Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

OF-и анти-OF тест-система в идентификации стрептокков группы А

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "OF-и анти-OF тест-система в идентификации стрептокков группы А"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

РГб од

_ г лпр шоа На правах рукописи

БЕЛЯКОВА Ира Витальевна

ОЙ- И АНТИ-ОР ТЕСТ - СИСТЕМА В ИДЕНТИФИКАЦИИ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ А

Специальность03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САН КГ-ПШР БУРГ 1993г.

Работа выполнена в научно-исследовательском инстит; экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, академик РАМН A.A. Тотол;

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор A.M. Королюк

кандидат медицинских наук, доцент А.П. Ходырев

Ведущее учреждение: Институт микробиологии эпидемиологии им. Пастера Гос. Комитета по сан.-эш надзору

Защита состоится:

«Л_» Ш^^МЛлЯ^ 1993 года в /3 часов

заседании Специализированного совета Д 001.23.02 присуждению ученой степени доктора наук при НИИ э* периментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Пете бурК ул. акад. И.П. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института

Автореферат разослан »/1 » ^ССО^ссц: 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Л. А. Бурова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Отличительной особенностью стрептококков группы А (СГА) чрезвычайно широко распространенных патогенов человека, является их внутривидовое антигенное разнообразие по признакам специфичности поверхностных белков, в частности Т- и М- белков.

Известно, что иммунологический ответ организма на инфекцию, обусловленную конкретным серотипои стрептококка, характеризуется выраженным типоспецифическим компонентом. "Эпидемиологическая и лабораторная практика накопила определенный опыт М- и Т- типирования циркулирующих стрептококков и оценки иммулогической структуры населения по отношению к стрептококкам. По распределению соответствующих антигенов и антител к ним показано преобладание определенных Т - типов СГА на конкретных территориях и динамическое изменение состава доминирующих серологических вариантов в интервалах времени, исчисляемых годами [Беляков В.Д.и др.Д986 ].

За последние года отечественными авторами получены приоритетные данные, характеризующие особенности взаимодействия неоднородных по антигенной структуре популяций стрептококка с неоднородной по иммунологической структуре популяцией людей. Показано их эпидемиологическое значение в становлении "ведущего" серотипа возбуди теля в определенных условиях. Он характеризуется выраженной моноспецифичностью, повышенной вирулентностью и высокой контаг'иоз-ностью, а также постепенной сменяемостью (антигенным шифтом > ти-1 повых характеристик по мере развития типоспецифического иммунитета в коллективе (Краоильников И.А.и соавт.]990],

Полнота накапливаемой при этом информации, а, следовательно, ее научное и практическое значение определяется числом и спектро» методов, используемых для типирования СГА, выделяемых от больных й здоровых носителей, периодичностью мероприятий по эпиднадзору, а также изучением иммунологической структуры населения по распространенности и выраженности ответа на стрептококковые антигены. Следует напомнить, однако, что проблема доступности и специфичности диагностических препаратов, простота их использования для проведе-

•«ия соответствующих исследований, до сих пор далека от адекватного решения.

Определенные перспективы в этой отношении открываются в направлении создания диагностических 0F- и анти-OF тест систем в дополнение к существующш системам типирования. На сегодня хорошо известно, что при изучении OF-фжтора опалеоценции СТА наряду с lili Т- белками была выявлена высокая антигенная типоспецифичностъ данного фехыента и его присутствие у определенных М-типов. Однако, со времени описания данного феномена соответствующие ему тесты не вошли еще прочно в лабораторную практику ни у нас, ни за рубежом, хоти высокая их специфичность а, значит, и диагностическая значимость, должны были привлечь внимание многих исследователей и практиков. Оказалось, что OF-серотипы культур в 100 % случаев совпадают с конкретными М-типами СГА, а антитела к 0F - антигенам в крови здоровых носителей и больных стрептококковыми инфекциями коррелируют с типом и титром соответствующих анти-М антител [Fraser С.A.M.,1982].Последнее нуждается в более прямых доказательствах, приведешшх в настоящей работе .

Показано также, что среди нетшируемых по М-антигену стрептококков 0F- положительные штаммы встречаются более, чем в 70 % случаев [Maxled W.R.,1973a]. К сожалению, OF-тшшрование СГА ограничено только теми штаммами, которые продуцируют фактор опалесценции. Но, тленно, эти штаммы, как правило, являются плохими проду-. центами М-белков и,соответственно,с трудом подвергаются М-типиро-ванию.Они, к тому же, слабы в антигенном отношении по сравнению с М- белками OF-отрицательных штаммов СГА. Именно , в этих случаях ценность OF-типировашя возрастает.

Все это свидетельствует о принципиальной возможности использования 0F- и анти-OF тестов для диагностических целей в интересах совершенствования как научно-исследовательских работ, так и практики саг;ггарно-эпидемиологического надзора. Однако, для этого требуется -.лучение соответствующих,высоко специфичных и полных по составу тест-наборов. Сказанным определяется;- ' . .актуальность провел, ния настоящего исследования. Цель работы - разработка диагностических препаратов на основе использования 0F- и анти-OF тестов, и их апробация по определение» типовой принадлежности выделяемых

стрептококков группы А и изучению распространенности и спектра антител к ним в крови людей в качестве средств расширения лабораторного надзора за стрептококковой инфекцией.

Для достижения основной цели решались следующие^. . .¿задачи:

- получение коллекции 0Р+ штаммов из всех известных в настоящее время ОР серотипов стрептококков группы А; приготовление 'из коллекции штаммов 0Р+ стрептококков группы А наборов типовых ОР вакцин для иммунизации животных о целью получения полного набора анти-ОР-сывороток и для получения диагностических препаратов о целью определения типоспевдфических противострептококковых антител в сыворотках людей;

- изучение условий получения активных специфических противос-трептококовых сывороток путем иммунизации экспериментальных животных и изготовление полного набора диагностических типоопецифичео-ких противострептококковых анти-ОР сывороток;

- испытание сывороток больных и чдоровых доноров на наличие специфических противострептококковых анти-ОР-антител и оценка перспектив их использования для • изготовления диагностических антительных препаратов;

- апробация антительных и антигенных диагностических' препаратов в практических условиях работы лабораторий по изучению стреп-тококовых. инфекций о целью определения эпидемиологической ценности соответствующих тестов;.

- изучение бактерицидных свойств анти-ОР сывороток для определения корреляции между показателями их анти-ОР активности и бак-терицидности,зависящей от присутствия анти-М антител.

Научнщновизна и теоретическая ценность.1 :На основе использования ОР- и анти-ОР тестов разработана новая диагностическая система по определению (тшшрованшо) антигенных вариантов ОР-позитив-ных стрептококков группы А и типоспецифических антител к ним в сыворотках больных и здоровых. В процессе апробации антительных диагностических препаратов получены новые научные данные, характеризующие особенйости серотипового пейзажа ОЕ-позитивных стрептококков группы А, циркулирующих в межэпидемические и эпидемичеокие по отрешгококковой инфекции периоды.

Показано эпидемиологическое значение "ведущих" ОР-позитивных серотипов стрептококка в эпидемиологические годы и разнообразие

типового состава стрептококков, высеваемых в межэпидемический пе-; РИОД. &

Показана принципиальная возможность получения анти-ОР сьшоро-ток от лиц, перенесших стрептококковую инфекцию.

Установлена возможность дискретного анализа Т-пагтернов СТА посредством ОР-типирования.

Показано, что анти-ОР активность ищунных сывороток может коррелировать с показателем их бактеридидности, то есть косвенно указывает на уровень защищенности организма от стрептококковой инфекции, вызванной штаммом определенного серотипа.

Практическая значимость. Обоснована пригодность использования данной диагностической системы как в научных целях по изучению механизмов развития эпидемического процесса стрептококковой инфекции, так и в практических условиях проведения эпидемиологического надзора за стрептококковой инфекцией. Соответствующие тесты обладают высокой специфичностью и чувствительностью. Поэтому, кетипи-руешедю .ОР~полокительяые штаммы СГА могут рассматриваться как возможные кандидаты в новый антигенный ОР-вариант или новый ОР-тип (Ргстз1опа1Туре). Диагностические анти-ОР сыворотки апробированы п стрептококковых центрах СНА и Чехо-Словакии с высокой положительной оценкой, что позволило передать их в Комитет ВОЗ по стрептококковым инфекциям для последующего распределения среди лабораторий разных стран-Центров ВОЗ по стрептококкам и стрептококковым инфекциям,

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработана и изготовлена диагностическая лабораторная система по определению серотиповой характеристики стрептококков группы А и типовых антител к ним в сыворотках людей на основе использования ОБ- и анти-ОР тестов.

2. Обоснована целесообразность применения данной диагностической системы для научных целей по изучению механизма развития эпидемического процесса стрептококковой инфекции и в интересах совершенствования • лабораторной базы эпидемиологического надзора за стрептококковой инфекцией.

3. Установлено, что анти-ОР активность противосгрептококковых сывороток может служить показателем их бактерицидности в отношении стрептококков, группы А соответствующих серотипов.

Достоверность полученных результатов и данныхё2 ёО подтверждает следующим:

1. Апробацией большого количества шташов стрептококка грушш А (800 изолятов,полученных из разных стран) и сывороток обследованных доноров п больных стрептококковыми инфекциями (2000 индивидуумов) .

2. Использованием в данной работе полного набора известных OF-антигенов и анги-ОР-иммунных сывороток.

3.Чувствительностью и строгой специфичностью используемой тест-системы.

4.Данными апробации полученных иммунных сывороток и их оценкой в референс-лаборагориях ( центрах) ЮЗ по стрептококкам в Институте гигиены и эпидемиологии, Прага, а также в Университете Миннесоты Миннеаполис .В рамках заключенного совместно с Францией, Италией, Индией, Чехо-Словакией и США договора по линии ВОЗ значительная часть иммунных сывороток передана проф. Е. Kaplan (Университет Миннесоты) для повторной проверки и распределения среди ре-ференс -лабораторий других стран..

5. Совместно с лабораторией стрептококковых инфекций при кафедре эпидемиологии Московской медицинской академии о .помощью полученного набора иммунных ^ывороток проведена типовая идентификация СТА в условиях организованного коллектива для изучения эпиде^ мического процесса респираторного стрептококцсоза, позволившего зарегистрировать три . "ведущих" типа СГА, обусловивших три вспышки заболеваемости в эпидемическом i990 году.

Апробация работы.Материалы диссертации опубликованы в 5 научных статьях,доложены на десятом международном симпозиуме по стрептококкам в .Кельне(ФРГ, 1987),на ленинградском научном обществе микробиологов и эпидемиологов(1990),в референс-лабораторий ВОЗ по стрептококкам в Институте гигиены и эпидемиологии ,Прага(1989). В законченном виде данные работы докладывались на заседании лаборатории молекулярной микробиологии в НИИЭМ РАМН(1993).

Объем и структура диссертации.Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста,включающего введение,обзор литзрату. J,описание материалов и методов исоледований,шесть глав собственных исследований,обсуждение полученных результатов,выводы

и список литературы.Работа проиллюстрирована 27 таблицами и 5 рисунками. Указатель литературы содержит 16 отечественных и 81 иное-"чэанный источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материала и метода исследования.

• OF-позитивные штагам СТА, используемые для приготовления вак-дин и антигенов, для OF-типирования и реакции ингибиции активности OF били получены от доктора Cherry A.M. Fraser, Public Health Service Laboratory, Colindale, London, England. В предоставленную нам коллекцию вошли референс-штаммы, относящиеся к 25 различным М-серотипагл СГА, в том числе и штаммы, рассматриваемые в качестве кандидатов в новые типы (FT): 1658, 180 и 2841. Типы М8, М13, М75 и М81 получены от доктора Н. Havlickova, WHO Reference Streptococcal Laboratory, Prague, CSFR. Используемые штаммы хранятся в лиофилизированном состоянии или же при температуре -70 С.

Питательная среда - бульон Todd-Hewitt (Difco, USA) с добавлением 2 - 4 % неопептона (Difco, USA) в зависимости от исходной OF-активности штаг,wob СГА.

Определение OF-активности OF-позитивных штаммов СГА проводили по методу Тор и Wannmaker [1968]. Для этого, испытуемые штаммы выращивали в 5 мл бульона Todd-Hewitt (Difco, USA) 18 часов, затем клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин 20 мин, в осадок (ресуспендированный в 0.5 мл физиологического раствора) и в надосадочную жидкость добавляли мертиолат в конечном разведении 1:5000. В качестве субстрата для тестирования OF использовалась нативная, инактивированная прогреванием лошадиная сыворотка, хранящаяся при 4 С с добавлением мертиолата,

Для стандартизации условий опыта (при постановке реакции ин-гибицшг энзиматнческой активности антигена), а также для проверки OF-активности вакцинных штаммов использовали HCl- экстракты OF-позитивных культур no Lancefield [1928], за исключением тех случаев, когда экстрацеллюлярная OF-активность штамма была выше, чем экстрагируемая из клеток. В последнем случае использовали супернатанты OF-позитивных штаммов.

Постановку реакции ингибиции активности OF (анти-OF тест)

осуществляли слайд-методом W. Maxted и соавт. [1974].Этим методом можно : (а) определять титр испытуемой антисыворотки или же тип испытуемого штамма OF-позитивных типов СТА; (Ö) проводить скрининг иммунных сывороток против полного набора 0F ---позитивных типов СГА на специфичность их ингибирующей активности.

Для определения ОР-ингнбирующих антител в образцах человеческих сывороток мы использовали микрометод D. Johnson и Е. Kaplan [1989].Результаты этого метода регистрировали не только визуально, но и фотометрически. Постановка опыта микрометодом производилась в U-образных микропланшетах (Titerteck, USA). Количественные результаты получали путем измерения содержимого плат при А = 450 нм фотометрическим ридером (считывателем), используемым для иммунофер-ментного анализа .

Вакцины приготавливали по методу C.A.H.Fraser[1982]. Для вакцинации использовали морских свинок-альбиносов, весом 450 г и белых кроликов - не менее 2.5 - 3.0 кг. "уро иммунизации варьировал в зависимости от вводного OF-положительного штамма конкретного серотипа СГА. Применяли различные пути введения вакцины морским свинкам и кроликам. Еженедельно по 6 -10 свинок для каждого OF-ти-па получали инъекции 0.50 мл вакцины внутрибрюшинно и 0.25 мл -подкожно, в заднюю часть шеи.

После 4-6 недель иммунизации у животных брали пробы крови, и если титры анти-OF антител не были удовлетворительными, курс иммунизации продолжали до 8 недель; если и в-этом случае не было же. лаемого эффекта, то животных реиммушз провали через 2-3 недели ь течение 4 недель.

При иммунизации кроликов использовали по 3 - 4 особи на один OF-позитивный тип. Кроликам вводили по 1 мл вакцины внутривенно три дня подряд еженедельно .В основном, кролики получали трехкратный курс иммунизации. Затем у животных под эфирным наркозом производили тотальный забор крови.

При постановке непрямого бактерицидного теста использовали метод I. Sramek [1977]. Бактерицидный тест оценивали по двум индексам: индексу роста и бактерицидному индексу,которые рассчитывали по формуле Stollerman [1958].

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Получение анти-OF сывороток.

Сегодня лабораторная оаза ограничивается серологическим группированием и М и Т титрованием антигенных вариантов СГА. При этом наиболее эффективные методы типировання СГА имеют ряд существенных недостатков. Так, например, Т типирование по существу направлено на определение не всегда одного, но в большинстве случаев нескольких Т антигенных детерминант (т.н. Т-паттернов), что снижает ценность результатов. Что касается М типировання, то оно не отличается высокой эффективностью и с его помощью удается оттипировать не более 30-35$ свежеввделенных штаммов. Причин этому много и, в частности, низкая антигенная активность М белков у т.н. ОР-позитивных стрептококков.

По данному признаку СГА условно могут быть разделены на две подгруппы: ОР-негатшмше и ОР-позитивные. Последние, хотя и относятся к 28 М-типам СТА, встречаются среди свежих изолятов в высоком проценте случаев (более 50$). Это обстоятельство делает ОР антиген диагностически более ценным по сравнению с М белком. Кроме того, по ОР аигигенности штаммы СГА можно отнести к конкретным М типам, а типирование СГА по ОР антигену должно повышать процент их тшшруемости, поскольку ОР тип культур во всех случаях совпадает с М типовой их принадлежностью.

С учетом изложенного основная цель работы состояла в создании полного набора (Ж-актигенов и анти-ОР сывороток, разработке и апробации путей их использования в экспериментальных и естественных ситуациях для расширения базы лабораторного надзора за стрептококковой инфекцией.

Путем подбора культур из известных коллекций был создан полный набор ОР-позитивных серотипов СГА - продуцентов типоспецифи-ческого фактора опалесценции. Было показано, что штаммы дифференцировались по ОР—продукции, уровень которой практически во всех случаях определялся составом питательных сред, условиями культивирования и хранения штаммов.

Поскольку в любом случае клеточносвязанная ОР-активность пре-эбладала над экстрацеллюлярной, в качестве источника ОР, как правило, мы пользовались НС1-экстрактами клеточного осадка. В итоге 'ыл создан набор из 28 ОР-антигенов, который может рассматриваться 1ак референс - набор для ОР и анти-ОР тестов с целью типировання >Р(+) СГА и выявления анти-ОР антител и определения их спектра в

- 11 -

донорских и экспериментальных сыворотках.

Для получения антл -OF сывороток на животных были использованы кролики и морские свинки.В обоих случаях для иммунизации были взяты нелинейные животные.Это обстоятельство было вынужденным и заведомо осложняло получение активных антисывороток. Каждым 0?(+) типом иммунизировали по 4 кролика в течение 12 недель.Б опыт были взяты 9 OF (+) типов.Из 32 испытуемых животных антительный ответ удалось получить лишь в 7 случаях и при этом только в одном с достаточно высоким титром (1:64 против OF-антигена типа М66).Го-видимому, это в значительной мере связано с отсутствием в отечественных питомниках кроликов нужной породы,на которых можно получать более высокие и стабильные результаты.Не было"возможности попользовать более 4 кроликов для иммунизации одним ОР-антигеном,хотя вполне возможно,что при использовании большего числа животных, можно было бы подобрать чувствительные особи ,как в случае с М66 типом. Использование в 4 раза большего количес"ва вакцины на одного кроли-ка,чем на одну морскую свинку,вкупе с нестабильностью иммунного ответа у кроликов .заставило отказаться от получения иммунных сывороток на этих животных и приступить к получению набора диагностических сывороток на морских свинках.

Преимущества получения анти-OF сывороток на морских свинках состояли,прежде всего, в том,что для этой цели использовали породных морских свинок - альбиносов,а также большое число особей для иммунизации одним типом OF-антигена.Применение комбинированного метода иммунизации создало достаточный антигенный стимул для получения антисывороток с высокими титрами антител.

Активные анти-OF сыворотки были получены в разные сроки ииму-низации. Так, например, антисыворотки против типов М4.М25, М48, М63 и М81 были получены через 6 недель иммунизации, в то же время, получение выраженного иммунного ответа к типовым антигенам М2, Mil, М22, М68, М78 и М79 требовало более длительной иммунизации, до 8-12 недель .Кроме того, морские свинки по -разному реагировали на вакцины к различным Й -типам СГА. Если к типам М4, М25, М48, М59, М61, М63 и М78 оказались чувствительш практически все взятые в опыт особи, то к таким типам, как, например, МП, М22, М28,- М49, М62, Мбо, М75, М77, М79 и РТ1658 - лишь около половины, хотя во многих случаях бгло обследовано до десяти и более животных . Ха-

рактерно, что в тех случаях, когда выраженный иммунный ответ получали у каждого животного, подвергнутого иммунизации тем йот' иным типом стрептококка, обычно требовался и минимальный курс Иммунизации. Всего из 240 иммунизированных свинок 146 (т.е. 61 %) дали выраженный иммунологический ответ.

\ Все антисыворотки были проверены в перекрестных реакциях ин-гибиции ОР-активности с полным набором типовых ОР-антигенов (НС1-экстрактов) .Все сыворотки реагировали строго специфически в разведении 1:5.

•Таким образом, удалось получить анти-ОР иммунные сыворотки к '26^-позитивным М-типам СГА, активные,как правило, в высоких разведениях 1:32 - 1:256. Высокая активность анти-ОР сывороток способствует более четкому тилированмо культур,, особенно при их относительно низкой ОР -активности.

Третьим источником анти-ОР антител оказались человеческие донорские сыворотки.Люди чаото болеют широко распространенными стрептококками группы А.Донорские сыворотки, как правило, редко Зывают моноспецифическими и обычно содержат в разных титрах анти-ОР антитела к 2 - 6 различным ОР-антигенам. В связи с этим была поставлена задача подобрать сыворотки доноров с возможно меньшим количеством типовых анти-ОР антител и с возможно большим разбросом соответствующих титров.Были обследованы многие донорские пункты С-Петербурга. Каждая донорская сыворотка была испытана в реакции ингибиции ОР с каждым из 28 известных на сегодня ОР-позитивных типов СГА.

Такой подход дал возможность отобрать донорские сыворотки к 14 ОР-позитивным типам СГА из двух различных групп доноров: постоянных доноров, сдающих Кровь на донорских пунктах С-Петербурга, и индивидуумов из закрытого воинского коллектива.

Таким образом, . были получены три донорские моносыворотки к наиболее распространенным ОР-типам СГА: М22, М48 и М75; семь сывороток от индивидуумов, имеющих антитела к одному из ОР-типов в высоком титре (1:46 - 1:128) и сопутствующие антитела к 1 - 2 типам - в низком титре (1:4 - 1:16); остальные семь образцов набора донорских сывороток содержали антитела к преимущественному типу в достаточно высоком титре 1:64 и сопутствующие антитела к 2 - 3 другим типам - в более "низких титрах (1:4 - 1:32).

Эти донорские сыворотки подучены в большом количестве (до 100 мл каждая) и могут использоваться в эпидемиологических обследованиях коллективов, во время вспышек стрептококковой инфекции. Вместе с тем, задача создания достаточно широкого или полного набора человеческих анти-ОР сывороток в пределах одного региона, представляется тало вероятной, поскольку в этих условиях ко.многим ОР-типам антитела в сыворотках не обнаруживаются вовсе или обнаруживаются редко и в низких титрах. Поэтому,полный набор донорских анти-ОР ■ сывороток может и должен создаваться силами ряда лабораторий на кооперативных началах.

2.Распределение типовых анти-ОР антител в сыворотках людей.

Процедура отбора донорских сывороток в качестве источника анти-ОР антител организационно может быть сопряжена с ретроспективной эпидемиологической оценкой стрептококковой заболеваемости по результатам распределения типовых анти-ОР антител в человеческих сыворотках, полученных в процессе популяционных обследований. Справедливость данного положения была проиллюстрирована при обследовании сывороток от двух групп доноров. Первая была составлена из сывороток от постоянных доноров из пунктов переливания крови ( 270 образцов от лиц 20 - 40 лет),а вторая из сывороток,полученных в организованном армейском коллективе (119 образцов от лиц 18 -19 лет).С эпидемиологической точки зрения первая группа лиц, по существу,рассматривалась в качестве открытого коллектива со значительными бытовыми контактами, а вторая - закрытого с резко ограниченными контактами.

В обет группах обследованных моноспецифические сыворотки были обнаружены лишь в единичных случаях, поскольку значительная распространенность стрептококковых заболеваний и возраст обследованных лиц, безотносительно к конкретной эпидемической обстановке, практически исключают возможность чаотого выявления моносывороток. ' . '

Так среди 119 доноров 18 - 19 лег было выявлено 10 доноров (8.65 %), тлеющих антитела преимущественно к одному ОР-типу СГА, а среди 270 доноров другой группы - линь 7 (2.5%) , то есть в 3.5 раза реже .

Одновременно с этим были обнаружены различия в распространенности анти-ОР типовых антител. В первой группе сывороток преобла-

дали антитела к М-типаы(в порядке убывания):73,2, 77, 4, 59 и 22, а во второй -антитела к ЕЛ -типам: 4, 22, 68, 2, 9 и 75.

Анализ распространенности типовых анти-OF антител в сыворотках еще раз подчеркнул то обстоятельство, что показатели анти-OF активности сывороток могут служить ретроспективным эпидемиологическим критерием распределения стрептококковых инфекций в разных возрастных группах и в разных географических зонах. В связи с этим следует напомнить, что, группа постоянных доноров была сформирована из жителей С.-Петербурга,в то время как"закрытый коллектив" был составлен из лиц, прибывших из разных регионов страны.

Интересно,что такого же порядка различия в анти-OF активности донорских сывороток наглядно проявились и при сопоставлении наших данных с данными по исследованию 60 доноров из США (сыворотки были любезно предоставлены проф. Е. Kaplan, Университет Миннесоты, Миннеаполис). Различия были выявлены по числу "негативных" сывороток,моноспецифических сывороток и по доминированию тех или иных анти-OF антител в сыворотках.В сыворотках из США превалировали следующие М-типы: 4, 2, 48, 75, РТ2841, 59. Следует напомнить,что к доминирующим типам были отнесены типы, которые обнаруживались в 10 и более процентах сывороток.

Таким образом, сыворотки'доноров , проживающих в разных географических регионах имели существенные качественные и количественные различая по анти-OF активности.

3.Проверка анти-OF специфичности донорских сывороток в прямом и непрямом бактерицидном тесте.

Как известно, серотип фактора опалесцещии 0F-позитивных типов СТА строго коррелирует с типом М белка. Для подтверждения этого , а также для контроля за специфичностью донорских сывороток, был. использован бактерицидный тест как, несомненно, наиболее корректный метод выявления типоспецифичности иммунитета при стрептококковых инфекциях.

В этих опытах использовали кровь т.н. "нормальных" доноров, лишенную типовой специфичности, в качестве среды для культивирования штаммов,а также сыворотки из этой же группы доноров в качестве источника анти-OF антител к определенным типам.СГА.

Анализ полученных результатов позволил установить,что во всех случаях обнаружения в сыворотках доноров анти-OF антител к опреде-

ленным М-типам, в крови тех же доноров практически не происходило размножение стрептококков соответствующих М-типов.

Непрямой бактерицидный тест позволил выявить протективные свойства сывороток доноров , причем опсонизирующий эффект был тем выше, чем вше была активность сыворотки.Исходя из данных прямою и непрямого бактерицидного теста можно было с успехом подтвердить-, что тлеется корреляция между серотипаш М- белков и факторов опа-лесценции , а также, что опсонизирующий эффект донорских сывороток коррелирует в пределах испытуемых сывороток с их анти- ОИ активностью.

Это отнюдь не означает ,что анти-ОР антитела несут защитную функцию. Вопрос этот может быть решен только при использовании ан-ти-ОР сывороток к химически чистым антигенам.Однако,соверпетга очевидно,что наличие анти-ОР антител и их выраженность прямо указывают на протективнооть соответствующих сывороток в отношении одноименных М типов и на уровень бактерицидного эффекта. У словно ,по наличию выраженных титров анти-ОР антител можно судить о защищенности того или иного индивидуума от инфекции штаммом конкретного М-типа.

4.Типирование ОР-позктивных штаммов СГА.

Создание нами полного набора иммунных анти-ОР сывороток явилось главным условием их использования с целью практического филирования СГА.Пригодность набора в подобных исследованиях была установлена при тнлировании 100 преимущественно ОР-позитивных штаммов СГА,предоставленных в наше распоряжение профессором 3. РеггеШ (США, Университет Оклахомы).

Каждый ытамгл характеризовался по Т-паттерну, происхождению л в ряде случаев по заболеванию, им вызванному.

Из 80 ОР-иозигивннх испытуемых штаммов удалось типнровать 60, что составляет 75 £.Этот показатель в 2 раза превышает М типируе-мость ' СГА.Очевидно, что ОР типирование позволяет значительно увеличить типируемость стрептококковых культур. 20 нетипируеммх штаммов гфинадлетлли, в основном, к Т-латтернам: 8/ 25/1тр.19, 4/28, 4/ 60, 4 и 3/13/03264.

Типироваиные штамлн оказались разнообразными по принадлежности к ОР-тштам, что естественно, так как они были выделены в разных ■легионах мира. Вместе с тем, несмотря на различное происхождение.

37 % всех (Ш-позитивних штаммов принадлежало к типу 4, 17 % - к типу. 22, 13 % - к типу 78, 10 % - к типу 2 и далее по убывающей к типам 60, 49 и 9. Остальные типы 48, 58, 68, 63 и РТ2841 встречались в единичных случаях.

На наш взгляд, такое распределение типов достаточно логично, так как М-типы: 4, 22, 2, относятся к числу наиболее распространенных во многих странах. Были также выявлены различия в распространенности ОР-позигивных типов среди штаммов, выделенных в разных странах.В Европе преобладали наиболее распространенные типы М4, 1.122, М2. Они же обнаруживались в Канаде, но здесь чаще других выделялся тип М78 (25 %). Штаммы М63, М58 происходили из стран Азии. Для Новой Зеландии более характерны были типы М60 и М49.

На практике классическому М-типированшо СТА обычно предшествует типирование по Т-антигену или Т-агглютинационному паттерну. При этом возможны варианты, когда одному Т-патгерну соответствует несколько М-типов, или когда один и тот же М-тип встречается более, чем в одном Т-паттерне. В связи с тем, что типовые характеристики по М и ОР-антигенам четко коррелируют, представлялось интересным сопоставить данные по Т -типу с результатами ОР-типирова-ния штаммов. Восемьдесят штаммов, о которых речь шла выше, распределились по 15 Т-паттернам и 12 ОРтипам. При этом в 6-ти Т-паттер-нах встречались штаммы, относящиеся к двум и более ОРтипам. Так, например, Т-паттерн 4 включал штаммы не только 0Р4, но и 0Р60 и 0Р63; Т-паттерн 4/24 -штаммы 0Р4, 0Р48 и 0Р РГ2841. По-видимому, аналогичная ситуация достаточно верна и для других Т-паттернов.

Очевидны были и обратные соотношения, когда штаммы одного ОР-типа распределялись по нескольким Т-паттернам. Данная ситуация подчеркивает относительность Т-типирования стрептококков и указывает на необходимость их дифференцированной серологической оценки за-счет сочетания менее (Т-типирование) и более (0Р и М тип) прецизионных методов типирования с целью повышения информативности лабораторной базы надзора за стрептококковой заболеваемостью. Последнее должно стать особенно важным при анализе эпидемических закономерностей .

Таким образом, созданный набор иммунных сывороток оказался высоко информативным для типирования ОР-позитивных штаммов. Возни-Есает вопрос о том. что собой представляют нетипируемые ОР-штаммы и

не включают ли они еще не идентифицированные OF-типы или варианты, которые могут служить кандидатами в новые М типы. Очевидно, что OF-типирование позволяет повысить типируемость СГА и дифференцировать реальную типовую характеристику штаммов, характеризующихся одинаковым Т-паттерном.

Из сказанного очевидна польза набора анти-OF типовых сывороток в интересах клинической и , по-видимому, особенно эпидемиологической диагностики стрептококковых инфекций.

5.OF-типирование при изучении эпидемического процесса стрептококковой инфекции.

Работ по изучению типового пейзажа стрептококков группы А ь эпидемических очагах мало, что связано с трудностью типирования выделяемых микроорганизмов. Цель очередного раздела работы в связи с этим состояла в оценке анти-ОР-теста для типовой идентификации СГА при изучении эпидемического процесса, вызванного респираторным стрептококкозом. Работа проводилась в воинском коллективе, в .котором на основе анализа заболеваемости ангиной за несколько лет была выявлена цикличность эпидемического процесса с короткими интервалами. В годы эпидемического подъема наблюдалась двугорбая кривая годовой динамики заболеваемости,причем подъемы отмечались после частичного обновления коллектива зимой и летом .

Следует напомнить,что с начала 1989 года по сентябрь 1990 года больные ангиной и ОРЗ подвергались бактериологическому обследованию в начале болезни и в период реконвалесценции. Помимо этого,в период с октября 1988 года по март 1990 года, то есть в течение голутора лет от начала службы , часть коллектива, одни, и те же лида (около 300 человек) регулярно каждые три месяца обследовались та носительство стрептококков группы А. Подъемы заболеваемости по яесяцам ангиной и ОРЗ не совпадали. Это дает основание полагать, 1то основная доля заболеваний ОРЗ была не стрептококковой этиоло-?ии. Результаты OF-типирования СГА, выделенных от больных' ангина-га, показывают, что разные типы стрептококка на протяжении 1989 южэпидешческого года распределялись относительно равномерно. 1ное распределение OF-позитивных типов наблюдалось в эпидемическом .990 году. В первые три месяца 1990 года доминировали штаммы Т2841 и М28 типа, а в апреле и июле отмечен выраженный подъем зп ■одеваний.обусловленных стрептококком МП типа.Следует от-отат»

- АО -

что в нашей стране вспышка ангин, вызванная штаммами стрептококка типа РТ2841 била отмечена впервые.

ОР-позитивный штамм типа РТ2841 впервые был выделен в июле 1989 года от реконвадесцента после ангины, а вспышка, обусловленная этим типом, началась только в 1990 году. Она включала 6 случаев ангины в январе, по 3 - в феврале и марте и 1 случай в апреле, т. е. распределение заболеваний характерно для цепочечной передачи возбудителя. Заболевания начали регистрироваться примерно через месяц после зимнего обновления коллектива. Аналогичный характер распространения заболеваний имел место при ангине, вызванной типом М28.

Иное распределение отмечалось при вспышке, обусловленной типом МП (12 случаев). Оно оказалось характерным для одномоментного заражения.

Суммарные результаты изучения стрептококков, выделенных от больных и здоровых в "закрытом" коллективе показывают, что среди 0Р- позитивных культур, выделенных от здоровых носителей, в 62$ случаев встречались нетипируемые, а на долю 11 идентифицированных 0Р- типов пришлось почти 38%. Между тем среди штаммов от больных респираторными стрептококковыми инфекциями, удельный вес типируе-мых был в 2 раза выше при более ограниченном числе встречающихся в этой труппе ОР-типов.' Обращает на себя внимание тот факт, что на долю 3 из них: МП, М28 и РТ2841 приходилось более половины всех 0Р-типов, отмеченных у больных (61$£).

Сопоставление результатов 0Р- и Т- типлрования СГА, выделенных от больных респираторными стрептококковыми инфекциями показало, что ОР-типирование позволяет более четко дифференцировать принадлежащие к одному Т-типу штаммы стрептококка. Так, Т-тип Т28 приблизительйо в 21% случаев включал в себя тип 0Р 28, & в 73 % -.тип РТ2841. Вместе с тем, продолжает оставаться очевидным значение Т-гипирования для идентификации ОР-негативных и нетипируемых по 0Р- признаку штаммов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при типировании культур СГА, в конкретных эпидемиологических обследованиях, методы т-и 0Р- гипирования являются взаимодополняющими.

В целом из 260 свежевыделенных в "закрытом" коллективе штаммов 57$ относились к ОР-позитивншл. Из них тшшровались лишь 43$.

Однако если типируемость среди "носителъских" культур соответствовала всего 37$, то среди культур от больных она достигала . более высоких показателей - 78.4$. Эти данные еще раз подчеркивают преимущество ОР-типирования перед М-типированием штаммов СГА.

ВЫВОДЫ

1. Сформирована коллекция ОР-позитивных штаг,плов, состоящая практически из всех известных на сегодня ОР серотипов стрептококка группы А. Это явилось необходимым условием получения всех типов 0? антигенов. Набор ОР антигенов был использован для обнаружения типос-пецифических анти-ОР антител и их спектра в сыворотках больных и здоровых людей. Среди них были обнаружены снворотки без анти-ОР^ минимальное количество моноспецифпческкх сывороток, а так же сыворотки о различными ровнями антител к нескольким ОР антигенам, что позволило отобрать из них несколько диагностических сывороток. 2. Необходимость определения спектра анти-ОР антител в человеческих сыворотках для ретроспективного анализа распространенности ОР-ти-пов стрептококков группы А в коллективах и эпидемиологической оценки ситуации показана при сравнительной характеристике сывороток двух групп людей, представляющих "открытый" и "закрытый" коллективы. 3. Изготовлен полный набор активных диагностических иммунных типослецифических анти-ОР сывороток дал гипирования стрептококков группы А. В модельных условия:': на коллекции' штаммов из разных стран показаны: высокая ОР-типируемость культур; возможность дискриминации Т-паттернов посредством ОР-типирования; доминирование разных ОР типов СГА в географически разню: регионах. Этот вывод был справедлив и для эпидемически условий. 4. При изучении эпидемического процесса респираторного стрептококкоза посредством ОР-типирования СГА установлены два пути (цепочечный и одномоментный) распространения инфекта при вспышках заболеваемости в "закрытых" коллективах. При этом обнаружены три "ведущих" ОР типа СГА, обусловивших три подъема заболеваемости; впервые среди актуальных штаммов на территории страны обнаружен ОР тип РГ2841. 5. Установлена корреляция между анти-ОР активностью иммунных сывороток. и их опсонизирующими и бактерицидными (протективными) 'свойствами. Таким образом, подтверждена тесная связь между М и ОР типами

СТА и доказано,что анти-OF сила сывороток является косвенным показателем их бактерицидности в отношении стрептококков группы А соответствующих серотипов. 6. Б итоге проведенная работа позволила усовершенствовать лабораторную диагностику широко распространенных острых стрептококковых заболеваний верхних дыхательных путей и доказать целесообразность OF типирования стрептококков группы А в интересах эпидемиологии и клиники.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ- ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Красильников И.А., Ионтова И.М., Белякова-И.В., Тотолян А.А.//В об.: Теоретические проблемы эпидемиологии и инфекционной иммунологии на современном этапе. Нальчик.- 1986.. с. 103-104.

2. Krasilnikov I.,IontovaI.,Beliakova I.,Totolian A. OF- and anti- OF tests in epidemiology of streptococcal infections.//Abstr.X th Int.Symp.on streptococci.,Cologne,FRG, Sept.1-4,1987.-p.111.

3. Ионтова И.М., Гревнина , Белякова И.В., Красильников И.А., Тотолян A.A. Перспективные разработки методов идентификации патогенных стрептококков и их использование в медицинокой практике.// В сб.: Актуальные проблемы клинической микробиологии. М.-1989- с. S6-59.

4. Белякова И.В.", Тотолян A.A. OF- и анти-OF тест-оистемы в микробиологической и эпидемиологической практике.// 2урн. микроби-ол.- 1989-N11- с. 54-59.

5. Красильников И.А.,. Ионтова И.М., Беликова И.В., Соболевская A.A., Зубов А.К., Степанова Т.А., Фомина Н.И., Тотолян A.A. OF-характеристика СТА и иммунитет к стрептококковой инфекции по результатам OF- и анти- ОРтеогов.// 2урн.микробиол.-1990-Н4-с. 26-31.

СПб.Ж. Зак. 97. Тир. 100. 03.03.1993.