Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммуноаналитических систем для определения стрептококка группы А и антител к нему

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноаналитических систем для определения стрептококка группы А и антител к нему"

- л" О Ъ"

9 <1 ДО ^

На правах рукописи

Амбросов Игорь Валерьевич

РАЗРАБОТКА ИММУНОАНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ А И АНТИТЕЛ К НЕМУ

Специальности : 03.00.23 - Биотехнология

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Российской Академии Наук

Инженерном Центре пептидных препаратов "Пептс

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Раев Михаил Борисович

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Брико Николай Иванович

Оффициальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Василов Раиф Гаянович

кандидат биологических наук, доцент Парфенова Елена Валентиновна

Ведущая организация: Государственный Научный Центр " Институт

иммунологии" Минздрава РФ

30

часов

Защита диссертации состоится <А, 1997 г. в -го

заседании диссертационного Совета по биотехнологии Д.054.34.13. в РХТУ им. Д. Менделеева по адресу: 125047 Москва, Миусская пл., д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д. Менделеева.

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д.053.34.13 кандидат биологических наук <~Ъ// Гусева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стрептококковые инфекции относятся к числу одних из наиболее распространенных заболеваний в мире. Наибольшее значение в патологии чеяовеха имеют ß-гемолитические стрептококки группы Л (Streptococcus pyogenes), вызывающие целый спектр разнообразных клинических проявлений таких как ангину, скарлатину, фарингит, хронический тонзиллит, а также негнойные постстрептококковые заболевания (вторичные формы стрептококковой инфекции), как ревматическая лихорадка, ревматические поражения сердца, рожистые воспаления, гломерулонефрит, хорея и другие.

Составляя значительный удельный вес в структуре инфекционной патологии человека, эта нозоологическая форма наносит большой социально-экономический ущерб и является одной из причин аллергизации и инвалидизации людей, как правило, еще трудоспособного возраста. При этом широкое распространение первичных и вторичных форм стрептококковых инфекций происходит на фоне принципиальной возможности лечения и профилактики заболеваний, обусловленной неспособностью S. pyogenes вырабатывать устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда. Учитывая многообразие клинических проявлений стрептококковой инфекции (от бессимптомного носительства до выраженных клинических форм) и в силу ненадежности только клинического диагноза, все чаще возникает необходимость широкого применения различных методов лабораторной диагностики, и особенно экспрессного иммуноанализа, как основного современного диагностического "инструмента". В 1983 году Всемирная организация здравоохранения приняла резолюцию о развитии системы экспресс-диагностики стрептококка группы А (СГА) и в настоящее время во многих зарубежных странах существует широкий спектр коммерческих тест-систем, в том числе и для экспресс-диагностики СГА, которые активно используются в практике. К сожалению, практическое отсутствие в нашей стране достаточного количества и разнообразия подобных отечественных тест-систем, а также слабое развитие материально-технической Сократит! в текст« АПСХ • группоспсцифическиА А полисахарид: АПСХ-БСА -группоспецифическиП А полисахарид коныогированный с бычьим сывороточным альбумином; БСА - бычий сывороточный альбумин; СГА - стрептококк группы А; ФСБТ - фосфатно-солевоП буфер содержащий 0.05% Твин-20; N-АГА-ПАА - N-aitenm-D-rraoKoiaMini ко1гмогироаа1П1ЫЙ с полиякриламидом.

лабораторной базы, делают невозможным своевременную диагностику, особенно в периферическом звене здравоохранения в малооснащенных лабораториях и полевых условиях, как того требуют мероприятия, направленные на предотвращение эпидемического процесса.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлись разработка основных компонентов и конструирование на их основе отечественных иммуноаналитических систем анализа (инструментальных и безин-струментальных) для первичного определения стрептококка группы А и антител к нему.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. Отработка технологии выделения группоспецифического полисахарида из культур клеток стрептококка группы А. Синтезирование на его основе антигенного препарата с улучшенными сорбционными свойствами и аффинного сорбента для выделения и очистки специфических антител. Исследование возможность использования в иммуноанализе химически синтезированного антигена, содержащего группоспецифическую детерминанту.

2. Исследование возможности использования в экспресс-диагностических целях литического комплекса из Б^ерЮтусез куопэ 96 для экстракции группоспецифического антигена

3. Синтезирование на основе выделенных и очищенных поликлонапьных антител коньюгатов с ферментными и неферментными метками, сравнение эффективности выделенных антител и синтезированных коньюгатов с импортными аналогами для оценки возможности их применения в конструировании высокоэффективных отечественных тест-систем.

4. Конструирование на основе полученных реагентов инструментальных и безинструментальных моделей тест-систем для идентификации стрептококка группы А на основе определения группоспецифического полисахарида.

5. Конструирование на основе полученных реагентов инструментальных и безинструментальных моделей тест-систем для определения антител к группоспецифическому полисахариду.

6. Оценка возможность применения сконструированных систем в клинико-диагностической практике

Научная новизна. Впервые отработана методика эффективного кратковременного лизиса стрептококковых клеток с использованием ферментативного комплекса, выделенного из Б^ерютусез 1еуопз, что

позволило использовать его в создании тест-систем для диагностики СГА с тампонов от больных.

Впервые синтезирован коньюгат группоспецифических антител к СГА с частицами коллоидного углерода, что позволило разработать варианты экспрессных и безопасных иммуноаналитических систем для определения стрептококка группы А и антител к нему, не требующих какого-либо инструментального обеспечения. Отработаны методики получения высокоаффинных антител и коньгогатов на их основе из отечественных компонентов, не уступающие по эффективности зарубежным аналогам.

Сконструированы модели тест-систем для определения антител к СГА в инструментальном (плашечном) варианте с использованием природного группоспецифического полисахарида или искусственного антигена, состоящего из группоспецифической детерминанты Ы-ацетилглюкозамина на инертном носителе.

Сконструированы модели тест-систем для определения антител к СГА в безинструментальном экспрессном варианте с использованием природного группоспецифического полисахарида или искусственного антигена, состоящего из группоспецифической детерминанты Ы-ацетилглюкозамина на инертном носителе в качестве твердофазных реагентов и суспензоидного коньюгата в качестве детектирующего агента.

Сконструированы модели тест-систем для определения группоспецифического полисахарида СГА в инструментальном (плашечном) варианте с использованием нового способа лизиса стрептококковых клеток.

Сконструированы модели тест-систем для определения группоспецифического полисахарида СГА в безинструментальном экспрессном варианте с использованием нового способа лизиса стрептококковых клеток и суспензоидного коньюгата в качестве детектирующего агента.

Сконструированные модели тест-систем продемонстрировали высокую чувствительность и специфичность, соответствующую требованиям практического здравоохранения.

Практическая значимость:

- Разработанный метод эффективного лизиса стрептококковых клеток позволяет упростить и ускорить определение группоспецифического полисахарида с тампонов от больных.

- Отработанные методики получения антител и коньюгатов на их основе из отечественных компонентов позволяют разработать ряд тест-систем для инструментального и безинструментального определения стрептококка группы А и антител к нему.

- Разработанные варианты инструментального определения группоспецифического полисахарида и антител к нему позволяют повысить эффективность анализов.

- Разработанные варианты безинструментальной идентификации группоспецифического полисахарида и антител к нему позволяют проводить быстрые и эффективные определения в условиях малооснащенных лабораторий и полевых условиях.

По материалам работы получен Патент Российской Федерации N 5018297 "Способ экстракции группоспецифического антигена для экспресс-диагностики стрептококковой инфекции" от 01.07.1992 г

По результатам работы начата подготовка документации для регистрации и сертифицирования в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича иммуноферментной тест-системы для определения антител к стрептококку группы А для лабораторного применения.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на XII и XIII Международных Симпозиумах по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Санкт-Петербург 1993, Париж 1996), на Российско-Германской выставке "Достижения российской биотехнологии" (Берлин 1996) и на IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста (без списка литературы) и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения результатов и заключения, выводов. Список литературы включает 156 наименований: 28 на русском и 128 на иностранном языках. Текст иллюстрирован 3 таблицами и 26 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. В работе использовали штамм стрептококка группы А № 6\49 типа М29 Пражской коллекции культур; группоспецифическую ослиную сыворотку производства НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи (г. Москва), белок А

генноинженерный производства МП "Фемина" (г. Оболенск, Московская обл.); пероксидазу хрена (НПО "Агротехника" г. Львов), 96-луночные полистирольные планшеты для иммуноанализа производства АО "Медполимер" (г. Санкт-Петербург); планшеты для серийных разведений из белого полистирола фирмы Flow Lab.; нитроцеллюлозные мембраны ВА-85 и АЕ-95 фирмы Schleicher & Schuell (Германия). В сравнительных экспериментах использовали антиослиные, антикроличьи и античеловеческие антитела, меченные пероксидазой хрена производства НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи (г. Москва); специфические антистрептококковые кроличьи референс-сыворотки групп А, В, С, G фирмы Wellcome (Великобритания); аффиноочищенные кроличьи антитела к стрептококку группы А и аффинноочищенные кроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена фирмы "Binex" (США).

Активированный суспензоидный реагент и белок А, меченный суспензоидными частицами коллоидного углерода, любезно предоставлены научным сотрудником Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) к.б.н. Раевым М.Б.; N-ацетилглюкозамин, коньюгированный с полиакриламидом, синтезирован и любезно предоставлен заведующим лаборатории химии углеводов Института биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва) д.х.н. Бовиным Н.В.; ферментативный лизирующий комплекс из Streptomyces levons штамм 96 и группоспецифические очищенные референс-полисахариды групп С, G и В любезно предоставлены для работы сотрудниками Проблемной научной лаборатории по изучению стрептококковых инфекции ММА им. И.М. Сеченова.

Материалом для иммунизации кроликов служила гидролизованная пепсином суспензия стрептококка группы А из Пражской коллекции, смешанная с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:2. Для получения антисыворотки использовались кролики породы "новозеландский белый".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Разработка основных компонентов иммуноаналитнческих систем для идентификации стрептококка группы А и антител к нему. 1.1. Получение и анализ группоспецифического антигена Группоспецифический полисахарид получали из клеточных стенок стрептококка группы А согласно схеме 1. Количественный выход данного метода составил 80-100 мг вещества из 20 г биомассы стрептококка (или 2,5 -3% в

Рис. 1. Химическая схема производства группоспецифического полисахарид стрептококка группы А

пересчете на осадок влажных клеточных стенок). Молекулярная масса полисахарида, по данным ВЭЖХ на колонке TSK. G2000SW (Toyo Soda, Япония), составляла 7-10 кДа. Иммунохимический контроль чистоты и специфичности проводили в тесте двойной иммунодиффузии с использованием стандартных референс-сывороток к группоспецифическим полисахаридам групп А, С и G. В концентрации 1 мг\мл препарат обладал иммунологической активностью с гомологичной сывороткой в разведении не менее 1\б4 при отсутствии реакции с референс-сывороткамии групп С и G.

Для преодоления слабой физической сорбции нативного полисахарида на полистирольных планшетах, используемых в иммуноанализе, была предпринята модификация АПСХ с целью увеличения сорбции препарата на полистироле при максимально возможном сохранении химических и иммунологических свойств. Для этого полисахарид подвергли окислению периодатом натрия и коньюгировали с гидразидным производным БСА методом восстановительного аминирования. Содержание углеводов в синтезированном коньюгате составляло 20%. Последующие эксперименты с применением метода иммуноанализа показали, что данный препарат обладает хорошей сорбцией на пластике за счет белкового составляющего и достаточной иммунологической активностью и специфичностью, присущих природному полисахариду. Кроме этого, коньюгат был иммобилизован на сефарозе 4В, активированной BrCN. Содержание лиганда (по белку) в данном сорбенте составляло 2-4 мг\мл сорбента. Это позволило осуществить в последующем хроматографическое выделение специфических аффинных антител с хорошим количественным выходом для использования их в дальнейшей работе.

1.2. Использование комплекса литических ферментов Streptomyces levoris 96

для экстракции группоспецифического полисахарида

Учитывая тот факт, что среди наиболее достоверных способов идентификации стрептококков являются методы, связанные с определением группоспецифического антигена, который предварительно экстрагируют каким-либо способом из клеток, была изучена возможность применения для данных целей комплекса литических ферментов, выделяемого из Streptomyces levoris 96

Оптимальное время лизиса клеток, при которых выделенный полисахарид содержал бы минимальное количество других антигенов клеточной стенки, по результатам сравнительных экспериментов с клеточными культурами

концентрации 10' и 104 кл\мл составило 10-15 мин при комнатной температуре, 510 мин при 37° С и 5 мин при 45° С при рабочей концентрации ферментного комплекса 0.25 мг\мл.

Для сравнения количественной экстракции 3 методов выделения АПСХ (ферментного, азотистокислотного и солянокислотного) была использована исходная взвесь микробных клеток 107 в мл. Результаты исследования методом ИФА приведены на рис 2.

00 492

Рис. 2. Выделение полисахарида А из клеток стрептококка группы А различными методами. По оси абсцисс - разведения экстрактов. 1 - экстракция азотистой кислотой; 2 - экстракция соляной кислотой 3 - экстракция ферментативным методом

Как видно из рисунка 2, в наибольшем количестве АПСХ экстрагируется при применении ферментного комплекса Б^ерЮтусез 1еуопз 96. Чувствительность ферментного метода экстракции в 2-3 раза выше по сравнению с кислотными, что позволяет определять более низкие концентрации микробных клеток, порядка 104 в мл, которые, согласно рекомендациям ВОЗ, является необходимым минимумом для чувствительности диагностических методов, особенно экспрессных, и позволяет проводить идентификацию СГА непосредственно с мазков. Проведенные дальнейшие исследования показали, что данный способ экстракции может быть применен и к другим серологическим группам стрептококков, что открывает возможности разработки единой диагностической тест-системы для идентификации различных групп стрептококков, используя единый ферментный

комплекс для . экстракции группоспецифических антигенов. Сравнение предложенного метода и метода химической экстракции реагентами из набора "Вю Мегеоих"(Франция) для постановки реакции латекс-агглютинации с использованием клинических образцов изолятов стрептококков показали, что совпадаемость результатов по группе А составила 99,5%, по группе В - 98,5%, по группе С - 97,7%, по группам в и Р - 98%, и что данный способ экстракции может успешно использоваться при конструировании тест-систем для экспресс-диагностики.

1.3. Выделение и очистка полнклональных антител

В качестве исходного материала были взяты группоспецифические лиофилизованные ослиные сыворотки, выпускаемые НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи, а также собственно полученные кроличьи сыворотки. Для получения аффинных антител использовали хроматографию низкого давления с применением в качестве сорбента сефарозы 4В с иммобилизованным препаратом АПСХ-БСА, полученным нами ранее. Глобулиновую фракцию оставляли на ночь при 4° С в процессе рециркуляции при скорости потока 10 мл\ч для максимального связывания специфических антител с лигандом сорбента. Элюцию проводили 0.1 М глицин-НС! (рН 2.4) с одновременной нейтрализацией на выходе 0.1 М Трис для предотвращения инактивации антител при низких значениях рН. Емкость синтезированного и использованного в работе сорбента по результатам исчерпывающей хроматографии и анализа оставшейся после рециркуляции сыворотки методом ИФА составила 7 мг аффиноочищенных антител на I мл сорбента. Полученные антитела проверяли в различных вариантах иммуноанализа в сравнении с коммерческим препаратом антител фирмы "Вшех" (США). Результаты показали, что выделенные антитела по эффективности не уступают зарубежным аналогам (рис. 3).

1.4. Получение и анализ детектирующих реагентов

1.4.1. Реагенты для ферментных иммуноаналитических систем.

Полученные на предыдущих этапах препараты антител использовали в синтезе детектирующих коньюгатов с ферментной меткой. В качестве метки применяли пероксидазу хрена в щелочной изоформе. Коньюгаты готовились по методу Т^еп (1984) с некоторыми модификациями. В частности, для достижения максимального связывания метки с антителами пероксидазу в реакциях

-1 -+-2

Рис. 3. Сравнительное определение препаратов аффинных антител в варианте прямой иммобилизации ЛПСХ-БСА на матрице. По оси абсцисс - концентрация препаратов антител (нг\мл)

1 - антитела фирмы "Втех" (США); 2 - собственно полученные антитела 00 492

Рис. 4. Сравнительный анализ прямого определения иммобилизованного на матрице АПСХ-БСА ферментными коньюгатами специфических антител. По оси абсцисс - рабочие концентрации коньюгатов (мкг\мл).

1 - синтезированный коньюгат

2 - коньюгат из коммерческого набора фирмы "Вшах" (США)

синтеза использовали в избыточных количествах, т.е. молярное соотношении антител и пероксидазы составило 1.5 : 1.0, а не 2.0 : 1.0, как рекомендуется в методике. Для конъюгации использовали аффинноочищенные антитела после гель-фильтрации на сефакриле Б-ЗОО, которая была необходима для удаления агрегированных форм антител, появляющихся в процессе аффинной хроматографии, во избежания спонтанной агглютинации готового реагента, вызываемой белок-белковыми взаимодействиями. Полученные коньюгаты были протестированы в различных вариантах иммуноферментного анализа и не уступали по эффективности коммерческим препаратам производства фирмы "Втех" (США) при оптимальной рабочей концентрации 1-2 мкг\мл (Рис 4)

1.4.2. Реагенты для неферменгных иммуноаналитических систем.

В качестве метки для получения неферментных коньюгатов использовали суспензоидные частицы коллоидного углерода. Для данного этапа работы использовались фракции аффинноочищенных специфических кроличьих антител после гель-фильтрации на сефакриле 8-300, так как их степень гомогенности, по результатам ВЭЖХ, была выше, чем у ослиных. К одной части раствора антител на роторном встряхивателе добавляли девять частей раствора активированного суспензоидного реагента. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре и активном встряхивании реакционную смесь выдерживали ночь при 4° С, затем центрифугировали 5 мин при 6000 об\мин и подвергали гель-фильтрации на колонке с сефарозой СЬ-бВ размером 2.5 см * 40 см при скорости потока 80 мл\час для удаления избытка суспензоидного реагента. Контроль за процессом хроматографии проводили визуально, учитывая интенсивную черную окраску полученного реагента. Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие коньюгат, объединяли и добавляли БСА для стабилизации и блокирования возможно оставшихся непрореагированных групп и глицерин для стабилизации и криопротектирования до конечных концентраций 1% и 20% соответственно, что позволяет добиться стабильности коньюгатов на протяжении как минимум одного года.

2. Конструирование моделей тест-систем для идентификации стрептококка группы А.

2.1. Разработка моделей тест-систем для инструментального определения стрептококка группы А.

Полученные реагенты использовали в конструировании моделей тест-систем для идентификации стрептококка группы А. В качестве твердофазного реагента использовали отечественные полистирольные планшеты с иммобилизованными из 0.05 М карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9.6) аффиноочищенными поликлональными антителами в концентрации 5 мкг\мл. В качестве анализируемых образцов брали лизаты стрептококковых культур, полученные 15-минутным лизисом при комнатной температуре с применением ферментного комплекса Streptomyces levoris 96 или очищенные полисахариды в качестве референс-антигенов. Детекцию образовавшегося специфического комплекса проводили полученным ранее пероксидазным коньюгатом аффинных антител в концентрации 1-2 мкг\мл. Проявление пероксидазной метки осуществляли субстратным раствором, содержащим 0.5 мг\мл орто-фенилендиамина в 50 мМ ацетате натрия (рН 5.0) с 0.02% перекиси водорода. Учет реакции проводили спетрофотометрически при 490 нм. Положительными считали пробы с оптической плотностью продукта пероксидазной реакции свыше 0.2 оптических единиц, превышающих не менее чем в два раза результат отрицательной реакции. При тестировании клеточных лизатов были получены результаты, показывающие возможность определения стрептококка группы А в концентрации 104 кл\мл, что является необходимым минимумом для чувствительности тест-систем, основанных на определении АПСХ (рис 5).

2.2. Разработка моделей тест-систем для безинструментального определения стрептококка группы А

2.2.1. Разработка безинструментальных ферментных моделей Учитывая возрастающий интерес к иммуноаналитическим методам, основанным на неинструментальных способах детекции, были проведены эксперименты по разработке и конструированию макетов безинструментальных тест-систем на основе пероксидазных коньюгатов. Принципиальная схема анализа была идентична схеме с использованием иммунологических плашетов. В качестве основной твердой фазы были выбраны белые непрозрачные непористые планшеты для серийных разведений, изготовленные из Hi-impact Sterene.

Рис. 5. Определение полисахарида в лизированных клетках в сэндвич-варианте ИФА. По оси абсцисс - разведения лизата из 106кл\мл

На дно лунки наносили в виде дотов в объеме 5 мкл раствор специфических антител (1-й дот) и собственно полученный специфический антиген в виде АПСХ-БСА (2-й дот), используемый в качестве положительного контроля проведения реакции. После инкубации в течении 1 часа при 37° С во влажной камере для предотвращения естественного высыхания дотов, капли аспирировали и всю поверхность лунок промывали раствором ФСБТ. Анализируемый образец, приготовленный ферментным методом лизиса клеток стрептококка по отработанной ранее схеме, и детектирующий реагент вносили в лунку в объеме 0.5 мл в ФСБТ и инкубировали при комнатной температуре в течении 20-30 мин и 15 мин соответственно. В качестве положительного контроля в соседнюю лунку вносили референс-антиген АПСХ. Субстратный раствор готовили в этаноле, содержащим 3 мг\мл 4-хлор-1-нафтола и 0.02% перекиси водорода. Продолжительность реакции хромогенной детекции составляла 10-15 мин, при которой результат учитывался визуально. В случае положительной реакции на белом фоне пластика, являющимся одновременно контролем на отсутствие неспецифического связывания, появлялись две точки темно-синего цвета. При этом аналогичная картина должна наблюдаться и в лунке с положительным референс-контролем. При отрицательном результате наблюдалась только одна точка в месте иммобилизации антигена АПСХ-БСА. В случае отсутствия всех точек или правой контрольной точки тест считался недействительным. Время

проведения самого анализа составляло 50-60 минут при визуальном прочтении результатов. Проведение анализа не требует специального оборудования (как, например, спектрофотометр) и при этом отсутствует строгое требование к точным объемам вносимых реагентов, что при условии использования заранее приготовленных в комплекте набора реагентов делает анализ достаточно удобным для пользователя. Проверка данной модели показала чувствительность при определении чистого полисахарида 16-32 нг\мл, а также возможность определения клеточных лизатов в концентрации 104 О6 клеток в мл.

В качестве другого альтернативного варианта твердой фазы была апробована нитроцеллюлозная мембрана с размером пор 0.45 ц (ЗЫе1сЬег & 81ше11), что позволило увеличить количество сорбируемого материала, тем самым повышая чувствительность анализа. Для решения проблемы неспецифического фона матрицы в процедуру проведения анализа была введена дополнительная стадия обработки мембраны после нанесения дотов раствором ФСБТ с 1% казеином в течении 30 мин для блокировки сайтов неспецифического связывания твердой фазы. Данный раствор также использовали для внесения образцов и коньюгата и промежуточных промывок. Чувствительность анализа составила 4-8 нг\мл при тестировании полисахарида и порядка 10] кл\мл при тестировании лизатов при однозначном прочтении результатов и отсутствии фона неспецифических взаимодействий (рис 6).

2.2.2. Разработка безинструментальных неферментных моделей.

Используя экспериментальный опыт предыдущих этапов работы, был проведен ряд экспериментов по конструированию макетов тест-систем для безинструментального неферментного определения группоспецифического полисахарида в образцах с мазков. Основным и принципиальным отличием от вышеизложенных безинструментальных систем стало использование на заключительной стадии выявления специфического комплекса полученного нами ранее коньюгата антистрептококковых аффинных антител, меченных суспензоидными частицами коллоидного углерода. Это позволило сохранив и увеличив в отдельных случаях чувствительность анализа, сократить время его проведения, исключив стадию субстратного проявления ферментной метки, и значительно упростить процедуру его проведения, сделав анализ при этом более безопасным, учитывая канцерогенные свойства используемых при детекции пероксидазной метки субстратов.. В результате в местах специфического связывания появлялись черные доты, видимые без какой-либо дополнительной

!•! 1*1 1*1

1*1 1*1

1*1 1*1 1*1

¡•I I •Гр.

та?'

Л1

1*1 1-1 1*1 <*и ш

Ш!!

Концентрация очищенного группоспецифического полисахарида

4мхг\мл 2 мкг\мл

1 шаДмл 500 нг\ыя 250 нг\ш1 125 шЛил 62кг\мл 31 шАмл 16 шЛмл 8 нг\мя

4 нг\мл

2 нг\мл I нг\мл

Рис 6. Оценка чувствительности модельной системы для безинструментального определения группоспецифического полисахарида на пористой твердой фазе.

10« Ю' Го» 101

АТ-Пероксмдаза

АТ-Углерод

Концентрация клеток ■ лиэате (КОЕЫл)

Рис. 7. Сравнительное определение чувствительности модельных систем анализов на пористой твердой фазе с помощью ферментной и неферментной детектирующих систем.

обработки. При этом контроль стадии проявления можно было проводить визуально, произвольно сокращая или удлиняя время стадии (обычно 5-15 мин) для достиженияя более интенсивной окраски. Другим преимуществом данного коньюгата является его высокая стабильность при хранении в широком интервале температур ( от -20°С до +18°С), возможность, при необходимости, его многократного использования, что делает анализ экономичнее, а также стабильность результатов анализов, которые не теряют в течении длительного времени хранения своей окраски (в отличие от ферментных) даже при хранении на свету. Проведенное сравнение возможностей ферментных и неферментных безинструментальных систем показало, что за счет более оптически насыщенного черного цвета чувствительность суспензоидной метки в отдельных случаях превышала ферментную как минимум в 2-4 раза (рис 7).

Модель тест-системы, сконструированная в варианте дот-анализа с использованием непористого твердофазного реагента, была апробирована на 250 пробах, полученных от больных ангинами (90), скарлатиной (15), контактных из очагов скарлатины (70), рожистыми воспалениями (2), обострениями хронического тонзилита (40), дифтерией (6), ОРВИ (22), стоматитом (1) и мононуклеозом (I). У всех обследованных отделяемое миндалин и задней стенки глотки брали одновременно двумя тампонами, один из которых использовали для экспресс-анализа, а второй для посева на кровяной агар с целью выделения ß-гемолитических стрептококков для дальнейшей идентификации с помощью коммерческого набора реагентов "Bio Merioux" (Франция). Тампоны с пробой для экспресс-диагностики обрабатывали ферментом из Streptomyces levoris 96 в течении 15 мин. Положительный результат (идентификация стрептококка группы А) был получен в 85% случаев, причем совпадение результата с микробиологическим тестом у больных ангинами составило 90%. Слабая ложноположительная реакция наблюдалась у 20 человек, у которых в последствии были обнаружены стрептококки иных серологических групп В, С и G ( у 2, 10и8 человек соответственно) и 38 положительных результатов не были подтверждены микробиологическим анализом.

3. Конструирование моделей тест-систем для определения антител к стрептококку группы А

3.1. Разработка моделей тест-систем для инструментального определения антител к стрептококку группы А

Антигенным компонентом системы, предназначенной для диагностики стрептококкозов в условиях невысеваемости возбудителя, является полученный нами ранее препарат группоспецифического полисахарида, коньюгированный с БСА, который сорбировали на матрице в рабочей концентрации 5 мкг\мл. Исследуемые сыворотки вносили в ФСБТ-БСА в начальном разведении 1\Ю0. Детекцию осуществляли коньюгатом антивидовых антител с пероксидазой с проявлением субстратной смесью, содержащей ортофенилендиамин. Результаты анализов учитывали при помощи спектрофотометра при длине волны 490 нм. При этом интенсивность реакции в лунках с контрольной отрицательной сывороткой не должна превышать 0.2 оптических единиц, а в лунках с контрольной положительной сывороткой должна быть не менее 0.8 ОЕ. Сконструированная система позволила достоверно определять очищенные препараты антител в концентрации 0.1 нг\мл, или 2-4 пг\пробу (рис 8)

00 492

Рис 8. Определение очищенных препаратов антител в твердофазном методе ИФА. По оси абсцисс - концентрация препарата антител (нг\мл).

Данная модель была протестирована в клинических условиях. Материалом для испытаний служила кровь больных стрептококковой инфекцией с лабораторным подтверждением диагноза. Испытания проходили на базе

ревматологического центра 1-ой Градской больницы. Всего было обследовано 1000 человек. В контрольную группу входило 300 человек доноров и 150 человек с неинфекционной патологией. В контрольной группе не было зафиксировано ни одного ложноположительного результата на фоне практически полного выявления повышенного уровня антител у лиц, инфецированных стрептококком А, что свидетельствует о надежности данной модели, позволяющей использовать ее в практических целях дня ранней диагностики стрептококкозов в условиях невысеваемости возбудителя, а также для контроля за течением ревматизма (как одного из проявления вторичных форм стрептококковых инфекций) и его перехода в активную стадию. В качестве альтернативного варианта аналогичная система была разработана с применением в качестве антигена препарата Ы-ацетилглюкозамина, коньюгированного с полиакриламидом, так как, во-первых, N-ацетилглюкозамин является группоспецифической детерминантой АПСХ, поэтому определение антител к нему также может являться способом диагностики стрептококковой инфекции; во-вторых, присутствие в природном полисахариде антигенных детерминант, сформированных рамнозой, которая обнаруживается в других серологических группах стрептококков, может приводить к получению ложноположительных результатов, что сказывается на специфичности анализа в целом; и в-третьих, использование природного полисахарида в качестве антигена может быть затруднено по причине отсутствия возможности его стандартизации, связанной как с физико-химическими свойствами самого антигена (большая гетерогенность препарата по массе), так и со спецификой различных методов его выделения из клеток. Результаты экспериментов, полученные при тестировании реагентов с различным содержанием N-ацетилглюкозамина от 2% до 30%, показали, что оптимальные результаты были зарегистрированы при использовании препарата с 10% плотностью углеводов на носителе. При проведении анализа данный антиген иммобилизовывали из карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9.6) в рабочей концентрации 5 мкг\мл. Дальнейшая постановка анализа проводилась аналогично при применении природного антигена. В процессе работы были исследованы 33 сыворотки от больных острой ревматической лихорадкой, 60 сывороток больных ревматическим пороком сердца и 30 сывороток больных ангиной. Контрольную группу составляли 30 практически здоровых людей, в мазках из зева которых стрептококк группы А обнаружен не был. Предложенная модель позволила

достоверно определить 90% здоровых доноров и 100% лиц с повышенным содержанием группоспецифических антител.

3.2. Разработка моделей тест-систем для безннстру-ментального определения антител к стрептококку группы А

3.2.1. Разработка безинструментальных ферментных моделей Основываясь на результатах экспериментов по конструированию инструментальных моделей, была предпринята попытка разработки безинструментальных версий тест-систем для определения антител. Основополагающими вариантами нами были взяты форматы анализов, использованные в безинструментальном определении полисахарида. В качестве твердой фазы использовали непористый белые луночные планшеты из Hi-impact Steren (Flow Lab.) и нитроцеллюлозу с размером пор 0,45 мкм (Schleicher & Shuell). На них в качестве дотов объемом 5 мкл наносили из 0.02 M карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9.6) препарат группоспецифического антигена, представляющий собой АПСХ-БСА или N-АГА-ПАА в рабочей концентрации 10 мкг\мл для непористой фазы и 5 мкг\мл для пористой. Анализируемый образец сыворотки вносили в лунки в разведении 1\100 в объеме 0.5-1 мл и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Детекцию осуществляли коньюгатом антивидовых антител или белка А с пероксидазой хрена в рабочем разведении (0.5-1 мкг\мл) в течении 20-30 мин при комнатной температуре с проявлением субстратным раствором, содержащим 4-хлор-1-нафтол. Результаты учитывались в виде дотов синего цвета. В качестве внутреннего положительного контроля на проведение реакции использовали нормальные иммуноглобулины (человека или кролика).

При тестировании данных моделей, используя препараты очищенных антител, были получены следующие результаты: на пористой - 0.25-0.5 нг\мл, на непористой твердой фазе определялось 1-2 нг\мл. Конечный титр верифицированной положительной сыворотки составлял 1X32000 и П64000 соответственно. Данные результаты довольно близки к данным, полученным при конструировании инструментальных моделей (0.1-0.2 нг\мл и Ц128000), что может служить подтверждением возможности использования данных модификаций в скрининговых массовых анализах в условиях малооснащенных лабораторий.

3.2.2. Разработка безинструментальных неферментных моделей При конструировании неферментных безинструментальных моделей тест-систем для определения антител к группоспецифическому полисахариду стрептококка А в качестве детектирующего реагента был использован оригинальный коньюгат, представляющий из себя белок А, ковалентно связанный с коллоидными частицами суспензоидного углерода. Использование аналогичного коньюгата на основе античеловеческих антител представлялось более целесообразным, но оказалось невозможным по причине технологических трудностей при синтезе подобного коньюгата на стадии получения высокоэффективного исходного гомогенного препарата антител, вследствие чего в готовом препарате коньюгата инициировалась спонтанная агглютинация и рабочая эффективность готового реагента снижалась. Упрощение процедуры и сокращение времени анализа за счет отсутствия стадии проявления ферментной метки было дополнено сохранением необходимой чувствительности анализа благодаря более оптически контрастной черной окраске дотов, что смогло приблизить данный способ по эффективности к инструментальному, сделав саму процедуру безопаснее. Определяемое количество антител составило 0.5-1 нг\мл на непористой фазе и 0.2-0.4 нг\мл на пористой. Конечный титр сыворотки был П51200 (рис. 9).

1/200

1/400

1/800

1/1600

1/3200

Ф

1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 Рис. 9. Определение конечного титра положительной референс-сыворотки на непористой твердой фазе. На матрице иммобилизован АПСХ-БСА. Детекция -коньюгат белка А с суспензоидным углеродом.

Таким образом, в результате проведенных исследований были получены препараты реагентов для осуществления первичной диагностики стрептококковых инфекций. Это позволило сконструировать высокочувствительные и специфичные модели различных аранжировок, в том числе экспрессных и безинструментальных, предназначенных дня использования в клинико-диагностической практике в лабораторных и полевых условиях с целью идентификации заболеваний, вызываемых Р-гемолитическим стрептококком серогруппы А, эпидемиологической оценки состояния здоровья населения и эффективности профилактических и лечебных мероприятий.

ВЫВОДЫ

1. Отработана технология выделения группоспецифического полисахарида из культур клеток стрептококка группы А, позволяющая получать очищенный и иммунологически активный антиген. На его основе синтезированы антигенный коньюгат с бычьим сывороточным альбумином для усиления сорбционных свойств при иммобилизации на пластике и высокоэффективный аффинный сорбент с емкостью до 7 мг\мл. Исследована возможность использования в качестве антигенного препарата N-ацетилглюкозамина на полиакриламиде и показана близкая эффективность природного и исскуственного антигенных препаратов для определения антител к стрептококку группы А.

2. Продемонстрирована возможность экстракции группоспецифического антигена из стрептококков различных серологических групп с использованием литических ферментов Streptomyces levoris 96 и эффективность использования данного способа при конструировании тест-систем для экспресс-диагностических целей.

3. На основе выделенных и очищенных поликлональных антител синтезированы детектирующие реагенты с ферментной (пероксидазной) и неферментной (суспензоидной) меткой. При сравнении полученных реагентов с коммерческими препаратами производства фирмы "Binex" (США) показана эффективность, не уступающая импортным реагентам, которая позволила определять полисахарид в образцах клеток с концентрациями 104-105 кл\мл и конструировать иммуноаналитические тест-системы, используя отечественные разработанные компоненты.

4. На основе разработанных компонентов сконструровано 6 моделей тест-систем для инструментального и безинструментального определения

группоспецифического полисахарида. В инструментальном варианте достигнута диагностически значимая чувствительность 104 кл\мл при времени анализа 2 часа. В безинструментальном - I05 кл\мл при времени анализа 45-50 мин и 103-10е кл\мл за 20 минут.

5. Используя разработанные компоненты сконструировано 12 моделей тест-систем для инструментального и безинструментального определения антител к группоспецифическому полисахариду стрептококка группы А. При определении препаратов аффинных антител достигнута чувствительность 0,1 нг\мл в инструментальной и 0,25-0,5 нг\мл в безинструментальной версиях.

6. Показаны диагностические возможности разработанных моделей тест-систем. По результатам тестирования 250 мазков из горла чувствительность безинструментальной модели для определения группоспецифического полисахарида с использованием суспензоидного коньюгата составила 85%. При проверке 1153 сывороток больных и доноров иммуноферментные модели тест-систем для определения антител на основе природного и искусственного антигенов позволили в 100% случаев выявить повышенный уровень сывороточных антител в крови.

Список работ, опубликованных по теме диссертации :

1. Шмакова З.Ф., Брико Н.И., Дынга JI.O., Амбросов И.В. Способ экстракции группоспецифического антигена для экспресс-диагностики стрептококковой инфекции. Патент РФ N 5018297 от 01.07.1992

2. Ambrosov I., Pavlova I., Krylova S., Briko N.. Shevelev В., Kulshin V. A noninstrumental method for diagnostic of Srteptococcus group A // Abstracts XII Lancefield International Symposium on srteptococci and streptococcal diseases. St.-Petersburg, Russia, 1993, p. 148

3. Шмакова З.Ф., Дынга JI.O., Ещина A.C., Амбросов И.В., Брико H.И. Использование литических ферментов Streptomyces levoris для выделения группоспецифического антигена из клеток стрептококка // Клинич. лаб. диагностика, 1994, N3, с. 41-43.

4. Rayev M., Ambrosov I., Briko N. A novel method for primary diagnostic of Streptococcus group A // Abstracts XIII Lancefield International Symposium on srteptococci and streptococcal diseases, Paris, France, 1996, p. 258.

5. Ambrosov I., Rayev M., Briko N. A novel method for sérodiagnostic of Streptococcus group A // Abstracts XIII Lancefield International Symposium on srteptococci and streptococcal diseases, Paris, France, 1996, p. 259.

6. Rayev M., Ambrosov I., Briko N. A novel method for the serodiagnosis of group A streptococcal antibodies // Streptococci and Host. Proceedings XIII LISSSD, Paris, France, 1997.

7. Ambrosov I., Rayev M., Briko N. A novel method for the primary diagnosisof group A streptococci from clinical specimens // Streptococci and Host. Proceedings XIII LISSSD, Paris, France, 1997.

8. Бовин H.И., Шевелев Б.И., Брико Н.И., Дынга JI.O., Блинникова Е.И., Куксюк П.П., Мясоедова С.Е., Амбросов И.В. Иммуноферментная тест-система для определения антител к группоспецифическому антигену стрептококка группы А на основе коньюгированного N-ацетилглюкозамина и ее применение в медицинской практике // Клинич. лаб. диагностика, 1997 - в пе"°-—