Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка унифицированного метода идентификации стафилококков с помощью стандартной тест-системы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка унифицированного метода идентификации стафилококков с помощью стандартной тест-системы"

9 " — з о

мята ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-

т«* ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЕРГАЦК» МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ им. Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

ВЛАСЕНКО Марина Анатольевна

РАЗРАБОТКА УНИФИЦИРОВАННОГО МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ СТАФИЛОКОККОВ С ПОМОЩЬЮ СТАНДАРТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии.

Научный руководитель — доктор медицинских наук К. Я. Соколова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И. Б. Куваева;

доктор медицинских наук А. С. Анкирская.

Ведущая организация—Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. Г. Тарасевича.

Защита состоится «_»___1993 г.

в_час. на заседании специализированного совета К 084.18.01 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского по адресу: 125212, А\осква, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

Автореферат разослан «_»___1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

3. Н. Ермоленко.

Актуальность пшбдспь:. •

В последние годы возросла роль стафилококков в этиологии заболеваний инфекционной природы человека и животных. Эти мик-.роорганизмы вызывают инфекции коглых покровов, глаз, ушей, мочеполового траста, систешше инфекции (Смирнова A.M., Трояш-кин A.A., Падерина E.U., 1977; Акатов А.К,, Зуева В.С.,1983; Bailey R.R. , 1973; Love D.N., Lomas G., Bailey M. et al. I98X; Burchard K.W., Minor L.В., ' Slotman C.J. et al. , 1984; Gemraell C.G. , 1987; Hamory B.H., Parisi J.T. , 1987; ..Pidalso s., Vazquez P., Mendosa M.C. et al. ,1990;

Lammller Ch. , 1990; Arber N., Militiariu A., Ben-Yehuda A. et al. , 1991). • '

t

В составе рода в настоящее' время признано 19 видов и несколько видов еще 'находится в исслодовадии.

Проведение видовой идентификации стафилококков,' особенно коагулазонегативных встречает серьезные трудности. Метода определения ввдовой принадлежности, предложенные зарубежными и .отечественными исследователями (Акатов А.К., Зуева B.C., 1983; Акатов А.К., 1988; Kloos w.e., Schieüer к.H. , 1975) с использованием дифференциально-диагностических сред традиционного приготовления являются трудоемкими, требуют длительной инкубации, большого набора питательных сред, вследствие этого они мало приемлемы для клиническйх лабораторий.

Стремление к ускорению ir стандартизации анализа реализовано разработкой за рубежом большого'числа различных диагностических систем дця идентификации, микроорганизмов, в том числе и стафилококков, основанных 'На выявлении их ферментных систем. Наиболее широко используются для идентификации стафилококков следующие тест-системы: API- STAPH , API- Staph-Ident , Staphy-test. ■'■. . ;

В нашей страаа в Нижегородском ШОШ разработан набор систем индикаторных бумажных (СИБ) душ идентификации стафилококков, в НПО "Питательные среды" (г.¡Махачкала) создана микро-тестсистема. Однако производственный выпуск данных препаратов отсутствует.

Принцип функционирования тест-систем основан на кшкро-культуралышх методах. Ускорение биохимических реакций достигается небольшим объемом ингредиентов при относительно большом количестве засеваемой культуры. Применение таких систем для дифференциации позволяет стандартизировать лабораторную диагностику, сократить трудоемкость, потребность в лабораторной посуде, питательных средах и ускорить сроки идентификации. Кроме того, преимуществом применения подобных систем является возможность автоматизации отдельных этапов исследования, перехода во многих системах к компьютерной обработке результатов.

Поскольку большинство устройств дня идентификации запатентовано и технология их изготовления полностью не раскрыта, то разработка новых диагностических препаратов для внзимоаден-нфасацш стафилококков составляет задачу специальных исследований.

Работа выполнена в рашах научной тематики Нижегородского НИИЭЫ по договору X 3-107-78 в соответствии с целевой программой научных исследований ИЗ РФ по проблеме "Медицинская биотехнология" на 1991-1995 гг.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка метода идентификации стафилококков с помощью стандартной тест-системы однократного применения.

В соответствие с целью были поставлены следующие задачи:

I. Провести отбор тестов дня идентифицирующей панели. -А-

2. Осуществить конструирование микрокультуральных субстратно-индикаторных сред.

3. Разработать технологию производства пластинчатой тест-системы для идентификации стафилококков.

4. Разработать цифровой каталог кодов и программное обеспечение для упрощения и ускорения этапа интерпретации результатов, полученных с помощью 1ВДС.

5. Изучить информативность, надехшость метода идентификации с помощью ПВДС в моделышх опытах на музейных и свеле-выделошшх культурах и в практической работе бактериологических лабораторий.

Научная новизна исследования

Разработан новый вид стандартного диагностического препарата - Пластина биохимическая, дифференцирующая стафилококки, включающего набор из 17 микрокультуральных субстратно-индикаторных сред.

Впервые разработаны каталог кодов и программное обеспечение, облегчающие и унифицирующие эгап интерпретации биохимического тестировашш стафилококков.

Практическая ценность Работы

Составлена и утверждена в ¡Динздраве РФ 31.07.92 г. нормативно-техническая документация на препарат:

1. ВЗС 42-353 ВС-92 "Пластина биохимическая дий>еренцпрую-щая стафилококки".

2. Инструкция по применению пластины биохимической дифференцирующей стафилококки.

3. Регламент производства Пластины биохимической ди$фе-ренцирующой стафилококки Л 34.

Проведена апробация разработшшой тест-спстемы совместно

с сотрудниками бактериологических лабораторий в конкретных -}

условиях лабораторной практики.

Проведены мероприятия для внедрения нового метода цденти-С'-1улции стафилококков в лабораторную практику, включающие обучение на рабочих местах, ежегодных республиканских курсах повышения квалификации врачей бактериологов в соответствии с планами Минздрава РФ.

На защиту выносится следующее положение:

Скомпааованный набор тестов для одноэтапной идентификации, каталог кодов и програмное обеспечение позволяют создать тест-систему 1ВДС, что унифицирует, упрощает к ускоряет процесс видовой идентификации стафилококков.

Апробация диссертации

Основные положения работы доложены на конференции молодых ученых Нижегородского медицинского института "Актуальные вопросы медицины" (Горький, 1990), на У1 Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Н.Новгород, 1991), на заседании эпидемиологического семинара Нижегородского Ник эпидемиологии и микробиологии (Н.Новгород, 1990,1993), на заседании Ученого Совета Нижегородского НИИЭМ (Н.Новгород, 1993).

По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов. Работа содержит 121 страницу машинописного текста, 27 таблиц, 7 рисунков, I схему, список литературы включает 169 источников, в том числе 123 зарубежных авторов*

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ШОЩОВАНИЯ

Объектом исследования в работе были представители рода staphylococcus , выделенные при проведении бактериологических анализов по изучению микрофлоры различных материалов, получен-

h-

них от больных (фекалий, ыочи, мокроты, желчи, крови, грудного молока, отделяемого ран, зева, конъюнктивы и т.д.), один шташ выделен из зева собаки. 36 штаммов были взяты из Всесоюзной коллекции музея живых культур ГИСК им. Л.А.Тарасовича. Всего в работе проведена идентификация 718 штаммов стафилококков.

В процессе конструирования диагностического препарата для идентификации стафилркокков было выполнено более 4 тысяч биохимических анализов.

При разработке 1ЩС изучались оптимальные количественные соотношения ингредиентов для каждого теста (субстрата, индикатора, стабилизатора, биологически активных; добавок). Изучались условия растворимости реагентов при различных температурах, подбирались виды буферных растворов с различными значениям , рН, а также индикаторы, наиболее четко определяющие изменения рН в реакционной смеси. Отрабатывались методы стерилизации, условия и режим суши, подбирались факторы роста и среда душ приготовления микробной суспензии.

При подборе контейнера-планшета для сухих дифференциально-диагностических сред сопоставляли 2 варианта планшетов. Первый состоит из трех частей: основания, вложенной в него рабочей панели с 20 лунками и крышки, изготовленных из поливкнилхлорид-ной пленки путем вакумформования. Второй - из двух частей: рабочей панели и крышки, изготовленных из полистирола путем литья. В обоих случаях материал, из которого изготовлены планшеты был индифферентным к реакционной смеси лунок.

Для установления надежности и специфичности ПВДС работа проводилась в параллельных опытах с общепринятыми методами определения ферментативной активности на жидких дифференциально-диагностических средах традиционного приготовления. Результаты

коррелятивного сопоставления выражали в процентах.

В ходе исследования нами подобрана группа индикаторных тест-культур для контроля специфической активности экспериментально-производственных серий ПЦДС. В число индикаторных культур включены 4 представителя рода стафилококков и I представитель рода микрококков, которые в совокупности позволяют выявить как положительные, так и отрицательные реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАНИЯ

При решении задачи по отработке способа ускоренной идентификации стафилококков были отобраны диагностически значимые тесты, сконструированы субстратно-индикаторные среды, подобрана реакционная среда и посевная доза бактерий, разработан метод постановки биохимических тестов в шшрообъемах.

При выборе оптимального набора тестов для ПБДС нами была проанализирована частота их встречаемости в разработанных импортных и отечественных тест-системах, что отражает мнение авторов о степени значимости дифференцирующей способности каждого теста. Для 48 признаков, которыми охарактеризованы представители рода Staphylococcus в "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" был рассчитан показатель дифференциации. Отбор тестов проводили с учетом данных литературы о значимости тестов и по величине показателя дифференциации. Мы принимали во внимание возможность перевода теста в планшетную форму., воспроизводимость, простоту постановки и учета теста, доступность необходимых реактивов при промышленном производстве препарата.

Мы оотановшшсь на 17 тестах, позволяющих в один этап идентифицировать как типичные, так и отличающиеся по отдельным признакам от типичных штаммы. Это тесты, позволяющие определить окисление фруктозы, маннозы, мальтозы, лактозы, трегалозы, ман-

нита, ксилозы, сахарозы, арабимозы,' галактозы, салицина, образованно ацетилмотштарбинола, наличие уреазы, фосфатазы, нптрат-редуктазы, аргининдегидролазы и в качестве положительного контроля использован тест по окислению глюкозы. Нами составлена таблица биохимических свойств стафилококков по 17 признакам.

Используя ранее разработанные при конструировании пластинчатой тест-системы для идентификации энтеробактерий принципы изготовления субстратно-лндикаторных шшросред (Соколова К.Я., 1990), нами внесены изменения в технологию их изготовления и методику использования применительно к микроорганизмам рода 31ар11у1ососсиа.

Показала возможность замены индикатора феноловый красный на крезоловый красный в мпкросредах с углеводами. Отработаны количественные соотношения ингредиентов сухих субстратно-индикаторных сред при использовании индикатора крезоловый красный. Hai.ni подтверждено на представителях рода staphy^ococcuз соответствие ранее предложенных количеств субстрата (2,4 мг на I лунку панели) для набора Сахаров и многоатомного спирта, включенных в набор ПБДС.

В ходе экспериментов выявлено снижение рП при смешивании ряда углеводных субстратов в фосфатном буфере и индикатора. Поэтому в методш(у приготовления этих видов субстратно-иццикатор-них сред введен этап коррекции реакции среды конечного раствора с помощью 1% раствора наОН.

При разработке субстратно-ивдикаторных сред для выявления фосфатазы н нитратредуктазы испытывали различные концентрации веществ (фенолфталеин фосфата натрия и азотнокислого калия, соответственно). о целью получения их оптимального содержания в лунке панели. В качество растворителя использовали дистиллированную воду.

Отработка тестов по выявлению уреазы и аргишшдегидрп-лазы велась по определению оптимального рН среды, позволяющего получить результаты через 18-24 часа. Выбирались наиболее оптимальные значения рН среды путем сравнительного изучения различных вариантов на штаммах с заведомо известными свойствами.

При отработке теста для выявления типа бронения у стафилококков наш определена пригодность среды, ранее предложенной в Пластине биохимической дифференцирующей энтеробактерыи (ПБДЭ).

Усовершенствован конте^Ьнер-планшет для сухих дифференциально-диагностических микросред. 0рав1швали контейнер-планшет, состоящий из трех частейV основания, вложенной в него рабочей панели и крыши!, изготовленных из поливинилхлорвдной жесткой светотехнической пленки и винипластовой коландриро- • ванной пленки путем вакууьформовашш и контейнер-планшет, состоящий из двух частей: рабочей панели и крышки, изготовленных из полистирола путем литья. Выявлено более прочное прилипание субстрата к полимеру при использовании планшетоЕ из полистирола, к тому же использование полистиролових планшетов является более экономичным, а производство та менее трудоемким.

При разработке ПВДС .отработана методика мпкридозировашш субстратно-ивдикаторных сред в лунки планшета с помощью дозатора автоматического 20-канального и дозатора полуавтоматического 20-канэ пышго, вместо применявшейся ранее при производстве пластинчатых тест-систем дозации с помощью ручных микропипеток.

Учитывая сложность видового определения микроорганизмов с помощью таблиц биохимических свойств бактерий, описашшх в

-К-

руководствах и определителях микробов, путем сравнения полученных результатов тестирования с даншш, представленными в таблицах, нами разработан каталог кодов ц программное обеспечение. Каталог годов и программное обеспечение позволяют сделать этап интерпретации результатов тестирования в определенной степени независимыми от опыта и уровня профессиональной подготовки исследователя.

При конструировании каталога кодов и программного обеспечения составлялась база данных, включающая 21 наименование (19 видов и 2 подвида) представителей рода стафилококков и данные по I? биохимическим тестам, входящим в состав 1ЩЦС и тесту плазмокоагуляции. Биохимическая характеристика видов основывается на данных представленных в "Bergey'a Manual of Systematic Bacteriology'1 (1986) И включает описание как ТИПИЧНЫХ, так и атипичных представителей этого рода.

G целью получения цис^рових кодов была выбрана октальная система кодирования, как наиболее удобная. Каждый тест в триплете обозначался цифрами "4", "2", "I". Показатели,положительных тестов в триплете складывались и получался код триплета, выраженный цифрами от "О" до "7". Кодовое число представляет собой последовательную запись кодов триплета. Для отработки данных составлялась программа на языке " cllipper ". Затем на компьютере проводился обсчет и сортировка кодовых чисел, позволившая расположить их по возрастанию числового значения. Для каждого кодового числа рассчитывалась абсолютная вероят- ■ ность видовой идентификации по форлуле?

P = Jifj . ... Mjg , где р - абсолютная вероятность видовой идентификаций} М - значения вероятности 18- количество тестов.

В случае, когда один и тот же числовой код относился к 2 или 3 видам вводился показатель относительной вероятности видовой идентификации, который рассчитывался по формуле: Рк

рк = Р1 + р2+.--й} ' гд0 Рк - относительная вероятность видовой идентификации к - от I до N

Рр. - абсолютная вероятность видовой идентификации

При составлешш каталога кодов было получено 1224 варианта кодовых чисел. Максимальным количеством кодовых чисел (512) в каталоге кодов представлен вид Б.1еп1;из , что свидетельствует о разнородности представителей данного ввда.

При работе с каталогом кодов учет результатов биохимического тестирования проводили с использованием разработанной нами кодовой карточки. В кодовой карточке тесты разделены на 6 групп (по 3 теста в каждой группе) и для каждого теста дано цифровое значение (4,2,1). При заполнении кодовой карточки результат теста в случае положительной реакции обозначается цифрой 4,2 или I, как указано для данного теста, а при отрицательной реакции цифровое значение любого теста равно нулю. Цифровые значения тестов в каждом триплете суммируются, после чего выводится кодовое число исследуемого микроорганизма. По каталогу кодов в соответствии с кодовым числом проводят определение микроорганизмов.

Информация в каталоге кодов ПБДС расположена в четырех графах: первая графа - кодовое число микроорганизма, вторая -видовое название, третья - абсолютная вероятность видовой идентификации, четвертая (при совпадении кодовых чисел) -относительная вероятность ввдовой идентификации-

Для создания автоматизированного рабочего места микробио-

40'

лога и дальнейшей унификации интерпретации результатов разработано программное обеспечение к персональным компьютерам типа Ыл-РС/аТ.

Использоъа}. ш каталога кодов и программного обеспечения позволяет сделать этап интерпретации результатов тестиро^лния в определенной степени независимым от огшта и уровня профессиональной подготовки исследователя.

С целью внедрения в практику созданного наш диагностического препарата, определения н&де:хности и кдентифицирующеи способности тест-системы проводилась ее апробация в лаборатории бактериальных кишечных инфекции, дисбактериозов и продуктов лечебного питания Нижегородского НИ^аЫ, в которой разрабатывался препарат при обследовании больных и здоровых лодей в ходе выполнения других запланированных научных исследовании, в лаборатории аэробов ШСК им. Л.А.Тарасовича, в лаборатории микробиология Российского научно-исследовательского центра перинатологии, акушерства и гинекологии, в бактериологических лабораториях дйТО им. Н.Н. 11риорова, клиники Нижегородского НйШ, Нижегородского НИИ детской гастроэнтерологии. Всего в ходе апробации идентифицирован 641 шташ.

Коррелятивное сопоставление результатов тестов, полученных с помощью сконструированных иикрокультуральннх сред и дифференциально-диагностических сред традиционного приготовления проведено на 156 штаммах. Сравнительные результаты определения биохимической активности стафилококков выявили корреляцию результатов от Ь6,5 до 1иУ,и У Ь тестов ( окисление глюкозы, фруктозы, маннозы, лактозы, каннита, сахарозы, салицина, арабинозы) выявлено практически полное совпадение результатов.

Использование нового диагностического препарата позволи-

ло провести видовое определение у 86,0 /о исследуемых культур, что не уступает показателю двд.вренциация у существующих зарубежных аналогов.

Отработана методика применения тест-системы с использованием чистом суточной агаровой культуры со скошенного мясо-пептонного агара и с использованием одной изолированной колонии. Пршенение ПЩС и каталога кодов позволило упростить,, стандартизировать сократить процесс видовой идентификации на 5-6 суток.

Таким образом, на основе общих данных о метаболизме стафилококков и с учетом особенностей представителей разных видов сконструирован новый диагностический препарат для ускоренной идентификации, необходимым как в медицинском,' так и в ветеринарной практике и предложены методы его использования. Разработанные к тест-системе каталог кодов и программное обеспечение открывают широкие возможности использования компьютерной техники для видового определения микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

I. С полющей анализа литературных данных и математических методов выбран комплекс ключевых признаков, необходимый для одноэтапной идентификация стафилококков до вида.

. 2. Внесены изменения в технологию приготовления ранее предложенной для энза/.оидентификации энтеробиктерий пластинчатой тест-системы применительно к микроорганизмам рода

§ЬарКу1Ьсоосиз.

3. .Предложена новая более экономичная (¿х>рма контейнера из полистирола для производства пластинчатых тест-систем, взамен планшетов из поливинилхлорида.

4. Составлен каталог кодов и программное обеспечение

к персональным компьютерам типа Хш-РС/АТ для унификации этапа интерпретации результатов биохимического тестирования стафилококков.

5. В экспериментальных условиях а при апрооации в лабораторной практике доказана надежность работы аЖС при коррелятивном сопоставлении тест-системы с традиционными дифференциально-диагностическими средами.

6. Разработан метод ускоренной идентификации стафилококков до вида с помощью идентификационной системы ПВДС, апробированный на коллекции музейных и свежевыделенных культур.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Блохина И.Н., Беляев Е.И., Бруснигина Н.*., Власенко м.ь., Залесских Н.в., Лихачева А.Ю., Соколова К.й., Усачева О.Ю. Организация бактериологического контроля за раневой инфекцией в экстремальных условиях, ¿методические рекомендация. Горький, 19Ь9.- 54с.

2. Соколова К.Я., Власенко Ы.А. Разработка стандартной тест-системы - ¿ЩС (11ластины биохимической дифференцирующей стафилококки) для идентификации стафилококков с целью совершенствования методов изучения 'микробиоценозов // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии. л1ахач-кала, 1990, ч.П, с.75-76.

3. Соколова К.а., Власенко «д.А., Рябова М.И. Разработка микрокультуральных методов энзиыоидентификации микробов. Тезисы докладов УХ всероссийского съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол. ыосква, 1991, т.2, с. 12Б-129.

4. ¿ласенко и.а., Денисенко Т.Л. Разработка тест-системы цлн идентификации стафилококков и ее сравнение с традиционным

методом // Новое в практике лабораторных исследований инфекционных заболевании. - Н.Новгород, 1991.- С.20-25.

5. Власенко М.А. Идентификация стафилококков с помощью тест-системы однократного использования // Биотехнология и генетика,- Н.Новгород, 1991. - С.45-49.