Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноаналитические методы лекарственного мониторинга теофиллина с использованием моно- поликлональных антител

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Иммуноаналитические методы лекарственного мониторинга теофиллина с использованием моно- поликлональных антител"

МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д063. 41.01

На правах рукописи

БЕКМАН Наталья Игоревна

ИММУНОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ЛЕКАРСТВЕННОГО МОНИТОРИНГА ТЕОФИЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ MOHO-И ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.23—Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Работа выполнена в лаборатории гибридом НПО „Биотехнология".

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ -

доктор биологических наук — Р. Г. Василов кандидат биологических наук — Н. П. Данилова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ -

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Института биохимии им. Баха — Дзантиев Б. Б.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник МГУ им. М. В. Ломоносова — Еремин С. А.

Ведущая организация —

Институт биорганической химии им. М. М. Шемякина

Защита состоится ,,_"_ 1992 г. в_

на заседании Специализированного совета Д 063.41.01 при Московском институте тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

По адресу 117571, г. Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова 119831, г. Москва, ул. М. Пироговская, 1

Автореферат разослан « »..... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук,

старщий научный сотрудник Лютик А, И.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

- I -

Актуальность проблемы. Современная лекарственная терапия базируется на индивидуальном подборе дозы препарата для каждого пациента на основе данных лекарственного мониторинга. Лекарственный мониторинг необходим прежде всего для длительно применяемых препаратов с низким терапевтическим индексом и серьезными побочными эффектами. Одним из центральных объектов лекарственного мониторинга является противдастматический препарат теофиллин (1,3-диметилксан-тин). Концентрация теофиллина в крови в настоящее время измеряется преимущественно с помощью иммуноаналитических методов. Для этих методов необходимы антитела, обладающие высокой специфичностью и аффинностью к теофиллину. К моменту начала этой работы антитела, полностью соответствующие этим требованиям, получены не были. Поэтому актуальной задачей являлось получение антител к теофиллину с необходимыми характеристиками. Эту задачу можно было решить с^к традиционными методами так и методами гибридомной технологии.

Современная диагностика развивается в двух направлениях: разработка методов, пригодных для проведения массовых исследований в условиях крупных диагностических центров, и создание' методов для визуальной экспресс-диагностики в нелабораторных условиях, поэтому нам представлялось актуальным создание на основе полученных антител иммуноаналитических систем обоих типов.

Целью данной работы является получение высокоаффинных и высокоспецифичных антител к теофиллину и разработка на их основе количественных иммуноаналитических методов, применимых для лекарственного мониторинга теофиллина.

Научная новизна. Разработаны методы синтеза новых коньюгиро-.ванных антигенов теофиллина с белковыми носителями. Изучено влия-*ние структуры конъюгатов на специфичность и аффинность образующихся антител, обнаружена уникальная пара конъюгатов для иммунизации животных и тестирования антител в. твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА). Установлено, что данные антигены позволяют получать (поликлоналыше антитела (пкАт) к теофиллину с улучшенной специфичностью'и аффинностью Структуры конъюгатов защищены авторским свидетельством на изобретение.

Впервые получены высокоаффинные и специфичные моноклона ль нъю антитела (мкАт) к теофиллину.

Разработан оригинальный иммунометрический метод анализа теофиллина в сыворотке крови на основе как поли-, так моноклональных антител, который защищен авторским свидетельством на изобретение.

Вт-'М днсс^т;:?.:^

Предложен ряд методов, основанных на прямом конкурентном ИФА теофиллина. Исследованы способы синтеза конъюгатов теофиллина с ферментами и установлена связь между их структурой и активностью.

На основе мкАт к теофиллину разработан новый метод анализа теофиллина, использующий принцип быстрой фильтрации иммунореагентов через мембрану с иммобилизованным антигеном.

Практическая значимость. Для измерения концентрации теофиллина в мире разрабатывается и производится большое количество диагностических систем, однако в нашей страна до настоящего времени подобные тест-системы не выпускались. В данной работе впервые в нашей стране поставлена задача разработки современных иммунофермент-ных методов анализа теофиллина. Работа проводилась в рамках исследований, предусмотренных Государственным планом N 1891-5562-02, теш • N 8СЮ. 02.

Нами впервые создана высокоэффективная тест-система "Тео-тест" для изменения концентрации теофиллина, которая прошла испытания в клинике. В настоящее время идет подготовка к ее производству на СГГ'Диаплюс" для широкого клинического применения.

Впервые предложен удобный неинструментальный экспресс-метод анализе- концентрации теофиллина в крови пациентов.

Положения выносимые на защиту: I. Разработка методов получения поли- и моноклональных антител к теофиллину. 2. Разработка конкурентных твердофазных ИФА теофиллина. 3. Разработка метода иммуно-фильтрации для экспресс-диагностики теофиллина.

Апробация работы. Диссертация .апробирована 6 мая 1392г.'на Коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов НПО "Биотехнологии". Материалы диссертации представлялись на: II Всесоюзной конференции Ьо фармакокинетике "Фармакокинетические исследования при создании и применении . лекарственных средств" г. Каунас 1987г., конференции "Современные направления развития биотехнологии" г. Москва 1991г.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано, 7 работ, получено 2 авторских свидетельства.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литература Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста, включая 10 таблиц и 41 рисунок. Список литературы содержит 142 источника.

- 3 -

Результаты исследования и их обсуждение.

1. Синтетические конъюгированые антигены.

Получение антител, пригодных для иммуноаналитическкх изэтодов анализа те о фи л лика, является довольно сложной задачей, т. к. антитела на должны взаимодействовать-'с многочисленными природными аналогами теофиллина (рис. I), присутствующими в жидкостях организма постоянно (ксантин, гипоксактин, мочевая кислота), попадающими в организм с пищей (кофеин и теобромин) или образующимися из теофил-лина в процессе его метаболизма (3-метилксантин, I, З-диматил и I-мэтилмочэвые кислоты). Дополнительная сложность заключается а том, что теофиллин является низкомолекулярным веществом и для получения к нему антител нужно ковалентно связать его с иммуног^тгам носителем. Структура такого конъюгата.обычно оказывает решающее влияние на свойства получаемых антител.

В литё'ратуре было описано получение коньпгатов тео$шояяа, в которых гаптен связан с белком через положения 3,7,8,9 молекулы теофиллина. Во всех случаях получаемые антитела обладали сильной перекрестной реактивностью по отношению к различный аналогам ..теофиллина. Наиболее специфичные антитела образовывались при использований для иммунизации конъюгата, содержащего пептидную ' связь между; белком и С8-положением теофиллина. Поэтому мы синтезировали несколько конъюгатов по 8-полокению молекулы теофилина с разньвш ■типами связи гаптен-белок (рис.2). В качестве белков-носителей' использовали человеческий или бычий, сывороточнш альбумины (ЧСА или БСА) и гемоцианин из Keyhole limpet (kih). Предварительно было синтезировано по известному методу производное теофиллина - 8-ами-нотеофиллин. Конъюгат I был получен из 8-вминотеофиллина и бежа с помощью карбодиимида, конъюгат 2 синтезирован реакцией 8-аминотео-филлина с глутаровым альдегидом и белкой, а конъюгат 3 - превращением аминогруппы гаптена в диазониевую соль с последующим присоединением активированного гаптена к ароматическим остаткам белка. Конъюгат 4 синтезирован нами по известному методу реакцией N-гид-роксисукцинимидного эфира 8-карбоксипроизводного теофиллина с аминогруппами белка в присутствии карбодиимида.

2. Поликлональные антитела к теофиллину.

Кроликов иммунизировали синтезированными конъюгатами и сыворотки тестировали на присутствие антител к гаптену твердофазным ЙФА.

Природой* ясамтммы: —м

гииоисаяткн

I/

Дд

и

мчвцд шалота

Пищсме кантом:

СН» кофвим

X

о

сн.

теобромин

Матаваеипп

х!хх

г о

1-ыетилыочемл кислот«

оЛ

о

ы,

1|3-цинвткпмочевая к-та

сн» 2

1x7 I

З-квтнлксамгкн

Рис Л Тесфшишн и его аналоги.

."¿гл О^Л'Чг^Ц-(Си»") Л, ц 8 сн.

* сн. СН. О

Рйс.2 Синтетические коныогированные антигены теофнллина о белками.

В качестве твердой фазы применяли полистироловые 96-луночныв планшеты для микротитрования, на которые сорбировали один из конъюга-тов ТФ-белок. Кроличьи антисыворотки раститровывали в планшете и с помощью меченных ферментом овечьих антител к иммуноглобулинам кролика измеряли количество антител, связывающихся с антигеном на твердой фазе. Первичное тестирование сывороток кроликов проводили, применяя в ИФА для сорбции на твердую фазу тот же коныогат, что и для иммунизации.' Было показано, что наибольший титр антител к теофиллину достигается при использовании для иммунизации коныпгатовЗ: ТФ-азо-БСА или ТФ-азочан. В дальнейшей работе мы использовали только эти конъюгата При иммунном ответе на конъюгированкьв антигены активируются различные клоны В-клеток, которые продуцируют антитела с разным сродством к гаптену, белковому носителю и участку связи гаптен-носитель. Для того, чтобы при тестировании Избежать помех со стороны антител, специфичных к белку-носителю или к связи гаптен-белок, мы исследовали возможность применения в ИФА конъюгированных антигенов I, 2 и 4, отличающихся от использованного для иммунизации как белком-носителем, так и типом химической связи гаптен-белок. Оказалось, что наилучшие результаты достигаются при использовании конъюгата 2 ТФ-гл-белок.

Для определения аффинности антител применяли радиоиммунологический анализ, в котором использовали меченный тритием теофиллин с удельной активностью 88 Ки/моль, который был получен методом прямого, изотопного обмена в институте Медицинской генетики АН СССР. Константу связывания антител определяли по методу Ленгмюра. Ветчины констант аффинности антител, полученных после иммунизации ко-нъягатом ТФ-азо-БСА, колебались от 3»10 до 4*10 для различных животных, а в случае использования для иммунизации конъюгата на основе гемоцианина средняя константа аффинности возрастала до 10

Специфичность полученных антител в теофиллину оценивали а ИФА по их способности взаимодействовать с препаратами, сходыми с тео-филлином по химическому строений , Для этого изучали возможность ин-гибирования Этими препаратами реакции связывания антител с конью-гатом ТФ-гл-белок, сорбированным на твердой фаз0. Как видно из представленных в табл. I данных, антитела к теофиллину практически не связывались с родственными препаратами, за исключенной кофеина, перекрестная реакции с которым составляла для различных животных примерно 3-5Ж по сравнению с теофиллином.

Таблица I. Сравнение специфичности поли- и монооональных антител.

Вещество Перекрестные * реакции %

пкАт мкАт

2сЗ 2С10 109

Теофиллин 100 100 100 100

3-метилксантин 0.1 а 002 а 001 8

1-метилмочевая к-та 0.1 10 а 001 80

1,3-диметилмочевая к-та 1.3 7 500 4000

Кофеин 3.2 а 001 100 2

Мочевая кислота а 001 а 001 0.001 а 001

Ксактин а ога 0.001 0.001 а 001

Пшоксантин 0.01 0. 001 а ога 0. 001

Ксантозин/ а 001 а 001 0.001 0.001

Аденин а 001 а 001 0. 001 а оо1

Гуанин 0.001 0.001 0.001 .а 001 *

процент перекрестных реакций - молярное соотношение концентраций -теофиллина и аналога, дающих 50 % ингибирование связывания антител с иммобилизованным антигеном.

Для описанных ранее антител, полученных к конъюгатам по 8-положению, наблюдался перекрест с кофеином до 40%, а для антител, полеченных к конъюгатам по 3-положеницбыло характерно высокое сродство К 1-датилмочевой кислоте.

Таким образом, нами были получены поликлональные антитела (пкАт) к теофиллину, характеризующиеся более высокой аффинностью и специфичность» Улучшение характеристик антител по сравнению с описанными в литературе можно, по-видимому, объяснить тем, что в конъюгатах, {грииеняемых нами для иммунизации, гаптен был присоеди-ненен А белку диазосвязыо.

П&Ат выделяли из кроличьих сывороток С ПОМОЩЬЮ ИОННО-ОбЬЙННОЙ или аффинной хроматографии. Для ионообменной хроматографии в качестве носителя использовали ДЭАЭ-целлюлоэу.. а для аффинной - се-фарозу, на которую через мостик из диаминогексама и глутарового альдегида был присоединен аминотеофиллин.

- 7 -

3. Моноклональныз антитела к теофиллину.

Проблема дальнейшего улучшения характеристик антител к теофиллину стала разрешима с развитием методов гибридомной технологии, позволяющих получать мкАг с нужной -специфичностью и аффинностью. Дополнительные преимущества мкАт заключаются в молекулярной однородности и доступности в больших количествах при сравнительно низкой себестоимости. Недавно была запатентована, гибридома, продуцирующая мкАт к теофиллину, однако, существенного улучшения характеристик антител по сравнению с пкАт не было достигнуто. - Нами была.предпринята попытка получения гибридомы, которая продуцировала бы мкАт к теофиллину, используя для этого спленоциты мышей, иммунизированных высокоиммуногенным конъюгатом ТФ-азо-кш. Наличие высокого гуморального иммунного ответа у этих животных позволяло надеяться на получение гибридомы с требуемыми характеристиками. Было обнаружено, что интервал между первой и второй иммунизацией должен бчть не менее 5-6 недель. После второй иммунизации у всех животных брали кровь и исследовали сыворотки на присутствие в них антител, специфичных к гаптену. Спленоциты тех животных, .чья сыворотка обнаруживала, значительный положительный ответ к гаптену, сливали с миеломными клетками линии Р3-Х63-Ад8.653. Слияние и клонирование проводилось общепринятыми методами, с применением в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля - ,4000. Для отборе положительных клонов мы использовали;метод твердофазного ИФА на планшетах с иммобилизованным антигеном ТФ-гл-БСА, разработанный нами для тестирования кроличьих антисывороток. Наличие" антител, связывающихся с твердой фазой, определяли с помощью антител к мышиным иммуноглобулинам в, меченных пероксидазой хрена. Таким образом было отобрано 18 положительных клонов. Далее изучали способность отобранных антител взаимодействовать со свободным теофил-лином. По результатам ингибирования свободным гаптеном связывания антител с иммобилизованным антигеном в ИФА было отобрано 3 клона, активно секретирующих антитела к теофиллину. 1в9, 253 и 2сШ

Кондтанты" аффинности антител, продуцируемых гйбридомами, были определены твердофазным ИФА по методике, описанной ВеаПу. Величины констант колебались от 10 (для 2С10) до 2*ю' (для 253).

специфичность полученных антител оценивали твердофазным ИФА по ингибированию связывания антител с иммобилизованным антигеном различными аналогами теофиллина (табл.1) . Антитела, продуцируемые

всеми гибридомами, хорошо связывают теофиллин, но сильно отличают ся по сродству к его структурным аналогам. Наиболее специфичными являются антитела 263: перекрестная реакция.с кофеином и 3-ыатилк-сантиноы составляют всего а 001% и 0. 002%, соответственно. Некоторый перекрест наблвдается лишь с 1-метилмочевой и I, З-диштилмоче-вой кислотами. Антитела 1б9 связывают 1,3-диметилмочевую кислоту в 40. раз сильнее,, чем теофиллин, их перекрест с 1-метилшчевой кислотой составляет 80%, с 3-метилксантином - 8%, с кофеином перекрест значительно ниже - всего 2%. С другой стороны, антитела 2СЮ связывают кофеин так же хорошо, как и теофиллин, I, 3-диметилмочевую кислоту в 5 раз сильнее, чем теофиллин, зато не узнают 3-ке-тилксантин и'1-штилмочевую кислоту. Все три антитела не взаимодействуют с ксантином, гипоксантином и мочевой кислотой.

Полученные результаты позволяют предположить, что для узна-ваю.. гаптена всеми антителами необходимо присутствие в его молекуле метальных групп на атомах С1 и СЗ ксантина, однако, для антител 2йЗ большее значение имеет метильная группа в положении I. На связывание с антителами 2С10 не оказывает влияния наличие или отсутствие в гаптене метильной группы на атоме С7, тогда как для узнавания антителами 2вЗ и 1в9 гаптен не должен содержать штильную группу на атоме С7. Присутствие в гаптене карбоксильной группы на атоме С8 сильно повышает сродство антител 1б9.

Таким образом, антитела к теофиллину 2С10 перекрестно реагируют с кофеином, который может поступать в организм с пищей, а антитела ЙЭ связываются с метаболитом теофиллина 1,3-диыетилмочевой кислотой лучше, чем с самим гаптеном, н поэтому эти антитела не могут чспользоваться в иммуноанализе. Оба эти антитела, однако, могут успешно применяться как специфические детоксицирующие агенты при отравлениях, вызванных теофиллином. Только антитела 2&3 по своей специфичности подходят для использования в иммуноанализе.

Гибридому, продуцирующую антитела 2йЗ, культивировали в виде асцитных опухолей в мышах и выделяли антитела из асцитной жидкости с помощью ионнообыенной или аффинной хроматографии. Чистоту полученных препаратов антител проверяли с помощью гельэлектрофореза. Данные электрофореза свидетельствовали о гомогенности выделенных препаратов антител. В этих жа экспериментах была сделана попытка определить локализацию мест связывания с теофиллином на молекуле иммуноглобулина. Для этого фильтр, полученный после электрофореза

в восстанавливающих, условиях с последу, дам блоттингом, проявляли двумя различными методами. Для определения местонахождения на фильтре легкой и тяжелой цепи мкАт использовали меченные ферментом антитела к мышиным иммуноглобулинам с, а для определения возможных мест связывания молекулы антитела с теофиллином применяли конъюгат теофиллина с пероксидазой. В результате эксперимента было установлено, что в связывании с теофиллином участвуют как тяжелые, так и легкие цепи иммуноглобулинов.

Далее мы получили Раь-фрагменты наших антител. Для этого были подобраны условия расщепления антител 2вЗ протеолитическим ферментом папаином и выделения РаЬ-фрагментов с помощью аффинной хроматографии. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью электрофореза. Полученные нами препараты сохраняли антиген-специфическую активность;

Итак, на данном этапе работы нами были получены высокоспецифичные антитела к теофиллину, как полк-, так моноклональные; разработаны методы их очистки и тестирования в твердофазном ИФА.

4. Разработка методов иммуноанализа теофиллина.

4.1 Прямой конкурентный метод с использованием конъюгатов теофиллина с ферментами (ТФ-Ф).

Наиболее распространенными твердофазными иммуноферментными методами. диализа низкомолекулярных соединений до настоящего момента являются методы, которые основаны на прямой конкуренции препарата из 'пробы и препарата, ковалентно связанного с ферментом, за связывающие центры антител,, иммобилизованных на твердой фаза. В качестве ферментов для мечения гаптенов обычно применяют щелочную фосфата-зу (ШФ) или пероксидазу хрена (ПО). Мы изучили возможность использования обоих этих меток в комбинации с нашими антителами к теофиллину для разработки соответствующих методов ИФА. Для этого различными методами синтезировали несколько конъюгатов теофиллина с ШФ н с ПО.

Конъюгирование теофиллина с ШФ проводили реакцией 8-аминотео-филлина с аминогруппами ЩФ в присутствии- глутароваго альдегида. Было опробовано несколько вариантов синтеза, при которых в реакцию вводили различные количества фермента на 1мг аминотеофиллина. Ко-

личество включения теофиллина на шль фермента определяли, добавляя в реакцию аыинотеофиллин, меченный тритием.. Полученные конъю-гаты содержали от I до 9 моль теофиллина на моль фермента.

Конъюгат теофиллина с пероксидазой (ТФ-ПО) синтезировали также из 8-аминотеофиллина, причем была изучена возможность коньюгирова-нич различными методами: с помощью глутарового альдегида; с помощью производного водорастворимого карбодиимида; реакцией с диа-зониевой солью 8-аминотеофиллина и, наконец, окислением пероксида-з« периодатом натрия с последующей реакцией окисленного продукта с аминотеофиллином. Были получены коьъюгаты с разным содержанием теофиллина на молекулу фермента (от I до 6 молей).

В процессе разработки конкурентного анализа мы изучили возможность применения различных твердых фаз и различных способов иммобилизации антител. Для получения твердой фазы с сорбированными антителам! использовали полистироловые шарики и 96-луночные планшеты. Твердая фаза с ковалентно присоединенными антителами была получена их ковадентным связыванием с активированной ВгСН-сефарозой, что позволило достичь высокого содержания антител на носителе. Используя полученные таким образом твердофазные носители, мы попытались разработать оптимальную систему анализа, варьируя фермент, степень замещения гаптена в конъюгатах ТФ-Ф, рабочее разведения конъкуатов, время анализа, температуру и объем пробы.

Анализ проводили по следующей общей схеме: Пробу или стандартный раствор теофиллина смешивали с конъюгатом Тф-Ф в присутствии иммобилизованных антител. После инкубации твердую фазу отделяли 'и измеряли-активность присоединившегося к ней фермента, применяя для этого соответствующий субстрат: 4-нитрофенилфосфат' для ШФ, перекись водорода и ортофенилендиамин - для ПО. Интенсивность развивающегося окрашивания оценивали по оптической плотности раствора при соответствующих длинах волн (402нм для ШФ и 492нм для ПО). По результатам, полученным для стандартных растворов теофиллина, строили калибровбчную кривую для определения концентрации препарата в анализируемой пробе.

а.) Метод с использованием конъюгата ТФ-1ДФ.

Фирма А11 егдепеи с$ выпускает тест-систему для определения теофиллина с использованием конъюгата теофиллина с ШФ, но эта система обладает неудовлетворительными характеристиками: требует 100мкл пробы, стадии предварительной инкубации, применения флуорогенного субстрата.

б.)

<и <ин»

,УУ„

ттттггггттттт

I

V У

г гппгп и \

ОКРАШШНЕЗ

у 10 20 30 40 ккг/нх концеятрсдяя зчсфкшша

Рис.З Конкзгрбнтный твердофазный И5А теофгошша с использованием конъпгата теофиллина- о щелочной фосфатазой. а.)калибровочная кривая б.)схема анализа.

Мы разработали вариант анализа с примением ТФ-ШФ и кроличьих антител, сорбированных на полистироловых планшетах (рис.3). Изучение влияния содержания теофиллина в коньюгате ТФ-ШФ на характервдг-"гики метода показало, что оптимальным является конъюгат, содержа-.щий I моль -теофиллина на моль фермента. Оптимизация параметров 'анализа привела к следующим характеристикам: объем пробы - 10 ко, время анализа - 2 часа при комнатной температуре. По сравнению с методом фирмы Л11 егдепеИ сз данный метод-на I час длиннее, однако, позволяет анализировать пробу меньшего объема и состоит всепу из .одной стадии. Основным недостатком обоих методов является высокая стоимость фермента.

б.) Методы с использованием конъюгата ТФ-ПО. Пероксидаза является более-дешевым ферментом, и поэтому мы попытались разработать метод анализа теофиллина с использованием кроличьих антител, сорбированных на твердой фазе, и коныпгатов ТФ-ПО.

Нами были опробованы все синтезированные конъюгаты ТФ-ПО и, оказалось, что наиболее подходящими для конструирования системы

иммуноанализа являются конъюгаты, полученные реакцией аминотеофил-лина с окисленной пероксидазой. При этом рост степени замещения теофиллина на молекулу фермента вызывал усиление связывания с антителами при некотором снижении ферментативная активности. Было показано, что оптимальным является конъюгат, содержащий 3 моль теофиллина на моль пероксидазы.

Метод, основанный на сорбированных пкАт, однако, обладал слишком низкой чувствительностью и требовал слишком длительного времени анализа. Чувствительность метода удалось значительно повысить используя пкАт, ковалентно связанные с сефарозой, за счет высокого содержания антител на носителе.

Анализ на пкАт, ковалентно связанных с сефарозой, проводили следующим образом: 10мкл пробы или стандартного раствора теофиллина добавляли к смеси конъюгата ТФ-ПО и суспензии сефарозы, ковалентно связанной с. антителами, и инкубировали в течение 15 мин. Сефарозу *'со связавшимся коныогатом ТФ-ПО осаждали центрифугированием, отмывали ее от несвязавшегося ТФ-ПО, и измеряли ферментативную активность. Данный метод позволяет эффективно определять концентрацию теофиллина в терапевтическом интервале (рис.4), однако, В этом методе есть стадия центрифугирования, которая усложняет процесс его выполнения.

Поуле получения высокоаффинных мкАт к теофиллину 2сЗ появилась возможность создания твердофазного ИФА с использованием ТФ-ПО и сорбированных на твердой фазе антител. В качестве твердой фазы в данном случае применили полистироловые шарики. -

Анализ на мкАт, сорбированных на твердой фазе: пробу, содержащую теофиллин, смешивали в пробирке с раствором ТФ-ПО и добавляли шарик. После инкубации шарик отмывали и измеряли активность фермента.

Бьшо изучено влияние различных параметров на характер калибровочной кривой. Оказалось, что для получения калибровочной кривой, линейной в области терапевтических концентраций теофиллина, достаточно 5ыкл стандартного раствора и 30 мин инкубации. Для определения специфичности полученного метода сравнивали кривые ингибирова-ния связывания антител с конъюгатом ТФ-ПО теофкллином из пробы с аналогичными кривыми ингибирования в присутствии наиболее важных аналогов и метаболитов теофиллина (рис.5). Присутствие родственных теофиллину соединений в концентрации 10 мкг/мл не искажало кривой ингибирования.

Таким образом, разработано несколько вариантов прямого твердо-

а.) *

4И»я

о ю 20 эо 40 ео

б.) у <ЙЬПО у

А ^ А

I

цвитродг гире мм* •

йь-па

нкг/мд тесфкимиа

Рис.4 Конкурентный твердофазный ША теофиллина ^использованием конъюгата теофиллина с пероксицазой 1ХФ-Ц0) и антител, ковалентно связанных с сефароэой. »калибровочная кривая б. )схема анализа

Рис;5 Конкурентный твердофазный ИФА теофиллина с /£5°йп?ованием «онъпгата теофиллина с персксидазой 1ТФ-ПО) и антител, иммобилизованных на шариках.

а.)схема анализа

б.»калибровочная кривая (•), та же кривая в присутствии 10 ыкг/мл аналогов теофиллина: кофеина (*), 1-метилмо-чевой кислоты (о) и 1,3-циметилмочевой кислоты (л).

фазного иммуноферментного . метода анализа теофиллина. Наилучшими характеристиками обладает метод с использованием пероксидазы и исАт.

4.2 Иммунометрические методы анализа теофиллина.

Иммунометрические твердофазные методы анализа гаптенов до настоящего времени не получали широкого распространения из-за менее стабильно результатов, а также из-за того, что реакция связывания меченных антител с антигеном, иммобилизованном на твердой фазе, обычно не полностью тормозится свободным гаптеном. Ранее нами была подобрана пара конъктатов ТФ-белок для иммунизации (ТФ-азочан) и для тестирования сывороток методом твердофазного ИФА (ТФ-гл-БСА), при использовании которой наблюдалось полное ингибирование свободным теофиллином реакции связывания антител с сорбированным конъю-гатом; при этом кривая ингибирования имела линейный характер в большом диапазоне концентраций теофиллина. Наличие столь удачной комбинации конъюгатов для получения и тестирования антител позволяло надеяться на возмонность разработки на их основе эффективного иммунометрического метода анализа теофиллина.

а) Кммунометрический метод с использованием пкАт.

Первоначально возможность использования иммунометрического принципа для создания метода анализа терфиллина изучалась на пкАт. Для разработки такого метода в качестве ферментной метки была выбрана пероксидоза из хрена. Фермент связывали с очищенными антителами методом периодатного окисления.

Для проведения анализа коньшгат ТФ-гл-белок предварительно иммобилизовали в лунках полистироловых 96-луночных планшетов. Анализ проводили в одну стадию пробу или стандартную сыворотку с известным содержанием теофиллина вносили в лунку планшета и смешивали с раствором конъюгата антитело-пероксидаза (Ат-ПО). Посла инкубации жидкость удаляли, твердую фазу промывали и измеряли по реакции с субстратом активность пероксидазы, связавшейся с твердой фазой.

Мы исследовали характер калибровочной кривой при разных условиях иммунохимической реакции. Варьировалось содержание гаптена в к о нъшгиро ванно м антигене, концентрации реагентов, время и температура реакции.

Наибольший наклон калибровочной кривой в терапевтическом интервале концентраций теофиллина достигался при применении для сорбции

на твердую фазу конъюгированного антигена ТФ-гл-белок с замещением 8 молекул теофиллина на молекулу белка.

По кривой зависимости связывания антител с твердой фазой от концентрации антигена, взятой для сорбции, определяли его оптнмаль ную концентрацию - как концентрацию^ соответствующую выходу кривой на плато (рис.6). В зависимости от типа пластика получали различные значения оптимальной концентрации антигена от I до 2-4 мкг/мл.

Конъюгат Ат-ПО использовали в разведении, приводящим в отсутствии свободного теофиллина к значению поглощения примерно 1.5, что соответствует разведению 1:800-из раствора 10мг/мл. Изучение зависимости параметров калибровочной кривой от объема пробы показало, что оптимальным объемом пробы является 10мкл (рис.7).

Время иммунохимической реакции оказывало существенное влияние на параметры калибровочной кривой. При малом времени реакции (от 15мин до 1час) величина ингибирования пропорциональна концентрации теофиллина, при увеличении времени реакции до 2час пропорциональность нарушается: при низких концентрациях препарата начинает наблюдаться не торможение, а усиление связывания антител с антигеном, сорбированном на твердой фазе. Это явление исчезает при инкубировании в течение 24 час, когда успевает установиться равновесие в системе. Таким образом, кривую ингибирования с необходимыми для анализа характеристиками можно получить как при длительном времени реакции, так и при очень коротком (15-20мин), до установления рав 'новесия в системе, при этом в реакцию вступают' только наиболее специфичные антитела.

Было показано, что оптимальным вариантом является проведение _:всех иммунохимических реакций при 20 С, так как это позволяет избежать искажений результатов (так называемого "краевого эффекта"), получаемых в лунках крайних рядов планшетов при более высоких температурах инкубации.

Стандартные растворы, содержащие 0,5,10,20 и 30 мкг/щ теофиллина, были приготовлены на человеческой или лошадиной сыворотке.

Разработанный метод был использован для анализа сывороток крови больных астмой, получавших теофиллин. Результаты измерений хорошо воспроизводимы, коэффициент вариабельности не превышал 12%. Одновременно 20 сывороток были проанализированы методом ВЭЖХ. Коэффициент корреляции между результатами, полученными двумя методами, равен 0. 98 (рис. 8).

Л

№к

2.0,

1.0 Рис .'6 Связывание антител с конъюги^-рованннм антигеном ТО-гл-БСА при использовании различных концентраций антигена для сорбции на твердую фазу.

8 2 0.5 0.125 мгг/мл

концентрация ТФ-гл-БСА

субстрат хроюгвн

ОШШМНЕ

Еис.7 Шмтаометрический твердофазный ГОА теофкллина. а.) схема анализа б.)калибровочные кривые, получаемые в различных вариантах анализа: на шашках с использованием полл-(1) и ыоноклональнызс антител(2) и на шариках с использованием моноклональных антител (3).

Риз. 8 Корреляция результатов иммунометрического метода на псанпслональных антитедах(ИБА) и метода высокоэффективной хвдко^гнсй хроматографии

, 4 12 20 Шк

концентрация теофиллвна.мнг/мл

Таким образом, твердофазный иммунометрический ИФА с использованием поликлональных антител к теофиллину, достаточно точен и чувствителен, его можно проводить за 30 минут сразу с большой партией проб крови и использовать 10 мкл пробы сыворотки крови. Данный иммунометрический метод анализа теофнллина, а также структуры используемых в нем коныогированных антигенов были защищены авторскими свидетельствами.

б) Иммунометрический метод с использование мкАт.

Получение высокоаффинных и специфичных мкАт создало дополнитель--ныз возможности для улучшения характеристик разработанного наш иммунометрического метода. Благодаря использованию этих антител объем анализируемой пробы сократился до Змкл, а время анализа до 15 мин. Конъюгат ихАт-ГО, полученный аналогично пкАт.-ПО, применялся в анализе в чрезвычайно высоком разведении 1:15 ООО (из исходного раствора 10мг/мл).

Использование в данном методе моноклональных антител обеспечило высокую специфичность анализа. Аналоги теофнллина, при добавлении в реакцию в сравнимых с теофиллином концентрациях не оказывали влияния на результаты анализа (табл.2). Некоторая ошибка в определении теофиллина возникала только в присутствии чрезвычайно высоких концентраций 1-метилночевой кислоты, которые однако никогда не встречаются в крови человека. При изучении влияния повышенных кон-

ВЭЖХ

0} н

5121

I

о, §

центраций различных эндогенных компонентов сыворотки, было- показано, что гепарин, гемоглобин и лецитин в концентрации до 2 мг/мл, билирубин до Ц1 мг/мл - не влияли на результаты анализа. Лекарственные препараты в концентрациях, наблюдающихся в сыворотке при терапии этими препаратами, также не вызывали ошибки.

Таблиц« 2. Влияние метаболитов и аналогов теофиллина на результаты определения концентрации теофиллина методом Тео-тест.

Аналог Концентрация, в мкг/мл, необходимая для увеличения на 20% кажущейся концентрации теофиллина в пробе с концентрацией 20 мкг/мл теофиллина

Кофеин > 10 ООО

Ксантин > 10 ООО

З-Метижсантин > I ООО

I-Метилыочевая кислота >100

I, З-Диметилмочевая кислота > 400

Мочевая кислота > 10 ООО

Гипоксантин > 10 ООО

Были опробованы два варианта анализа, с использованием в качос- . •тве твердой фазы полистироловых шариков и 96-луночных планшетов. Как видно из приведенного рис.7, калибровочные кривые, получение обоими методами, линейны в области терапевтических концентраций. Поскольку площадь поверхности шарика незначительно отличается от площади поверхности лунки планшета, то и объемы всех реагентов, используемых в этих вариантах анализа, отличались незначительно.

Чувствительность анализа для обоих вариантов составляла менее 1 мкг/мл.'

Для определения коэффициента вариабельности результатов измерения 30 проб анализировали в десяти повторах 10 раз. Коэффициент вариабельности при использовании планшетов не превышал 3,5 %, для шариков это значение было еще ниже - 2,4% и значительно ниже, чем при использовании пкАт.

Были изучены условия Хранения всех реагентов. Стандартные растворы теофиллина в сыворотке хорошо храняться в лиофилизованном виде. Концентрированные растворы конъюгата Ат-Ф (2-4 мг/мл) в при-

сутствии 10мг/ыл лошадиных иммуноглобулинов стабильны при 4*С в течение года, а при 37*С в течение 20 дней. Однако, разведенные растворы коныогата теряют свою антиген-связываицую активность довольно быстро.

Результаты анализа хорошо коррелируют с данными, полученными с помощью хроматографии высокого давления ( табл.3). Таблица 3. Сравнение результатов анализа теофиллина в двух вариантах ИФА с результатами ВЗНХ.

Методы Результаты определения концентрации теофиллина в пробах

Планшеты Шарики ВЭЖХ 9.0 13.5 11.3 9.2 13.7 II. 9 2.9 - - (13 . В. 7 13.1 12.3 9.0 14.3 - 3.1 3.5 16.6 а 6 9.6 13.8 11.2 9.2 13.'3' II. 4 3.4 3.8 13.9 а 5

Таким образом, нами разработан точный и удобный метод анализа теофиллина в сыворотке крови человека на планшетах и шариках, для которого необходимо всего лишь Змкл пробы и 20мин времени анализа. Для метода характерна высокая специфичность анализа, низкая вариабельность результатаов и хорошая корреляция с другими методами.-

В настоящее время идет подготовка к производсту на Ро.ссийско--Швейцарском совместном предприянии "Диаплюс" набора реагентов для анализа теофиллина "Тео-Тест", который основан на этом методе.

4. 3 Метод иммунофйльтрации. В последнее время интенсивно разрабатываются методы, которые позволяют анализировать лекарственные препараты в лабораториях с минимальным приборным оснащением, например, в кабинете врача, а также методы для самоанализа.

Нами был разработан оригинальный экспресс-метод определения концентрации теофиллина в сыворотке крови, который основан на фильтрации смеси пробы, содержащей теофиллин, и меченных ферментом антител через нитроцеллюлоэную мембрану с иммобилизованным конъю-гатом-ТФ-белок (рис.9).

Анализ проводили следующим образом: на нитроцеллюлознуп мембрану предварительно сорбировали коньюгат ТФ-гл-БСА. Стандартные растворы теофиллина или пробу смешивали с раствором коныогата мхАт-Ф. Полученную смесь фильтровали через мембрану. После отмывания мемб-ранн от несвязавшихся антител определяли активность фермента, связавшегося с мембраной. Для этого через мембрану пропускали раствор

Рис.9 Схема метода имцунофильтрации.

хромогена и субстрата пероксидазы, и развивавдэеся окрашивание мембраны оценивали с помощью фотометра. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации теофиллина в крови.

Исследование влияния вариации параметров анализа на его характеристики показало, что оптимальной концентрацией конъюгированного антигена для сорбции на мембрану является 100мкг/мл, рабочее разведение меченных антител составляет 1:1000 (из концентрированного раствора 10мг/мл), а оптимальным объемом исследуемой пробы является Змкл. Изучение влияния такого параметра, как время предварительной инкубации пробы с антителами показало, что варьирование времени инкубации от 0 до 5 часов не приводило к существенным изменениям характеристик метода (рисЛОа). Данный факт, по-видимому, можно объяснить высокой скоростью взаимодействия антител с гапте-ном, которая обеспечивается аффинностью наших мкАт. к теофиллину. По этой причине при фильтрации антител через мембрану стабильное связывание антител с мембраной достигается при времени фильтрации всего 15 сек (рис.106). Дальнейшее увеличение времени фильтрации вплоть до 6 мин не приводит к каким-либо изменениям интенсивности сигнала. Благодаря таким кинетическим параметрам метод позволяет добиваться стабильных результатов при проведении анализа в течение всего Зминут, включая время пипетирования. Было исследовано' Влияние различных структурных аналогов теофиллина на результаты анализа и показано (табл.4), что присутствие их в исследуемо! пробе не влияет на определение теофиллина.

Таблица 4. Влияние метаболитов и'аналогов теофиллина на результаты определения концентрации теофиллина методом иммунофильтрации.

Аналог Концентрация, в мкг/мл, необходимая для увеличения на 20% кажущейся концентрации теофиллина в пробе с 20мкг/мл теофиллина

Кофеин- - > 10 ООО

Ксантин > 10 ООО

З-Метилксантин > I ООО

1-Метилмочевая кислота > 500

I, З-Диметилыочевая кислота > I ООО

Мочевая кислота > 10 ООО

Гипоксантин > Ю ООО

Такие характеристики метода, как линейность в терапевтическом интервале концентраций теофиялина, чувствительность метода - менее 1мкг/мл, коэффициент вариации - юанее 52 позволяют эффективно ис-пользовать данный метод для лекарственного мониторинга теофиллина.

Предложенный нами метод анализа ложно проводить и в другой модификации - без -применения фотометра, а с помощью визуальной детекции. В таком случае для проведения анализа достаточно использовать три стандартных раствора теофиллина О, 10 и 20 мкг/ил и оценивать! интервал, в котором находится значение концентрации теофиллина в исследуемой пробе: ниже терапевтического интервала, в терапевтическом интервале- или вьвв допустимого значения (рис. II).

.Таким образом, намиразработан простой и чувствительный метод анализа теофиллина, позволяющий быстро к надежно определить кон-Чвнтрацию теофиллина в катах объеме исследуемой проба Очевидно также, что этот метод легко поддается автоматизации, что является «те дополнительным преимущество«.

- 23 -в ы вад ьь

1. Разработаны методы синтеза конъюгатов теофиллин-белок на основе 8-аминотеофидлина и отобрана оптимальная пара конъюгатов для получения антител к теофадлияу и их тестирования в твердофазном ИФА. Конъюгированный антиген ТФ-азо-К1Н вызывает более сильный и специфичный иммунный ответ, чем все конъюгаты, описанные ранее. Поликлональные антитела к теофшшгау, полученные иммунизацией этим конъюгатом, обладают вьсокой аффинностью (константа аффинности составляла 10 ) и специфичность!} (перекрестная реакция с кофеином не превышала 5%). Конь гагат ТФ-г.т-БСА оказался наиболее эффективным

4 для тестирования этих антител в ИФА. Структуры конъюгатов были защищены авторским свидетельством на изобретение.

2. Данная .пара конъюгатов позволила получить гибридому 2еЗ, продуцирующую моноклональные антитела к теофиллину, для которых характерна высокая специфичность (перекрест с кофеином был ниже П. 001%) и аффинность (константа аффинности составила 2-10 ).

3. Предложено несколько вариантов прямого конкурентного твердофазного ИФА теофиллина с использованием ферментов пероксидаэы хрена и щелочной фосфатазн на основе как полит- так и моноклональ-ных антител. Разработаны метода синтеза конъюгатов теофиллина с этими ферментами. Оптимальный конъвгат с щелочной фосфатазой был синтезирован из 8-аминотеофиллина с использованием глутаровог^ альдегида и содержал I моль теофшишна на моль фермента; наиболее активный коньюгат с пероксидазой бйл получен из в-аминотеофиллдаа методом периодатного окисления и содержал 3 моль теофиллина йа моль фермента.

4. Впервые разработаны иммуномвтрические методы анализа теофиллина. Показано, что в методе могут использоваться поли- и моноклональные антитела к теофиллину. Метод характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью^ малым временем анализа,. а также хорошей корреляцией о другими нвтодаки. Описанный метод был защищен авторский свидетельством на изобретение.

Метод был положен в основу тест-системы для измерения концентрации теофиллина в сыворотке человека "Тео-тест". Клинические испытания данной тест-системы показали ее эффективность в фармакоки-нетических исследованиях и лекарственном мониторинге теофиллина. Наборы реагентов для этой тест-системы готовятся к производству на СГТ'Диаплюс".

6. Предложен новый метод экспресс-анализа теофиллина с помощью иммунофильтрации через бумажную мембрану, применимый для лекарственного мониторинга в лабораториях с минимальным приборным оснащением. Разработанный метод позволяет измерить концентрацию теофиллина в 3 мкл пробы за 2-3 мин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Иммуноферментный метод определения теофиллина //Данилова П. П., Бекман Н. И., Еайсберг Е., Василов Р. Г. / - Мат. II Всесоюзн. конф. по фармакокинетики г. Каунас 1987 с. 88-91.

2. Твердофазный иммуноферментный метод определения теофиллина в сыворотке крови //Данилова Н. П., Бекман Е И., Шустова Л. Е, Василов Р. Г. / - Хим. фарм. журнал 1989, N 7, с. 871-875.

3. Способ получения конъюгированного антигена теофиллин-белко-вый носитель // Василов Р. Г., Данилова Н. П., Бекман Е И. /-Авторское свидетельство на изобретение N I59I986, опубликовано 15мая 1990г.

4. Способ определения теофиллина в сыворотке крови//Данилова Н. п Василов Р. Г., Бекман R И. / - Авторское свидетельство на изобретение N 1573427, опубликовано 22 февраля 1990 г.

5:»Быстрый иммунометрический метод анализа теофиллина в сыворотке крови человека // Бекман Н. И., Данилова Е П., Василов Р. Г., / Мат. конференции ВНИИ Биотехнологии "Современные направления развития биотехнологии" 1991, с. 9.

6. Иммуноферментный метод на основе ноноклональных антител для определения теофиллина в сыворотке и в сухих пятнах крови// Е Е Данилова, Бекман Е И., А. С. Зиганшин, Р. Г. Василов/-Хим. фарм. журнал, 1992 N7, с.7/.

7. Monoclonal antibodies ta drugs - phénobarbital, dlgoxln, theophyl Une // N. P. Dani lova, N. I. Beckman, S.A.Yazynin, A.B.Ozgoev et al/«-B1ome<Mcal Science, 1992 !)• , P.