Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка статистического метода видовой идентификации микроорганизмов на примере представителей рода STAPHYLOCOCCUS

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка статистического метода видовой идентификации микроорганизмов на примере представителей рода STAPHYLOCOCCUS"

На правах рукописи

ФОТ НАТАЛИЯ ПАВЛОВНА

РАЗРАБОТКА СТАТИСТИЧЕСКОГО МЕТОДА ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПРИМЕРЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА STAPHYLOCOCCUS

Специальность - 03.00.23 - Биотехнология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Дерябин Дмитрий Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Бирюков Валентин Васильевич

доктор биологических наук, профессор Дрынов Игорь Дмитриевич

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита состоится «24» мая 2005 года в 12 ч. 30 мин, на заседании диссертационного совета ДМ 212.204 13 в РХТУ им. Менделеева по адресу 125047, Москва, Миусская площадь, дом 9

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Менделеева

Автореферат разослан «22» апреля 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

ДМ 212.204 13, к.т.н.

И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проведение видовой идентификации микроорганизмов является обязательным требованием в биотехнологических, экологических и медицинских исследованиях. В биотехнологических исследованиях подобная необходимость определяется задачей стандартизации производственных штаммов микроорганизмов, а также контролем их стабильности во времени. В результате для решения данной задачи предложено множество миниатю-ризированных тест-систем для биохимической идентификации с визуальным или автоматизированным учетом результатов и определением вида микроорганизма по прилагаемым каталогам кодов или с использованием специализированных компьютерных программ (Скала JI.3. с соавт., 1997).

Существенным недостатком разработанных на сегодняшний день методов является невысокая достоверность результатов идентификации, определяемая особенностями используемых математических алгоритмов с невозможностью получения диагностических заключений при произвольной комбинации идентификационных тестов. В этой связи актуальным представляется разработка алгоритма и на его основе универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков, позволяющей максимально оптимизировать данную процедуру и тем самым создать условия для качественной оценки присутствия данных микроорганизмов в различных объектах (внешней среды, в организме человека).

Цель работы: Повышение эффективности идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus с использованием вероятностно-статистических методов обработки данных.

Задачи исследования:

1 .Выбор и обоснование многомерного статистического метода для осуществления видовой идентификации микроорганизмов с последующей разра-

рсс. H'-'iWtV''.- \Я

E.i- г -

<.. -I

2Q0^\__

з

боткой компьютерной программы, унифицирующей и автоматизирующей данную процедуру на примере представителей рода Staphylococcus.

2.Адаптация разработанного программного продукта к решению задач анализа эффективности различных тест-систем для видовой идентификации стафилококков с определением причин возникновения возможных диагностических ошибок.

3.Оценка видового биологического разнообразия санитарно-показатель-ных микроорганизмов рода Stapylococcus в воздушной среде и организме носителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

Научная новизна. Предложен и обоснован вероятностно-статистический метод дифференциации сложных биологических объектов, основанный на использовании процедуры кластерного анализа. Продемонстрированы преимущества подобного подхода перед применяемыми в настоящее время вероятностно-статистическими методами, заключающиеся в высокой точности показателей идентификации, а также мобильности процедуры при введении новых дифференцирующих тестов или расширении перечня идентифицируемых видов.

Впервые проведен анализ диагностической эффективности наиболее распространенных коммерческих тест-систем для видовой идентификации стафилококков и охарактеризованы основные причины возникновения диагностических ошибок. На основании проведенных исследований получены новые данные о зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее дифференцирующих тестов, а также отклонений от значений конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берджи» (1997).

Получены новые данные об увеличении видового биологического разнообразия стафилококков в объектах внешней среды и в организме человека в условиях техногенного химического воздействия на экосистему, преимуществен-

но связанные с расширением перечня определяемых видов и требующие для своей оценки использования индекса разнообразия Шеннона.

Практическая значимость. Разработана, апробирована и внедрена в работу бактериологических лабораторий «Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов», позволяющая автоматизировать и унифицировать процесс интерпретации биохимических идентификационных тестов. Основным отличием данной программы от существующих аналогов является то, что она представляет из себя «открытую систему», позволяющую получить правильное диагностическое заключение при любой комбинации дифференцирующих тестов, как входящих в состав коммерческих идентификационных систем, так и выполняемых непосредственно пользователем.

Определены направления создания новых и совершенствования существующих тест-систем для видовой идентификации стафилококков на основе отбора комплекса тестов с наибольшей диагностической информативностью.

Продемонстрирована возможность использования показателя видового биоразнообразия стафилококков в объектах внешней среды и в организме человека при проведении микробиологического мониторинга природных экосистем в условиях их техногенного химического загрязнения.

Положения, выносимые на защиту:

1.Применение методов кластерного анализа для целей идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus.

2.Сравнение диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков.

3.Использование показателей видового биологического разнообразия стафилококков при проведении экологического мониторинга.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х всероссийских и региональных на-

учно-практических конференциях, экспонировались на Второй Приволжской Ярмарке «Российским инновациям - Российский капитал» (г. Нижний Новгород, 2004 г.). По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах и 2 тезисов докладов в материалах конференций, получено свидетельство о регистрации разработанного программного продукта.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах и состоит из введения, пяти глав, заключения и списка использованных источников, включающего 103 публикации отечественных и зарубежных авторов, содержит 6 таблиц и 18 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования: При проведении работы использована группа из 23 эталонных штаммов стафилококков с известной видовой принадлежностью и биохимическими характеристиками, полученных из музея живых бактериальных культур НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (Москва), 150 клинических и природных изо-лятов, идентифицированных до вида референс-методом по совокупности используемых для этих целей таксономически значимых конвенциональных тестов. При анализе видового биологического разнообразия изучены 326 штаммов стафилококков, из которых 132 изолированы из атмосферного воздуха населенных пунктов, расположенных в зоне влияния предприятия газовой промышленности (72 штамма) и фоновой зоне (60 штаммов), а также 194 культуры, выделенные из передних отделов носа бактерионосителей, из которых 136 проживали в населенных пунктах, расположенных в зоне влияния предприятия газовой промышленности и 58 в фоновой зоне.

Методы видовой идентификации. При проведении видовой идентификации изученных культур стафилококков в зависимости от цели исследования у них определялись от 16 до 44 конвенциональных таксономически значимых

культуральных и биохимических характеристик, оцениваемых в соответствии с «Определителем бактерий Берджи» (1997). Параллельно данные культуры были изучены с использованием коммерческих тест-систем ТТБДС (пластина биохимическая, дифференцирующая стафилококки); НПО «Диагностические системы», Россия; STAPHYtest-8 и STAPHYtest-16 («Lachema», Чехия); APl-Staph и 32ID («bioMerieux», Франция). Результаты реакций учитывали визуально по таблицам «Интерпретация реакций» и оценивали в соответствии с соответствующими идентификационными таблицами и каталогами кодов.

Методы статистической обработки и программирования. Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием критерия Пирсона, методов оценки корреляций и регрессий в программе «Microsoft Excel - 2000», а также методов кластерного и дискриминантного анализа в программе «Statistica». Разработка «Универсальной программы видовой идентификации микроорганизмов» проводилась в среде программирования Delphi 5.0. Для характеристики информативности отдельных биологических характеристик стафилококков использована мера Кульбака. При оценке видового биологического разнообразия стафилококков использовался графический метод с построением кривых доминирования-разнообразия, а также проводилось вычисление индексов Симпсона, Шеннона и Пиелу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении приведена общая характеристика работы.

В первой и второй главах выполнен анализ известных публикаций, описаны объекты и использованные методы исследований.

В третьей главе проведено обоснование выбора метода вероятно-статистического анализа для целей дифференциации сложных биологических объектов и на данной основе разработана "Универсальная программа для видовой идентификации микроорганизмов".

Необходимость использования вероятностно-статистических методов для целей видовой идентификации микроорганизмов определяется многоплановостью и сложностью исследуемых объектов, данные о которых носят многомерный характер (для каждого объекта регистрируются значения множества переменных), что выдвигает на первый план проблему построения группировок и классификаций по совокупности весьма разнородных данных (Айвазян С.А., Мхитарян B.C., 2001).

Современная электронно-вычислительная техника в настоящее время предлагает для решения этой задачи ряд методов статистического анализа, среди которых при выполнении настоящей работы использованы корреляционный, дискриминантный и кластерный анализы.

Корреляционный анализ для решения проблем классификации объектов предлагает оценку характеристики парных отношений идентифицирующих признаков (ковариация, корреляция), которые в дальнейшем используются в качестве базовой исходной информации. Метод канонических корреляций (вариант корреляционного анализа) является обобщением множественной корреляции и отражает связь между одной случайной величиной и множеством других случайных переменных. (Дубров A.M. с соавт., 1997).

В частности, при выполнении настоящей работы посредством корреляционного анализа проведено сравнение дифференцирующих признаков известных видов стафилококков с признаками каждого из неизвестных (идентифицируемых) штаммов микроорганизмов. Решение об отнесении исследуемого штамма к определенному виду стафилококков может выноситься на основании значений коэффициентов между исследуемым и каждым из известных видов: чем они выше, тем больше вероятность подобной идентификации. Однако, отсутствие некоторых признаков у исследуемого объекта, являющееся распространенным вариантом представления данных, влечет за собой уменьшение значений коэффициентов корреляции и делает нецелесообразным применение данного метода при практическом решении подобной задачи дифференциации.

Процедура дискриминантного анализа (Трошин Л.И.) оценивает адекватность исходно предлагаемой классификации объектов (видов микроорганизмов), а также формирует набор правил (дискриминирующих функций), обеспечивающих отнесение нового идентифицируемого микроорганизма к некоторому виду. Однако, при всей привлекательности использования дискриминантного анализа для целей межвидовой дифференциации микроорганизмов, выявленное в анализируемых выборках несоблюдение условия нормальности распределения исходных данных о распространенности идентифицирующих признаков, сделало его применение в нашем случае невозможным.

Кластерный анализ позволяет классифицировать многомерные наблюдения, каждое из которых описывается набором независимых и разнородных исходных переменных. При этом целью анализа является образование групп схожих между собой объектов, которые принято называть кластерами (Айвазян С. А., Мхитарян В.С.,2001).

При применении методов кластерного анализа для целей видовой идентификации стафилококков исходные данные были представлены в виде матрицы размерностью 36x44 (36 известных видов стафилококков, охарактеризованных по 44 таксономически значимым характеристикам). Проведение дальнейших вычислений с использованием обычного Евклидовою расстояния, по формуле: ёч2 = 2к-1т (х.к - где х,к - х^ - расстояние между 1 ивидами стафилококка, принадлежащими к к-ому классу, позволяет представить каждый из вновь идентифицируемых микроорганизмов как некую «точку» в 44-мерном признаковом пространстве, где геометрическая близость двух точек означает однородность их видовой принадлежности. Соответственно, при изменении исходных данных (расширении перечня идентифицируемых видов или расширении числа идентификационных признаков) общая структура расчетов не меняется, а новые данные просто добавляются в уже сложившуюся картину дифференциации.

Таким образом, проведенные исследования позволили констатировать при-

емлемость использования метода кластерного ана1иза для решения задачи дифференциации сложных биологических объектов, что послужило обоснованием его дальнейшего использования при разработке компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов.

На данной основе в среде программирования Delphi 5 была разработана программа для персонального компьютера, схема работы которой представлена на рис.1.

После запуска программы на экране появляется основная форма «Универсальной программы для видовой идентификации микроорганизмов», в которой из нескольких групп микроорганизмов на основании предварительно проведенных исследований (морфологические, тинкториальные и др. свойства) предлагается выбрать одну для дальнейшей идентификации.

Рисунок 1. Схема работы программы

В диалоговом режиме после нажатия соответствующей кнопки на экране появляется форма ввода данных, представляющая из себя таблицу с перечнем таксономически значимых характеристик, используемых для видовой идентификации определенной группы микроорганизмов. При этом в ячейки, соответствующие отдельным биологическим характеристикам, использованным для идентификации исследуемого микроорганизма, вводятся результаты тестов: «+» — наличие признака; «-» - отсутствие признака. В случае, если какие-либо тесты не выполнялись или при их учете был получен нечеткий результат, соответствующие ячейки таблицы не заполняются.

В итоговой форме «Результат идентификации» приводятся значения Евклидова расстояния между идентифицируемым штаммом и известными видами микроорганизмов с указанием вероятности подобного заключения, результаты тестов «за» и «против» отнесения идентифицируемого штамма микроорганизма к текущему виду (при этом указывается обшее число совпавших и несовпав-ших тестов), а также рекомендуемые значения дополнительных тестов для более точной дифференциации между тремя наиболее вероятными видами микроорганизмов.

Разработанная «Универсальная компьютерная программа идентификации микроорганизмов» зарегистрирована в качестве оригинального программного продукта для ЭВМ (сертификат № 2004610330 от 2 февраля 2004г.).

Основным отличием данной программы от известных аналогов является то, что она жестко не связана ни с одной из известных коммерческих диагностических тест-систем и представляет собой «открытую систему», позволяющую получать требуемый результат при использовании любой комбинации конвенциональных таксономически значимых тестов, в том числе самостоятельно выполняемых пользователем.

В четвертой главе с использованием разработанной «Универсальной компьютерной программы идентификации микроорганизмов» проведен анализ диагностической эффективности наиболее широко распространенных коммерческих тест-систем для видовой идентификации стафилококков и анализ причин возникновения диагностических ошибок.

При выполнении данного раздела работы были изучены пять наиболее широко представленных на российском рынке тест-систем: ПБДС (пластина биохимическая, дифференцирующая стафилококки), производимая НПО «Диагностические системы» (Россия), «БТАРНУЧез^в» и «ЗТАРНУЧеБМб» (ЬасЬеша, Чехия), а также АР1-8(арЬ и Ш32 («ЫоМепеих», Франция). Эффективность сравниваемых тест-систем исследовалась с использованием «Универсальной компьютерной программы идентификации микроорганизмов»

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы ПБДС, позволили констатировать совпадение с результатами, полученными с использованием ре-ференс-метода только в 57,14±1,06 % случаев (рисунок 2,А). При этом причины неправильной видовой идентификации стафилококков при использовании тест-системы ПБДС сведены к двум основным моментам. Ошибки первого рода определялись тем, что несмотря на заявленные диагностические возможности тест-системы как достаточные для идентификации определенного спектра видов стафилококков, полученный результат все же оказывался неверным. На ее долю приходилось 28,52±1,27 % от общего количества полученных диагностических заключений. Ошибки второго рода были связаны с тем, что диагности-

14.3

28,5'

28,7'

9,4

О

%Р

В

г д

Рис.2. Диагностическая эффективность тест-систем для видовой идентификации стафилококков: А- ПБДС; Б - «БТАРтЧев^»; В- «БТАРНУ^Иб»; Г -АР1-81арЬ; Д - ГО32 ( щ - правильные заключения (%); неправильные заключения:

С3- ошибки первого рода (%); СИЗ - ошибки второго рода (%).

ческие возможности данной тест-системы принципиально не позволяли получить верное заключение, так как она изначально предусматривала возможность идентификации только 19 из 36 известных видов и подвидов стафилококков

(14,34±0,98 % от общего количества диагностических заключений). При дальнейшем анализе тест-систем природа ошибочных заключений была аналогичной и связана с недостаточными диагностическими возможностями исследуемых тест-систем и невозможностью идентификации некоторых видов микроорганизмов. Максимальная диагностическая эффективность была зафиксирована у тест-системы ID32 - 85%, минимальная - у STAPHYtest-8 - 44,83% (рис.2).

В рамках проведения данного фрагмента работы интерес представляет модификация тест-системы «STAPHYtest - 8» с удвоением перечня идентифицирующих тестов, что позволило сформировать панель «STAPHYtest - 16» и проявилось в значительном повышении ее диагностической эффективности.

По результатам сравнительного анализа тест-систем «STAPHYtest-8» и «STAPHYtest-16» (рис. 3) в отношении отдельных видов стафилококков констатировалось значительное повышение точности идентификации. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что совершенствование панели для идентификации стафилококков от «STAPHYtest-8» к «STAPHYtest-16» представляет собой пример удачной модификации.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

1 6 11 16 21 26 31 36 i 6 II 16 21 26 31 36

А Б

Рис.3. Эффективность идентификации отдельных видов стафилококков с использованием тест-систем «STAPHYtest-8» (А) и «STAPHYtest-16» (Б). Обозначения: светлая часть столбцов- правильная идентификация; темная часть -неправильная идентификация (по оси ординат - % от общего количества изученных штаммов определенного вида, по оси абсцисс - идентифицируемые виды

стафилококков).

Таким образом, у пяти сравниваемых коммерческих тест-систем для идентификации стафилококков была продемонстрирована различная диагностическая эффективность, связанная с количеством используемых в них дифференцирующих тестов. В этой связи на следующем этапе работы с целью анализа причин, определивших границы идентификационных возможностей сравниваемых тест-систем, был осуществлен анализ информативности входящих в них идентификационных тестов, а также отклонений в их интерпретации от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи».

При проведении подобного исследования информативность (I) каждого из конвенциальных таксономически значимых признаков стафилококков была рассчитана и выражена в числовой форме («мера Кульбака»), каковая оказалась максимальной для признака образования кислоты в аэробных условиях из ман-нозы (1=30,08), а минимальной - для способности к росту в аэробных условиях (1=0,001). При этом в группе из 44 конвенциональных тестов, используемых для целей межвидовой дифференциации стафилококков, были выявлены 20 признаков с максимальной информативностью (1>20), в наибольшей степени пригодные для решения соответствующих задач (рис. 4).

Рисунок 4. Информативность признаков.

В состав системы ПБДС входили тесты с достаточно низкой информативностью, что привело к относительно невысокой суммарной информативности данной тест-системы (21=346,40).

Входящие в состав панели «8ТАРНУ1е51-8» тесты имели достаточно высокую информативность, однако их небольшое количество определило суммарную информативность всей тест-системы на уровне всего 1)1=171,68.

На этом фоне суммарная информативность тест-системы «БТАРШЧев!-16» составила уже £1=402,31,

Суммарная информативность системы АР1-81арЬ (11=365,95) оказалась выше чем у ПБДС, но ниже чем у «БТАРН^ЧевЫб», что соответствует указанным выше невысоким значениям ее диагностической эффективности.

В состав панели 32ГО входили уже 25 тестов, основная масса которых является высокоинформативными, что среди сравниваемых тест-систем позволяет констатировать ее наибольшую суммарную информативность (£1=507,06).

Таким образом, проведенный анализ позволил сделать предположение о связи диагностической эффективности тест-системы с суммарной информативностью входящих в нее дифференцирующих тестов.

Дополнительной причиной возникновения диагностических ошибок, выявленной при проведении настоящего исследования, явились отклонения в интерпретации результатов дифференцирующих тестов от значений, приведенных в 9-м издании «Определителе бактерий Берджи». При этом наибольшее количество подобных отклонений обнаружено у тест-системы 32Ш (105 значений), а наименьшее - у ПБДС (14 значений).

Найденное на этой основе уравнение множественной регрессии (рис.5) имело вид ДЭ=0,8536* (11%) - 0,17*(%отк)+2,9863 и при оценке вклада каждой переменной в уравнении на ДЭ было выявлено, что диагностическая эффективность изученных тест-систем для идентификации стафилококков на 75% определяется суммарной информативностью входящих в них дифференцирующих тестов, а на 20% - отсутствием отклонений от значений, приведенных в

«Определителе бактерий Берджи». В целом же анализ выявленных зависимостей позволил констатировать, что от современных коммерческих тест-систем с ограниченным количеством идентификационных тестов ожидать диагностической точности на уровне 95-99% вряд ли представляется возможным.

Рис 5. Графическое выражение зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее тестов и процента отклонений от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи».

В то же время, в условиях увеличения перечня идентифицируемых видов стафилококков, постоянный мониторинг информативности тестов, используемых для их межвидовой дифференциации, может стать эффективным инструментом для определения оптимального перечня тестов, позволяющим при минимизации затрат получить максимально возможный диагностический эффект.

Пятая глава посвящена апробации «Универсальной компьютерной программы для идентификации микроорганизмов» на примере оценки показателей видового биологического разнообразия стафилококков в природных экосистемах. При этом основной акцент был сделан на анализе биоразнообразия стафилококков в воздушной среде и организме бактерионосителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

Для видовой идентификации данных стафилококков у них определяли наличие/отсутствие от 16 до 20 конвенциональных таксономически значимых биологических и биохимических характеристик, интегрально оцениваемых с использованием разработанной «Универсальной компьютерной программы для видовой идентификации стафилококков». Всего с использованием данной программы выявлены представители 20 из 36 доступных для идентификации видов стафилококков

Результаты бактериологического исследования атмосферного воздуха позволили констатировать стабильное присутствие представителей рода Staphylococcus, обнаруживаемых в 70,3±7,9% исследованных проб. Список идентифицированных видов преимущественно был представлен коагулазоотрицатель-ными стафилококками животного происхождения. Однако, в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности регистрировалось существенное расширение перечня определяемых видов, что нашло свое отражение в соответствующих сдвигах числовых индексов, описывающих биологическое разнообразие стафилококков (таблица). При этом использование индекса Симпсона, оценивающего в первую очередь доминирующие виды, не позволило выявить достоверных отличий между обследованной и фоновой зонами: С=0,735±0,029 и С=0,720±0,018 соответственно (Р>0,05). С другой стороны, расчет индекса Шеннона, придающего больший вес редким видам и лучше подходящего для целей сравнения в тех случаях, когда исследователя не интересуют компоненты разнообразия по отдельности, позволил констатировать достоверный рост видового биологического разнообразия стафилококков в атмосферном воздухе населенных пунктов, находящихся в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности (Н=0,770±0,031) по сравнению с фоновой зоной (Н=0,609±0,025; Р<0,05).

Таблица. Индексы видового биологического разнообразия в популяциях стафилококков, изолированных в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности и фоновой зоне

Источники выделения стафилококков Индекс разнообразия Симпсона (С) Индекс разнообразия Шеннона (Н)

Атмосферный воздух фоновой зоны (п=60) Атмосферный воздух обследуемой зоны (ч=72) 0,720±0,018 0,735±0,029 0,609±0,025 0,770±0,031»

Бактерионосители, проживающие в фоновой зоне (п=58) Бактерионосители, проживающие в обследуемой зоне (п=136) 0,659*0,020 0,663±0,019 0,521 ±0,023 0,619±0,021*

Обозначения: * - Р<0,05 при сравнении обследуемой и фоновой зон

Изучение состава отделяемого от бактерионосителей свидетельствовало о том, что от одного обследованного преимущественно изолировалось не более чем один вид стафилококка, причем каждый вид занимает прежде всего свободную и неперекрывающуюся с другими нишу. Данное обстоятельство может объясняться существованием выраженной межвидовой конкуренции (Нобл У.К., 1986), что обычно отражается в отборе ограниченного количества видов, наиболее адаптированных к складывающимся условиям существования.

При сравнении видового биологического разнообразия стафилококков в зоне влияния крупного предприятия газовой промышленности и фоновой зоне проведенное исследование и в этом случае позволило констатировать существование достоверных различий (таблица 1). При этом вновь при отсутствии значимых изменений индекса разнообразия Симпсона (0,663±0,019 в обследуемой и 0,659±0,020 в фоновой зонах; Р>0,05), значения индекса разнообразия Шеннона, имели тенденцию к увеличению в обследуемой зоне (0,619±0,021) по отношению к фону (0,521±0,023;Р<0,05).

Таким образом, проведенная оценка видового биологического разнообразия стафилококков, изолируемых из атмосферного воздуха и от бактерионосителей, позволила сделать выводы о направленности сдвигов данного показателя в экологически скомпрометированных зонах. При этом одним из последствий техногенного химического воздействия оказалось не снижение (как это типично для более сложных сообществ), а рост видового биологического разнообразия потенциально патогенных микроорганизмов в организме человека и объектах окружающей среды.

Основные результаты и выводы:

1. Обосновано применение метода кластерного анализа для целей идентификации сложных биологических объектов на примере решения задачи видовой идентификации микроорганизмов рода Staphylococcus.

2. На основе процедуры кластерного анализа разработан алгоритм и создана универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов, основными преимуществами которой перед существующими аналогами являются возможность получения требуемого результата при любой комбинации идентификационных тестов, а также совместимость с выпускаемыми для этой цели диагностическими тест-системами.

3. С использованием универсальной компьютерной программы для идентификации микроорганизмов оценена диагностическая эффективность наиболее широко распространенных тест-систем для идентификации стафилококков, составившая для: ПБДС (Россия) - 57,14±1,06%, «STAPHYtest-8» (Чехия) -44,83±5,33%, «STAPHYtest-16» (Чехия) - 73,83±3,6%, API-Staph (Франция) -58,33±5,03 % и 1D32 (Франция) - 85,0±6,87%.

4. Показано, что диа! ностическая эффективность изученных тест-систем пропорциональна суммарной информативности входящих в них идентификационных тестов, что может быть использовано для обоснования оптимальных комбинаций последних. Определены направления создания новых и совершенствования существующих тест-систем для видовой идентификации стафило-

кокков на основе отбора комплекса тестов с наибольшей диагностической информативностью.

5. Установлено увеличение показателей видового разнообразия представителей рода Staphylococcus, регистрируемого как в организме бактерионосителей, так и в атмосферном воздухе в условиях техногенного химического воздействия на экосистему. Доказана возможность использования показателя видового биоразнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды при проведении микробиологического мониторинга природных экосистем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Фот Н.П. Идентификация сложных биологических объектов (на примере рода Staphylococcus) // Материалы III региональной научно-практической конференции областного благотворительного фонда памяти Д.Соловых - Оренбург: ОГМА, 2000.-С.59.

2. Фот Н.П. Возможность использования статистических методов при идентификации стафилококков // Материалы Международной юбилейной научно-практической конференции «Учебная научно-производственная инновационная деятельность высшей школы в современных условиях». - Оренбург: ИПК ОГУ,

2001,- С.60.

3. Фот Н.П., Бравичева О.С. Видовая идентификация микроорганизмов рода стафилококков с применением методов кластер-анализа // Вестник ОГУ,

2002, №3,- С. 132-135.

4. Дерябин Д.Г., Фот Н.П. Использование универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков для сравнения эффективности тест-систем «STAPHYtest-8» и «STAPHYtest-16» (Lachema, Чехия) // Вестник ОГУ, 2003, №1-С.41-45.

5. Дерябин Д.Г., Фот Н.П. Сравнение диагностической эффективности трех тест-систем для идентификации стафилококков: ПБДС (Россия), STAPHYtest-16 (Чехия) и API-Staph (Франция) // Клиническая лабораторная диагностика,

2004, № 4. - С41-45;

6. Дерябин Д.Г., Фот Н.П. Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов: принципы создания и опыт практического использования // Материалы Всероссйской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век». - Саратов: СГУ, 2004. - С. 76-78;

7. Дерябин Д.Г., Фот Н.П., Бравичева О.С. Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов (свидетельство о регистрации Российского агентства по патентам и товарным знакам от 2 февраля 2004г. №2004610330).

Лицензия № ЛР 020716 от 02.11.98.

Подписано в печать 14.04.05 Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 233.

Отпечатано в Оренбургском государственном университете. 460352, г. Оренбург, ГСП, пр. Победы, 13., ИПК ОГУ

РНБ Русский фонд

2005-4 45885

19 m и 2005

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Фот, Наталия Павловна

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Видовая идентификация микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты

1.1 Современные представления о таксономии и номенклатур 8 микроорганизмов (на примере представителей род Staphylococcus) и методы их видовой идентификации.

1.2 Вероятностно-статистические методы, применяемые для 13 целей межвидовой дифференциации микроорганизмов.

1.3 Практические аспекты видовой идентификации 29 микроорганизмов при оценке биологического разнообразия природных экосистем.

Глава 2 Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования - микроорганизмы рода 37 Staphylococcus и методы их выделения.

2.2 Методы видовой идентификации стафилококков

2.3 Методы математического анализа и программирования.

Глава 3 Обоснование использования метода кластерного анализа для целей межвидовой дифференциации и его использование при разработке "Универсальной программы для видовой идентификации микроорганизмов".

3.1 Сравнительный анализ результатов дифференциации, 51 полученных методами корреляционного, дискриминантного анализа и кластерного анализа.

3.2 Использование метода кластерного анализа при 57 разработке «Универсальной программы для видовой идентификации микроорганизмов».

Глава 4 Анализ диагностической эффективности различных тестсистем с использованием разработанной универсальной компьютерной программы для видовой идентификации стафилококков.

4.1 Анализ диагностической эффективности тест-системы 70 ПБДС (пластина биохимическая дифференцирующая стафилококки), производимой НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород, Россия).

4.2 Анализ диагностической эффективности тест-систем для 73 идентификации стафилококков «8ТАРНУ1ез1:-8» и

4.3 Анализ диагностической эффективности тест-систем API- 81 Staph и ID32(«bioMerieux», Франция).

Глава 5 Оценка биологического разнообразия стафилококков для 88 оценки техногенного воздействия на природные экосистемы.

STAPHYtest-16» (Lachema, Чехия).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка статистического метода видовой идентификации микроорганизмов на примере представителей рода STAPHYLOCOCCUS"

Актуальность проблемы. Оценка видового биологического разнообразия в настоящее время стала одним из традиционных методов оценки состояния природных экосистем и экологического мониторинга [34]. В наибольшей степени подобный подход разработан применительно к сложным многоклеточным биообъектам (животным, растениям, насекомым и др.), для большинства которых показано снижение показателей видового биологического разнообразия при увеличении антропогенной нагрузки на экосистему [31]. Применительно же к представителям микромира представления о биологическом разнообразии разработаны в значительно меньшей степени [36], что определяется сложностями проведения корректной видовой идентификации.

В полной мере подобное утверждение может быть отнесено и к имеющим важное экологическое и биоиндикационное значение микроорганизмам рода Staphylococcus, в номенклатуре и таксономии которых в 80-90-х годах XX века произошли принципиальные изменения [13]. В результате для решения данной задачи предложено множество миниатюризированных тест-систем для биохимической идентификации с визуальным или автоматизированным учетом результатов и определением вида микроорганизма по прилагаемым каталогам кодов,или с использованием специализированных компьютерных программ [38].

Однако, существенным недостатком разработанных на сегодняшний день методов является все еще невысокая достоверность результатов идентификации, определяемая особенностями используемых математических алгоритмов с невозможностью получения диагностических заключений при произвольной комбинации идентификационных тестов. В этой связи актуальным представляется разработка универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков, позволяющей максимально оптимизировать данную процедуру и тем самым, создать условия для качественной оценки присутствия данных микроорганизмов в организме человека и объектах внешней среды.

Цель работы; Применение вероятностно-статистических методов обработки данных при решении задач идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus.

Задачи исследования:

1) Обосновать оптимальный многомерный статистический метод, пригодный для целей видовой идентификации микроорганизмов с последующей разработкой компьютерной программы, унифицирующей и автоматизирующей данную процедуру на примере представителей рода Staphylococcus.

2) Использовать разработанную программу для анализа диагностической эффективности различных тест-систем для видовой идентификации стафилококков с определением причин возникновения возможных диагностических ошибок.

3) Оценить видовое биологическое разнообразие санитарно-показательных микроорганизмов рода Stapylococcus в воздушной среде и организме носителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

Научная новизна. Обоснован оптимальный вероятностно-статистический метод дифференциации сложных биологических объектов, основанный на использовании процедуры кластерного анализа. Продемонстрированы преимущества подобного подхода перед применяемыми в настоящее время вероятностно-статистическими методами, заключающиеся в высокой точности показателей идентификации, а также мобильности процедуры при введении новых дифференцирующих тестов или расширении перечня идентифицируемых видов.

Впервые проведен анализ диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков и охарактеризованы две основные причины возникновения диагностических ошибок. На основании проведенных исследований получены новые данные о зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее дифференцирующих тестов, а также отклонений от значений конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берджи» [29].

Получены новые данные об увеличении видового биологического разнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды в условиях техногенного химического воздействия на экосистему, преимущественно связанные с расширением перечня определяемых видов и, тем самым, для своей оценки требующие использования индекса разнообразия Шеннона.

Практическая значимость. Разработана, апробирована и внедрена в работу бактериологических лабораторий «Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов» (свидетельство о регистрации № 2004610330 от 2 февраля 2004г.), позволяющая автоматизировать и унифицировать процесс интерпретации биохимических идентификационных тестов. Основным отличием данной программы от существующих аналогов является то, что она представляет из себя «открытую систему», позволяющую получить правильное диагностическое заключение при любой комбинации дифференцирующих тестов, как входящих в состав коммерческих идентификационных систем, так и выполняемых непосредственно пользователем.

Определены направления создания новых и совершенствования существующих тест-систем для видовой идентификации стафилококков на основе отбора комплекса тестов с наибольшей диагностической информативностью.

Продемонстрирована возможность использования показателя видового биоразнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды при проведении микробиологического мониторинга природных экосистем в условиях их техногенного химического загрязнения.

Положения, выносимые на защиту;

1. Применение методов кластерного анализа для целей идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus.

2. Сравнение диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков.

3. Использование показателей видового биологического разнообразия стафилококков при проведении экологического мониторинга.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х всероссийских и региональных научно-практических конференциях, экспонировались на Второй Приволжской Ярмарке «Российским инновациям - Российский капитал» и IX выставке - конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции», отмечены дипломом за разработку «Универсальной компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов». По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах и 2 тезисов докладов в материалах конференций, получено свидетельство о регистрации разработанного программного продукта.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 страницах и состоит из введения, пяти глав, заключения, двух приложений и списка использованной литературы, включающего 104 публикации отечественных и зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 6 таблицами и 19 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Фот, Наталия Павловна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Оценка видового биологического разнообразия в настоящее время стала одним из традиционных методов оценки состояния природных экосистем и экологического мониторинга [34]. В наибольшей степени подобный подход разработан применительно к сложным многоклеточным биообъектам (животным, растениям, насекомым и др.), для большинства которых показано снижение показателей видового биологического разнообразия при увеличении антропогенной нагрузки на экосистему [31]. Применительно же к представителям микромира представления о биологическом разнообразии разработаны в значительно меньшей степени [36], что определяется сложностями проведения корректной видовой идентификации.

Для решения данной задачи предложено множество миниатюризированных тест-систем для биохимической идентификации с визуальным или автоматизированным учетом результатов и определением вида микроорганизма по прилагаемым каталогам кодов или с использованием специализированных компьютерных программ [38].

Однако, существенным недостатком разработанных на сегодняшний день методов является невысокая достоверность результатов идентификации, определяемая особенностями используемых математических алгоритмов с невозможностью получения диагностических заключений при произвольной комбинации идентификационных тестов. В этой связи актуальным представляется разработка универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков, позволяющей максимально оптимизировать данную процедуру и тем самым, создать условия для качественной оценки присутствия данных микроорганизмов в организме человека и объектах внешней среды.

Оценка биологического разнообразия микроорганизмов в настоящее представляется одним из достаточно перспективных методов изучения состояния природных экосистем. Однако, несовершенство методов видовой идентификации микроорганизмов делает этот аспект оценки биоразнообразия наименее изученным. В этом контексте разработка вероятностно-статистических подходов к решению задачи видовой идентификации микроорганизмов становится одним из необходимых условий для проведения подобных экологических исследований.

Новый взгляд на видовое разнообразие стафилококков потребовал разработки новых методов их дифференциации, так как используемые до этого подходы, основанные на применение одного-двух высокоинформативных тестов, оказались полностью неприемлемы. Кроме того, среди всего спектра известных таксономически значимых фенотипических признаков отсутствуют такие, которые на основании положительного или отрицательного результата только одного теста позволяли бы с достаточной точностью дифференцировать какой-либо один вид стафилококков от всех остальных. Решение данной проблемы оказывается возможным только при использовании достаточно широкого комплекса идентифицирующих тестов.

Причины возникновения диагностических ошибок, как показала практика, связаны со многими факторами, основными из которых являются:

1) низкое качество используемых реагентов и несовершенство технологий, не позволяющее получать стабильные и воспроизводимые результаты. Данная проблема была наиболее актуальной на первых этапах становления методологии видовой идентификации микроорганизмов (Dowell, У.Я, СаЬгп-НапБеп В.) и к настоящему времени в основном решена;

2) недостаточное количество используемых тестов, неадекватное количеству идентифицируемых видов. Для решения этой проблемы количество одновременно используемых тестов в современных идентификационных системах увеличено до более чем 20 [63-68]. Однако, частично названная проблема существует и в настоящее время - ни одна из известных тест - систем не позволяет идентифицировать все описанные к настоящему времени виды стафилококков: для этого пришлось бы еще более увеличить количество определяемых параметров, что неизбежно отразится на стоимости проводимого исследования. Разумным компромиссом в этом плане представляется разработка и создание неких "оптимальных" тест -систем, ориентированных на использование в медицинской или ветеринарной практике с акцентом для выявления потенциально патогенных для человека или животных видов стафилококков;

3) взвешенный учет результатов комплекса идентификационных тестов, каждый из которых считается независимым и равнозначным для определения видовой принадлежности микроорганизма. На разных этапах предлагалось решать эту задачу на основании дихотомических схем, каталога кодов или компьютерных программ с указанием вероятности формулируемого диагностического заключения [11,25,26,38]. Однако, резко возросшее количество самих видов микроорганизмов, так и используемых для их идентификации тестов на сегодняшний день требует привлечения использования специальных методов математического анализа.

В условиях многоальтернативной дифференциации вероятностный характер признаков определил необходимость использования вероятностно-статистических подходов к дифференциации видов микроорганизмов, которые были положены в основу существующих методов идентификации.

Относительно простые математико-статистические вычисления посредством таблиц и простых арифметических действий, лежащие в основе многих дифференцирующих методов, привело к их всестороннему использованию, одними из самых распространенных которых являются: метод определения ошибок, предложенный Нечмеревым, метод диагностических порогов, разработанный Генкиным, а таюке методы нумерической таксономии [20]. Однако, несмотря на свое широкое применение данные методы обладают рядом существенным недостатков: отсутствие мобильности при увеличении перечня дифференцирующих признаков и снижение тем самым достоверности получаемых результатов, а также «закрытость систем», не позволяющая получать требуемый результат при использовании любой комбинации конвенциональных таксономически значимых тестов.

С этих позиций представляется возможным использование современных математических методов многомерного статистического анализа, с привлечением специализированных статистических программных модулей. Наиболее перспективными для решения поставленной задачи были выбраны методы корреляционного, дискриминантного и кластерного анализов.

Анализ адекватности применения каждого из данных методов на примере решения задачи дифференциации 36 видов и подвидов стафилококков, показал, что наиболее перспективным для решения задачи дифференциации сложных биологических объектов является методика кластерного анализа, и это послужило обоснованием для его дальнейшего использования при разработке компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов.

Разработанная в системе программирования Delphi программа, позволяющая автоматизировать идентификацию неизвестного вида стафилококка, реализует многомерный статистический подход к решению задачи видовой идентификации микроорганизмов на основе учета комплекса их таксономически значимых биологических характеристик.

Данный программный комплекс позволяет автоматизировать идентификацию неизвестного вида стафилококка, где на «входе» задачи располагают классифицируемыми данными и для решения задачи обращаются к методам кластер-анализа. При этом производилось вычисление наибольшей близости каждого из вновь анализируемых объектов (штаммов) с определенным видом стафилококка с известными таксономическими характеристиками, сформированными на основе данных об описанных в международном определителе Берджи [Берджи] видах и подвидах микроорганизмов.

Существующие аналоги компьютерных программ дл идентификации микроорганизмов, такие как API - Staph и StaphyTest, включают меньшее количество дифференцирующих признаков (у API - Staph - 20, у Staphytest -18) и представляют собой «закрытую систему», то есть отсутствует возможность использования любой комбинации таксономически значимых тестов, что является их главным отличием от разработанной универсальной компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов [57-65, 72-83]. При этом исследование диагностической эффективности программы на примере 23 эталонных и 150 клинических штаммов стафилококков, предварительно идентифицированных до вида референс-методом в соответствии с «Определителем бактерий Берджи» (1997), свидетельствовало о не менее чем 95% точности при вероятности идентификации каждого штамма на уровне не менее 85%.

Выявленные преимущества разработанного комплекса позволили применить его при оценке диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков и охарактеризовать основные причины возникновения диагностических ошибок. На основании проведенных исследований получены новые данные о зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее дифференцирующих тестов, а также отклонений от значений конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берджи». При оценке эффективности сравниваемых тест-систем в ряде случаев создавался «виртуальный образ штамма», характеризуемый наличием или отсутствием анализируемых таксономически значимых конвенциональных характеристик, для чего использовалась разработанная «Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации стафилококков».

При выполнении данного раздела работы были изучены пять наиболее широко представленных на российском рынке тест-систем: ПБДС (пластина биохимическая дифференцирующая стафилококки), производимая НПО «Диагностические системы» (Россия), «STAPHYtest-8» и «STAPHYtest-16» (Lachema, Чехия), а также API-Staph и ГО32 («bioMerieux», Франция).

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы ПБДС, позволили констатировать совпадение с результатами, полученными с использованием референс-метода в 57,14±1,06 % случаев. При этом причины неправильной видовой идентификации стафилококков при использовании тест-системы ПБДС были сведены к двум основным моментам. Ошибки первого рода были связаны с тем, что диагностические возможности данной тест-системы принципиально не позволяли получить верное заключение, так как она изначально предусматривала возможность идентификации только 19 из 36 известных видов и подвидов стафилококков (14,34±0,98 % от общего количества диагностических заключений). Ошибки второго рода определялись тем, что несмотря на заявлённые диагностические возможности тест-системы как достаточные для идентификации определенного спектра видов стафилококков, полученный результат все же оказывался неверным. На долю последней причины приходилось более половины всех ошибочных результатов идентификации и 28,52±1,27 % от общего количества полученных диагностических заключений.

Проведенные исследования позволили констатировать, что результаты идентификации стафилококков по трехзначному цифровому коду, предусмотренному при использовании диагностической тест-системы «8ТАРНУ1е51-8», совпали с результатами, полученными с использованием референс-метода, лишь в 44,83±5,33% случаев.

Совершенствование данной системы с удвоением перечня идентифицирующих тестов («8ТАРН У1ез1-16») результировалось в значительном повышении ее диагностической эффективности, выразившемся в совпадении с результатами, полученными с использованием универсальной компьютерной программы, в 73,83±3,6% случаев.

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы АР1-8СарЬ, позволили констатировать совпадение с результатами, полученными с использованием референс-метода только в 58,33±5,05% случаев.

Результаты идентификации изученной выборки стафилококков по совокупности тестов, предусмотренных при использовании системы 32 ГО, совпали с результатами, полученными с использованием референс-метода в 85,0±6,87% случаев, что является самым высоким показателем из всех исследованных тест-систем.

Таким образом, у пяти сравниваемых коммерческих тест-систем для идентификации стафилококков была продемонстрирована различная диагностическая эффективность. В этой связи был осуществлен анализ информативности входящих в них идентификационных тестов, а также отклонений в их интерпретации от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи».

Информативность каждого из конвенциальных таксономически значимых признаков стафилококков была расчитана и выражена в числовой форме. При этом в группе из 44 конвенциональных тестов, используемых для целей межвидовой дифференциации стафилококков, были выявлены 20 признаков с максимальной информативностью (1>20), в наибольшей степени пригодные для решения соответствующих задач.

В состав системы ПБДС входили тесты с достаточно низкой информативностью что привело к относительно невысокой суммарной информативности данной тест-системы (£1=346,40) и результировалось в ее минимальной диагностической эффективности.

Входящие в состав панели «БТАТЧ^ПЛез^» тесты имели достаточно высокую информативность, однако их небольшое количество определило суммарную информативность всей тест-системы на уровне всего £1=171,68, что также результировалось в ее невысокой диагностической эффективности.

На этом фоне суммарная информативность тест-системы «БТАРНУЧея!:-16» составила уже £1=402,31.

Суммарная информативность системы АР1-81ар11 (£1=365,95) оказалась выше чем у ПБДС, но ниже чем у «8ТАРНУ1езИ6», что соответствует указанным выше промежуточным значениям ее диагностической эффективности.

В состав панели 32ГО входили уже 25 тестов, основная масса которых является высокоинформативными, что среди сравниваемых тест-систем позволяет констатировать ее наибольшую суммарную информативность (£1=507,06) и соответствующую ей диагностическую эффективность.

Проведенный анализ позволил сделать предположение о связи диагностической эффективности тест-системы с суммарной информативностью входящих в нее дифференцирующих тестов, каковая была выражена логарифмической зависимостью вида ДЭ=90,99^(£1%)-88,23; где ДЭ - диагностическая эффективность (в %), И% - суммарная информативность диагностической панели в процентах от суммарной информативности всех 44 конвенциональных тестов.

Дополнительной причиной возникновения диагностических ошибок, выявленной при проведении настоящего исследования, явились отклонения в интерпретации результатов дифференцирующих тестов от таковых, приведенных в «Определителе бактерий Берджи». При этом наибольшее количество подобных отклонений, обнаружено у тест-системы 32ГО (105 значений), а наименьшее у ПБДС (14 значений).

Найденное на этой основе уравнение множественной регрессии имело вид: ДЭ=0,8536*(П%)+0,17*(%отк)+2,9863, где ДЭ - диагностическая эффективность (в %); %отк - процент отклонений от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи», и при расчете через коэффициент детерминации свидетельствовало о том, что диагностическая эффективность изученных тест-систем для идентификации стафилококков на 75% определяется суммарной информативностью входящих в них дифференцирующих тестов, а на 20% - осутствием отклонений от значений, приведенных в «Определителе бактерий Берджи».

Разработанный программный комплекс был использован при оценке показателей видового биологического разнообразия стафилококков в природных экосистемах. При этом основной акцент был сделан на анализе биоразнообразия стафилококков в воздушной среде и организме бактерионосителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

С использованием данной программы выявлены представители 20 из 36 доступных для идентификации видов стафилококков.

Результаты бактериологического исследования атмосферного воздуха и анализ мазков-отпечатков, выделенных от бактерионосителей позволили констатировать стабильное присутствие представителей рода Staphylococcus, обнаруживаемых в 70,3±7,9% исследованных проб в первом случае и в 68,0±3,3% во втором. В зоне влияния крупного объекта газовой промышленности регистрировалось существенное расширение перечня определяемых видов, что нашло свое отражение в соответствующих сдвигах числовых индексов, описывающих биологическое разнообразие стафилококков. В данном случае использование индекса Симпсона, оценивающего в первую очередь доминирующие виды, не позволило выявить достоверных отличий между обследованной и фоновой зонами. С другой стороны, расчет индекса Шеннона, придающего больший вес редким видам и лучше подходящего для целей сравнения в тех случаях, когда исследователя не интересуют компоненты разнообразия по отдельности, позволил констатировать достоверный рост видового биологического разнообразия стафилококков в атмосферном воздухе населенных пунктов и выделенных от бактерионосителей, находящихся в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.

Проведенная оценка видового биологического разнообразия стафилококков, изолируемых из атмосферного воздуха и от бактерионосителей, в первом приближении позволила сделать выводы о направленности сдвигов данного показателя в экологически скомпрометированных зонах. При этом одним из последствий техногенного химического воздействия оказалось не снижение (как это типично для более сложных сообществ), но рост видового биологического разнообразия потенциально патогенных микроорганизмов в организме человека и объектах окружающей среды. Прикладные же аспекты обнаруженного феномена могут быть связаны как с возможностью углубленной оценки последствий воздействия экотоксикантов, так и с разработкой новых подходов к биоиндикации техногенного воздействия на экосистемы.

105

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Фот, Наталия Павловна, Москва

1. Алещенко Г.М, Букварева E.H. Некоторые вопросы моделирования разнообразия в биологических системах различных типов / Журн. общ. биологии. -Т.Ш. - Выпуск 6. - 1991 г. -С. 803 - 811.;

2. Акатов А.К., Зуева B.C. Стафилококки. М.: Медицина, 1983 г.;

3. Андерсон Т. Введение в многомерный статистический анализ. // М., Физматгиз, 1963 г;

4. Айвазян С.А., Мхитарян B.C. Прикладная статистика и основы эконометрики, Москва: ЮНИТИ, 1998 г.;

5. Букварева E.H., Алещенко Г.М. Задача оптимизации взаимодействия человека и живой природы и стратегия сохранения биоразнообразия// Журнал общей биологии. Т.114. - Вып. 2.- 1994. -С.133- 143.;

6. Бухарин О.В., Гриценко В.А., Дерябин Д.Г. Место внутривидового фенотипического разнообразия в экологии Escherichia coli и Staphylococcus aureus// Вестник Российской академии медицинских наук: М.- Медицина. 1997 г. №3. стр. 34-40;

7. Бухарин О.В., Дерябин Д.Г., Немцева Н.В. Стафилококковая обсемененность слизистых верхних дыхательных путей в различных условиях загрязнения атмосферного воздуха // Гигиена и санитария -1996. №6. - С.6-8.;

8. Буч Г. Объектно-ориентированный анализ и проектирование с примерами приложений на С++. 2-е изд.: Пер. с англ. М.: Издательство Бином, СПб.: Невский диалект, 1999 г.;

9. Власенко М.А. Идентификация стафилококков с помощью тест-системы однократного использования //Биотехнология и генетика// Нижегородский государственный университет. Нижний Новгород,1991.-С.45-49;

10. Ю.Гапочко К.Г., Мисников О.П., Раевский К.К. Средства и методы изучения микробных аэрозолей. Д.: Медицина, 1985.;

11. П.Генкин A.A. Отнесение наблюдений к одному из двух возможных классов// Диагностика и прогнозирование- 2000. №3. - С.51-54.;

12. Голубець М.А., Царик И.В. Стабильность и устойчивость важные функциональные особенности // Проблемы устойчивости биологических систем. - М.: Наука, 1992. -С. 32-40.;

13. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - 239с.;

14. Дубров A.M., Мхитарян B.C., Трошин Л.И. Многомерные статистические методы Москва: "Финансы и статистика", 2000 г.;

15. Емельянов И.Г. Разнообразие и устойчивость биосистем // Успехи современной биологии. 1994. - Т.115, Вып. 3. - С. 304 - 316.;

16. Животовский JI. А. Показатель внутрипопуляционного разнообразия // Журн. общей биологии. 1980. - Т. XLI, №6 .- С.828 - 836.;

17. Кабалова JI.A., Гореленкова H.A., Виноградова JI.A. Показатели неспецифической сопротивляемости организма в оценке состояния здоровья детей, проживающих в условиях различной техногенной нагрузки // Гиг. и сан. 1995. - №1. - С.22-25.;

18. Калинина В.Н., Колемаев В.А. Теория вероятностей и математическая статистика-М.: «Инфра-М», 1999 г.;

19. Ковалева Е. П. Теоретическое обоснование снижения инфекционной заболеваемости // Эпидемиология и инфекционные болезни. №3, 1998 г. - С. 4-8.;

20. Кульбак С. Теория информации и статистика. М.: Наука, 1967.;

21. Лопатин И. К. Разнообразие животного мира: прошлое, настоящее, проблемы сохранения // Соросовский образовательный журнал. 1997г. - №7. - С. 18- 24.;

22. Мамкаев Ю.В. Морфологические принципы систематизации биоразнообразия //Журн. общей биологии. Т.57. - №2. - 1996. - С.40 -51.;

23. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Staphylococcus.-MocKBa, 1990;

24. Митрохин С.Д. Значимость микробиологической лаборатории в современной системе инфекционного контроля многопрофильного стационара // Consilium medicum. 2002. - Т.4. - №1. - С.42-45.;

25. Нечмирев А.Б., Нечмирева Т.С. "Надежность и эффективность дифференциации микроорганизмов// ЖМЭИ. 1989. - № 3. - С.26-29;;

26. Нечмирев А.Б. Вероятностно-статистический подход к дифференциации родов энтеробактерий // ЖМЭИ. 1989. - № 4. - С.26-29.;

27. Нобл У.К. Микробиология кожи человека / Пер. с англ. -М. Медицина, 1986.

28. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер с англ. / Под ред. Дж.Хоума, Н.Крига, П.Снита и др. М.: Мир, 1997.;

29. Одум Ю. Основы экологии. М.: Мир, 1975 г. - 740 е.;

30. Одум Ю. Экология. М., 1986. - 376 е.;

31. Пинигин М.А. Гигиенические основы оценки степени загрязнения атмосферного воздуха // Гигиена и санитария 1993. - №7. - С.4-8.;

32. Практикум по эконометрике // Под. Редакцией Елисеевой И.И., М.: Финансы и Статистика, 21

33. Пузаченко Ю.Г. Биологическое разнообразие, устойчивость и функционирование / Проблемы устойчивости биологических систем. -М., 1992. С. 5 - 32.;

34. Пузаченко Ю.Д., Пузаченко А.Ю. Семантические аспекты биоразнообразия // Журн. общей биологии. Т.57. - №1 ~ 1996. -С. 543.;

35. Савилов Е.Д. Устойчивость эпидемического процесса с позиций биологической системы // Вести. РАМН. N8. - 1997. -С. 29-32. ;

36. Савицкая К.Н., Черненькая Т.В. Использование микротест систем для идентификации изолированных клинических штаммов// Клиническая лабораторная диагностика. 1996 - №5 - с.29-35;

37. Скала Л.З., Сидоренко C.B., Нехорошева А.Г., Резван С.П., Карп В.П. Практические аспекты современной клинической микробиологии. М.: Лабинформ, 1997.;

38. Смирнова A.M., Трояшкин A.A., Падерина Е.М. Микробиология и профилактика стафилококковых инфекций; Ленинград Медицина, 1977 г ■

39. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования /Под. Ред. М.О. Биргера. М.,1982г.;

40. Тарасов В.Н. Аэромикробиология (экологические и эпидемиологические аспекты). М.:ВИНИТИ,1987.

41. Черкасский Б.Л. Системный подход в эпидемиологии. М.: Медицина. -1988. - 288с.;

42. Чибилев А.А. Введение в геоэкологию Екатеринбург: институт степи УрОРАН, 1998, 117 с.;

43. Чхартишвили А.Г., Шикин Е.В. Математическме методы и модели в экономике М.:Дело, 2000 г.;

44. Эфрон Б. Нетрадиционные методы многомерного статистического анализа: пер. с англ. М.: Финансы и статистика, 1988;

45. Яблоков А.В., Ларина Н.И. Введение в фонетику популяций новый подход к изучению природных популяций. М.: "Высшая школа", 1985.-159с;

46. Baird-Parker А.С. The classification of staphylococci and micrococci from world-wide sources// J. Gen. Microbiol. 1965.Y. 38, P. 363-387;

47. Buchanan, R.E., and N.E. Gibbons (ed.). 1971. Bergey's manual of determinative bacteriology, 81 h ed. The Williams & Wilkens Co., Baltimore.

48. Burriel A.R. In vivo presence of capsular polysaccharide in coagulase-negative staphylococci of ovine origin// New microbiology, 1998 V/ 21, N.l P.49-54;

49. Burriel A.R., Scott M. Evaluation of the Staph Zym system in the identification of staphylococci isolated from ovine milk and the ewe environment//J. Basic. Microbiology, 1997. Y.37, N.4 P. 245-250;

50. Cato, E.P., L.Y. Holdeman, and W.E.C. Moore. 1982. Clostridium perenne and Clostridium paraperfringens: later subjective synonyms of Clostridium barati. Int. J. Syst. Bacterid. 32:77-81.;

51. Chesneau O., Morvan A., Grimont F. et al Staphylococcus pasteuri sp. nov., isolated from human, animal, and food specimens // Int. J. Syst. Bacteriol.1993. V. 43, P. 237-244;

52. Dowell, V.R., and T.M. Hawkins. 1979. Laboratory methods in anaerobic bacteriology, CDC laboratory manual. DHEW Publication No. (CDC) 798272. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.;

53. Dowell, V.R., and G.L. Lombard. 1977. Presumptive identification of anaerobic nonsporeforming gram-negative bacilli. U.S. Dept. HEW. Pub. Hlth. Service, Center for Disease Control, Atlanta.;

54. Dowell, V.R., G.L. Lombard, F.S. Thompson, and A.Y. Armfield. 1977. media for isolation, characterization, and identification of obligately anaerobic bacteria. U.S. Dept. HEW. Pub. Hlth. Service, Center for Disease Control, Atlanta.;

55. Dybowski, W., and D.A. Franklin. 1968. Conditional probability and the identification of bacteria: a pilot study. J. Gen. Microbiol. 54:215-229.;

56. Edwards, P.R., and W.H. Ewing. 1972. Identification of Enterobacteriaceae, 3rd. ed. Burgess Publishing Co., Minneapolis.;

57. Ewing, W.H. 1974. Differentiation of Enterobacteriaceae by biochemical tests. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Center for Disease Control, Atlanta.;

58. Finegold, S.M., W.E. Shepherd, and E.H. Spaulding. 1977. Cumitech 5: Practical anaerobic bacteriology. Coordinating ed., W.E. Shepherd. American Society for Microbiology, Washington, D.C.;

59. Friedman, R.B., D. Bruce, J. MacLowry, and V. Brenner. 1973. Computerassisted identification of bacteria. Am. J. Clin. Pathol. 60:395-403.;

60. Friedman, R., and J. MacLowry. 1973. Computer identification of bacteria on the basis of their antibiotic susceptibility patterns. Appl. Microhiol. 26:314317.;

61. Gemmell C.G., Dawson J.E. Identification of coagulase-negative staphylococci with the API-Staph system // J.Clin.Microbiol. 1982. - V.16. -N5. - P.874-877.;

62. Grant C.E., Sewell D.L., Pfaller M. Et al. Evaluation of two commercial systems for identification of coagulase-negative staphylococci to species level // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - V.18. -Nl. - P.l-5.;

63. Hajek V., Ludwig W., Schleiferi K. H. et al. Staphylococcus muscae, a new species isolated from flis // Intern. J. Syst. Bacterid., 1992. V.42, P. 97-101;

64. Hansen, S.L. and BJ. Stewart. 1976. Comparison of API and Minitek to Center for Disease Control methods for the biochemical characterization of anaerobes. J. Clin. Microbiol. 4:227-231.;

65. Hansen, S.L. and B.J. Stewart. 1978. Slide catalase. A reliable test for differentiation and presumptive identification of certain clinically significant anaerobes. Am. J. Clin. Pathol. 69:36-40.;

66. Hartman, P.A. 1968. Miniaturized microbiological methods. Academic Press, New York.;

67. Holdeman, L.V., C.P. Cato, and W.E.C. Moore. 1977. Anaerobe laboratory manual, 4th ed. Anaerobe Laboratory, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg.;

68. Holdeman, L.V., and W.E.C. Moore. 1974. S. New Genus, Coprococcus,twelve new species, and amended descriptions of four previously described species of bacteria from human faeces. Int. J. Sys. Bacteriol. 24:260-277.;

69. Holdeman, L.V., W.E.C. Moore, PJ. Churn, and J.L. Johnson. 1982. Bacteroides oris and Bacteroides buccae, new species from human periodontitis and other human infections. Int. J. Syst. Bacteriol. 32:125-131.;

70. Holland, J.W., S.M. Gagnet, S.A. Lewis, and L.R. Stauffer. 1977. Clinical evaluation of a simple rapid procedure for the presumptive identification of anaerobic bacteria. J. Clin. Microbiol. 5:416-426.;

71. Holland, J.W., E.O. Hill, and W.A. Altemeier. 1977. Numbers and types of anaerohic bacteria isolated from clinical specimens since 1960. J. Clin. Microbiol. 5:20-25.;

72. Kloos W. E., Bannerman T. L. Staphilococci and Micrococci // Manual of Clinical Microbiology. Washington DC, 1995. P. 282-298;

73. Lapage, S.P., S. Bascomb, W.R. Willcox, and M.A. Curtis. 1970. Computer identification of bacteria, p. 1-22. In A. Baillie and R.J. Gilbert (ed.), Automation, mechanization and data handling in microbiology. Academic1. Press, London.;

74. Lapage, S.P., S. Bascomb, W.R. Willcox, and M.A. Curtis. 1973. Identification of bacteria by computer: general aspects and perspectives. J. Gen. Microbiol. 77:273-290.;

75. Leadbetter, E.R, S.C. Holt, and S.S. Socransky. 1979. Capnocytophaga: New genus of gram negative gliding bacteria. I. General characteristics, taxonomic considerations and significance. Arch. Microbiol. 122:9-16.;

76. Livingston, S.J., S.D. Kommos, and R.B. Yee. 1978. New medium for selection and presumptive identification of the Bacteroides fragilis group. J. Clin. Microbiol. 7:448-453.;

77. Lombard, G.L. 1977. Characteristics of anaerobic bacteria. U.S. Dept. of Health, Education and Welfare, Center for Disease Control, Atlanta.;

78. Martin, WJ. 1974. Isolation and identification of anaerobic bacteria in the clinical laboratory. A 2-year experience. Mayo Clin. Proc. 49:300-308.;

79. Moeller, V. 1955. Simplified tests for some amino acid decarboxylases and for the arginine dihydrolase system. Acta. Pathol. Microbiol. Scand. 36:158172.;

80. Perl T.M., Rhomberg P.R., Bale M.J. et al. Comparison of identification system for Staphylococcus epidermidis and other coagulase-negative Staphylococcus species // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - V.18. - N3. -P.151-155.;

81. Petras P. AORIDES orientational identification of coagulase-negative staphylococci from human clinical materialu// Epidemiol-Microbiol-Imunol. 1995 March; 44(1): 15-9;

82. Polian D., Zeman J. Discrimination value of test performed with STAPHYtest Lachema from the aspect of clinical microbiology// Cesk. Epidermid., Imunol. 1994-V. 43-p. 26-28;

83. Renneberg J., Rieneck K., Gutschik E. Evaluation of Staph ID 32 system and Staph Zym system for identification of coagulase-negative staphylococci // J-Clinic-Microbiol. 1995 May; 33(5): 1150-3;

84. Salyers, A.A., J.R. Vercellotti, S.E.H. West, and T.D. Wilkins. 1977. Fermentation of mucus and plant polysaccharides by strains of Bacteroides from the human colon. Appl. and Environ. Microbiol. 33:319-322.;

85. Sanders, A.C., J.E. Faber, and T.M. Cook. 1957. A rapid method for the characterization of enteric pathogen using paper discs. Appl. Microbiol. 5:3640.;

86. Sedlacek I., Kocur M. Identification of Staphylococcus and Micrococcus species with the STAPHYtest system// Folia Microbiol (Praha). 1991. -V.36.-p.401-405.;

87. Snyder, M.L. 1954. paper discs containing entire culture medium for the differentiation of bacteria. Pathol. Bacteriol. 67:217-226.

88. Soto, O.B. 1949. Fermentation reactions with dried paper discs containing carbohydrate and indicator. Puerto Rican J. Publ. Hlth. Trop. Mod. 25:96100.;

89. Stargel, M.D., G.L. Lombard, and V.R. Dowell, Jr. 1978. Alternative procedures for identification of anaerobic bacteria. Am. J. Mod. Tech. 44:709-722.;

90. Stargel, M.D., F.S. Thompson, S.E. Phillips, G.L. Lombard, and V.R. Dowell, Jr. 1976. Modification of the Minitek miniaturized differentiation system for characterization of anaerobic bacteria. J. Clin. Microbiol. 3:291

91. Sutler, V.l., D.M. Citron, and S.M. Finegold. 1980. Wadsworth anaerobic bacteriology manual, 3rd ed. The C.V. Mosby Co., St. Louis.;

92. Tanasupawat S., Hashimoto Y., Ezaki T. et al. Staphylococcus picifermentans sp. nov., from fermented fish in Thailand //Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42, N 4. P. 577-581;

93. Weaver, R.Ü. 1954. Quicker bacteriological results. Am. J. Med. Technol. 20:14-26.;

94. Webster J. A., Bannerman T.L., Hubner R.J. et al Identification of Staphylococcus sciuri species group with EcoRI fragments containing rRNA sequences and description of Staphylococcus vituluns //I nt. J. Syst. Bacteriol. 1994. v. 44, N 3. P. 454-460;

95. Willcox, W.R., and S.P. Lapage. 1975. Methods used in a program for computer aided identification of bacteria, p. 103-119. In R.J. Pankhurst (ed.), Biological identification with computers. Academic Press, New York.;

96. Рост в анаэробных условиях1. Рост к азробных уело пнях1. Плазм окоагу лаза1. Кланто 1г-фактор1. Термостабильнаж нуклеаза1. Гемолизиша1. Каталазаи