Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител в исследовании иммуноглобулина Е и некоторых антигенов главного комплекса гистосовместимости человека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Использование иммуноферментного анализа с применением моноклональных антител в исследовании иммуноглобулина Е и некоторых антигенов главного комплекса гистосовместимости человека"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

На правах рукописи

СЕРДЮК Ольга Анатольевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА С ПРИМЕНЕНИЕМ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ИССЛЕДОВАНИИ ИММУНОГЛОБУЛИНА Е И НЕКОТОРЫХ АНТИГЕНОВ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте биотехнологии Министерства медицинской промышленности СССР.

Научный руководитель:

доктор, биологических наук Р. Г. ВАСИЛОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук К. Б. АЛИБЕКОВ доктор медицинских наук Л. П. АЛЕКСЕЕВ

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова Российской АМН

Защита состоится «

» . . . 1992 г. в // . часов

на заседании специализированного совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструктор-ском институте прикладной биохимии по адресу:

125299, Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструктор-ского института прикладной биохимии.

Автореферат разослан « зг » .1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

И. И. ГУСЕВА.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В связи с широкой распространенностью аллергических заболеваний особую актуальность приобретают методы ях диагностики. В развитии аллергических процессов основную роль играют иммуноглобулины класса Е (1дЕ), Известно, что повыыанная концентрация 1дЕ в крови является важным диагностическим признаком атонического характера заболевания," поэтому разработка лммуноферментных диагностякумов на основе моноклональных антител (мкАт) для измере- . кия концентрации общего ХдЕ в сыворотке крови детей и взрослых в настоящее время очень актуальна.

При разработке и внедрении в производство иммунодиагностикумов на общий 1дЕ возникает ряд проблем, касающихся общих принципов нк-муноферментного анализа - ИФА (стабильность компонентов, оптимизация параметров иммунохимической и ферментативной реакции) и конкретных деталей (поиск надежных источников 1дЕ для производства калибровочных стандартов, характеристика препаратов 1дЕ из разных источников, стандартизация препаратов 1дЕ, оценка влияния фрагментов ХдЕ и анти-1д£ аутоантител на определение уровня ХдЕ ). Сочетание научного подхода с современными технологическими принципами позволяет разреиить этп проблемы и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики.

В последнее время появляется все больше подтверждений существования связи между регуляцией биосинтеза ХдЕ в организме и системой главного комплекса гистосовместкмости (ГКГ) человека. Развитие биохимических методов анализа антигенов ГКГ с использованием мкАт и принципов ИФА, позволяющих получить- дополнительную информацию о структуре и свойствах антигенов ГКГ и способствуйте более глубокому пониманию механизмов развития аллергических заболеваний тоже является актуальной задачей.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является исследование иммуноглобулина Е и некоторых антигенов ГКГ человека с помощью иммукоформентных методов Я НкАт -я-разработка на этой осноае' методов их анализа, пригодных для широкого.клинического применения. При выполнении работы ставились следующие- задачи:

1. Разработка на основе мкАт серия 1дЕ/11 педиатрического варианта иммунодиагностикума для измерения концентрация 1д2 в газоротке крови а диапазоне 1-100 НЕ/мл.

2 . • Разработка на основе мхАт'серии ХдЕ/11 иммунодиагностиху-мов, совместимых с технологией СПиДИАплюс" для измерения концентрации IgE в разных диапазонах.

3. Получение калибровочных стандартов IgE с использованием препаратов IgE из разных источников.

4. Стабилизация компонентов разработанных диагностикумов и проверка их стабильности в разных режимах хранения.

5.Разработка методических подходов к анализу антигенов ГКГ человека с помощью электрофоретических методов с доследующим иммуноб-лоттингом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В данной работа впервые в отечественной практике получека иммуноферментная тест-система на основе мо-ноклональных антител для измерения концентрации IgE в диапазоне 1-100 МЕ/мл, предназначенная для педиатрии. Впервые разработан им-мунодиагкостикум на шариковых носителях, совместимый с технологией Л1"ДИАплюс" дли измерения IgE в двух диапазонах - 1-100 и 25-1000 МЕ/мл. Подобраны оптимальные условия иммунохимической реакции и научено влияние различных факторов на результаты измерений концентрации IgE; изучена стабильность препаратов IgE н компонентов диаг-костихумов в разных режимах хранения с добавлением разных стабилизаторов и консервантов. Проведен анализ поликлонального IgE из разных источников. Показано присутствие анти-IgE аутоактител а препаратах поликлонального IgE и оценено их влияние на качество калибровочных стандартов. Разработаны подходы получения калибровочных стандартов IgE из препаратов миеломного, поликлонального и рекомби-иактного IgE к проведена их сравнительная оценка.

Разработан метод анализа некоторых антигенов ГКГ человека с помощь» иммуноферментных методов и мкАт после электрофоретического разделения балков в образце. Анализ ряда клеточных линий и лимфоцитов периферической крови человека с использованием мкАт НС10 показал принципиальную возможность применения данного .подхода 'для 6iíct.-'t poro и точного выявления полиморфизма антигенов I класса ША, а также для анализа некоторых антигенов IX класса. ■

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ..Разработанная тест-система для измерения концентрации IgE а диапазоне 1-100 МЕ/мл прошла испытания'

в ГЯСЯ им.Тарасевича и в настоящее, время внедряется в производство для широкого клинического применения.

Утверждены Технические условия на диагностикум "ИгЕ-ТЕСТ" и в настоящее время начинается его внедрение в производство на СП"ДИАя-люс".

Предложенные подходи получения калибровочных стандартов IgE используются- при производстве на СП"ДНАплюся тест-системы "ИгЕ-ИФА" на мнкротнтрациоккых планшетах.

Разработанный метод анализа некоторых антигенов ГКГ человека используется в отделе иммуногенеткки Ин-та Иммунологии Минздрава СССР.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ КА ЗАЩИТУ: 1.Разработка на основе мкАт серии IgE/11 педиатрического варианта иммунодяагностикума для измерения концентрации- ХдЕ в сыворотке крови в диапазоне 1-100 ME/ад. 2.Разработка на основе мкАт серии IgE/11 нммунодиагностикумаа, совместимых с технологией СП"Д'ЛАплюсн для измерения концентрации IgE в разных диапазонах. 3.Получение калибровочных стандартов IgE с использованием препаратов IgE из разных источников. 4. Стабилизация компонентов разработанных диагностикумов. 5. Метод анализа полиморфизма антигенов ГКГ человека с помощью злектрофоретических методов с последующим иммуноблоттингом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована 20 ноября 1991 г. иа коллоквиуме отдела медицинских диагностикумов 1;П0"Биотох1:ологияи Материалы диссертации были представлены иа Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988), на II Всесоюзное конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990), на Международном симпозиуме по аллергик х клинической иммунологии "Regulation and Clinical Significance of IgE", (Москва, 1990), на XIV Международно^ конгрессе во аллергологии и клинической кммунологкк (Киото, 1991).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит кэ введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включавшего 238 работ. Работа изложена иа 145 страницах, содержит 21 рисунок и 14 таблиц.

- 4 -

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ.РАБОТЫ

1.РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО IgE ДЛЯ ПЕДИАТРИИ.

Ранее в наыея лаборатории были получены мкАт к иммуноглобулину Е человека серии ХдЕ/11 и на основе пары антител IgE/11-З и IgE/11-5 была разработана тест-система для определения концентрации IgE в диапазоне 25-1000 ME/мл. Концентрация IgE в сыворотке крови детея невелика и изменяется с возрастом. Определение концентрации общего IgE в сыворотке или плазме крови детея может быть информативно при выявлении предрасположенности к аллергическим заболеваниям и при постановке диагноза. Чтобы детектировать низкие концентрации IgE, характерные для детей, необходимо было разработать надежную высокочувствительную тест-систему для определения уровня IgE.

Для выполнения этой задачи была выбрана пара антител IgE/11-l ч IgE/11-4. Котя при измерении двумя разными методами Kaff антител этой пары отличались не значительно от Kaff антител IgE/11-3 и -5, тем не менее в твердофазном ИФА пара 1-4 оказалась на порядок чувствительней.

Разработка иммунодиагностикума для определения IgE в сыворотках детей предъявляет особые требования к качеству коньюгата антител с пероксидазой хрека. Минимальная детектируемая концентрация IgE должна составлять всего 0,5-1,0 ME/мл (это нормальный уровень IgE для новорожденных). В результате испытаний разных вариантов приготовления коньюгата было решено внести некоторые изменения в традиционный протокол по Hakane. (1974) .

Дчя кокьюгатов IgE/11-l и IgE/11-З с пероксидаэой было определено оптимальное соотношение антител и пероксидаэы. Результат оценивали. в И.А и по профилю гель-фильтрации на колонке с Сефакрнлом S-300. При весовое отношении пероксидаэа:антитела 1:2 - 1:3 количество неггрореагировавыях иммуноглобулинов и пероксидазы было минимально, л пик« содержащий высокомолекулярные полимеры, практически , отсутствовал. В результате замены диализа на гель-фильтрацию была достигнута высокая воспроиэвйдимость при получении разных партия конъюгатов и достаточно хорошее их качество, позволяющее выявлять в прямом одностадийном ИФА концентрации IgE до 0,5 ME/мл. Полученные коныогаты успешно использовались также в разработка, мембранных тест-систем на аллергенсггацифкчаский и общий IgE.

В качестве калибровочных проб в тест-системе применялись разведения миеломного ХдЕ(Уи) человека, откалиброванные по второму стандарту ВОЗ 75/502 для сывороточного 1дЕ.

Были подобраны оптимальные параметры иммунофермеиткой реакции. Основные аналитические характеристики тест-системы и результаты проведенных лабораторных испытаний представлены в Таблице 1.

Таблица 1» Основные характеристики и результаты л&Во-■ раторных испытаний педиатрического варианта тест-системы для измерения концентрации 1дЕ.

измеряемый параметр основная характеристика

Принцип метода анализа Одностадийный, твердофазный,

иммуноферментный(иммунометри-.

ческий) на основе комбинации

двух мкАт разной специфичности

Твердая фаза Микротитраюгонхый планыет

Общее время анализа Не более 1,5 часа

Обьем пробы 15 мкл

Диапазон измерений 1-100 МЕ/мл

Тип калибровочной кривой Линейный или близкий к линейному

Чувствительность 1*0,4 МЕ/мл

Воспроизводимость (КВ%) 5%

Тест на "открытие" 90-110%

Тест на "линейность" 90-110%

Кроме того, было установлено, что в данной тест-системе отсутствует эффект высоких концентраций (до 67 <000 МЕ/мя) ,• было исследовано влияние антикоагулянтов и компонентов сывороток на результаты измерений и показано, что антикоагулянты лишь незначительно влияют на определение IgE. Это позволяет проводить нзюрекия в клинике как в плазме, так ив сыворотке крови, а кроме того, в гемолитических, ихтеряческих и липемических сыворотках, а также в образцах от больных, получающих терапевтические дозы теофиллина. Было проведено параллельное измерение концентрации IgE в сериях образцоь сывороток детей с помощью данной тест-системы и иммуноферментного не"5ора фирмы Behring (ФРГ).-Коэффициент корреляции составил 0,90 (Рис.1).

- б -

IgE,

. EnzygnosMgE Behring monoclonal

Ряс. 1. Корреляция результатов измерения концентрации IgE с помоцья кммуиодиагноетикума фирмы Behring (ФРГ) и педиатрического варианта тест-системы на МТП.

IgE, lü/ml

Pharmacia IgE EIA

,» о

Рис. 2. Корреляция результатов измерения концентрации IgE с помощью ■ нммукодиагностикума фирмы Pharnacia "(Швеция) и тест-системы на шариковых носителях, диапазон 0-1000 МЕ/мл.

- 7 - , ,

Таким образом, разработанная тест-система позволяет•эффективно измерять концентрации IgE в сыворотке и плазме крови детей .• Тест-систему отличают высокая чувствительность, воспроизводимость, аналитическая надежность, а кроме того, быстрота проведения анализа и простота исполнения. Результаты, полученные с помощью разработанной тест-системы, достаточно хорошо коррелируют с результатами, полученными с.использованием коммерческого набора фирмы Behring. Диагностикум отвечает требованиям, предъявляемым к подобным тест-системам .

2. РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ IgE С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШАРИКОВЫХ НОСИТЕЛЕЙ

При масштабировании производства иммунодиагностикумов на обыий IgE было решено объединить тест-систему для определения IgE у взрослых (25-1000 ME/мл) и педиатрический вариант (1-100 ME/мл), для чего перейти на пару антител IgE/11-4 и IgE/11-1 и адаптировать диагностикум. к другой твердой фазе - полистироловым шарикам, которые используются в наборах фирмы Roche (Швейцария) и СП ДИАплюс. При переходе на шариковые носители были подобраны оптимальные условия сорбции к блокирования (сорбировали на шарики в 1,5-2 раза больше антител, чем на мккротитрационные планшеты - МТП; сорбцию вели при постоянном покачивании для равномерной посадки антител; для блокировки неспацифического связывания использовали бычий сывороточный альбумин - БСА). Использование оборудования фирмы Roche исключает присутствие детергентов в растворе для промывания, промывочный раствор был заменен на дистиллированную воду. Качество конь-югата позволило это сделать без существенного повышения значений оптической плотности для фона.

Были подобраны оптимальные параметры-иммунохш-лческой и ферментативной реакций; а результате была получена тест-система для измерения концентрации IgE в двух диапазонах. Проведение анализа для двух диапазонов отличается по объему пробы и по времани иммуно-химической реакций. В ТабЛкиё 2' -представлены основный - параметры ' разработанного диагностикума и результаты лабора-орных испытаний. Результаты обсчитывались по программе, составленной для спектрофотометра фирмы Roche.

.. Эффект высоких концентрация не выявлялся при концентрациях IgE в образце до 80 ООО МЕ/мл. Был проведен анализ влияния компонентов сывороток и антикоагуяянтов на результаты измерений IgE и показано, «то компоненты сыво[ >ток незначительно влияют на определение IgE. Коэффициент корреляции результатов измерений концентрации IgE в 40 образцах сывороток крови с помочью иммунофарментного набора фирмы Pharmacia "IgE-EIA 100" (Ивешгя) и разработанной тест-системы на' шариковых носителях составил 0,957 (Рис. 2).

Таблица 2. Основные характеристики и результаты лабораторных испытаний тест-системы "ИгЕ-ТЕСТ"

Диапазон

25 - 1000 МЕ/мл 1 - 100 МЕ/мл

Принцип анализа

Твердая фаза Общее время анализа Время инкубации пробы Объем пробы

Тип калибровочной кривой Чувствительность Воспроизводимость (КВ%) Тепт на "открытие" Тест на "линейность"

Одностадийный, твердофазный, иммуноферментный (иммунометрический) на основе комбинации двух мкАт разной специфичности Полистироловые шарики Не более 1 часа Не более 2,5 часа 30 мин. 2 часа

20 мкл 50 мкл

Линейный или близкий к линейному 12*0,5 МЕ/мл 1*0,7 МЕ/мл

7,5% &,3%

90-110% 90-110%

90-110% 90-110%

■ В результате проведенных исследований получена тест-система, отвечающая мадико-техническим требованиям, предъявляемым к тест-системам подобного ' типа. Она совместима с технологией производства иммуноферментных наборов фирмы Roche и СП ДИАплюе. Полученная тест-система универсальна, так как позволяет проводить измерения концентрации IgE в очень широком диапазоне - от 1 до 1000 МЕ/мл; соответственно она может использоваться в клинической аллергологии как лля взрослых, так и для детей.

3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНЫХ СТАНДАРТОВ 1дЕ ДЛЯ ИММУНОДИАГНОСТИКУМОВ НА ОБВДЙ 1дЕ.

Большой проблемой при разработке иммунодиагностикумов на обший 1дЕ является приготовление калибровочных стандартов. Прежде всего, для этого необходимо значительное количество самого 1дЕ. Источником его молет служить сыворотка больных аллергией с высокой концентрацией 1дЕ, мчеломный 1дЕ или искусственно созданный методами генной ккженэрии ХдЕ.

По своим свойствам поликлональный, миеломный и гекнсинженерниЯ 1дЕ заметно отличаются.Было проведено сравнение кривых титрования для международного стандарта ВОЗ 1дЕ, поликлокалького ХдЕ (пул сывороток от больных с аллергией к Оепаа-сорЬадоЫез pteronissinus), миеломного ХдЕ(¥и) п рекомбянантяого 1дЕ, продуцируемого клеточной линией ЛИ. Оказалось, что кривая титрования поликлональчого 1дЕ практически совпала с кривой титрования стандарта БОЗ. Это естественно, т.к. в качестве стандарта ВОЗ служит лиофилязованный препарат пула сывороток со стандартизованной концентрацией 1дЕ, т.е. по-ликлональный 1дЕ. Что же касается миеломного 1дЕ, то форма кривой заметно отличалась от стандарта ВОЗ, особенно на низких концентрациях; предполагается, что это связано с тем, что поликлональный 1дЕ присутствует в сыворотке в виде комплексов, и при разведениях происходит их частичная диссоциация и высвобождаются новые сайты связывания для мкАт. Кривая титрования для рекомбинантного 1дЕ также несколько отличалась от кривой титрования пояиклонального белка, хотя и в меньшей степени, чем миеломного (Рис.3).

В работе показано, что для приготовления стандартов из миеломного ХдЕ следует подбирать свою схему разведений, такую, чтобы 00 каждого стандарта совпадала с Ой разведений стандарт.. ВОЗ или по-лнклочальноя референс-сыворотки. Такая схема была подобрана для приготовления стандартов из миеломного 1дЕ(Уи) для педиатрического варианта диагностикума.

В приготовлении калибровочных стандартов из поликлонального ХдЕ есть свои сложности. Как известно, сыворотка крови содержит •'' большое количество различных ферментов, протеаз. При .разведении сыворотки с высокой концентрацией ХдЕ эти вротвазы попадают в стандарт, Полностью ннгибировать их сложно, хотя и добавляются ингибиторы протеаз. А инактквировать кх нельзя, т.к. 1дЕ термически лабилен, и тепловая обработка приводит к его необратимой денатурации.'

Поэтому предпочтительней готойить стандарты из очищенных препаратов поликлонального IgE.

С помощью иммуноаффинной хроматографии был выделен поликло-нальный IgE человека из плазмы с высоким содержанием IgE после плазмофереза . Выход составил около 30 % (менее 0,1 мг из 300 мл плазмы). Как оказалось после анализа нескольких полученных из разных сывороток препаратов IgE с помощью ДСН ПААГ-электрофореза По Laemmli (1970), все они содержали некоторое количество IgG.

Следующим этапом нашей работы было изучение возможности использования в качестве источника поликлонального IgE материала, сорбировавшегося на аффинных колонках с мкАт IgE/11-5 при процедурах экстракорпоральной плазмоиммуносорбции, проводившихся в Институте Пульмонологии МЗ РСФСР для лечения больных атонической астмой. После ультрафильтрации концентрированные элюаты анализировались' с помощью электрофореза и иммуноблоттннга. Было показано,что образцы содержат несколько белковых компонентов с М.М. от 50 до 200 кД. При иммуноблоттинге полосы с М.М. 190 кД выявляются мкАт IgE/11-З. В контрольных образцах эти полосы отсутствуют; М.М. 190 кД соответствует М.М. интактной молекулы IgE, т.е. значительная часть молекул IgE не разрушилась при перфузии и элюции. Было обнаружено, что образцы кроме IgE содержали еще ряд Релков - главным образом альбумин и IgG человека, которые, возможно, как самые массивные белки сыворотки, либо неспецифйчно сорбируются на матрнксе , либо это просто результат недостаточной предварительной промывки сорбентов перед злюцией. Для дальнейшей очистки препарата поликлонального IgE из элюатов сначала была применена гель-фильтрация на Сефакриле S-300. Но полностью избавиться от IgG так и не удалось, иммуноблоттинг IgE-coдержащего пика с М.М.> 150 кД выявил присутствие IgG. Обработка препарата белок А-сефарозой оказалась тоже не эффективной. С помощью' аффинной хроматографии образцов на иммуносорбенте с мкАт IgE/11-З было показано, что IgG, прочно связанный с IgE, представляет собой анти-IgE аутоантитела в составе комплекса 1дЕ-анти-1дЕ, аутоантнтела. Чтобы проверить, не является ли присутствие IgG результатом простой неспецифической агрегации молекул в процессе перфузии и элюции, аффинная хроматография была повторена в присутствии 0,05% Таин-20, .но добавление-детергента не повлияло на результат очастю: (Рис.4). -

ЛОО 600

^Е, Ш/т1

.800

1000

•«» р2/2 подаклокальный 1зЕ из алката о-о 55 миеломныЛ 1«Е •х-х ^ рекомвинанпш!) I гЕ

Рас. 3. Кривые титрования иммуноглобулинов Е из разных источников .

ко Ч-. * '

V

67,0— ■___„ —«

4 3,0-

30,0- — —

л^о- —

14.5-

Рис. 4. Электрофоретическое разлеление препаратов 1дЕ. Образцы 1,2 были приготовлены в невосстанавливаюиих . условиях, 3,4 и 5,6 - в восстанавливающих условиях.. К - калибровочные стандарта мол. весов; -1 -'образец элюата; 2,3 - препарат ГдЕ после аффинной очистки элюата на колонке с мкат 1дЕ/11-Э; 4 1д<3 человека; 5 - аффинная очистка элюата а присутствии Твииа 20; 6 - баз Твина 20. Окраска Кумасси И-250.

Таким образом, элюаты после плаэмоиммуносорбции содержат значительное количество IgE. В 0,5 л элюата, получаемого после одной процедуры, может содержаться до 3 мг IgE, IgE в элюатах сохраняет интактную структуру и антигенные детерминанты, распознаваемые мкАт серии IgE/11. Концентрированные элюаты могут служить источником IgE для научных целей к для приготовления калибровочных стандартов для тест-систем на общий IgE; незначительные примеси посторонних белков в элюатах не мешают проведению анализа. Калибровочные стандарты для тест-системы на шариковых носителях были приготовлены из концентрированных элюатов путем кратных разведений в сыворотке лошади. Стандарты IgE, приготовленные из элюатов, были достаточно стабильны; кривая титрования поликлонального IgE из элюатов полностью совпадала с кривой титрования стандарта ВОЗ.

Результаты экспериментов с гель-фильтрацией, обработкой бе-лок-А Сефарозой и аффинной хроматографией указывают на то, что некоторое количество IgG достаточно прочно связано с IgE в препаратах и представляет собой аутоантитела к IgE, что подтверждается данными литературы (Vasella С.et al., 1990).

При приготовлении стандартов из поликлонального 1дЁ важно учитывать, что разные сыворотки содержат разные пропорции свободного IgE, IgE в виде комплексов и фрагментов IgE. Все это влияет на форму кривой титрования, поэтому при приготовлении калибровочных стандартов и референс-сывороток следует делать пул из большого количества сывороток с высокими концентрациями IgE или элюатов от нескольких пациентолв, чтобы усреднить и свести к минимуму эти различия.

4. СТАБИЛИЗАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ IgE.

При использовании в качестве твердой фазы МТП в блокирующий раствор (ЗФР с 1% БСА) добавляли 0,1% азида натрия и такие МТП хранились в течение многих -юсяцев (до года) без утраты активности антител. Полистироловые шарики точно так же хранились в растворе, содержащем 1% БСА ü ЗФР с 0,1% азида натрия. ,

Поскольку для производства и потребителей предпочтительнее сухие планшеты и шарики, были подобраны условия для их высушивания. Стабилизировали белки при сушке сахарами. Высушивание несколько снижало антигеясвязываюыую активность антител. В случае МТП это составило 30*10%, в случае шариков - 23^=7%. Чтобы компенсировать

это снижение активности, увеличивали в 1,3-2 раза количество сорбируемых антител или увеличивали концентрацию коньк "ата мкАт с пе-роксидазой. Оказалось, что при суике несколько возрастает коэффициент вариабельности, но не настолько, чтобы исключить использование высушенных компонентов.

Стабилизация калибровочных стандартов для иммунодиагностику мов на общий IgE включает ц себя ряд моментов! необходимо защитить белок от действия протеаэ, з том числе бактериальных, и предотвратить денатурацию. Чтобы выполнить эти условия, очищенный IgE разводили в термически инактивированноп лошадиной сыворотке с добавлением ингибиторов протеаэ! PMSF, апротинина, а также антибактериального агента тимаросала. Была проведана проверка.хранения стандартов, приготовленных на основа миеломного IgE(Yu), поликлонального IgE, полученного посла иммуносорбшш и рекомбинантного IgE JW. Как миалом-ный, так и поликлональный IgE в составе калибровочных стандартов оказались достаточно стабильными. Стандарты на основе рекомбинантного белка JW также практически не теряли антигенной активности при хранении.

Лиофильиоа высушивание препаратов IgE для последующего приготовления стандартов, как оказалось, заметно i-нижает антигенную активность IgE. IgE после иммуносорбшш был аффинна очищен, диализо-ван и лиофнльно высушен с добавлением 40% маннита в качестве стабилизатора. В результате он потерял около 60% активности. В то же время при лиофилизации культуральной среды клеточной линии JW, содержащей рекомбинантный IgE, было утрачено всего 25% активности.

Наибольшую трудность представляет собой стабилизация конъюгата мкАт с пероксидазой. Были проведены ис: игания разны- способов стабилизации конъюгата мкАт к IgE с пероксидазой по трем группам: 1) концентрированные растворы - 100-кратные по отношению к рабочему разведению; 2) лиофнлизованные препараты; 3) разбавленные оастворы с рабочим разведением. Сначала было проверено хранение при 37° С ("транспортная стабильность"), затем те варианты, ксгорые инактиви-ровались в минимальной степени, проверялись в течение более длительного периода хранения при +4° С. Оптимальными по трем группам оказались следующие составы: 1) преципитат 50% сульфата аммония среди концентрированных растворов; 2) 10% сорбит, 0,05% имидазол ' в фосфатном буфере, рН 7,4 - для лиофилнэованкых пррпар.зтоп; 3) 0,05* тимола или фенола, 1-2%.GCA а фосфатном буфяр^, рй 7,4 -..для ряэ-

бавленного раствора, при использовании с МТП. Для полнстнроловых шариков был оп'нмальным следующий раствор: 0,1% фенола, 11 БСА в ЗФР, рН 7,4.

После того, как были подобраны оптимальный в данном случае системы стабилизации для твердой фазы, для раствора конъюгата и для калибровочных стандартов, был проведен эксперимент по хранению всех этих компонентов при +37°С, Результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Хранение компонентов тест-систем для определения концентрации обшего 1дЕ при +37°С.

реагент

день после начала Эксперимента

1а.Полистироловые шарики, покрытые 100

мкАт к 1дЕ,в ЗФР с 1%БСА и 0,1% ^N3

100±10 100*10

16.МТП, покрытые мкАт к 1дЕ, залитые ЗФР с 1% БСА к 0,1% Ыа^

100

100*10 1001-10

2. Раствор конъюгата мкАт к 1дЕ в рабочем разведении, в ЗФР с 1% БСА и 0,1% 100 фенола

100*10 90*10

За.Калибровочные стандарты ХдЕ на основе

поликлонального 1дЕ, в сыворотке лоша- 100 дн, с 1мМ РМЭР и 0,05% ткмеросала.

100*10 100*10

36.Калибровочные стандарты 1дЕ на основе

миеломного 1дЕ в'сыворотке лошади, с 100 1мМ РМБР и 0,05% тимеросала.

100*10 100*10

Зв.Калибровочные стандарты 1д£ на основе .. рекомбинантного ХдЕ, в сыворотке лоша- 100 ди, с 1мМ РМБ!" и 0,05% тимеросала.

100*10 100*10 ,

4. Контрольная сыворотка человека, с 1мМ 100 100*10 100*10 РМБК и 0,05% тимеросала.

Можно видеть, что все компоненты достаточно хорошо хранятся в • течение недели при +37°С, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к подобным дяагностикумам.

Было показано, что ряд отечественных реагентов и материалов можно использовать при производстве описанных диагиостикумов.

5. АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ АНТИГЕНОВ I И II'КЛАССОВ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТЙ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОФОРЕТИ-ЧЕСКИХ МЕТОДОВ С ПОСЛБДУЮЫИМ ИММУНОБЛОТТЙНГОМ.

В данной работе показана возможность биохимического анализа некоторых антигенов ГКГ человека достаточно быстрым, высокочувствительным методом, основанным на применении моно- и поликлональных антител для визуализации зон белков, полученных яри двумерном электрофорезе (ЭФ) и одномерном изоэлектрофокусировании (ИЭФ).

Как известно, антигены I класса ГКГ состоят из константной легкой цепи с М.М. около 12 кД - J)^ -микроглобулина, и тяжелой цепи с М.М. около 45 кД. pl тяжелых цепей лежат обычно а области 5-7. На двумерной фореграмме в указанной области находится большое количество пятен белков и выявить среди них белки, имеющие отношение к антигенам ГКГ достаточно сложно.

Существуют 2 основных подхода: первый - выделить антигены ГКГ нз лизата клеток с помощью иммунопреципитации, а затем разделить их в ЭФ или в ИЭФ, ко при этом интересующие нас белки нужно предварительно метить радиоактивно. Второй возможный подход - разделить все имеющиеся в лиэате клеток белки с помощью электрофоретическнх методов, а затем, используя специфические мкАт к антигенам ГКГ, выявить пятна или зоны, соответствующие данным ;1тигенам. В настоящей работе были применены мкАт НС-10, реагируюыие практически со всеми спе-цифичностями В-локуса и со многими специфичностями А-локуса в денатурирующих условиях. Было проведено сравнение картин белков, полученных методами с предварительной иммунопреципктацией из лнэатов ' мечеияЬх и не меченных клеток и с непосредственным: выявлением антигенов I класса ГКГ яри иммуноблоттинге. Полученные картины были практически идентичны - то же взаимное расположение и относительный размер пятен (Рис. 5).

Рис. 5. Двумерный электрофорез антигенов I класса ГКГ. Це-лочная область справа. А. Автограф иммунопреципитата меченных клеток линии В-1, преципитирующие антитела - И6/32. Б. Иммуноблот преципитата клеток линии В-1, преципитирующие антитела - N6/32; выявляющие антитела - НС-10; окраска 4-хлор-1-нафтолом, В. То же, что и Б., но в качестве образца взят цельный лнзат клеток линии В-1.

1 2 3 •» 5 4 ?

Рис. б. Одномерное нзоэлектрофокусированне разных образцов с последующим иммуноблоттингом , выявляющие антитела - НС-10, окраска 4-хлор-1-нафтолом. Щелочная область вверху. Образцы - лизат.ы клеток линий:. 1- - ВЭМ; 2 - 5010; 3 -. 4901; 4 -5954; 5 ~ .7иг)<а£; 6 - В-1; 7 .- контроль (нормальная сыворотка мкаи).

Хотя 2-мерный ЭФ дает полную картину белков ГКГ, в настоящее время большее распространение приобретает 1-мерное'ИЭФ потому, что позволяет сравнивать между собой большое количество разных образцов клеток, т.к. антигены ГКГ отличаются у разных фенотипов главным образом по рХ. Для снижения гетерогенности, вызванной различиями в гликозилировании, применяли нейраминидазу - фермент, отыепляк.пгй остатки сиаловой кислоты так, чтобы продукт одного гена давал лиыь одну полосу или одно пятно. В данной работе было показано, что яей-раминидаза функционирует как в иммунопреципитатах, так и непосредственно в лизатах клеток. Т.е. стадия иммунонреципитации не нужна и при обработке нейраминидазой при 1-мерном ИЭФ. Описанным методом был проведен анализ образцов лимфоцитов периферической крови человека, Т-клеточной линии Jurkat, В-клеточных линий, типированных по антигенам HLA, и клеточной линии В-1 (рис.б). Отличия были хорошо заметны, хотя для точной локализации конкретных антигенов необходимо наносить на один гель большое количество образцов предварительно типированных серологически клеток.

Подобный подход попробовали применить и при анализе антигенов II класса HLA. На радиоавтографе геля после 2-мерного ЭФ меченных клеток линии В-1 (иммунопреципитация про-едена с использованием мкАт L-206) выявляется область антигенов I класса и пятна балков, соответствующие - и jtS -цепям антигенов II класса. После иммуко-блоттинга с 2-мерных гелей поликлональные антитела с< DP выявляют пятна белков, соответствующие с<- иуЗ- цепям антигенов II класса .

Был проведен анализ антигенов Р-области II класса ГКГ с до-мощыв 1-мерного ИЭФ с последующим иммуноблоттиигом. Как известно, антигены II класса ГКГ зкспрессируются 5 заметных количествах ,<е на всех типах клеток. Детектируемые количества их представлены на клетках, трансформированных вирусом Эпштеяна-Барр. Поэтому на лимфоцитах периферической крови человека и на клетках селезенки выявить их не удалось, в то время как в В-клеточных линиях они детектируются описанным методом. Было показано, что обраслы разных клеточных линий* отличаются главным образом по J&-цепям, а сК-цапй практически одинаковы. Это согласуется с данными других авторов, полученными при 2-мерном ЭФ радиоактивно меченных клеток (Rust N., 1986).

Описан достаточно быстрый, аысоко чувствительный метод бпохи* мкческого анализа антигенов ГКГ человека, не требующий применения

радиоактивной метки и исключающий трудоемкую стала» иммунопреципн-тацни. Для однпго анализа достаточно всего 10® клеток. Результаты можно получить уже на следующий день после начала исследования. Метод применим и для анализа некоторых антигенов II класса ГКГ. Он может служить для дополнительной биохимической характеристики типи-рованных серологически антигенов. После составления сравнительных "карт" больыого числа типированных клеток его можно применять' и как самостоятельный метод.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана иммуноферментная тест-система на основе мкАт для измерения концентрации IgE в сыворотке и плазме крови детей. Тест-систему отличают высокая чувствительность (1=0,4 ME/мл), воспроизводимость (КВ не более 10%), быстрота проведения анализа . а простота исполнения. По аналитическим параметрам - линейности, открытию, КВ, корреляции с результатами,полученными с использованием коммерческого набора, она соответствует требованиям, предъявляемым к иммунсдиагностикумам подобного типа.

2. Разработана иммуноферментная тест-система на основе mkVt позволяющая проводить измерения концентрации IgE в двух диапазонах (от 1 до 100 и от 25 до 1000 ME/мл). По своим аналитическим параметрам она соответствует требованиям к тест-системам подобного типа. В качестве твердой фазы в тест-системе используются полистироловые ыарики, что делает ее совместимой с технологией производства фирмы Roche и СП "ДИАплюс",

3. Была рассмотрена возможность использования для приготовления калибровочных стандартов иммуноглобулина Е из разных'источников - миеломкого IgE, поликлокального к рекомбиианткого. Был проведен анализ препаратов IgE из элюатов с колонок, применяющихся для плаз-моиммуносорбции. Показало, что элюаты могут служить источником получения поликлонального IgE в препаративных количествах. Было продемонстрировано присутствие в препаратах поликлоналького IgE' ан-» ти-IgE аутоантктел в виде комплекса 1дЕ-анти-1дЕ и оценено их влияние на свойства калибровочных стандартов на основе поликлонального IgE.

4. Подобраны условия для оптимального сохранения активности основных компонентов диагностикумов на общий IgE и проверена их стабильность в разных режимах хранения. Было показано, что ряд отечественных материалов и реагентов можно использовать при производстве описанных диагностикумов.

5. Описан достаточно быстрый, высоко чувствительный метод биохимического анализа некоторых антигенов ГКГ человека, не требующий применения радиоактивной метки и исключающий трудоемкую стадию им-мунопреаипитацни. Он основан на использовании моно- и поликлональ-ных антител к белкам ГКГ для визуализации зон, полученных при анализе злектрофоретнческнми методами. Анализ ряда клеточных линия и лимфоцитов периферической крови человека с использованием мкАт НС10 показал принципиальную возможность применения данного подхода- для быстрого и точного выявления полиморфизма антигенов I класса HLA,: а также для анализа некоторых антигенов II класса.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Василов Р.Г., Юрин Б.Л., Циников Э.Н., Сердюк . O.A., Пороиина Ю.А., Феденко Е.С. Одностадийный иммунеферментный метод количественного определения IgE человека с использованием мояокло-нальных антител // Иммунология. - 1989. - N 1. - С. 77 - 81.

2. Сердюк O.A., Цыииков Э.Н., Василов Р.Г. Иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для определения общего уровня иммуноглобулина Е у детей и подростков// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины „— 1989. - Т.б. - С. 722 -724.

3. Сердюк O.A., Сергеева A.D., Васнлов Р.Г. Разработка иммунофер-ментной тест-системы на шариковых носителях для намерения общего IgE в двух диапазонах концентраций ,'/ Мат. 2-ой Всесоюзной конференпи "Современные направления создания медицинских диагностикумов" -Москва, 1990. -С.128.

4. Сердюк O.A., Смирнова Е.Я., Лебедин B.C., Василов р.Г. Препаративное выделение IgE человека методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител // Биотехнология - медицине и народному хозяйству (Сб. научи, тр.) - И.: ЧНИИ Биотехнологии, 1990. - Т.1. - С.7 - 10.

5. Vlasov G.S., Smirnova E.Ya, Serdyuk O.A.,Tsitsikov E.N., Petrova E.N., Vasilov R.G. Application of the membrane-based' linear EI.ISA to the diagnosis of allergy 11 Abstracts of 6 International Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology - Helsinki, 1990. - P.184.

6. Serdyuk O.A., Smirnova E.Ya., Lebedin Vu. S., Petrova E.N. Purification and partial characterisation of human polyclonal IgE from single donor // Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE" - Moscow, 1990. - P.65.

7. Serdyuk 0.A., Vasilov R.G. Analysis of human major histocompatibility complex antigens by electrophoretic methods with subsequent immunoblotting // Biomedical science. - 1990. - Vol. 1. - P. 384 - 390.

8. Serdyuk 0.A., Sergeeva A.Yu., Lebedin Yu.S., Vasilov R.G. Detection of IgE-anti-IgE complexes during antiallergic therapy // Abstracts of XIV International Congress of Allergology and Clinical Immunology - Kyoto, 1991. - P.288.