Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммунодиагностических тест-систем с использованием золотых наночастиц и фаговой библиотеки антител

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммунодиагностических тест-систем с использованием золотых наночастиц и фаговой библиотеки антител"

На правах рукописи

Видяшева Ирина Викторовна

РАЗРАБОТКА ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ И ФАГОВОЙ БИБЛИОТЕКИ АНТИТЕЛ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 (1ЮН 2011

Саратов-2011

4850759

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН

Ведущая организация - Филиал Учреждения Российской академии нау

Института биоорганической химии им. академик М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «6» июля 2011 г. в 10.00 часов на заседаш диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиолог! растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13 Тел./факс (8452)970383.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте http://ibppm.ru

Автореферат разослан июня 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета

Научный руководитель -

доктор биологических нау старший научный сотрудн Лев Абрамович Дыкма

Официальные оппоненты:

доктор биологических нау старший научный сотрудн Михаил Иосифович Чумак

доктор биологических наук, професс Анатолий Анисимович Щербако

доктор биологических наук, с.н.с.

В.А. Богатырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Последние десятилетия стали периодом интенсивного азвития и внедрения иммунодиагностических тест-систем с использованием новых атериалов и систем регистрации. Их явные преимущества заключаются не только в ысокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета езультатов, что существенно расширяет возможности их использования, ммунодиагностические тест-системы могут быть эффективно применены как для здентификации разнообразных биологических соединений, так и для изучения их изико-химических и биохимических свойств (Дзантиев, 2010). Как правило, иологическими компонентами, используемыми в тест-системах для специфического заимодействия с антигенами (АГ), являются антитела (АТ). Способность АТ узнавать I с высокой аффинностью связываться с определенными участками АГ (антигенными етерминантами) даже в сложной смеси соединений сделала их ключевыми объектами широком диапазоне приемов обнаружения и изучения АГ. Получение и выбор одходящих АТ - необходимый этап успешного проведения иммуноанализа. радиционно это специфические поли- и моноклональные антитела. Однако, рименение как поликлональных, так и моноклональных антител сопряжено с рядом удностей.

Существуют ситуации, когда иммунизация животных по какой-либо причине евозможна или не удается обойти их толерантность к выбранному АГ. Для азрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного онирования фрагментов генов АТ, Одним из таких методов является технология агового дисплея АТ. К достоинствам метода фагового дисплея можно отнести озможность отбора клонов-продуцентов мини-антител т \itro, минуя стадию ммунизации животных, возможность получения АТ к аутоантигенам, токсинам и лабоиммуногенным соединениям, сокращение времени получения индивидуальных онов до 10-14 дней по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной ехнологии, относительную простоту получения мини-антител и их низкую ебестоимость, возможность создания гибридных молекул АТ с маркерными белками 1сСайеПу а а1., 1990).

В современной литературе встречается множество работ, посвященных получение аговых антител к различным по структуре и свойствам АГ (Мо11оу й а1., 1998; пегзёогГег е1 а1., 1999; 1ли е1 а1., 2000; Уи е1 а1., 2005; БткЬ е1 а1., 2007 и др.). Однако оличество работ по проблеме получения мини-антител против целых бактериальных еток невелико ((1е СгееЯ- е1 а1., 2000; ЫаБеет е1 а1., 2009). Работ, посвященных олучению мини-антител к бактериальной поверхности почвенных микроорганизмов в частности, азоспирилл), нами обнаружено не было.

Получение АТ к низкомолекулярным и слабо иммуногенным АГ (гаптенам) вляется ещё одной актуальной задачей современной иммунохимии. Тест-системы на снове АТ являются весьма удобным (зачастую единственным) средством ониторинга таких АГ как витамины, гормоны, антибиотики, наркотики и др. Кроме ого, АТ к отдельным участкам биомакромолекул являются незаменимым нструментом в исследованиях их структуры и топографии. Традиционно такая задача ешается с использованием химического присоединения гаптена к белковому

носителю, применением адъювантов и напряженных схем иммунизации животнь полученным конъюгатом. Однако при этом образуются АТ как против гаптена, так против иммунодетерминантных участков носителя. Причем далеко не всегда npi использовании подобного носителя развивается выраженный иммунный ответ н слабо иммуногенные АГ. Кроме того, последующая очистка и скрининг получаемы АТ трудоемки и дороги, а их титр и аффинность зачастую оказываются низким (Ковалев, Полевая, 1985).

В 1986 г. был описан способ получения АТ к ряду гаптенов in vivo использованием коллоидного золота (КЗ) в качестве носителя АГ (Shiosaka et al. 1986). В работах (Дыкман и др., 2004; Dykman et al., 2010) были приведены варианть получения АТ in vivo к большому количеству гаптенов различной природы использованием в качестве носителя золотых наночастиц. Было отмечено, что КЗ и е конъюгаты не обладает токсичностью в отношении перитонеальных клеток. Однак многие аспекты вопросов взаимодействия КЗ с клетками иммунной системы остаютс открытыми.

Таким образом, к моменту начала исследований, представленных в данно! диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с проблемам использования КЗ в качестве носителя для получения АТ к слабо иммуногенным АГ получения фаговых антител на целые клетки микроорганизмов, применен миниантител и биомаркеров на основе КЗ в исследованиях поверхностных структу клеток и в диагностических тест-системах. Их рассмотрение связано с изучение биохимических и иммунологических процессов, происходящих в ответ н проникновение в организм животных наноразмерных частиц золота, используемых качестве носителей антигенов. Мы исходили из того, что уникальные свойств наноструктурированных объектов создают, кроме всего прочего, весьм благоприятную основу для конструирования новых типов диагностических систем.

Целью диссертационной работы было усовершенствование и развитие методо получения антител к разнообразным антигенам in vitro путем селекции антител и комбинаторной фаговой библиотеки и in vivo с использованием их конъюгатов наночастицами золота и изучение механизмов взаимодействия полученнь конъюгатов с фагоцитирующими клетками иммунной системы с последующи конструированием на этой основе диагностических тест-систем.

Для достижения данной цели в работе решались следующие задачи:

1. Получить антитела к туберкулину и вирусу трансмиссивного гастроэнтерита использованием наночастиц золота в качестве носителя антигена и адъюванта.

2. Исследовать влияние золотых наночастиц и их конъюгатов с антигенами н показатели клеточного и гуморального иммунитета лабораторных животных.

3. Провести селекцию мини-антител к туберкулину, целым животным бактериальным клеткам (СПЭВ, A. brasilense) с использованием овечьей фагово библиотеки.

4. Оценить эффективность использования в иммуноанализе конъюгатов антите полученных in vivo и in vitro, с частицами коллоидного золота микроскопическими твердофазными методами.

Научная новизна работы:

впервые получены поликлональные антитела на туберкулин и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней с использованием в качестве носителя наночастиц коллоидного золота;

получены данные о влиянии коллоидного золота и его конъюгатов с вирусом и туберкулином на дыхательную активность перитонеальных макрофагов и выработку интерферона;

впервые получены мини-антитела на целые клетки Azospirillum brasilense Sp245 с использованием овечьей фаговой библиотеки;

разработаны методики экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, биоимиджинга опухолевых клеток и детекции A. brasilense Sp245.

Практическая значимость работы определяется усовершенствованием ехнологии получения антител к низкоиммуногенным антигенам с использованием ьювантных свойств наночастиц КЗ, получением экспериментальных свидетельств ффективности применения конъюгатов золотых наночастиц при вакцинации ивотных; разработкой иммунологических тест-систем для обнаружения, дентификации и изучения микроорганизмов, количественного биоимиджинга пухолевых клеток.

На защиту выносятся следующие основные положения:

. Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против туберкулина и вируса трансмиссивного гастроэнтерита; полученные антитела могут быть использованы в диагностических целях. . Взаимодействие функционализованных золотых наночастиц с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки, вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов и усиливает выработку цитокинов.

Полученные при помощи фаговой библиотеки мини-антитела к растворимым (туберкулин) и корпускулярным (СПЭВ, A. brasilense) антигенам обладают высокой специфичностью и чувствительностью и могут быть использованы для создания иммунологических тест-систем.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН по планам НИР в амках следующих бюджетных тем: «Комплексный иммунохимический анализ нтигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия икроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный уководитель - д.х.н. проф. С.Ю. Щеголев) и «Комплексный иммунохимический нализ эктосимбиотических растительно-микробных систем» (№ гос. регистрации 1200904388, научный руководитель - д.х.н. проф. С.Ю. Щеголев).

Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда ундаментальных исследований (гранты №№ 07-04-00301-а и 09-02-12442-офи_м) и фограммы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные ауки - медицине».

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другим исследователями. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с д.б.н. С.А Староверовым. На защиту вынесены только те положения и результать экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Эксперименты по оценке эффективности мечения клеток конъюгатам1 наночастиц золота были выполнены совместно с к.ф.-м.н. В.А. Ханадеевым Эксперименты по изучение поверхностных антигенов азоспирилл - совместно с д.б.н О.И. Гулий. Препараты флагеллина и липополисахарида азоспирилл были получены i любезно предоставлены к.б.н, Г.Л. Бурыгиным.

Апробация результатов. Основные результаты диссертации представлялис автором на следующих научных конференциях: Int. School for Junior Scientists an Students on Optics, Laser Physics and Biophysics (Saratov, Russia, Sept. 23-26, 2008, Sept 21-24, 2009); 5-й Московский межд. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективь развития" (Москва, Россия, 16-20 марта 2009); межд. конф., посвященная 80-лети Самарской НИВС Россельхозакадемии "Актуальные проблемы ветеринарной науки агропромышленном комплексе" (Самара, Россия, 16-17 сент. 2009); 2-я всеросс. научн конф. с межд. участием "Нанотехнологии в онкологии 2009" (Москва, Россия, 9-1 окт. 2009); межд. раб. совещ. "Инновационные подходы в профилактике, диагностик и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека Саратовской области" (Саратов, Россия, 16-17 нояб. 2009); межд. научн.-практ. конф "Вавиловские чтения - 2009" (Саратов, Россия, 25-26 нояб. 2009); 14-я Пущинск-межд. школа-конф. молодых ученых: "Биология - наука XXI века" (Пущино, Россия 19-23 апр. 2010); межд. научн. конф. "Биотехнология начала III тысячелетия' (Саранск, Россия, 26-28 мая 2010); научн.-практ. конф. "Инновации РАН - 2010' (Казань, Россия, 1-4 июня 2010); XII Intern. Conf. on Laser Applications in Life Science (Oulu, Finland, June 9-11 2010); V всеросс. конф. молодых ученых "Стратеп взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов Россия, 28 сент. - 1 окт. 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числ 6 статей, три из которых - в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной част содержащей 3 главы, заключения и списка использованных литературных источнико (275 наименований). Работа изложена на 159 страницах, иллюстрирована 4 рисунками и включает 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой литературный обзор, в котором рассмотрены проанализированы современные сведения о структуре и функциях AT. Подроби изложены способы их получения, при этом особое внимание уделено КЗ ка адъюванту и носителю АГ. Отдельно рассмотрен метод получения AT из фаговь библиотек. Приведены данные о применении AT в диагностических тест-системах, также об их клиническом использовании. Кроме того, необходимо отметить,

аждый из разделов главы 3 (полученные результаты) предваряет собственный мини-бзор, посвященный конкретной проблеме, рассматриваемой в данном разделе. В аключительной части 1-й главы формулируются нерешенные проблемы и задачи сследования.

Сведения об использованных материалах и методах изложены во главе 2. В ней еречислены использованные в работе реактивы, оборудование, среды, буферные астворы и микроорганизмы. Подробно изложена процедура получения еритонеальных макрофагов периферической крови и их использование для изучения ммунного ответа in vitro. Приведены методики иммунизации животных и получения нгител in vivo с применением в качестве носителя антигенов наночастиц золота и in itro - путем аффинной селекции специфичных клонов из комбинаторных фаговых иблиотек мини-антител. Подробно изложена методология анализа с использованием ветовой и электронной микроскопии, дот-иммуноанализа. Отдельно описаны роцедуры синтеза золотых наночастиц и их конъюгатов с АГ. Приводится описание етода оценки изменения дыхательной активности клеток и метод подсчета клеток, роме того, некоторые оригинальные методики представлены в соответствующих азделах 3-й главы.

В работе использовали бактериальные клетки A. brasilense Sp245 и Escherichia coli > 0-1 Blue, полученные из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН. Культуры ycobacterium bovis вакцинного штамма БЦЖ, М. Phlei, М, Smegmatis, Staphylococcus ureus 209-R, Brucella abortus вакцинный шт. 82 были взяты из лаборатории уберкулёза и бруцеллёза Саратовской научно-исследовательской ветеринарной анции Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИВС РАСХН). ирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) был предоставлен лабораторией актериальных и вирусных инфекций, а клеточная линия почек эмбриона свиньи СПЭВ) - лабораторией вирусологии ГНУ НИВС РАСХН. Овечья фаговая библиотека Т (Griffin. 1) любезно предоставлена профессором W.J. Harris (Aberdeen University, еликобритания).

Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований

3.1. Разработка метода идентификации возбудителя туберкулёза с применением

антител и коллоидного золота

В начале раздела помещён мини-обзор, посвященный краткой характеристике икобактерий туберкулёза, а также основным методам диагностики микобактерий с бсуждением их положительных и отрицательных сторон.

Целью данного этапа работы было изучение вопросов, связанных с механизмами содействия туберкулина на иммунную систему животного; получение оликлональных AT на туберкулин с использованием КЗ и мини-антител из фаговой иблиотеки; проведение их сравнительного анализа и разработка тест-системы дентификации возбудителя туберкулёза с применением микроскопических методов.

Известно, что AT на туберкулин при его внутрикожном введении не образуются, и ммунный ответ на него - клеточный. Поэтому получение AT на туберкулин редставляется важной задачей.

В качестве микробного антигена использовали туберкулин PPD (Purified Protein erivate). КЗ было получено по методу Френса (Frens, 1973). Средний диаметр

полученных частиц составил 15 нм при концентрации частиц 1.6-1012/мл. Конъюгаци проводили простым смешением реагентов без использования сшивающих агенто (Дыкман и др., 2008). В результате иммунизации кроликов конъюгатами и чисты туберкулином было установлено, что AT на туберкулин удается получить, тольк приготовив его конъюгаты с КЗ. Чувствительность кроличьей сыворотки определенная методом дот-анализа, составила 0.78 мкг туберкулина.

Следующей задачей было выяснение того, за счет чего происходит купировани гуморального ответа при введении туберкулина. А также того, как происход формирование иммунного ответа при иммунизации конъюгатами туберкулина с КЗ Для этого мы исследовали механизм взаимодействия туберкулина и его конъюгатов фагоцитирующими клетками иммунной системы.

Выделение перитонеальных макрофагов крыс проводили по стандартной методик (Пастер с соавт., 1989). При постановке эксперимента макрофаги ресуспендировали RPMI среде до концентрации 2-108 клеток на мл. В пробирки с клетками вносил исследуемые конъюгаты.

Мы исследовали взаимодействие КЗ с фагоцитирующими клетками использованием оценок изменений активности клеточного дыхания и активност митохондриальных дегидрогеназ перитонеальных макрофагов крыс при взаимодействии с золотыми наночастицами диаметром 15 нм. Сначала мы оценил влияние КЗ на дыхательную активность перитонеальных клеток крыс in vitro. Уровен восстановления формазана при культивировании клеток с КЗ составил 0.25±0.0 мг/мл. В контроле (без КЗ) количество восстановленного формазана было значительн ниже и составило 0.06±0.01 мг/мл. Анализ влияния КЗ на активност митохондриальных ферментов (сукцинатдегидрогеназы i

глицерофосфатдегидрогеназы) дал следующие результаты. В экспериментах сукцинатдегидрогеназой концентрация восстановленного формазана в пробах клето составила 0.0256±0.006 мг/мл, в контроле - 0.0095±0.006 мг/мл. При воздействии К на альфа-глицерофосфатдегидрогеназу концентрация восстановленного формазан составила: в пробах клеток, культивированных с КЗ, - 0.017±0.004 мг/мл, в контроле 0.015±0,004 мг/мл,

В дальнейших исследованиях использовали клетки, культивированные конъюгатами туберкулина с КЗ, и клетки, культивированные с нативны туберкулином. Измерение дыхательной активности клеток проводили использованием НСТ-теста по общепринятому методу (Bernas, Dobrucki, 2000). Проб культивировали при 37°С, после чего измеряли оптическую плотное восстановленного формазана через 4 и 6 ч после начала культивирования. В табл. показана динамика изменения дыхательной активности перитонеальных клеток кры культивированных в присутствие туберкулина и конъюгатов с КЗ. Отметим, чт туберкулин обладает токсичностью в отношении перитонеальных клеток, дыхательная активность у них через 4 ч снижалась на 37%, а через 6 ч - на 40% п сравнению с дыханием клеток контрольной группы. При культивировании конъюгато туберкулина с КЗ дыхательная активность клеток через 4 ч снижалась на 17.3%, поел чего активность клеток начинала постепенно восстанавливаться, и через 6 ч различи между пробой и контролем составляло всего лишь 7.8%.

I 1

Таблица 1. Динамика изменения дыхательной активности перитонеальных клеток крыс, культивированных в присутствие туберкулина и конъюгатов с КЗ

Время реакции Концентрация формазана, мкг/мл

туберкулин контроль КЗ+т V б ер кул и н

4ч 7.57 12.01 9.93

6ч 6.79 11.33 10.44

Оставался открытым вопрос о локализации конъюгата туберкулина с КЗ в фагоцитирующих клетках. Поэтому мы провели микроскопические исследования препаратов клеток, культивированных в присутствие туберкулина и его конъюгатов с

КЗ.

| Конъюгирование туберкулина с ФИТЦ проводили по общепринятой методике [Фримель, 1987). Полученные конъюгаты туберкулин/ФИТЦ с КЗ вносили к перитонеальным клеткам и культивировали в течение 2 ч при 37°С. При микроскопическом исследовании взаимодействия перитонеальных клеток с конъюгатом коллоидного золота с туберкулином, меченным ФИТЦ, мы обнаружили 5еленое свечение клеток, что указывает на вероятность проникновения антигена во внутриклеточное пространство.

На рис. 1а показана локализация коллоидных золотых частиц в клетках или на их мембранах. КЗ при верхнем освещении в клетках светится красным. При культивировании клеток с не конъюгированным туберкулином свечение не обнаруживается (рис. 16). Для уточнения локализации конъюгата (проникает ли он внутрь макрофагов или локализуется на мембране) мы использовали конфокальную лазерную микроскопию. Один из снятых 7-стеков приведен на рис. 2. Этот оптический <срез» демонстрирует проникновение золотых наночастиц в цитоплазму макрофагов.

Исходя из приведенных выше результатов, можно отметить, что, по-видимому, КЗ способствует повышению дыхательной активности клеток ретикулоэндотелиальной системы и, тем самым, увеличивает фагоцитирующую активность клеток. КЗ за счет проникновения во внутриклеточное пространство частично снимает токсический

а 6

Рис. 1, Темнопольное изображение перитонеальных клеток крыс, культивированных с

конъюгатом КЗ с туберкулином, меченным ФИТЦ (а) и нативным туберкулином (б)

эффект, оказываемый туберкулином на перитонеальные макрофаги крыс. Эт способствует более активному развитию гуморальной реакции и выработке AT hi туберкулин. Поэтому КЗ, можнс рекомендовать к использованию качестве носителя для получения AT на вещества, обладающие токсический эффектом. В дальнейшем полученны-AT мы использовали для разработку диагностикума на М. tuberculosis.

Следующим этапом работы сталс получение AT на туберкулин из овечьей фаговой библиотеки (мини-антител) v сравнение их активности с полноценными поликлональными AT Было проведено три раунда селекции мини-антител. При постановке иммунодот-анализа с использованием мини-антител, меченных золотыми нанооболочками (НО) было показано, что чувствительность метода составила 104-103 микробных клеток в \ мкл, тогда как при использовании поликлональных сывороток мы детектировали 400 200 микробных клеток в 1 мкл. Основные принципы дот-анализа и его реализация с частицами коллоидного золота и НО детально описаны в работах (Khlebtsov et al.! 2007; 2008).

При оценке специфичности полученных нами AT мы установили (рис. 3), чтс мини-антитела реагируют как с туберкулином, так и с клетками Mycobacterium bovis С такими микроорганизмами, как Е. coli XL-1 blue, S. aureus 209-R, В. abortw вакцинный шт. 82, полученные нами мини-антитела не реагировали. Hpi тестировании поликлональных сывороток нами были получены аналогичны« результаты.

В дальнейших исследованиях специфичности полученных AT проводили анализ возможности появления перекрестной реакции между М. bovis и атипичными штаммами микобактерий, такими как М. phlei и М. smegmatis. Было установлено (рис 4а), что полученные мини-антитела давали частичный перекрест в больши? концентрациях (от 2.5-108 клеток в мл и выше) с М. smegmatis. Перекрест мини!

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 3. Оценка специфичности AT, полученных при помощи фаговой библиотеки.

Выявление фаговых частиц проводили с использованием конъюгатов антифаговых AT с золотыми НО: 1 - мини-антитела в концентрации 1013 частиц в мл; 2 -туберкулин в концентрации 1 мг/мл; 3-М. bovis вакцинный шт. БЦЖ; 4-Е. coli XL-1 blue; 5 -S. aureus 209-R; 6 -В. abortus вакцинный шт. 82; 7- бруцеллин в концентрации 1 мг/мл

- ■ ' V; ■ IfjPWgr."

И??': -i,' -

с* •'■■

А * „ -ti

С '¿у'} • *

Рис. 2. Проникновение конъюгата КЗ с

туберкулином+ФИТЦ в

перитонеальные макрофаги

(конфокальная микпоскопия)

Антител с М. phlei в иммунодот-анализе нами обнаружен не был. При использовании [поликлональных AT наблюдалась сходная реакция (рис. 46).

Следующим этапом работы стало применение полученных AT для микроскопических исследований клеток микобактерий. На рис. 5 приведены данные Ьлектронной микроскопии по выявлению антигенных детерминант на клеточной поверхности микобактерий при помощи фаговых AT и AT, полученных in vivo с ^пользованием КЗ. Из фотографий видно, что мини-антитела выявляют туберкулин ría одном из субполярных концов клеточной поверхности микобактерий. При использовании поликлональных AT отмечено диффузное распределение АГ по всей щеточной поверхности микобактерий.

| После проведения электронной микроскопии мы оценили возможность применения полученных нами мини-антител для иммунохимического обнаружения Микобактерий в препаратах методом световой микроскопии с использованием КЗ в качестве контрастирующего агента. На рис. 6 показаны клетки М, bovis вакцинного

ш 1 А

В

•ш 1 '|А

В

а б

Рис. 4. Дот-анализ микобактерий (двойные разведения) с использованием мини-антител (а) и поликлональных AT (б) на туберкулин: А - М bovis: В - М smegmatis; С -М. phlei.

Рис. 5. Электронно-микроскопическое выявление туберкулинового антигена на клеткахМ bovis шт. БЦЖ при помощи мини-AT (А) и пАТ (Б)

■i? -

_ Л' *

i А

I •<

AN

штамма БЦЖ, выявленные мини-i антителами и контрастированые антифаговыми AT,

конъюгированными с КЗ.1 Поликлональные AT, для выявления которых использовали конъюгат антикроличьих AT с КЗ, также обнаруживали М. bovis.

Можно отметить, что при использование как фаговых, так и поликлональных AT клетки микобактерий в световой микроскопии обнаруживаются каг полиморфные палочки,

окрашенные в красный цвет Данным методом можно, вероятно,

Рис. 6. Свето-микроскопическое выявление

туберкулинового антигена на клетках М. bovis шт. БЦЖ при помощи мини-антител. Выявление фаговых частиц проводили с использованием конъюгатов антифаговых AT с КЗ (стрелкой отмечены клетки

микобактерий). _ _ _ обнаруживать микобактерии i

различных объектах окружающей среды, что становится хорошим дополнением s

имеющимся уже методам традиционной окраски. В дальнейшем полученные AT

планируется использовать для создания диагностикума на М tuberculosis.

3.2. Изучение иммуностимулирующего действия золотых наночастиц, конъюгированных с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита

В начале данного раздела представлены общие сведения о ТГС. Описывается ere строение, антигенные свойства и методы диагностики.

Целью данного этапа работы было изучение влияния конъюгатов КЗ с вирусов ТГС на дыхательную активность перитонеальных клеток мышей и выработку интерферона, а также получение поликлональных AT к вирусу ТГС с целью дальнейшей разработки на их основе антивирусных вакцин.

В нашем исследовании использовали вирус ТГС, который наращивали на клетка> линии СПЭВ. КЗ со средним диаметром частиц 15 нм получали по методу Френса Перед конъюгацией вируса ТГС с КЗ определяли золотое число. Получен!« устойчивого конъюгата КЗ с ТГС обусловлено взаимодействием белков капсидг вируса с поверхностью золотых наночастиц за счет электростатических v гидрофобных взаимодействий, а также и донорно-акцепторных связей. Конъюгации проводили простым смешением реагентов без использования сшивающих агентов.

Для изучения влияния вируса ТГС и его конъюгатов с золотыми наночастицами н' дыхательную активность белых нелинейных мышей животных делили на две группь по 10 особей, АГ вводили внутрибрюшинно в дозе 70 мкг на 20 г живой массы. Первая (контрольная) группа была иммунизирована вирусом, не содержащим КЗ. Вторук (экспериментальную) группу иммунизировали конъюгатом вируса с коллоидны^ золотом (0.1 мл, 1.6- 10й частиц). Животных иммунизировали однократно, на 2, 3, 5, j и 14 день по два животных из каждой группы забивали цервикалъной дислокацией Затем у них выделяли перитонеальные клетки (макрофаги) по стандартной методике Дыхательную активность клеток определяли в HCT-тесте.

При изучении влияния вируса ТГС и его конъюгатов с золотыми наночастицами на дыхательную активность макрофагов нами были получены следующие результаты. 'Активность дыхания перитонеальных клеток мышей, иммунизированных конъюгатом Вируса с КЗ, резко возрастала и характеризовалась на 2 день 114 пг формазана на клетку, на 5 день - 140 пг формазана на клетку. Далее на 7 и 14 дни дыхательная Активность у перитонеальных клеток постепенно снижалась до уровня 120 и 30 пг формазана на клетку, соответственно (рис. 7).

J В группе, иммунизированной неконъюгированным вирусом, на второй день нами также наблюдалось повышение дыхательной активности перитонеальных клеток, Которой соответствовало 52 пг восстановленного формазана на клетку. При этом, однако, концентрация формазана была примерно в 2-4 раза ниже по сравнению с таковой в случае иммунизации коньюгатом ТГС+КЗ. На пятый день происходило

Постепенное снижение дыхательной активности до 35 пг восстановленного формазана а клетку. В дальнейшем на 7 и 14 дни существенных изменений дыхательной активности перитонеальных клеток не наблюдалось.

Получив в опытах на мышах результаты, описанные выше, мы провели иммунизацию кроликов вирусом ТГС, его конъюгатом с КЗ и чистым КЗ для изучения влияния данных препаратов на выработку у-интерферона - одного из основных медиаторов воспаления при вирусных инфекциях - и продукцию специфичных AT.

Подопытных животных делили на три группы, в каждой из которых было по 3 кролика. Первой группе вводили АГ в концентрации 220 мкг, растворенный в 1 мл КЗ (1.6-1012 частиц). Второй группе инъецировали АГ в концентрации 220 мкг, растворенный в 1 мл физиологического раствора. Третьей группе вводили 1 мл КЗ без АГ. Иммунизацию проводили в 10 точек вдоль позвоночного столба трехкратно с интервалом в 14 дней, кровь для исследований у животных брали спустя 10 дней после последней иммунизации.

Рис. 7. Динамика изменения дыхания перитонеальных клеток мышей при их иммунизации вирусом ТГС и его конъюгатом с КЗ.

В плазме крови кроликов определяли содержание у-интерферона с' использованием тест-системы на основе ИФА. Титр специфических АТ определяли в| реакции нейтрализации (Пузанкова с соавт., 2004).

Титр вируснейтрализующих АТ был самым высоким в группе животных, иммунизированных вирусом, конъюгированным с КЗ, и составил 1:1365±591. У| кроликов, иммунизированных не конъюгированным вирусом, титр был значительно ниже и составил 1:170±74. У контрольной группы, иммунизированной КЗ без вируса,! вируснейтрализующие АТ обнаружены не были.

При определении у-интерферона в плазме крови кроликов наибольшая его! концентрация также была обнаружена у животных, иммунизированных конъюгатом вируса с КЗ, и составила 1067±10 пг/мл. В группе, иммунизированной не конъюгированным вирусом, концентрация у-интерферона была несколько ниже и составила 910±14 пг/мл, У кроликов контрольной группы (неиммунизированные животные) и в группе животных, иммунизированных чистым КЗ, концентрация у-интерферона в плазме составила 475±35 и 515±7 пг/мл, соответственно (рис. 8).

Таким образом, конъюгаты КЗ с вирусом ТГС обладают более высокой иммуномодулирующей активностью по сравнению с неконъюгированным вирусом. По-видимому, иммуностимулирующее (адъювантное) действие данного комплекса связано с активацией фагоцитирующих клеток, что приводит к улучшению| презентации антигена антителообразующим клеткам. Ранее было показано (Дыкман с соавт., 2004; 2007), что наночастицы золота, использованные в качестве носителя антигенов, активируют фагоцитарную активность макрофагов и влияют на функционирование лимфоцитов, что, возможно, и определяет их иммуномодулирующий эффект. Результаты, представленные в настоящем исследовании, возможно, послужат основой для создания антивирусных вакцин с использованием в качестве носителя антигена и адъюванта золотых наночастиц.

1200 с 1000

о 800 |

о

| 600 к

§ 400 -

1067,625

910 -Е-

515

475

-ь-

тгс

тгс+кз

КЗ

Контроль

Рис. 8. Изменение концентрации у-интерферона в сыворотки крови кроликов, иммунизированных различными антигенами.

3.3. Биоимиджинг опухолевых клеток с использованием фаговых антител и

наночастиц золота

В начало этого раздела помещён мини-обзор, посвященный характеристике современных методов диагностики и лечения опухолей с помощью наночастиц. Приведены последние данные о методах оптического имиджинга, основанного на рассеянии света, позволяющего осуществить новый подход к неинвазивной диагностике рака.

Целью данного этапа работы являлось получение мини-антител на мембранные структуры опухолевых клеток, получение конъюгатов мини-антител с КЗ и применение данных нанокомплексов для мечения опухолевых клеток.

Была использована СПЭВ - перевиваемая клеточная линия почек эмбриона свиньи; морфология - эпителиоподобная, способ культивирования - монослойный. На поверхности экспонированы опухолевые антигены лейковирусов (Мезон-Пфайфер-подобных) и онкорнавирусов А и С.

Клетки СПЭВ культивировались на КРМ1-1640 среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков (гентамицин и амфотерицин) в С02 инкубаторе при 37°С и 5% С02 в течение семи дней до концентрации 5-8-108 клеток/мл.

Мини-антитела на клетки СПЭВ были получены из овечьей комбинаторной фаговой библиотеки АТ. Для этого было проведено 3 раунда селекции по методу, описанному в работе (Костеша и др., 2005). Полученные специфичные фаги были проверены методом дот-анализа.

Кроличьи АТ к фагам были получены путем иммунизации кролика по протоколу из руководства по иммунологическим методам (Фримель, 1984). Сотрудниками лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН были изготовлены золотые НО на ядрах из двуокиси кремния (\Vestcott е1 а1., 1998). Для тиолирования кроличьих антифаговых антител использовали ОРББ-РЕО-ЫНБ. Для дот-анализа использовали бычий сывороточный альбумин (контроль) и овечьи антитела к иммуноглобулинам ^О кролика.

Выращенные клетки СПЭВ дважды отмывали в 0.2 М фосфатном буфере и Рис. 9. Схема непрямого мечения смешивали с фагами из расчета 500 фагов на клеток СПЭВ. На первом шаге клетку (\Villingham, 1994) и оставляли клетки СПЭВ инкубировались с реагировать на ночь при 4°С. Схема фаговыми АТ (Ф). На втором протокола мечения показана на рис. 9. шаге, клетки, покрытые мини- На первом шаге клетки СПЭВ антителами, инкубировали с инкубировались с мини-антителами. Затем конъюгатами НО с кроличьими мечеНые фаговыми АТ («опыт») и антифаговыми АТ._ немеченые («контроль») клетки

Рис. 9. Схема непрямого мечения

клеток СПЭВ. На первом шаге клетки СПЭВ инкубировались с фаговыми АТ (Ф). На втором шаге, клетки, покрытые мини-антителами, инкубировали с конъюгатами НО с кроличьими антифаговыми АТ.

инкубировали с конъюгатами золотых НО с кроличьими антифаговыми ATf| Конъюгаты золотых нанооболочек с антифаговыми AT биоспецифически связывались лишь с клетками, на поверхности которых присутствовали мини-антитела, а в случае «контроля» биоспецифического мечения не происходило.

Затем по 100 мкл конъюгатов НО добавляли к 1 мл меченных фагами и немеченый (контрольных) клеток СПЭВ, инкубировали в течение 1 ч и отмывали центрифугированием при 180 g 10 мин. Клетки «контроля» не изменили цвета после инкубации с конъюгатом - в пробирке после центрифугирования образовывался типичный клеточный осадок серого цвета, тогда как в пробирке с клетками, мечеными фаговыми AT, наблюдался осадок зелёного цвета, что свидетельствовало об успешном присоединении конъюгатов золотых НО. Для фиксации сформировавшихся комплексов использовали 3.7% раствор формалина в воде. Фотографии для анализа получали в режиме тёмного поля на микроскопе Leica DM 2500.

Для проверки качества конъюгатов НО с антифаговыми AT и их способности связываться с адсорбированными фаговыми мини-антителами мы использовали метод: дот-анализа. Методом дот-анализа проверяли взаимодействие клеток СПЭВ с фаговыми мини-антителами, которое выявляли с помощью конъюгата НО (рис. 10).

В первую клетку верхнего ряда мембраны наносили 1 мкл суспензии клето = СПЭВ (с концентрацией примерно 107 клеток/мл). В следующие клетки этого ряда наносили двукратные разведения образца, нанесённого в первую клетку. В качества негативного контроля в клетки нижнего ряда слева направо наносили лимфоцить: крысы с той же концентрацией, как и СПЭВ. Для предотвращения неспецифическогс связывания блокировали мембрану в 2% растворе сухого молока в течение 1 ч. Длг| адсорбции фаговых мини-антител на поверхности клеток инкубировали мембрану с фаговыми AT в течение 1 ч. После этого ее помещали в раствор конъюгато! нанооболочек на 30 мин. Для клеток СПЭВ видны окрашенные пятна вплоть дс концентрации клеток около 106 клеток/мл. Для негативного контроля окрашивания н; происходило. Окрашивания так же не происходило и в случае клеток СПЭВ немеченых фаговыми антителами (данные не представлены).

Фотографии клеток СПЭВ, меченных НО, были получены методом темнопольнои микроскопии с помощью микроскопа Leica 2500 DM, оборудованного цветной ПЗС камерой с использованием объектива с 40-кратным увеличением. Все изображен^

меченых и «контрольных» клето! получали при одинаковы? условиях освещения. Н; темнопольных снимках НС выглядят как красные цветны: пятна за счет интенсивногс рассеяния света.

На рис. 11 приведень темнопольные фотографин

клеток СПЭВ, которьк инкубировались только I конъюгатами НО |

антифаговыми AT (а) а так ж<

■СПЭВ

. Лимфоциты крысы

т Двукратные разведения »

Рис. 10. Дот-анализ биоспецифического

взаимодействия между клетками линии СПЭВ (двойные разведения, начальная концентрация 107 кл/мл) и фаговыми АТ, мечеными конъюгатом НО с кроличьими антифаговыми АТ. Нижний ряд -отрицательный контроль (лимфоциты крысы).

а б

Рис. 11. Темнопольные изображения клеток СПЭВ, инкубированных с конъюгатами золотых НО (негативный контроль, а), и клеток СПЭВ, которые инкубировались с мини-АТ и затем с конъюгатами золотых НО (б). На вставке показан увеличенный фрагмент, на котором отчетливо видно красное рассеяние света от адсорбированных золотых НО.

¡¡шеток СПЭВ, которые сначала инкубировались с фаговыми AT и затем с конъюгатами НО (б). На темнопольных изображениях отчетливо была видна разница между биоспецифически мечеными (фаговые АТ+конъюгат), неспецифически ¡печеными (только конъюгаты НО) и не мечеными клетками. Однако визуально рценить эффективность мечения достаточно сложно. Поэтому для проведения количественного анализа и сравнения эффективности специфического и неспецифического мечения нами был использован новый метод оценки эффективности мечения клеток резонансно рассеивающими наночастицами, разработанный сотрудниками лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН. Данный метод позволяет достоверно отличить неспецифическое связывание от негативного контроля и в количественной форме выразить эффективность биоспецифического связывания коньюгатов с клетками.

3.4. Получение мини-антител к поверхностным антигенам A. brasilense Sp245 и их использование для детекции микробных клеток

Получение мини-антител к АГ азоспирилл осуществляли путем селекции фагов из овечьей фаговой библиотеки Griffin. 1. Концентрацию фаговых частиц определяли пектрофотометрически, используя для расчетов следующее соотношение: А269=30 ~ 2-Ю14 фаговых частиц/мл. Нами было проведено 3 раунда селекции мини-антител на целые клетки A. brasilense Sp245 и I раунд селекции на ЛПС и флагеллин с использованием клонов, обладающих более высокой чувствительностью и продукционной активностью.

Чувствительность полученных фаговых частиц определяли методом дот-анализа (рис. 12). Из представленных данных видно, что чувствительность фаговых AT увеличилась после 3-го раунда селекции. Титр полученных фаговых мини-антител составил 1: 8000.

Далее был проведён дот-анализ ЛПС и флагеллина клеток A. brazilense Sp245 с использованием мини-антител, полученных после четвертого раунда селекции (рис. 13).' Из представленных данных видно, что мини-антитела на ЛПС обладают большей чувствительностью по сравнению с мини-антителами на флагеллин.

Для электронно-микроскопической идентификации взаимодействия клеток А.\ brasilense Sp245 с мини-антителами готовили препараты с концентрацией клеток 106 кл/мл, инкубировали 0.5 мл суспензии-микроорганизмов в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с 10 мк раствора гомологичных AT с концентрацией 100 мкг/мл в течение 1 ч на шейкере. После чего центрифугировали суспензию пр 12000 g 5 мин и ресуспендировали осадо» клеток в 0.5 мл ЗФР. Инкубировал?: суспензию со 100 мкл раствора маркера антифаговые АТ+КЗ (£)52о=0.5) в течение 1 ч| Повторяли операции осаждения к ресуспендирования. Приблизительно 20 мк суспензии наносили на пленку («Parafilm»! США) и помещали на каплю никелевую сеточку с нитроцеллюлозной подложкой укрепленной углеродом, на 20 мин. Осуществляли тепловое прикрепление, удерживав сеточку около лампы накаливания 2 мин. Анализ проводили с помощью электронног микроскопа Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) (рис. 14).

Как видно по этим результатам, полученные нами фаговые мини-антителг располагаются по всей клеточной поверхности в случае ЛПС и, вероятно, т

©

О

• в

Рис. 12. Дот-анализ целых клеток Л. brazilen.se вр245 с использованием фаговой библиотеки, обогащенной после второго (А) и третьего (В) раундов селекции. Выявление проводили с использованием конъюгатов антифаговых АТ с КЗ.

I

_ В

Рис. 13. Дот-анализ ЛПС (А) и

флагелина (В) с использованием фаговой библиотеки, обогащенной после четвёртого раунда селекции. Выявление фаговых частиц проводили с использованием конъюгатов ангифаговых АТ с золотыми НО.

а б

Рис. 14. Электронно-микроскопическое выявление антигенов клеточной поверхности Л. бгая'/етме 8р245с помощью мини-АТ на ЛПС (а) и флагеллин (б).

(обломке» жгутика в случае с флагеллином. Из данного эксперимента можно сделать ывод, что на основе мини-антител и коллоидного золота можно разработать тест-истему для изучения клеточной поверхности бактерий.

Сотрудниками лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФРМ РАН были роведены измерения электрооптических параметров клеток A. brasilense Sp245 при взаимодействии с полученными нами мини-антителами. Эффект лектроориентации бактериальных клеток в переменном электрическом поле ценивали с использованием электрооптического анализатора ELUS («ГНЦ ПМБ», оссия). Полученные результаты показывают, что при взаимодействии клеток А. rasilense Sp245 с мини-антителами на соматический антиген и с мини-антителами на лагеллин происходит значительное изменение величины ЭО-сигнала, отражающее вменение электрической поляризуемости клеток при адсорбции на них специфичных нтител. Мы полагаем, что эти результаты могут быть использованы для создания еста быстрой детекции микробных клеток и оценки экспонированности тех или иных нтигенных детерминант в составе клеточной поверхности бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показывают, что обнаруженное ранее наличие у наночастиц олота свойств эффективного носителя антигенов и адъюванта имеет, вероятно, остаточно общее значение и распространяется также на использованный в данной аботе набор антигенов самой разной природы. Комплекс КЗ с антигеном не только силивает активность фагоцитирующих клеток, но и повышает титр антител к водимому антигену, что может указывать на стимуляцию золотыми наночастицами еток лимфоидного ряда. На основании полученных данных мы предложили врианты ммунологических тест-систем с использованием поликлональных и фаговых AT для етекции и изучения микроорганизмов. В рамках работы были получены данные о озможности применения конъюгатов золотых наночастиц при вакцинации животных, езультаты, полученные в данной работе, могут найти применение в таких областях, ак иммуноанализ, ветеринария, фототермальная терапия и биоимиджинг.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что использование частиц коллоидного золота в качестве носителя для туберкулина и TTC при иммунизации животных приводит к получению эффективного иммунного ответа за счет проявления адъювантных свойств золотых наночастиц.

2. Обнаружено, что при взаимодействии с клетками ретикулоэндотелиальной системы туберкулин, конъюгированный с золотыми наночастицами, проникает в перитонеальные клетки и усиливают их митохондриальное дыхание. При этом введение самого коллоидного золота в популяцию перитонеальных клеток также приводит к повышению их дыхательной активности.

3. Введение комплекса наночастиц золота с вирусом ТГС в организм подопытного животного не только повышает активность фагоцитирующих клеток, но и увеличивает титр антител, полученных к вводимому антигену, а также усиливает выработку интерферона.

4. Впервые полученные мини-антитела на туберкулин, целые клетки A. brasilense Sp245 и клетки линии СПЭВ, показали высокую чувствительность специфичность в микроскопических и твердофазных методах иммуноанализа.

5. На основе антител из фаговой библиотеки и иммунозолотых маркеро разработаны иммунологические тест-системы для диагностики возбудите, туберкулёза, биоимиджинга опухолевых клеток и детекции A. brasilense Sp245.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах

l.Staroverov S.A., Aksinenko N.M., Gabalov K.P., Vasilenko O.A., Vidyasheva I.V. Shchyogolev S.Yu., Dykman L.A. Effect of gold nanoparticles on the respirato activity of peritoneal macrophages // Gold Bull. - 2009. - V. 42, No, 2. - P. 153-156.

2.Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Staroverov S.A., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A. Ilineva E.S., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Quantitative eel bioimaging using gold nanoshell conjugates and phage antibodies // J. Biophotonics. 2011.-V. 4, No. 1-2.-P. 74-83.

3.Староверов С.А., Видяшева И.В., Габалов К.П., Василенко O.A., Ласкавый В.Н. Дыкман JI.A. Изучение иммуностимулирующего действия золотых наночастиц конъюгированных с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита // Бюлл. Эксп Биол. Мед. - 2011. - Т. 151, No. 4. - С. 418-421.

Статьи в сборниках научных трудов

4. Староверов С.А., Видяшева И.В., Габалов К.П., Василенко O.A., Ласкавый В.Н. Дыкман Л.А. Изучение иммуностимулирующего действия комплексо коллоидного золота с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней "Актуальные проблемы ветеринарной науки в агропромышленном комплексе" Матер. межд, конф., посвященной 80-летию Самарской НИВ Россельхозакадемии. -Самара: Изд-во "Матрикс", 2009. - С. 438-442.

5.Кочанова И.А., Бурыгин Г.Л., Староверов С.А., Видяшева И.В., Крючкова Е.В. Дыкман Л.А. Выявление бактерий-деструкторов глифосата с применение фаговых мини-антител // "Вавиловские чтения - 2009" / Матер, межд. научн. практ. конф. -Саратов: Изд-во "Научная книга", 2009. - С. 37-38.

6. Староверов С.А., Видяшева И.В., Дыкман Л.А. Золотые наночастицы ка средства внутриклеточной доставки антигенов и лекарственных веществ "Инновации РАН - 2010" / Матер, научн.-практ. конф, -Казань: Изд-во "Слово' 2010. - С. 390-393.

Тезисы докладов

7. Vidyasheva I.V., Vasilenko O.A., Staroverov S.A., Dykman L.A. Obtaining о antibodies to tuberculin with use gold nanoparticles // Saratov Fall Meeting SFM'08, Workshop on Nanobiophotonics IV, Saratov, Russia, Sept. 23-26, 200 http://optics.sgu.ru/SFM/2008/report/705.

8. Дыкман Л.А., Староверов С.А., Богатырев В.А., Видяшева И.В., Щёголев C.I Иммуногенные свойства наночастиц золота // Матер. 5-го Московского мея конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития". -М.: ЗАО "Эксп биохим-технологии", 2009. - С. 58.

9.Khanadeev V.A., Staioverov S.A., Khlebtsov B.N., Vidyasheva I.V., Skaptsov A.A., lleneva E.S., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Cancer cell imaging with gold nanoshells conjugated to phage miniantibodies // Saratov Fall Meeting -SFM'09, Workshop on Nancbiophotonics V, Saratov, Russia, Sept. 21-24, 2009. http://optics.sgu.rn/SFM/2009/report/795.

10. Ханадеез В.А., Староверов C.A., Хлебцов Б.Н.. Видяшева И.В., Скапцов A.A., Иленева Е.С., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Н.Г. Количественный бионмиджинг раковых клеток с использованием плазмонно-резонансного светорассеяния и непрямого мечения золотыми нанооболочками через фаговые мини-антитела // Вторая всеросс. научн. конф. с межд. участием "Нанотехнологии в онкологии 2009", Москва, Россия, 9-10 окт. 2009. - С. 34-35.

11. Дыкман Л.А., Староверов С.А.. Видяшева И.В., Щёголев С.Ю., Игнатов В.В. Использование наночастиц для внутриклеточной доставки антигенов и лекарственных веществ //Матер, межд. раб, совещ. "Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области", Саратов, Россия, 16-17 нояб. 2009. - С. 20-21.

12. Староверов С.А, Видяшева И.В., Габалов К.П., Василенко O.A., Ласкавый В.Н., Богатырев В.А., Щёголев С Ю., Игнатов В.В., Дыкман Л.А. Обоснование новых подходов к профилактике туберкулеза // Там же. - С. 71-72.

13. Хлебцов Н.Г., Богатырев В А,, Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Староверов С.А., Бурыгин Г.Л., Максимова И.Л., Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г.. Ханадеев В.А., Пылаев Т.Е., Видяшева И.В. Создание биомаркеров на основе наночастиц с настраиваемым плазмонным резонансом для биомедицинских применений // "Фундаментальные науки - медицине", Тезисы докладов конференций и семинаров по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН в 2009 г., -М: Фирма "Слово", 2009. - С. 94-95.

14. Видяшева И.В., Староверов С.А., Дыкман Л.А. Использование фаговых мини-антител, конъюгированных с наночастицами золота, в диагностике инфекционных заболеваний // 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых: "Биология - наука XXI века", Пущино, Россия, 19-23 апр. 2010. - С. 235.

15. Дыкман Л.А., Староверов С.А., Богатырев В.А., Видяшева И.В., Щёголев С.Ю. Наноиммунологический метод получения антител /./ Межд. научн. конф. "Биотехнология начала Ш тысячелетия", Саранск, Россия, 26-28 мая, 2010, - С. 109.

lö.Khanadeev V.A., Khlebtsov B.N., Staioverov S.A.. Vidyasheva I.V., Bogatyrev V.A., Dykrnan L.A., Khlebtsov N.G. Quantitative cell bioimaging using resonance scattering from gold-nanoshell bioconjugates // XII Intern. Conf. on Laser Applications in Life Sciences, Oulu, Finland, June 9-11, 2010. - P. 112.

17.Видяшева И.В., Староверов С.А., Гулий О.И., Игнатов О.В., Дыкман Л.А. Получение фаговых антител к поверхностным антнгенам азослирилл // Матер. V всеросс. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой", Саратов, Россия, 28 сент. - 1 окт. 2010, -Саратов: Научная книга. - С. 42.

18,Хлебцов Н.Г., Ханадеев В.А., Пылаев Т.Е., Видяшева И.В., Панфилова Е.В. Гасина O.A., Хлебцов Б.Н., Богатырев В.А., Дыкман JI.A., Староверов С.А. Максимова И.Л., Терентюк Г.С., Тучин В.В. Золотые и композитны наночастицы для применений в качестве термосенсибилизаторов, биомаркеро и адъювантов // "Фундаментальные науки - медицине", Тезисы докладо конференций и семинаров по научным направлениям Программ фундаментальных исследований Президиума РАН в 2010 г., -М.: Фирм "Слово", 2010. - С. 104-105.

Примечание: исследования с использованием вакцинных штаммов и вирусов проводились на базе ГНУ НИВС РАСХН.

Подписано к печати 1.06.2011. TapHinypa Times New Roman 10. _Формат 60x84 1/16. Объем 1 усл. печ. л. Тираж 100 экз._'

Отпечатано в ИБФРМ РАН 410049 Саратов, пр. Энтузиастов 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Видяшева, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Анализ литературы и постановка задач исследования.

1.1. Структурная организация и основные функции антител.

1.2. Методы получение антител in vivo и in vitro.

1.2.1 Получение поликлональных антител.

1.2.1.1. Адъюванты.

1.2.1.2. Носители.

1.2.1.3. Использование наночастиц золота в качестве носителей антигенов и адъюванта.

1.2.2. Получение моноклональных антител.

1.2.3. Фаговый дисплей на основе нитевидных бактериофагов.

1.2.3.1. Нитевидные фаги.

1.2.3.2. Получение мини-антител с использованием комбинаторных фаговых библиотек.

1.3. Применение антител в исследовательских, аналитических и терапевтических целях.

1.3.1 Использование антител в диагностических целях.

1.3.2. Клиническое применение антител.

1.4. Постановка задач исследования.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Оборудование.

2.3. Среды, буферные растворы и микроорганизмы, использованные в работе.

2.4. Получение коллоидного золота.

2.5. Получение конъюгатов антигенов с коллоидным золотом.

2.6. Получение перитонеальных макрофагов:.

2.7. Измерение дыхательной активности клеток.

2.8. Иммунизация животных и получение антител.

2.9. Аффинная селекция мини-антител из фаговой библиотеки.

2.10. Световая микроскопия бактерий.

2.11. Электронная микроскопия бактерий.

2.12. Дот-иммуноанализ фаговых антител.

2.13. Получение антифаговых антител.

2.14. Подсчет клеток в камере Горяева.

Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований.

3.1. Разработка метода идентификации возбудителя туберкулёза с применением антител и коллоидного золота.

3.1.1. Основные современные методы диагностики и дифференциальной диагностики туберкулёза.

3.1.2. Изучение взаимодействия туберкулина и его конъюгатов с клетками иммунной системы.

3.1.3. Применение поликлональных антител и мини-антител для идентификации возбудителя туберкулёза, с использованием световой и электронной микроскопии.

3.2. Изучение иммуностимулирующего действия золотых наночастиц, конъюгированных с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита.

3.2.1. Антигенные свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

3.2.2. Методы диагностики трансмиссивного гастроэнтерита.

3.2.3. Изучение влияния конъюгатов коллоидного золота с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней на дыхательную активность перитонеальных клеток мышей.

3.2.4. Получение поликлональных антител на вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

3.3. Биоимиджинг опухолевых клеток с использованием фаговых антител и наночастиц золота.

3.3.1. Современные методы диагностики и лечения опухолей с помощью коллоидных частиц.

3.3.2. Получение мини-антител на клетки СПЭВ и кроличьих антифаговых антител.

3.3.3. Синтез нанооболочек и их конъюгация с антителами.

3.3.4. Биоспецифическое мечение клеток СПЭВ.

3.3.5. Исследование мечения клеток конъюгатами нанооболочек методом дот-анализа.

3.3.6. Темнопольная микроскопия клеток СПЭВ с использованием конъюгатов мини-антител с нанооболочками.

3.4. Получение мини-антител к поверхностным антигенам Агозр1гШит ЬгаэИепБе Эр245 и их использование для детекции микробных клеток.

3.4.1. Краткая характеристика бактерий рода АговртПит.

3.4.2. Использования фагового дисплея антител для получения мини-антител против целых бактериальных клеток.

3.4.3. Получение мини-антител на поверхностные антигены А. ЬгаэНепБе Бр245.

3.4.4. Использование фаговых антител для исследования и детекции бактериальных клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммунодиагностических тест-систем с использованием золотых наночастиц и фаговой библиотеки антител"

Последние десятилетия стали периодом интенсивного развития и внедрения иммунодиагностических тест-систем с использованием новых материалов и систем регистрации. Их явные преимущества заключаются не только в высокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета результатов, что существенно расширяет возможности их использования. Иммунодиагностические тест-системы могут быть эффективно применены как для идентификации разнообразных биологических соединений, так и для изучения их физико-химических и биохимических свойств. Традиционно биологическими компонентами, используемыми для специфического связывания при детекции клеток, являются антитела. Получение и выбор подходящих антител - необходимый этап успешного проведения иммуноанализа.

Антитела (АТ) представляют собой сывороточные гликопротеины н глобулиновой фракции и относятся к классу иммуноглобулинов В организме животных АТ вырабатываются в ответ на проникновение антигена (АГ) лимфоцитами и плазматическими клетками лимфатических узлов, селезенки и костного мозга. Способность АТ узнавать и с высокой аффинностью связываться с определенными участками АГ (антигенными детерминантами) даже в сложной смеси соединений сделала АТ ключевыми объектами в широком диапазоне приемов обнаружения антигенов [1].

АТ широко используются в исследовательских, аналитических и терапевтических целях, для определения биологически активных веществ [2], локализация очагов опухолевого роста [3], в онкологии [4], в терапевтических целях для нейтрализации токсинов. С помощью АТ к групповым АГ крови оценивают совместимость крови донора и реципиента. АТ применяют для идентификации возбудителей различных заболеваний и для идентификации АГ в судебно-медицинской практике [2]. АТ находят применение в исследованиях для выделения (иммуноаффинная хроматография) и характеристики биомолекул [3].

Традиционно используются специфические поли- и моноклональные антитела. Однако, применение как поликлональных антител (пАТ), так и моноклональных антител (мАТ) имеет ряд недостатков. В последние десятилетия для повышения специфичности АТ и снижения их себестоимости активно развивают технологию фагового дисплея АТ.

Существуют ситуации, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти их толерантность к выбранному АГ. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов-АТ [4]. Одним из таких методов является техника фагового дисплея АТ. К достоинствам метода фагового дисплея можно отнести возможность отбора клонов-продуцентов мини-антител т уИго, минуя стадию иммунизации животных, возможность получения АТ к аутоантигенам, токсинам и слабоиммуногенным соединениям, отсутствие необходимости использования лабораторных животных и сокращение времени получения индивидуальных клонов до 1014 дней по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии.

Получение АТ к низкомолекулярным и низкоиммуногенным АГ остается одной из самых актуальных задач современной иммунохимии. Тест-системы на основе АТ являются весьма удобным (зачастую единственным) средством мониторинга в разнообразных объектах таких веществ, как антибиотики, гормоны, витамины, нейромедиаторы, пестициды и др. Кроме того, АТ к отдельным участкам биомакромолекул (гаптенам) являются незаменимым инструментом в исследованиях их структуры и топографии. Традиционно такая задача решается с использованием химического присоединения гаптена к белковому носителю, применением адъювантов и напряженных схем иммунизации животных полученным конъюгатом. Однако при этом образуются АТ как против гаптена, так и против иммунодетерминантных участков носителя. Поэтому весьма актуальным является разработка новых носителей (систем доставки) и адъювантов, включая частицы нанометровых размеров. Данная работа, в частности, посвящена изучению биохимических и иммунологических процессов, происходящих в ответ на применение наноразмерных частиц золота в качестве носителей антигенов. Это связано с тем, что уникальные свойства наноструктурированных объектов создают весьма благоприятную основу для конструирования новых типов лекарственных форм и диагностических систем.

Целью диссертационной работы было усовершенствование и развитие методов получения антител к разнообразным антигенам in vitro путем селекции антител из комбинаторной фаговой библиотеки и in vivo с использованием их конъюгатов с наночастицами золота и изучение механизмов взаимодействия полученных конъюгатов с фагоцитирующими клетками иммунной системы с последующим конструированием на этой основе диагностических тест-систем.

В ходе реализации данной цели были получены результаты, научная новизна которых заключается в следующем:

- впервые получены поликлональные антитела на туберкулин и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней с использованием в качестве носителя наночастиц золота;

- изучено влияния коллоидного золота и его конъюгатов с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита и туберкулином на дыхательную активность перитонеальных клеток мышей;

- впервые получены мини-антитела на целые клетки Azospirillum brasilense Sp245 с использованием овечьей фаговой библиотеки;

- разработаны методики для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, биоимиджинга опухолевых клеток и детекции А. brasilense Sp245.

Практическая значимость работы определяется усовершенствованием технологии получения АТ к низкоиммуногенным АГ с использованием адыовантных свойств наночастиц КЗ, получением экспериментальных свидетельств эффективности применения конъюгатов золотых наночастиц при вакцинации животных; разработкой иммунологических тест- систем для обнаружения, идентификации и изучения микроорганизмов, количественного биоимиджинга опухолевых клеток.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против туберкулина и вируса трансмиссивного гастроэнтерита; полученные антитела могут быть использованы в диагностических целях.

2. Взаимодействие функционализованных золотых наночастиц с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в.фагоцитирующие клетки, вызывает стимулирование ' дыхательной активности макрофагов и усиливает выработку цитокинов.

3. Полученные при помощи фаговой библиотеки мини-антитела к растворимым (туберкулин) и корпускулярным (СПЭВ, A. brasilense) антигенам обладают высокой специфичностью и чувствительностью и могут быть использованы для создания иммунологических тест-систем.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель - д.х.н. проф. С.Ю. Щеголев) и «Комплексный иммунохимический анализ эктосимбиотических растительно-микробных систем» (№ гос. регистрации 01200904388, научный руководитель - д.х.н. проф. С.Ю. Щеголев).

Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 07-04-00301-а и 09-02-12442-офим) и программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с д.б.н. С.А. Староверовым. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Эксперименты по оценке эффективности мечения клеток конъюгатами наночастиц золота были выполнены совместно с к.ф.-м.н. В.А. Ханадеевым. Эксперименты по изучение поверхностных структур азоспирилл - совместно с д.б.н. О.И. Гулий. Препараты флагеллина и липополисахарида» азоспирилл были получены и любезно предоставлены к.б.н. Г.Л. Бурыгиным.

Апробация результатов

Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях: Int. School' for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics (Saratov, Russia, Sept. 23-26, 2008, Sept. 21-24, 2009); 5-й Московский межд. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 16-20 марта 2009); межд. конф., посвященная 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии "Актуальные проблемы ветеринарной науки в агропромышленном комплексе" (Самара, Россия, 16-17 сент. 2009); 2-я всеросс. научн. конф. с межд. участием "Нанотехнологии в онкологии 2009" (Москва, Россия, 9-10 окт. 2009); межд. раб. совещ. "Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области" (Саратов, Россия, 16-17 пояб. 2009); межд. научн.-практ. конф. "Вавиловские чтения - 2009" (Саратов, Россия, 25-26 нояб. 2009); 14-я Пущинская межд. школа-конф. молодых ученых: "Биология — наука XXI века" (Пущино, Россия, 19-23 апр. 2010); межд. научн. конф. "Биотехнология начала III тысячелетия" (Саранск, Россия, 26-28 мая 2010); научн.-практ. конф. "Инновации РАН - 2010" (Казань, Россия, 1-4 июня 2010); XII Intern. Conf. on Laser Applications in Life Sciences (Oulu, Finland, June 9-11 2010); V всеросс. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, Россия, 28 сент. — 1 окг. 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 статей, три из которых - в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 3 главы, заключения и списка использованных литературных источников (275 наименований). Работа изложена на 159 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и включает 2 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Видяшева, Ирина Викторовна

На основании полученных данных мы предложили варианты иммунологических тест-систем для детекции и изучения микроорганизмов. В рамках работы были получены данные о возможности применения конъюгатов золотых наночастиц при вакцинации животных. Результаты, полученные в данной работе, могут найти применение в таких областях, как иммуноанализ, ветеринария, фототермальная терапия и биоимиджинг. На основании данных исследований можно сделать следующие ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что использование частиц коллоидного золота в качестве носителя для туберкулина и ТГС при иммунизации животных приводит к получению эффективного иммунного ответа за счет проявления адъювантных свойств самих золотых наночастиц.

2. Обнаружено, что при взаимодействии с клетками ретикулоэндотелиальной системы туберкулин, конъюгированный с золотыми наночастицами, проникает в перитонеальные клетки и усиливают их митохондриальное дыхание.

3. Введение комплекса наночастиц золота с вирусом ТГС в организм подопытного животного увеличивает титр антител, полученных к вводимому антигену, а также усиливает выработку интерферона.

4. Впервые полученные мини-антитела на туберкулин, целые клетки А. brasílense Sp245 и клетки линии СПЭВ, показали высокую чувствительность и специфичность в микроскопических и твердофазных методах иммуноанализа.

5. На основе антител из фаговой библиотеки и иммунозолотых маркеров разработаны иммунологические тест-системы для диагностики возбудителя туберкулёза, биоимиджинга опухолевых клеток и детекции A. brasilense Sp245.

БЛАГОДАРНОСТИ

Считаю приятным долгом выразить глубокую признательность директору ИБФРМ РАН заведующему лабораторией иммунохимии д.х.н профессору Сергею Юрьевичу Щёголеву и научному руководителю д.б.н. Льву Абрамовичу Дыкману за постоянную помощь и полезные советы при выполнении и оформлении диссертации.

Я хочу выразить свою искреннюю благодарность сотрудникам Лаборатории иммунохимии и Лаборатории нанобиотехнлогии ИБФРМ РАН - д.б.н. Староверову С.А., д.б.н. Богатыреву В.А., д.ф.-.м.н. Хлебцову Н.Г., к.ф.-.м.н. Хлебцову Б.Н., к.б.н. Бурыгину Г.Л., к.ф.-м.н. Мельникову А.Г., к.ф.-м.н. Ханадееву В.А. и сотрудникам других лабораторий ИБФРМ д.б.н. Соколову О.И., д.б.н. Игнатову О.В., д.б.н. Гулий О.И., к.б.н. Соколовой М.К., к.х.н. Бурову A.M. за содействие и поддержку при выполнении и оформлении данной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Из данных литературного обзора и оригинальных исследований можно сделать вывод о широких перспективах применения пАТ, полученных с помощью КЗ и мини-АТ из фаговой библиотеки. В данной работе мы попытались подробно рассмотреть и усовершенствовать данные технологии получения АТ, а также сравнить их по чувствительности и специфичности. Были также проведены исследования посвященные взаимодействию КЗ и конъюгатов АГ - КЗ с иммунной системой организма.

В результате проведенных исследований хочется отметить, что КЗ за счет проникновения во внутриклеточное пространство частично снимает токсический эффект, оказываемый туберкулином на перитонеальные макрофаги крыс. Это способствует более активному развитию гуморальной • реакции и выработке АТ на туберкулин. Поэтому КЗ, можно использовать как носитель для получения АТ на вещества, обладающие токсическим, -эффектом.

Использование мини-АТ и пАТ позволяет обнаружить клетки микобактерий при световой микроскопии как полиморфные палочки, • окрашенные в красный цвет, что в дальнейшем может позволить обнаруживать микобактерии в различных объектах окружающей среды и быть хорошим дополнением к имеющимся уже методам окраски. Кроме того, используя специфические АТ, данным методом можно в дальнейшем проводить дифференциальную диагностику микобактерий.

Конъюгаты КЗ с вирусом ТГС обладают более высокой иммуномодулирующей активностью по сравнению с неконъюгированным вирусом. По-видимому, иммуностимулирующее действие данного комплекса связано с активацией фагоцитирующих клеток, что приводит к улучшению презентации антигена антителообразующим клеткам. Наиболее интересным аспектом проявления антигенами иммуногенных свойств при их иммобилизации на золотых наночастицах является то, что наночастицы. золота выступают и в роли адъюванта, и в роли носителя, т.е. представляют гаптен Т-клеткам. Было обнаружено влияние наночастиц золота, конъюгированных с антигеном, на активацию Т-клеток. Этот факт показывает принципиальную возможность целенаправленно активировать Т-клетки, с последующей активацией макрофагов и • уничтожением возбудителя. Результаты, представленные в настоящем исследовании, возможно, послужат основой для создания антивирусных вакцин с использованием в качестве носителя антигена и адъюванта золотых наночастиц.

Одним из этапов работы стало получение мини-АТ на поверхностные структуры клеток СПЭВ, получение конъюгатов мини-АТ с коллоидным золотом, и применение данных нанокомплексов для мечения опухолевых клеток. На основе полученных нами нанокомплексов был разработан и программно реализован простой алгоритм обработки темнопольных фотографий животных клеток, меченых конъюгатами золотых НО; на основе программы анализа изображений 1та§е1 Метод позволяет количественно' оценить эффективность мечения и вычислить параметр эффективности-мечения.

Часть работы была посвящена получению рекомбинаторных фаговых АТ на антигены клеточной стенки типового штамма А. ЬгазИете Бр245 и возможности их применения для изучения поверхностных антигенов клеточных структур и детекции клеток с помощью микроскопии и метода электрооптического анализа клеточных суспензий. В результате проведённых исследований было установлено, что на основе мини-АТ и КЗ можно разработать эффективный инструмент для изучения клеточной поверхности бактерий.

При взаимодействии клеток А. ЪгазИете Бр245 с мини-АТ на ЛПС и с мини-АТ на флагеллин, установлено, что происходит значительное изменение величины ЭО-сигнала. Мы полагаем, что полученные результаты могут быть использованы для создания быстрого теста детекции микробных клеток и оценки экспонированноети тех или иных антигенных детерминант в составе клеточной поверхности бактерий. Кроме того, по аналогичной методике нами были получены мини-АТ на штаммы-деструкторы глифосфата: Acinetobacter Sp К7 и Agrobacterium Sp КЗ, использованные для идентификации и мониторинга численности этих бактерий в лабораторных и полевых условиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Видяшева, Ирина Викторовна, Саратов

1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - 592 с.

2. Галактионов В.Г. Иммунология. М.: Академия, 2004.-528 с.

3. Биотехнология: учеб. пособие для вузов в 8 кн. / под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. Кн. 1: Егоров Н.С, Олескин А.В., Самуилов В.Д. Проблемы и перспективы. М.: Высш. шк., 1987. - 159 с.

4. Биотехнология: учеб. пособие для вузов в 8 кн. / под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. Кн. 3: Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф. Клеточная инженерия. М.: Высш. шк., 1987. - 127 с.

5. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

6. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1982. - 368 с.

7. Иммунологические методы / под ред. Фримеля Г. М.: Мир, 1987. - 472 с.

8. Антитела. Методы / под ред. Кэтти Д. М.: Мир, 1991. - 287 с.

9. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адъюванты. М.: Медицина, 1969. - 206 с.

10. Stewart-Tull D.E.S. Freund-type mineral oil adjuvant emulsions // In: The Theory and Practical Application of Adjuvants / Ed. Stewart-Tull D.E.S. N-Y.: Wiley, 1995.-P. 1-19. ,

11. Freund J. The effect of paraffin oil and mycobacteria on antibody formation and sensitization: A review // Am. J. Clin. Pathol. 1951. - V. 21. - P. 645-656.

12. Freund J., Casals J., Hosmer E.P. Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil // Proc. Soc. Exp. Biol. 1937. - V. 37. -P. 509-513.

13. Herbert W.J. Mineral-oil adjuvants and the immunization of laboratory animals // In: Handbook of Experimental Immunology / Ed. Weir D.M. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1978. - P. A3.l-A3.15.

14. Moncada C., Torres V., Israel Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization // J. Immunol. Meth. 1993. - V. 162. - P. 133-140.

15. Altman A., Dixon F.J. Immunomodifiers in vaccines // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 1989. - V. 33. - P. 301-343.

16. Rudbach J.A., Johnson D.A., Ulrich J.T. Ribi adjuvants: Chemistry, biology and utility in vaccines for human and veterinary medicine // In: The Theory and Practical Application of Adjuvants / Ed. Stewart-Tull D.E.S.-N-Y.: Wiley, 1995. -P. 287-313.

17. Johnson A.G. Molecular adjuvants and immunomodulators: New approaches to immunization // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - V. 7. - P. 277-289.

18. Morrison D.C. Diversity of mammalian macromolecules which bind to^ bacterial lipopolysaccharides // In Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions / Eds. Nowotny A., Spitzer J.J., Ziegler E.J.-Amsterdam: Elsevier, 1990: -P. 183-189.

19. Unanue E.R., Allen P.M. The basis for the immunoregulatory role- of macrophages and other accessory cells // Science. 1987. - V. 236. - P. 551-557.

20. Warren H.S., Vogel F.R., Chedid L.A. Current status of immunological adjuvants // Ann. Rev. Immunol. 1986.,- V. 4. - P. 369-388.

21. Nicklas W. Aluminum salts // Res. Immunol. 1992. - V. 143. - P. 489-493.

22. Brewer J.M., Conacher M., Hunter C.A., Mohrs M., Brombacher F., Alexander J. Aluminum hydroxide adjuvant initiates strong antigen-specific Th2 responses in the absence of IL-4 or IL-13-mediated signaling // J. Immunol. 1999. - V. 163. -P. 6448-6454.

23. Cooper P.D., McComb C., Steele E.J. The adjuvanticity of Algammulin, a new vaccine adjuvant// Vaccine. 1991. - V. 9. - P. 408-415.

24. Leibl H., Tomasits R., Bruhl P., Kerschbaum A., Eibl M.M., Mannhalter J.W. Humoral and cellular immunity induced by antigens adjuvanted with colloidal iron hydroxide // Vaccine. 1999. - V. 17. - P. 1017-1023.

25. Староверов С.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А. Влияние поверхностно активных веществ и витаминов на формирование иммунного ответа // Ветеринария. 2003. - № 4. - С. 38-40.

26. Староверов С.А., Семенов С.В., Сидоркин В.А. Адъювантные свойства воднодисперсных растворов неионогенных поверхностно активных веществ и витаминов // Ветеринария. 2003. - № 10. - С. 30-31.

27. Del G.G. New carriers and adjuvants in the development of vaccines // Curr. Opin. Immunol. 1992. - V. 4. - P. 454-459.

28. Nesmeyanov V.A., Golovina T.V., Valyakina T.I., Andronova T.M., Ivanov V.T. Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides // In Immunotherapy of Infections / Ed. Masihi N.-N-Y.: Marcel Dekker, 1994. P. 213"223.

29. Arnon R., Levi R. Synthetic recombinant vaccine induces anti-influenza long-term immunity and cross-strain protection // In: Novel Strategies in Design and Production of Vaccines / Eds. Cohen S., Shafferman A.-N-Y.: Plenum Press, 1996.- P. 23-29.

30. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М.: Наука, 1985. - 304 с.

31. Иванов В.Т., Вольпина О.М., Андронова Т.М. Пептидные антигены и адъюванты в синтетических вакцинах // Ж. Всес. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1988. - Т. 33. - С. 523-530.

32. Arnon R., Horwitz R.J. Synthetic peptides as vaccines // Curr. Opin. Immunol.- 1992.-V. 4.-P. 449-453.

33. Ben-Yedidia Т., Arnon R. Design of peptide and polypeptide vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. 1997. - V. 8. - P. 442-448.

34. Harris W.J., Cunniugham С. Antibody therapeutics. Berlin: Springer-Verlag, 1995.- 150 p.

35. Marco M.-P., Gee S., Hammock B.D. Immunochemical techniques for enviromental analysis // Trends in Anal. Chem. 1995. - V. 14. - P. 415-425.

36. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.S. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipid // J. Mol. Biol. 1965. - V.13. - P. 238-252.

37. Papahajopoulos D., Kimelberg H.K. Phospholipid vesicles (liposomes) as models for biological membranes // Progr. Surface Sci. 1973. - V. 4. - P. 141-232.

38. Das P.K., Ghosh P., Bachhawat B.K., Das M.K. Liposomes as earner for production of sugar specific antibodies: Preparation of antigalactosyl antiserum // Immunol. Commun. 1982. - V. 11. - P. 17-24.

39. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 1984. - 240 с.

40. Liposomes, a practical approach / Ed. New R.R.C. Oxford: IRL Press, 1992.390 p. /

41. Ефременко В.И. Липосомы (получение, свойства, аспекты применения в биологии и медицине). Ставрополь: НИПЧИ, 1999. - 236 с.

42. Allison А.С., Gregoriadis G. Liposomes as immunological adjuvants // Recent Results Cancer Res. 1976. - V. 56. - P. 58-64.

43. Foldvari M., Moreland A. Clinical observations with topical liposome-encapsulated interferon alpha for the treatment of genital papillomavirus infections // J. Liposome Res. 1997. - V. 7. - P. 155-126.

44. Cordeiro C, Wiseman D.J. Antibacterial Efficacy of gentamicin encapsulated in pH-sensitive liposom against an in vivo Salmonella enterica serovar Typhimurium intracellular infection model // Antimicrob. Agents Chemother. -2000.-V. 44.-P. 533-539.

45. Beaulac C., Sachetelli S., Lagace J. In vitro bactericidal efficacy of sub-MIC concentrations of liposome- encapsulated antibiotic against Gram-negative and Gram-positive bacteria // J. Antimicrob. Chemother. 1998. - V. 41. - P. 35-41.

46. Schiffelers R., Storm G. Liposome-encapsulated aminoglycosides in preclinical and clinical studies // J. Antimicrob. Chemother. 2001. - V. 48. - P. 333344.

47. Торчилин В.П., Клибанов A.JI. Липосомы как средства направленного транспорта лекарств // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. 1987. - Т 32. - С. 502-513.

48. Sanchex Y., Ionescu-Matiu I., Dreesman G. R. Humoral and cellular immunity to hepatitis В virus-derived antigens: Comparative activity of Freund's complete adjuvant, alum and liposomes // Infect. Immun. 1980. - V. 30. - P. 728-733.

49. Desiderio J.V., Campbell S.G. Immunization against experimental murine salmonellosis with liposome-associated O-antigen // Infect. Immun. 1985. - V. 48.-P. 658-663.

50. Eldridge J.H., Staas J.K., Meulbroek J.A., McGhee J.R., Tice T.R., Gilley R.M. Biodegradable microspheres as a vaccine delivery system // Mol. Immunol. 1991. - V. 28. - P. 287-294.

51. Khlebtsov B.N., Kovler L.A., Bogatyrev V.A., Khlebtsov N.G., Shchyogolev S.Yu. Studies of phospatidilcholine vesicles by spectroturbidimetry and dynamic light scattering methods // J. Quant. Spectr. Radiat. Transfer. 2003. - V. 79 - 80. -P. 829-838.

52. Shiosaka S., Kiyama H., Wanaka A., Tohyama M. A new method for produsing a specific and high titer antibody against glutamate using colloidal gold as a carrier// Brain Research. 1986. - V. 382. - P. 399-403.

53. Shiosaka S., Kohno J., Kiyama H., Tohyama M., Shiotani Y. Antibody specific to low-molecular weight substance and method of producing the same by using colloidal gold metal as carrier // European Patent № 0232717, 1987.

54. Ottersen O.P., Storm-Mathisen J. Localization of amino acid neurotransmitters by immunocytochemistry // Trends in Neurosci. 1987. - V. 10. - P. 250-255.

55. Tomii A., Masugi F. Production of anti-platelet-activating factor antibodies by the use of colloidal gold as earner // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1991. - V. 44. - P. 7580.

56. Tatsumi N, Terano Y, Hashimoto K, Hiyoshi M, Matsuura S. An anti-platelet activating factor antibody and its effects on platelet aggregation // Osaka City Med. J. 1993.-V. 39.-P. 167-174.

57. Moffett J.R., Espey M.G., Namboodiri M.A.A. Antibodies to quinolinic acid and the determination of its cellular-distribution within the rat immune-system // Cell and Tissue Res. 1994. - V. 278. - P. 461-469.

58. Chen J., Zou F., Wang N., Xie S., Zhang X. Production and application of LP A polyclonal antibody // Bioorg. Med: Chem. Lett. 2000. - V. 10. - P. 1691-1693.

59. Оленина JI.B., Колесанова Е.Ф., Гервазиев Ю.В., Зайцева И.С., Кураева Т.Е., Соболев Б.Н., Арчаков А.И. Получение антипептидных антител к участкам связывания белка Е2 вируса гепатита С с CD81 // Мед. иммунол.2001. Т. 3.-С. 231.

60. Загоскина Т.Ю. Теоретические и прикладные аспекты конструирования твердофазных иммунохимических тест-систем для диагностики бруцеллеза // Дис. докт. мед. наук. Владивосток, 2003.

61. Pow D.V., Crook D.K. Extremely high titre polyclonal antisera against small neurotransmitter molecules: Rapid production, characterisation and use in light and electron-microscopic immunocytochemistry // J. Neurosci. Meth. 1993. - V. 48. -P. 51-63.

62. Baude A., Nusser Z., Molnar E., Mcllhinney R.A.J., Somogyi P. Highresolution immunogold localization of AMPA type glutamate receptor subunits atsynaptic and non-synaptic sites in rat hippocampus // Neurosci. 1995. - V. 69. - P. 1031-1055.

63. Pickard L., Noel J., Henley J.M., Collingridge G.L., Molnar E. Developmental changes in synaptic AMPA and NMDA receptor distribution and AMPA receptor subunit composition in living hippocampal neurons // J. Neurosci. 2000. - V. 20. -P. 7922-7931.

64. Schell M.J., Molliver M.E., Snyder S.H. D-serine, an endogenous synaptic modulator: Localization to astrocytes and glutamate-stimulated release // PNAS. -1995.-V. 92. P. 3948-3952.

65. Schell M.J., Cooper O.B., Snyder S.H. D-aspartate localizations imply neuronal and neuroendocrine roles // PNAS. 1997. - V. 94. - P. 2013-2018.

66. Eliasson M.J.L., Blackshaw S., Schell M.J., Snyder S.IT. Neuronal nitric oxide synthase alternatively spliced forms: Prominent functional localizations in the brain//PNAS. 1997. -V. 94. - P. 3396-3401.

67. Staimer N., Gee S.J., Hammock B.D. Development of a sensitive enzyme immunoassay for the detection of phenil-ß-D-thioglucoronide in human urine // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. - V. 369. - P. 273-279.

68. Деменев B.A., Щинова M.A., Иванов Л.И., Воробьева Р.Н., Здановская Н.И., Небайкина Н.В. Совершенствование методических подходов к конструированию вакцины против клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1996. - Т. 41. - С. 107-110.

69. Деменев В.А., Щинова М.А., Иванов Л.И., Воробьева Р.Н., Здановская Н.И., Небайкина Н.В. Способ получения вакцины против клещевого энцефалита на основе растворимого антигена // Патент РФ № 94016771/13, 1997.

70. Kayed R., Head E., Thompson J.L., Mclntire T.M., Milton S.C., Cotman C.W., Glabe C.G. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis // Science. 2003. - V. 300. - P. 486-489.

71. Kowalczyk D.W., Ertl H.C.J. Immune responses to DNA vaccines // Cell. Mol. Life Sci. 1999.-V. 55.-P. 751-770.

72. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J.W. Nucleic acid immunization: Concepts and techniques associated with third, generation vaccines // J. Immunol. Meth. 1999. - V. 229. - P. 1-22.

73. Зеленин A.B. Генная терапия на границе третьего тысячелетия // Вестник РАН. 2001. - Т. 71. - С. 387-395.

74. Liu М.А., Hillerman M.R., Kurth R. DNA vaccines: A new era in vaccinology // Ann. N-Y. Acad. Sci. 1995. - V. 772. - P. 1-294.

75. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: Immunology, application, and optimization // Annu. Rev. Immunol. 2000. - V. 18. - P. 927-974.

76. Cui Z., Mumper R.J. The effect of co-administration of adjuvants with a nanoparticle-based genetic vaccine delivery system on the resulting immune responses // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003. - V. 5. - P. 11-18.

77. Chen D., Payne L.G. Targeting epidermal Langerhans cells by epidermal powder immunization // Cell Res. 2002. - V. 12. - P. 97-104.

78. Chen D., Zuleger C., Chu Q., Maa Y.F., Osorio J., Payne L.G. Epidermal powder immunization with a recombinant HIV gpl20 targets Langerhans cells and induces enhanced immune responses // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2002. - V. 18.-P. 715-722.

79. Dean H.J., Fuller D., Osorio J.E. Powder and particle-mediated approachas for delivery of DNA and protein vaccines into the epidermis // Сотр. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - V. 26. - P. 373-388.

80. Thomas M., Klibanov A.M. Conjugation to gold nanoparticles enhances polyethylenimine's transfer of plasmid DNA into mammalian cells // PNAS. -2003.-V. 100.-P. 9138-9143.

81. Дыкман JI.A., Сумарока M.B., Староверов С.А., Зайцева И.С., Богатырев-В.А. Иммуногенные свойства коллоидного золота // Известия АН, Сер. биол. -2004.-Т. 31.-С. 86-91.

82. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predetermined specificity // Nature. 1975. - V. 256. - P. 495-497.

83. Calfre G., Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies, strategies and procedures // Meth. Enzymol. 1981.- V. 73. - P. 3-45.

84. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Д., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: Новый уровень биологического анализа. М.: Медицина, 1983. -416 с.

85. Coding J.L. Antibody production by hybrydomas // J. Immunol. Meth. 1980. -V. 39.-P. 285-308.

86. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell DJ. Phage antibodies: Filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature. 1990. - V. 348.-P. 552-554.

87. Smith G.P. Filamentous phage fusion: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the viron // Science. 1985. - V. 228. - P. 13151317.

88. Щелкунов C.H. Генетическая инженерия. Учеб. пособие: В 2 ч. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1994 1997.

89. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология. М.: Мир, 1981.680 с.

90. Amersdorfer P., Marks J.D. Phage libraries for generation of anti- botulinum scFv antibodies //Meth. Mol. Biol. 1999. - V. 145. - P. 219-240.

91. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technique // Ann. Rev. Immunol. 1994. - V. 12. - P. 433-455.

92. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage display // Chem. Rev. 1997. - V. 97. - P. 391-410.

93. Willats W.G.T. Phage display: Practicalities and prospects // Plant Mol. Biol. -2002.-V. 50.-P. 837-854.

94. Yau K.Y.F., Lee H., Hall J.C. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies // Biotechnol. Adv. 2003. -V. 21.-P. 599-637.

95. Molloy P.E., Harris W.J., Strachan G., Watts C., Cunniugham C. Production of soluble single-chain T-cell receptor fragments in Escherichia coli trxB mutants //J. Mol. Immunol. 1998. - V. 35. - P. 73-81.

96. Yu B., Ni M., Li W.H., Lei P., Xing W., Xiao D.W., Huang Y., Tang Z.J., Zhu H.F., Shen G.X. Human scFv antibody fragments specific for hepatocellular carcinoma selected from a phage display library // World J Gastroenterol. 2005. -V. 11.-P. 3985-3989.

97. Krag D.N., Shukla G.S., Shen G.P., Pero S., Ashikaga T., Fuller S., Weaver D.L., Burdette-Radoux S., Thomas C. Selection of tumor-binding ligands in cancer patients with phage display libraries // Cancer Res. 2006. - V. 66. - P. 7724-7733.

98. Smith A., Hudson R., Malatesti N., Savoie H., Boyle R.W., Greenman J. Development and characterization of novel photosensitizer: scFv conjugates for use in photodynamic therapy of cancer // Immunology. 2007. - V. 120. - P. 512517.

99. Garen A., Cai X. Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells: Selection of specific antibodies from single-chain Fv fusion phage libraries // Med. Sci. 1995. - V. 92. -P. 6537-6541.

100. Sergeeva A., Kolonin M.G., Molldrem J.J., Pasqualini R., Arap W. Display technologies: application for the discovery of drug and gene delivery agents // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - V. 58. - P. 1622-1654.

101. Liu В., Marks J.D. Applying phage antibodies to proteomics: Selecting single chain Fv antibodies to antigens blotted on nitrocellulose // Anal. Biochem. 2000. -V. 286.-P. 119-128.

102. Stich N., Gandhum A., Matyushin V., Raats J., Mayer C., Alguel Y., Schalkhammer T. Phage display antibody-based proteomic device using resonanace-enhanced detection // J. Nanosci. Nanotechnol. 2002. - V. 2. - P. 375381.

103. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1941. - V. 47. - P. 200-202.

104. Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. 1950. -V. 91. - P. 1-13.

105. Barnard G.J.R., Collins W.P. The development of luminescence immunoassays // Med. Lab. Sci. 1987. - V. 44. - P. 249-256.

106. Yalow R.S., Berson S.A. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods //Nature. 1959. - V. 184. - P. 1648-1649.

107. Nakane Р.К., Priece C.B.J. Enzyme-labelled antibodies: Preparation and application for the localization of antigens // J. Histochem. Cytochem. 1966. - V. 14.-P. 929-931.

108. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G // J. Immunochem. 1971. - V. 8. - P. 871-874.

109. Van Weemen B.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugate//FEBS Lett. 1971. - V. 15. - P. 232-236.

110. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова E.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

111. Лефковитс И., Пернис Б. Иммунология. Методы исследований. М.: Мир, 1983.-349 с.

112. Waldmann Т. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy // Science. -1991.-V. 252,-P. 1657-1662.

113. Дыкман Л.А., Богатырев B.A., Щёголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение. М: Наука, 2008.- 319 с.

114. Oldham R.K. Monoclonal antibodies in cancer therapy // J. Clin. Oncol. -1983.-V. 1.-P. 582-590.

115. Nadler L., Stashenko P, Hardy R, Kaplan W.D., Button L.N., Kufe D.W., Antman K.H., Schlossman S.F. Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated antigen // Cancer Res. -1980: V. 40. - P. 3147-3154.

116. Rosenberg S., Terry W. Passive immunotherapy of cancer in animals and man // Adv Cancer Res. 1977. - V. 25. - P. 323-388.

117. Ritz J, Schlossman S. Utilization of monoclonal antibodies in treatment of leukemia and lymphoma // Blood. 1982. - V. 59. - P. 1-11.

118. Dillman R., Shawler D., Sobol R., Collins H.A., Beauregard J.C., Wormsley S.B., Royston I. Murine monoclonal antibody therapy in two patients with chronic lymphocytic leukemia // Blood. 1982. - V. 59. - P. 1036-1045.

119. Dillman D. Monoclonal antibodies for treating cancer // Ann. Intern. Med. -1989.-V. 111.-P. 592-603.

120. Dillman R. Antibodies as cytotoxic therapy // J. Clin. Oncol. 1994. - V. 12. -P. 1497-1515.

121. Giles F., Estey E., O'Brien S. Gemtuzumab ozogamicin in the treatment of acute myeloid leukemia // Cancer. 2003. - V. 98. - P. 2095-2104.

122. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies // Nat. Rev. Cancer.-2001.-V. l.-P. 118-129.

123. Stern M., Herrmann R. Overview of monoclonal antibodies in cancer therapy: present and promise // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2005. - V. 54. - P. 11-29.

124. Hamilton A., Piccart M. The contribution of molecular markers to the prediction of response in the treatment of brest cancer: a review of the literature on Her-2, p53 and Bcl-2 // Ann. Oncol. 2000. - V. 11. - P. 647-663.

125. Насонов E.JI. Применение инфликсимаба (моноклональные антитела к фактору некроза опухоли) в ревматологии: новые данные // РМЖ. 2004. - Т. 12.-С. 1123-1127.

126. Насонов E.JI. Новые направления терапии ревматоидного артрита: перспективы применения моноклональных антител к В-лимфоцитам (ритуксимаб) // РМЖ. 2006. - Т. 14. - С. 1778-1782.

127. Соловьев С.К., Котовекая М.А., Насонов E.JI. Ритуксимаб в лечении системной красной волчанки //РМЖ. 2005. - Т. 13. - С. 1731-1735.

128. Кочергин Н.Г., Кондратов Г.В., Румянцева Е.Е. Опыт применения инфликсимаба при псориазе // Тезисы, научных трудов I Российского конгресса дерматовенерологов, Санкт-Петербург, 2003. С. 54-55.

129. Nestle F.O., Kaplan D.H., Barker J. Mechanisms of disease: psoriasis // N. Engl. J. Med. 2009. - V. 361. - P. 496-509.

130. Деев C.M., Лебеденко E.H: Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения // Acta naturae. 2009. -№1.- С. 32-49.

131. Miller R., Maloney D., Warnke R, Levy R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody // N. Engl. J. Med. 1981. - V. 306. - P. 517-522.

132. Hurvitz S., Timmerman J. Current status of therapeutic vaccines for non-Hodgkin's lymphoma // Curr. Opin. Oncol. 2005. - V. 17. - P. 432-440; .

133. Dillman R. Radiolabeled anti-CD20 monoclonal« antibodies for the treatment of B-cell lymphoma // J. Clin. Oncol: 2002. - V. 20. - P. 3545-3557.

134. Hudis C. Trastuzumab-mechanism of action and use in clinical practice // N. Engl. J. Med. 2007. - V. 357. - P.39-51.

135. Sandler A., Gray R., Perry M., Brahmer J., Schiller J.H., Dowlati A., Lilenbaum R., Johnson D.H. Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer // N. Engl. J. Med. 2006. - V. 355. - P. 2542-2550.

136. Miller K., Wang M., Gralow J., Dickler M., Cobleigh M., Perez E.A., Shenkier T., Cella D., Davidson N.E. Paclitaxel plus bevacizumab versus paclitaxel alone for metastatic breast cancer // N. Engl. J. Med. 2007.;- V. 357.,- , , P. 2666-2676.

137. Dillman R., Dillman J., Halpern S., Clutter M. Toxicities and side effects associated with intravenous infusions of murine monoclonal antibodies // J. Biol. Response Mod. 1986. - V. 5. - P. 73-84.

138. Bulow J.F.M. von, Dobereiner J. Potential for nitrogen fixation in maize genotypes in Brazil // PNAS. 1975. - V. 72. - P. 2389-2393.

139. Frens G. Controlled nucleation for the particle size in monodisperse gold suspension //Nature Phys. Sci. 1973. - V. 241. - P. 20-22.

140. Khlebtsov N.G., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Melnikov A.G., Spectral extinction of colloidal gold and its biospecific conjugates // J. Coll. Interf. Sci. -1996.-V. 180.-P. 436-445.

141. Пастер Е.У., Овод B.B., Позор B.K., Вихоть H.E. Иммунология: Практикум. Киев: Вища шк., 1989. - 304 с.

142. Bernas Т., Dobrucki J.W. The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts, MTT, and CTC // Arch. Biochem. Biophys. 2000. - V. 380. -P. 108-116. :,

143. Медицинские лабораторные технологии. Справочник. Т. 2 / Под ред. Карпищенко А.И. -Санкт-Петербург: Интермедика, 2002. 600 с.

144. Дыкман JI.A., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 411-418.

145. Charlton К.А., Moyle S., Porter A.J.R., Harris W.J. Analysis of the diversity of a sheep antibody repertoire as revealed from a bacteriophage display libraiy // J. Immunol. 2000. - V. 164. - P. 6221-6229.

146. Oliver H. Lowry, Nira J. Rosebrough, A. Lewis Farr, and Rose J. Randall Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193.-P. 265-275.

147. Vergne I., Chua J., Singh S.B, Deretic V. Cell biology of mycobacterium tuberculosis phagosome // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. - V. 20.,- P. 367394.

148. Kusner D.J. Mechanisms of mycobacterial persistence in tuberculosis // Clin. Immunol. 2005. - V. 114. - P. 239-247.

149. Houben E.N, Nguyen L, Pieters J. Interaction of pathogenic mycobacteria with the host immune system // Curr. Opin. Microbiol. 2006. - V. 9 - P.76-85.

150. Othieno C., Hirsch C.S., Hamilton B.D., Wilkinson K. Interaction of Mycobacterium tuberculosis-Induced Transforming Growth Factor bl and Interleukin-10 // Infection and immunity. 1999. - V. 67. - P. 5730-5735.

151. Caccamo N., Meraviglia S., Mendola C., Guggino G., Dieli F. Phenotypical and Functional Analysis of Memory and Effector Human CD8 T Cells Specific for Mycobacterial Antigens // The Journal of Immunology. 2006. - V. 177. - P. 17801785.

152. Geluk A., Lin M.Y., Meijgaarden K., Leyten E., Franken K., Ottenhoff T., Klein M. T-Cell Recognition of the FIspX Protein of Mycobacterium tuberculosis.

153. Correlates with Latent M. tuberculosis Infection but Not with M. bovis BCG Vaccination // Infection and immunity. 2007. - V. 75. - P. 2914-2921.

154. Waters W.R., Palmer M.V., Thacker T.C., Bannantine J.P., Vordermeier H.M. Early Antibody Responses to Experimental Mycobacterium bovis Infection of Cattle // Clinical and Vaccine Immunology. 2006. - V. 13. - P. 648-654.

155. Waters W.R., Palmer M.V., Thacker T.C., Payeur J.B., Harris N.B.Immune Responses to Defined Antigens of Mycobacterium bovis in Cattle Experimentally Infected with Mycobacterium kansasii // Clinical and Vaccine Immunology. -2006.-V. 13.-P. 611-619.

156. Stead W.W. Genetics and resistance to tuberculosis // Ann. Int. Med. 1992. -V. 116.-P. 937-994.

157. Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy // Chest. 2007. -V. 131. - P. 1898-1906.

158. Huebner R.E., Schein M.F., Bass J.B. The tuberculin skin test // Clin. Infect. Dis. 1993. - V. 17. - P. 968-975.

159. Reischl U., Naumann L. Molecular biology methods in detection of mycobacterium. Improved and newly developed test systems for the diagnosis of mycobacterium // Fortschr. Med. 1996. - V. 114. - P. 237-241.

160. Stein M., Sela-Razon В., Linder I., Somekh E. The effect of open heart surgery on tuberculin skin test reactivity // Ann. N. Y. Acad. Sci: -2007. -V. 1109. -P. 229-234.

161. Ozekinci Т., Ozbek E., Celik Y. Comparison of tuberculin skin test and a specific T-cell-based test, T-Spot.TB, for the diagnosis of latent tuberculosis infection // J. Int. Med. Res. 2007. -V. 35. - P. 696-703.

162. Kuwabara S. Amino acid sequence of tuberculin active protein from Mycobacterium tuberculosis I/ J. Biol. Chem. 1975. - V. 250. -P. 2543-2568.

163. Borm P.J.A., Mtiller-Schulte D. Nanoparticles in drug delivery and environmental exposure: same size, same risks // Nanomedicine. 2006. - V. 2. - P. 235-249.

164. Paciotti F.G., Kingston D.G.I., Tamarkin L. Colloidal gold nanoparticles: a novel nanoparticle platform for developing multifunctional tumor-targeted drug delivery vectors // Drug Dev. Res. 2006. - V. 67. - P. 47-54.

165. Oldenburg S.J., Averitt R.D., Westcott S.L., Halas N. Nanoengineering of optical resonances // Chem. Phys. Lett. -1998. -V. 288. -P. 243-247.

166. Хлебцов Б.Н., Ханадеев B.A., Богатырев B.A., Дыкман JI.A., Хлебцов Н.Г. Использование золотых нанооболочек в твёрдофазном иммуноанализе // Российские нанотехнологии. -2008. -Т. 3. С. 66-79.

167. Люминесцентная микроскопия: Учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2008. - 36 с.

168. Денскевич A.C. Инфекционные болезни свиней. Алма-Ата.: Кайнар, 1977. - 77 с.

169. Белоусова Р.В., Третьякова И.В. Ветеринарная вирусология. М.: Колос, 2007. - 93 с.

170. Конопаткина A.A. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1984. - 87 с.

171. Жаров A.B. Паталогическая анатомия с/х животных. М.: Колос, 1999.56 с.

172. Сергеев В.А., Водяников В.И., Земляков Р.Н., Сосницкая Г.Н. Специфическая профилактика и вирусоносительство при трансмиссивном гастроэнтерите свиней // Ветеринария. 2007. - № 4. - С. 15-18.

173. Салимов В.А. Практикум по паталогической анатомии животных. М.: Колос, 2003. - 37 с.

174. Пузанкова О.С., Байбиков Т.З., Николаева К.П., Кукушкин С.А. Методика выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в реакции нейтрализации на панелях. Владимир: ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 2004. 57 с.

175. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии // Успехи химии. 2007. - Т. 76. - С. 199-213.

176. Patra Н.К., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A.K. Cell selective response to gold nanoparticles // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.- 2007. V. 3. - P. 111-119.

177. Han G., Ghosh P., Rotello V.M. Functionalized gold nanoparticles for drug delivery //Nanomedicine. 2007. - V. 2. - P.l 13-123.

178. Gosh P., Han G., De M., Kim C.K., Rotello V.M. Gold nanoparticles in delivery applications // Advanced Drug Delivery Reviews.-2008.-V. 60 P. 13071315.

179. Patra C.R., Bhattacharya R., Wang E., Lau S. Targeted delivery of gemcitabine to pancreatic adenocarcinoma using cetuximab as a targeting agent // Cancer Res. -2008. -V. 68. V. 6. - P. 1970-1971.

180. Wang Z., Liu D., Sun L. Functional gold nanoparticle-peptide complexes as cell-targeting agents // Langmuir. 2008. - V. 24. - P. 10293-10297.

181. Nativo P., Prior I.A., Brust M. Uptake and intracellular fate of Surface-Modified Gold Nanoparticles // Acsnano. 2008. - V. 2. - № 8. - P. 1639-1644.

182. Mandal D., Maran A., Yaszemski M.J., Bolander M.E., Sarkar G. Cellular uptake of gold nanoparticles directly cross-linked with carrier peptides by osteosarcoma cells // J. Mater Sci. Mater Med. 2009 - V. 20. - P. 347-350.

183. Ren J., Xie C., He H. Nonbleaching fluorescence of gold nanoparticles and its applications in cancer cell imaging // Anal. Chem. 2008. - V. 80. - P. 5951-5957.

184. Fujimoto J.G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging // Nat. Biotechnol. 2003. - V. 21. - P. 1361-1367.

185. Palmer G.M., Zhu Ch., Breslin T.M., Xu F., Gilchrist K.W, and Ramanujam N. Comparison of multiexcitation fluorescence and diffuse reflectance spectroscopy for the diagnosis of breast cancer // IEEE Trans. Biomed. Eng. -2003.-V. 50.-P. 1233-1242.

186. Lee T.M., Oldenburg A.L., Sitafalwalla Sh., Marks D.L., Luo W., Toublan F. J.-J., Suslick K.S., Boppart S.A. Engineered microsphere contrast agents for optical coherence tomography // Opt. Lett. 2003. - V. 28. - P. 1546-1548.

187. El-Sayed I.H., Huang X., El-Sayed M.A. Surface plasmon resonance scattering and absorption of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics: applications in oral cancer // Nano Lett. 2005. - V. 5. - P. 829834.

188. Huang X., El-Sayed I.H., Qian W., El-Sayed M.A. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods // J. Am. Chem. Soc. 2006. - V. 128. - P. 2115-2120.

189. Durr N.J., Larson T., Smith D.K., Korgel B.A., Sokolov K., Ben-Yakar A. Two-photon luminescence imaging of cancer cells using molecularly targeted gold nanorods // Nano Lett. 2007. - V. 7. - P. 941-945.

190. Agrawal A., Huang S., Wei A., Lin H., Lee M.H., Barton J.K., Drezek R.A., Pfefer T.J. Quantitative evaluation of optical coherence tomography signal enhancement with gold nanoshells // J. Biomed. Opt. 2006. - V. 11.- P.0411211-6.

191. Troutman T.S., Barton J.K., Romanowski M. Optical coherence tomography with plasmon resonant nanorods of gold // Opt. Lett. 2007. - V. 32. - P. 14381440.

192. Huang Y., Swarup V.P., Bishnoi S.W. Rapid Raman imaging of stable, functionalized nanoshells in mammalian cell cultures // Nano Lett. 2009. - V. 9. -P. 2914-2920.

193. Anker J.N., Hall W.P., Lyandres O., Shah N.C., Zhao J., van Duyne R.P. Biosensing with plasmonic nanosensors //Nat. Mater. 2008. - V. 7. - P. 442-453.

194. Nusz G.J., Marinakos S.M., Curry A.C., Dahlin A.F., Wax A., Chilkoti A. Label-free plasmonic detection of biomolecular binding by a single gold nanorod // Anal. Chem. 2008. - V. 80. - P. 984-989.

195. Stone J.W., Sisco P.N., Goldsmith E.C., Baxter S.C., Murphy C,J. Using Gold Nanorods to Probe Cell-Induced Collagen Deformation // Nano Lett. 2007. - V. 7. -P. 116-119. i

196. Yong K.T., Swihart M.T., Ding H., Prasad P.N.Preparation of gold nanoparticles and their applications in anisotropic nanoparticle synthesis and bioimaging // Plasmonics. 2009. - V. 4. - P.79-93.

197. Yang X., Skrabalak S.E., Li Z.Y., Xia Y., Wang L.V. Photoacoustic tomography of a rat cerebral cortex in vivo with Au nanocages as an optical contrast agent //Nano Lett. 2007. - V. 7. - P. 3798-3802.

198. Wu X., Liu H., Liu J. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots // Nat. Biotechnol. 2003. -V. 21.-P. 41-46.

199. Sudimack J., Lee R.J. Targeted drug delivery via the folate receptor // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. - V. 41. - P. 147-162.

200. Fu K.5 Sun J., Bickford L.R., Lin A.W.H., Halas N.J., Yu Т.К., Drezek R.A. Measurement of immunotargeted plasmonic nanoparticles cellular binding: a key factor in optimizing diagnostic efficacy // Nanotechnology. 2008. - V. 19. - P. 045103(1-6).

201. Костеша H.B., Ламан А.Г., Шепеляковская A.O., Зайцева И.С., Орлов В.П., Дыкман Л.А., Бровко Ф.А., Соколов О.И. Селекция и характеристика фаговых мини-антител к актинам различного происхождения // Биохимия. -2005.-Т. 70.-С. 1070-1077.

202. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984.-480 с.

203. Westcott S.L., Oldenburg S.J., Lee T.R., Halas, N.J. Formation and adsorption of clusters of gold nanoparticles onto functionalized silica nanoparticle surfaces // Langmuir. 1998. - V. 14. - P. 5396-5401. *

204. Хлебцов Б.Н., Ханадеев B.A., Хлебцов Н.Г. Коллективные плазмонные резонансы в монослое металлических наночастиц и нанооболочек //-Оптика и спектроскопия. 2008. - Т. 104, № 2. - С.324-337.

205. Loo С., Hirsch L., Lee М., Chang Е., West J., Halas N., Drezek R. Gold nanoshell bioconjugates for molecular imaging in living cells // Optics Letters. -2005. V. 30. - P. 1012-1014.

206. Khlebtsov B.N., Dykman L.A., Bogatyrev V.A., Zharov V.P., Khlebtsov N.G. A solid-phase dot assay using silica/gold nanoshells // Nanoscale Research Letters. 2007.-V. 2.-P. 6-11.i

207. Hawkes R., Niday E., Gordon J. A dot immunobinding assay for monoclonal and other antibodies // Analyt. Biochem. 1982. - V. 119. - P. 142-147.

208. Vaessen R.T.M.J., Kreike J., Groot G.S.P. Protein transfer to nitrocellulose filters. A simple method for quantitation of single proteins in complex mixtures // FEBS Lett. 1981. - V. 124. - P. 193-196.

209. Gupta Sh., Huda S., Kilpatrick P.K., Velev O.D. Characterization and optimization of gold nanoparticle-based silver-enhanced immunoassays // Anal. Chem. 2007. - V. 79. - P. 3810-3820.

210. Döbereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation / Eds. Newton E., Nijman C.J. Washington: Pullman, 1976.-P. 518-538.

211. Eichhorn M. Offene Fragen bei der ^zosp/rzV/ww-Halbsymbiose mit Pflanzen // Biol. Rundsch. 1989. - Bd. 27. - S. 204-205.

212. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 103121.

213. Krieg N.R., Döbereiner J. Genus Azospirillum (Tarrand, Krieg and Döbereiner, 1979) // In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore/London: Williams & Wilkins, 1984. - P. 94-104.

214. Smit G., Kijne J., Lugtenberg B. Roles of flagella, iipopolysaccharide, and Ca2+-dependent cell surface protein in attachment of Rhizobium leguminosarum biovar viciae to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 569-572.

215. Wolpert J.S., Albertshen P. Host-symbiont interactions. 1. The lectins of legumes interact with the O-antigen containing lipopolisaccharides of their simbiont Rhizobia II Biochem. Biophys. Res. Comm. 1976. - V. 70. - P. 729-737.

216. Huber T.A., Agarwal A.K., Keister D.L. Extracellular polysaccharide composition, ex planta nitrogenase activity, and DNA homology in Rhizobium japonicum II J. Bacteriol. 1984.-V. 158.-P. 1168-1171.

217. Whatley M.H., Bodwin J.S., Lippincott B.B. Lippincott J.A. Role for Agrobacterium cell envelope lipopolisaccharides in infection site attachment // Infect. Immun. 1976. - V. 13. - P. 1080-1083.

218. Matthysse A.G., Wyman P.M., Holmes K.V. Plasmid-dependent attachment of Agrobacterium tumifaciens to plant tissue culture cells // Infect. Immun. 1978. -V. 22.-P. 516-522.

219. Lugtenberg В., van Aphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria // Biochem. Biophis. Acta. 1983.-V. 737. - P. 51-115.

220. Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985. - 190 с.

221. Krishnaswamy S., Kabir М.Е., Miyamoto М., Furuichi Y., Komiyama Т. Cloning antifungal single chain fragment variable antibodies by phage display and competitive panning elution // Anal. Biochem. 2009. - V. 395. - P. 16-24.

222. Boulter-Bitzer J.I., Lee H., Trevors J.T. Single-chain variable fragment antibodies selected by phage display against the sporozoite surface antigen P23 of Cryptosporidium parvum II J. Parasitol. 2009. - V. 95. - P. 75-81.

223. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense // Микробиология. 1998. - Т. 67. - С. 815820.

224. Beatty J.D., Beatty B.G., Vlahos W.G. Measurement of monoclonal affinity by noncompetitive immunoassay // J. Immunol. Meth. 1987. - V. 100: - P. 173179.

225. Беляков А.Е., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л. Получение и исследование гликозилированного флагеллина почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense II Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова 2010. - № 9. - С. 3-6.

226. Fedonenko Y.P, Zatonsky G.V, Konnova S.A, Zdorovenko E.L, Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

227. Бунин В.Д., Игнатов O.B., Гулий О.И., Волошин А.Г., Дыкман-Л.А., О'Нейл Д., Ивницкий Д. Исследование электрофизических свойств клеток Listeria monocytogenes при взаимодействии с моноклональными антителами // Биофизика. 2005. - Т. 50. - С. 316-321.