaSarri'O

' 719 CAGGTCCTflarCTArAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTCGC UInLouUuVallyrAanAlaLyaTlirLeuAlaOluOlyValProSerArgrhaSerGly

779 AGTQGAXCAGGCACACAGXTTXCXCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCXOAAGAITrTGGtJ SerOlySoi'OlyTtirOliiPleSerLeulyalloAajiSei'LouGlr.ProOluAoprhoOly

B39 AGTTAXTACIGXCAACATCATXAXGGXAGXCCAXXCACOXXCGGCXCGGGGACAAAGTIU SarTyrTyrOyoOlnlUaHtalyraiyThrri-oPlioIbrriioGlySoHJlyThfLyslBU Vspl

B99 gaaataaaaccg&atccgcgcttaXttaaIîaagc ClulleLyaAr&AapPruArgLeuIlBAan-»-

Рис. 7. Нуклеотидная последовательность и последовательность аминокислот рекомбинантного гена антн$ерритиновых одноцепочечных антител. Выделены нуклеотидные и аминокислотные последовательности фрагмента гена pelB, содержащего лидерный пептид (L pelB), линкерный пептид (Linker), вариабельные фрагменты легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей антител Pli, последовательность Авр-Рго, а также нуклеотидная последовательность сайта узнавания ресгриктаэы Vspl. Прямоугольником выделена последовательность участка связывания с рибосомой гена pelB. Вертикальной стрелкой указано место отщепления лидерного.пептида пактатлиазы В.

антител Fl 1 единственного участка узнавания указанной рестриктазы позволяет легко присоединять к С-концевому участка гена рекомбинантного белка фрагменты ДНК, кодирующие различные белковые или аминокислотные последовательности, например, пептиды для последующей аффинной очистки рекомбинантных антител, токсины, ферменты и другие.

Клонирование универсального терминатора трансляции было спланировано таким образом, что после кепления плаэмиды pBIuescript(Ter) рестриктазой BamHI и объединения ее после обработки фрагментом Кленова с фрагментом L V LlnkV. - на С-

PLB II L

конце рекомбинантного гена возникает Аяр-Рго аминокислотная последовательность (рис. 7). Азр-Рго-связь - единственная в рекомбинантном белке и, являясь кислотолабильной связью (Дэрбре, 1988), позволяет в мягких условиях отшеплять присоединенные белковые или аминокислотные последовательности. Плазмиды

pBIuescript(гР11), в которых рекомбинантный ген был в корректной ориентации, секвенировали, чтобы убедиться в отсутствии нуклеотидов, ошибочно включенных ДНК-полимеразой T.aquatiqua и меняющих смысл кодонов (Tindall and Kunkel, 1988).

Полная нуклеотидная последовательность гена одноцепочечннх антител к ферритину человека, содержащая часть 5*-нетранслируемой области и информацию о лидерном пептиде pielB, приведена на рис. 7.

Экспрессия гена одноцепочечных антиферритиновых антител в

E.coll.

Для получения одноцепоче"ных антител в E.coli была выбрана система экспрессии рекомб1шантных генов, разработанная Стадиером и соавт. (Studier et al., 1990). В качестве вектора для экспрессии рекомбинантного гена антиферритиновых антител была выбрана плазмида рЕТЗа(х). Эта плазмида предназначена для клонирования и экспрессии фрагментов ДНК под контролем РНК-полимеразы фага Т7 и содержит один из сильных промоторов Т7 ДНК, промотор flO. Размер синтезированной РНК ограничивается последовательностью эффективного терминатора транскрипции Tf. Поскольку ген, кодирующий rFI1, имеет все необходимые сигналы инициации трансляции, из рЕТЗа(х) был удален фрагмент Xbal - Kp'nl, который содержит участок связывания с рибосомой и 260 Кодонов гена 10 фага Т7 (Studier et al., 1990). Для этого плазмиду рЕТЗа(х) щепили рестриктазой Xbal, "затупляли" выступайте 5'-концы с помощью

(r F И)

Вic. 8. Схема клонирования гена рекомбинантных антител гР11 в вектор для экспрессии. (Пояснения в тексте).

фрагмента Кленова, а затем расщепляли рестриктазой Kpnl. Плазмиду pBlueaorlpt(гР11) обрабатывали рестриктазами Ес113б11 .(изошизомер Saol, рвстрпктааа Ео1136И дает "тупые" концы) и Kpnl. Фрагмент ДНК, содежащий ген анти$ерритиновых одноцепочечных антител, объединяли с рЕТЗа(х), у которой отсутствует фрагмент Xbal - Kpnl (рис. 8). Полученной плазмидой рЕТ(гР11) трансформировали штамм Е .coli BI21, лиэогенный по бактериофагу ДЕЗ и несущему ген РНК-полимеразы фага Т7 под контролем lacUVS промотора. Таким образом, индукция изопропил-ß-D—гиогалактоэидом (ИПТГ) приводит к синтезу молекул Т7 РНК-полимеразы, которая , в свою очередь, осуществляет селективную транскрипцию рехомбинантного гена и обеспечивает высокий уровень матричных РНК для анти|>ерритиновых антител. Одним из преимуществ штамма BL21 является отсутствие продукта гена Ion, АТФ-аависимой протеиназы 1а, а также протеиназы наружной клеточной мембраны бактерии, продукта гена ошрТ, что должно снижать степень протеолитической деградации одноцепочечных антител.

- IT - .

№ рис. 9a представлены результаты электрофоретического анализа бактериальных белкрв, синтезируемых бактериальными клетками-продуцентами. Можно видеть, что в индуцированных культурах присутствуют два белка с молекулярной массой приблизительно 27 КДа и 29 КДа, которые составляют вместе до 15» от суммарного клеточного белка и не обнаруживаются в контрольной культуре. По величине эти белки соответствуют процессированной (без сигнального пептида), и . непроцессированной формам одноцепочечных антител гР11, молекулярные массы которых должны составлять 26,3 КДа И 28,51 КДа, как рассчитано на основании аминокислотных последовательностей. В зависимости от момента индукции соотношение двух форм в конечной культуре, менялось, причем наибольшая доля процессированного белка била получена, когда ИПТГ добавляли к бактериям в поздней логарифмической фазе роста (рис. 9а). Как можно видеть из того же рисунка, общая доля рекомбинантных белков (как процессированного, так и непроцессированного) уменьшается в зависимости от стадии роста клеток в момент индукции. Так, рекомбинантные белки составляют до 15% от общего белка бактериальных клеток при индукции в ранней логарифмической стадии и снижается до 7-9* при индукции в поздней логари|>мической фазе роста. Максимальный уровень синтеза рекомбинантных антител наблюдался уже при 0,08 мМ 'ИПТГ в культуральной среде и не изменялся при увеличении концентрации индуктора вплоть до 2 мМ. Вероятно, даже при такой низкой концентрации ИПТГ (0,08 мМ) в клетке синтезируется достаточное количество молекул Т7 РНК-полимеразы для того, чтобы полностью "загрузить" белоксинтезирупций аппарат бактерии.

При анализе субклеточной локализации белков выяснилось, что основная масса обеих форм антител rFI1 находится в нерастворимом состоянии, не освобождается при осмотическом шоке и соосаждается с фракцией мембран E.coll. Установлено, что при транспорте белков протеинтранслоцирувздей системой E.coll через мембрану отделение сигнального пептида происходит в тот момент, когда переносимый белок оказывается за пределами цитоплазмы (Bllgin et al., 1990). Исходя из этого можно заключить, что непроцессированная форма rF11, вероятно, накапливается в виде "тел вклюнения" в цитоплазме бактерий, .тогда как процессированные молекулы одноцепочечных антител форштруют агрегаты в перйплазматическом пространстве. Такой вывод согласуется с данными по получению одноцепочечных

антифлуоресцеиновых антител, приведенными Pantoliano et al. (1991), а также Power et al. (1992).

Ряд белков. входящих в состав протеинтранслоиир^пощвго комплекса E.ooll или поддерживающих необходимую конформацию свкрвтируемого полипептида, относятся к числу белков теплового шока . В то же время, протеинааа La, которая индуцируется при повышенных температурах и играет ключевую роль в деградации абнормальных белков в E.coli (Goif and Goldberg., 1985), как упоминалось выше, отсутствует в штамме BL2I. Поэтому мы предположили, что в условиях теплового шока, когда в клетке будет повышенный уровень белков, способствующих секреции полипептидов в периплазму, можно ожидать более полного превращения предшественника в арелую форму одноцепочечных антител.

В нашем эксперименте клетки E.ooll BL21(DE3), содержащие плаэмиду pET(rFM), выращивали при 37°С до оптической плотно.сти 0,6, а аатем индуцировали ИПТГ и растили при той же температуре или при 42° С в течение трех часов, либо в течение двенадцати часов при 20°С. Суммарное количество всех форм рекомбинантных антител при выращивании клеток при 37°С составляло до 100 мг из 1 л культуры. При этом непроцессированная и зрелая формы присутствовали примерно в эквивалентном соотношении (рис. 9а и 10). Анализ бактериальных белков с помощью электрофореза в ПААГ (рис. 10) позволил выявить, что культивирование при повышенной температуре (42°С) приводит к значительному накоплению продотированных молекул одноцепочечных антиферритиновых антител, большая часть которых присутствует в растворимом виде. Длительное " выращивание при пониженной температуре также приводит к преобладанию зрелой формы гГ11 над непроцессированной. Однако, при этом процессированные молекулы большей частью находятся в нерастворимом виде. Как можно судить по данным электрофоретического анализа лизатов трансформированных клеток E.ooll наибольшее количество-(до 10 мг из одного литра культуры) растворимого одноцепочечного антитела можно было бы получить проводя индукцию и последупцее выращивание при 42°С. Однако, после такой инкубации при попытке получить периплазматическую фракцию наблюдался массовый лизис клеток, и растворимая процессированная форма попадала во фракцию растворимых белков клеток-продуцентов. В результате этого не удалось очистить функциональные одноцепочечные антитела с помощью фракционирования сульфатом аммония и

а 6

Рис. 9. Электрофоретический анализ белков индуцированных ИПТГ культур E.coli.. а - культуры бактерий, индуцированных при достижении оптической плотности 0,3, 0,6, 1,0 при 540 нм, соответственно (2,3,4) и контрольная культура (1). б - препарат, полученный после обратимой денатурации рекомбинантных антител (2) и препарат одноцепочечных антител, фракция 30-70 % насыщения сульфата аммония (1). Непроцессированная и процессированная формы одноцепочечных антител обозначены (Н) и (П), соответственно. Молекулярные массы белков-стандартов приведены в кДа.

1 2 3 4 5 6 97» —- •—

Рис. 10. Электрофоретический анализ белков индуцированных ИПТГ культур E.coli. После индукции

культуры выращивали при 20°С

(1, 2), 37°С (3, 4) и 42°С (5,

6). 1, 3, Б - фракции растворимых белков, 2, 4, 6 -фракции нерастворимых белков E.coli. Непроцессированная и процессированная формы

одноцепочечных антител

обозначены (Н) и (П), соответственно. Молекулярные массы белков-стандартов

приведены в кДа.

ионообменной хроматографии. В этом случае весьма успешной могла бы быть очистка на аффинном сорбенте, содержащем иммобилизованный антиген - селезеночный ферритин человека. К сожалению, из-за отсутствия достаточного количества этого белка (источник получения - трупный материал) получить такой сорбент не представлялось возможным,

Для перевода в растворимое состояние рекомбинантных белков из агрегатов обычно проводят инкубацию с сильным хаотропным агентом (8М мочевина или 6М гуанидин гидрохлорид). После удаления денатуранта или разбавления происходит корректная укладка белковой молекулы, позволяющая удерживаться ей в растворенном состоянии. Как можно судить по результатам гель-электрофореза (рис. 96), процедура денатурации - ренатурации приводит к появлению растворимых непроцессировадаой и зрелой формы одноцепочечных rP.t 1. Две формы rF11 можно легко разделить путем фракционирования с помощь» сульфата аммония, причем препарат, полученный при 30-70% насыщения, более чем на 80% состоит из процессированной формы одноцепочечных антител (рис. 96).

Для изучения иммунохимических свойств использовали растворимые рекомбинантные антитела Р11 из периплазмы или полученные после процедур ренатурации и последующего фракционирования сульфатом аммония. Выход первых составлял в наших экспериментах 0,25-0,3 мг (из них не менее 80% функционально активных) и вторых - 0,3-0,35 мг (не менее 70% функционально активных) иэ одного литра культуры E.coli, выращенных после индукции ИПТГ при 37°С.

Анавиэ специфичности связывания одноцепочечных антител с

Ферритином. Определение константы связывания.

Связывание ренатурированных антител гР11 с ферритином изучали с помощью иммунорадиометрического анализа. В соответствии со схемой анализа, антиген вначале инкубируется с меченными 1251 антителами, а затем комплекс антиген-антитело связывается другими антителами к ' данному антигену, иммобилизованными на твердом носителе. После освобождения от несвязавшихся меченых антител производят радиометрирование образцов. В качестве меченых одноцепочечных антител использовали иодированный препарат ренатурированных гР11 (фракция 30-70% насыщения сульфата аммония). Кроме того, анализировали конкурентное связывание одноцепочечных

антител rP11 с ферритином в присутствии нативных антител. Для этого при инкубации с ферритином в реакционную смесь вносили "холодные" моноклональные антитела в количествах, значительно превышающих уровень меченых антител. Это были либо исходные нативние антитела Р11, либо антитела 010, которые взаимодействуют с иным эпитопом на молекуле ферритина (Мельникова и др., 1993).

Как следует из данных, представленных на рис. 11, была обнаружена количественная зависимость связывания рекомбинантных антител с ферритином в диапазоне концентраций антигена 10-250 нг/мл. Присутствие в инкубационной смеси нативных моноклонштышх антител F11 приводило к полному блокированию взаимодействия меченых одноцепочвчннх антител с ферритином. В противоположность этому, добавление моноклоналышх антител Gl О, которые не конкурируют с антителами FH, не оказывало влияния на связывание одноцепочечных антител с антигеном.

Константа связывания одноцепочечных антител к ферритину человека, определенная методом Beatty et al. (1987), составила 1,7хЮ7 M"1. Она оказалась приблизительно в три раза меньше, чем определенная в тех же условиях для исходных нативных антител PI i (5хЮ7 1Г1). Подобное уменьшение константы связывания коррелирует с литературными данными для одноцепочечных антител (Glockshuber et al., 1990; Anthony et al., 1992).

Таким образом, разработанный нами способ позволил получить функционально активные рекомбинантные антитела, которые сохранили специфичность нативных моноклональных антител к ферритину человека.

РвДИОвКТИРНО? ТЬ, ИМ Г1/ МММ вООг

I, с ферритином: (1) - в отсутствие нативных антител; (2) - в присутствии антител 010; (3) - в присутствии антител 1. По оси ординат отложена разница между радиоактивностью образцов, содержавших ферритин в* концентрациях 10, 25, 100, £50 нг/мл, и контрольного. образца - О нг/мл.

Рис. 11. Иммунометрический анализ связывания одноцепочечных антител гР11, меченных

125-, _ л-™,™,,™.. и \ _ «

- 22 -ВЫВОДЫ

1. Разработана стратегия клонирования вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов из клеток гибридомных линий.

2. С помощью двух различных методов клонированы кДНК, кодирующие вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов из клеток двух гибрвдомных линий мыши, продуцирующее антитела к ферритину из селезенки человека и к белку р24 ВИЧ-1. Установлены нуклеотидные последовательности четырех новых иммуно-глобулиновых генов.

3. Клошгрован фрагмент ДНК, кодирующий сигнальный пептид пектат-лиаэы В E.carotovora. С его помощью осуществлена секреция ре-комбинантного белка в периплазматическое пространство бактериальных клеток.

4. Разработан способ сборки генов одноцепочечных антител путем ориентированного объединения фрагментов ДНК с помощью полиме-раанай цепной реакции.

5. Получена генетическая конструкция, кодирупидя ген одноцепочечных антител к маркеру раковых клеток - ферритину человека. Осуществлена ее экспрессия в клетках E.coli. Продемонстрирована способность рекомбинантных "минимальных" антител эффективно связывать ферритин из селезенки человека.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Беспалов И.А., Щиянов П.А., Лукашевич Л.В., Лупев В.Е., Трибуш С.С., Гапонова Г.И., Деев С.М. Получение одноцвпочечных антител к ферритину человека в Escherichia coli - Молекулярная биология. 1993. Т.27. С.451-460.

2. Деев С.М., Ураков Д.Н., Шиянов П.л., Морозов А.Ю., Поляновский О.Л. Функционирующие и молчащие перегруппированные гены иммуноглобулинов в геноме гибридокн - Молекулярная биология. 1993. Т.27. С.924-933.

3. Deyov S.M., Shlyanov Р.Д., Bespalov I.Д., RadJko B.V., Polanovsky O.L. Genetically engineering antibodies. Expression In oucaryotic and procaryotic cells. - Materials of International Sjraposiuu "Catalytic antibodies end antibody engineering". Moscow. 1993. P.12.

4. Deyev S.M., Shlyanov P.A., Bespalov I.A., Radko B.V., Polanovsky 0.1. Expression of chimeric and single-chain antibodies in lymphoid and nonlymphold cells. - Materials of 12th European Immunology Meeting. Barcelona. 1994. P.553.

5. Shlyanov P.A., Bespalov I.A., Terlet3kaye H.H., Deyev S.M. Sequences of the heavy and light chain variable regions of an antibody IIV44 specific to IIIV-1 - P24. - EMBL Database Accession numbers X78107, X78108.

6. Shlyanov P.A., Bespalov I.A., lukashevich I.V., lunev /.E., Tribush S.S., Gsponova 0.1., Deyev S.M. Sequences of the heavy and light chain variable regions of an antibody P11 specific to human ferritin. - EMBL Database Accession numbers X69859, £70822.

Павел Анатольевич Шиянов

КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНА ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ К ФЕРРИТЙНУ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 20.09.94 г.

Формат 60x84 I/I6. Бутл. тип. № 2. Печать офсетная.

Уч.-изд.л. 1,6. -Усл. печ. л. 1.4. Тираж 100. Заказ 120.

Отпечатано на ротапринте АНК "Институт тепло- и массообмена им. A.B. Лыкова" АН Беларуси. 220072, Минск, П.Бровки, 15.