Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Препараты для диагностики и профилактики гепатита А: разработка и стандартизация методов оценки качества

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Препараты для диагностики и профилактики гепатита А: разработка и стандартизация методов оценки качества"

На правах рукописи

КАЛАШНИКОВА Татьяна Валентиновна

ПРЕПАРАТЫ

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ГЕПАТИТА А: РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1998 г.

Диссертационная работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Министерства здравоохранения РФ

Научные консультанты: академик АЕН РФ, доктор мед. наук,

профессор Бектимиров Т.А.

член- корр. АЕН РФ, доктор мед. наук, профессор Карпович Л.Г.

Официальные оппоненты: член -корр. АЕН РФ, доктор мед. наук,

профессор Воробьева М.С.

академик АЕН РФ, доктор мед. наук, профессор Шахгпльдян И.В.

доктор биологических наук Королев М.Б.

Ведущая организация : Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Защита состоится « Л? » ¿¿^/^^б 1998 г. в час. на

заседании Специализированного Совета (Д 001. 20. 02) при Институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН (Москва ,123098, ул. Гамалеи, дом 16)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан «

» _1998 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

Актуальность проблемы. Вирусные гепаппы человека представляют одну из важнейших медицинских проблем, все еще далекую от своего разрешения. На сегодняшний день, как и прежде, сохраняется высокий эпидемический потенциал всех известных вирусных гепатитов. При этом вирусный гепатит А (ГА) по своей распространенности и причиняемому экономическому ущербу в ряде стран мира , в том числе и в нашей стране (Онищепко Г. Г., 1997 ), занимает доминирующее положение. По данным ВОЗ, учтенная заболеваемость ГА в мире в первую половину 90-х годов составляла около 1,5 млн случаев в год. Однако по данным серологических исследований зарегистрированные случаи ГА составляют всего 15-20% от их общего числа ( Соринсон С.Н.,1996; Gust T.D.1992; Papaevangelou G.1992).

Сохранение высокого уровня заболеваемости ГА несмотря на многолетние изыскания путей и способов повышения эффективности мероприятий санитарно-противоэпидемического характера для борьбы с этой инфекцией , а также применения и совершенствования системы иммуноглобулинопрофилак-тики ГА (Ананьев В.А. с соавт.,1958, Алейник М. Д.,1968, Горбунов М.А., 1988; Winocur P.L., 1992) обусловили настоятельную необходимость разработки препаратов для диагностики и вакцинопрофилактики этой инфекции. Основой для их создания явились крупнейшие научные достижения 70-х годов, связанные с открытием вируса гепатита A (Feinstone S. et.al.., 1973) , адаптацией изолятов [ЗГА к размножению в культурах клеток ( Provost Ph. et.al.., 1979) и получением высокоэффективных систем репродукции ВГА in vitro.

На основе ВГА, выращенного в культуре клеток, в восьмидесятые годы за рубежом, а затем и у нас в стране были разработаны тест-системы для вы-*вления основных маркеров ГА: антигена ВГА ( АГ ВГА), иммуноглобулинов игасса М к ВГА ( анти-ВГА IgM ), а также суммарных антител к ВГА, пред-лгавлешшх преимущественно иммуноглобулинами класса G ( анти-ВГА антител).

Наряду с созданием диагностических препаратов проводились научные исследования по созданию вакцин против гепатита А: инактивированных, живых, а также полученных с помощью генноинженерных методов. Наиболее перспективными для внедрения в практику здравоохранения оказались цельно-вирионные инактивированные вакцины.

В нашей стране коллективом авторов ИПВЭ им .М.П. Чумакова РАМН ( Балаян М.С., 1988, Кусов Ю.Ю. с соавт., 1989) в результате адаптации ВГА к лшши гетероплоидных клеток почек зеленой мартышки 4647, аттестованной в соответствии с требованиями ВОЗ (Миронова Л.Л., с соавт.,1987) и рекомендованной ГИСК им.Л.А.Тарасевича для получения инактивированных вирусных вакцин, были разработаны основы технологии приготовления и созданы первые серии цельновирионной инактивированной культуральной вакцины против гепатита А «Геп-А-ин-Вак», крупномасштабное производство которой в настоящее время освоено в НПО «Вектор» (г. Новосибирск). Параллельно аналогичные вакцины разрабатывались за рубежом (Provost Р. et al.,1986; Flehmig В. et al.,1987; Andre F. et al.,1990). В настоящее время их производство освоено в Бельгии (фирма «Smith Kline Beecham Biologicals»), в США (фирма «Merk Sharp & Dohme»), во Франции (фирма «Pasteur Merieux Connaught» ).

Необходимым условием внедрения новых медицинских иммунобиологических препаратов ( МИБП) в практику здравоохранения является наличие адекватных и стандартных методов их контроля , а также требований к их качеству. К началу наших исследований (1986 г.) проблемы, связанные с разработкой и стандартизацией методов оценки качества препаратов для диагностики и профилактики ГА , являлись не изученными. Отсутствовали как национальные , так и международные требования к основным параметрам их качества . Не было рекомендаций ВОЗ в отношении методов их контроля, а также не были предложены соответствующие международные стандартные образцы и референс-препараты для оценки их качества. Решение этих проблем , как и многих других задач, связанных с внедрением в практику отечественного здра-

воохранения новых МИБП, возложены на ГИСК им. Л.А. Тарасевича. В соответствии с действующими законодательными актами ГИСК им. Л. Д. Тарасевича является Национальном органом контроля РФ, ответственным за качество внедренных в практику и выпускаемых в нашей стране МИБП.

Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного основная цель работы состояла в разработке и стандартизации методов контроля, а также гребований к качеству препаратов для диагностики и профилактики гепатита А.

Для выполнения поставленной цели основные задачи исследования решались в трех взаимосвязанных направлениях:

1. Разработка и стандартизация средств для оценки качества препаратов для диагностики и профилактики гепатита А:

• получение национальных стандартов - отраслевых стандартных образ-дов (ОСО) к основным маркерам ГА ;

• сравнительное изучение различных штаммов ВГА, используемых для троизводства препаратов для диагностики и профилактики ГА с целью разработки требований к производственным штаммам.

Разработка системы стандартизации , аттестации и методов оценки качества фепаратов для диагностики гепатита А. в частности;

- тест-систем для выявления 1§М к ВГА ;

- тест-систем для выявления суммарных антител к ВГА, представленных преимущественно 1дО;

- тест-систем для выявления антигена к ВГА.

• совершенствование системы аттестации новых препаратов для диагно-■тики гепатита А по лабораторным тестам с применением разработанных тандартов и в клинико-эпидемиологических испытаниях при использовании еференс-препаратов сравнения;

• составление и апробация унифицированной математической модели и спользование ее, а также разработанной на ее основе компьютерной програм-

мы для оценки эффективности диагностических препаратов в клинико-эпидемиологических испытаниях;

• изучение и сравнительная оценка диагностической эффективности тест-систем для выявления различных маркеров ГА и определение области их применения для практического здравоохранения.

3. Разработка системы стандартизации . методов ко!ггроля и требований к качеству инакгивированных вакцин, в частности:

• подлинности антигена ВГА в вакцинном препарате при использовании разработанных ОСО, содержащих и не содержащих антитела к ВГА:

• специфической безопасности в тесте определения полноты инактивации ВГА in vitro;

• специфической активности , оцениваемой in vitro и в опытах на лабораторных животных;

• сравнительное изучение качества вакцин отечественного и зарубежного производства в экспериментальных и клинических исследованиях на добровольцах с целью оценки адекватности и информативности разработанных лабораторных методов и требований к основным показателям их качества.

Научная новизна.

Впервые научно обоснованы принципы стандартизации и контроля препаратов для диагностики и вакцинопрофилактики ГА , а также разработаны национальные требования к показателям их качества. С этой целью: :

• разработаны и получены первые национальные стандарты - отраслевые стандартные образцы ( ОСО) к основным маркерам гепатита А , а также ОСО панели сывороток с заданными характеристиками;

• разработаны методы контроля и требования к производственным штаммам ВГА для получения диагностических и профилактических препаратов.

Применительно к препаратам для диагностики ГА:

• разработаны методы контроля и впервые сформулированы лабораторные критерии оценки их качества, адекватность которых подтверждена результатами клинико - эпидемиологических исследований;

• усовершенствована система аттестации тест-систем для выявления различных маркеров ГА - анти-ВГА IgM , анти-ВГА антител, антигена ВГА , включающая лабораторные тесты при использовании полученных стандартов и клинико-эпидемиологические исследования с применением ре-ференс-препаратов сравнения;

• предложен и апробирован унифицированный подход к оценке качества любых диагностических препаратов при их полевых испытаниях, математический алгоритм которого явился основой разработанной компьютерной программы «ДИАТЕСТ».

• при использовании унифицированной системы аттестации препаратов впервые получены сравнительные данные оценки диагностической эффективности отечественных и зарубежных тест-систем, предназначенных для выявления различных маркеров ГА, и определена область их применения для практики здравоохранения.

Применительно к инактивированным вакцинам против гепатита А:

• разработан метод определения подлинности АГ ВГА в вакцинных препаратах в ИФА с помощью ОСО;

• стандартизован метод контроля и сформулированы требования к специфической безопасности вакцин в тесте на полноту инактивации ВГА in vitro, эффективность которых подтверждена результатами экспериментальных и клинических исследований .

• разработаны методы контроля и требовшшя к специфической активности инактивированных вакцин, определяемой по содержанию в них АГ ВГА в ИФА и иммуногенной активности в опытах на экспериментальных животных ( морские свинки, аутбредные мыши); установлена адек-

вагаость экспериментальной модели на животных для оценки иммуно-генной активности вакцины против ГА.

• по результатам доклинических и клинических исследований впервые получены сравнительные данные о качестве первой отечественной вакцины "Геп-А-ин-Вак" на этапах ее разработки и промышленного выпуска в сопоставлении с ее зарубежными аналогами - инактивировшшыми вакцинами против гепатита А -"HAVRIX -1440" ( фирма Smith Kline Beecham Biologicals" / Бельгия/) и «VAQTA» (фирма «Merk Sharp &Dohme» /США/).

Практическая значимость

Работа имеет практическую направленность и посвящена разработке , совершенствованию и стандартизации средств и методов, определяющих качество препаратов для диагностики и профилактики ГА.

Получены и внесены в реестр отраслевых стандартных образцов , применяемых на предприятиях Минздрава РФ и других ведомств, выпускающих МИБП, первые национальные стандарты к основным маркерам ВГА: ОСО сывороток, содержащие и не содержащие суммарные антитела к ВГА , представленные преимущественно IgG (ОСО 42-28-158-89, ОСО 42-28-178-90); ОСО сывороток, содержащие и не содержащие антитела к ВГА , представленные преимущественно IgM, которые приготовлены в виде моностандартов (ОСО 42-28162-89, ОСО 42-28-163-89) и панели сывороток (ОСО 42-28-220-96). На указанные препараты составлена и утверждена нормативная документация (НД) -"Свидетельства" и "Инструкции по применению".

Разработанные с использованием утвержденных ОСО методы контроля и требования к основным показателям качества первых отечественных препаратов для диагностики и профилактики ГА сформулированы в утвержденных Минздравом РФ нормативных документах (НД) - ВФС и ФС. ( табл.1)

Таблица 1.

Перечень утвержденных НД на препараты для диагностики и профилактики гепатита А, контроль которых осуществляется с использованием разработанных ОСО

Наименование препарата * Используемые

Г У' ОСО

Тест-системы иммунофермент- ' ОСО 42-28-162-89 ные для выявления анта-ВРА :.; ОСО 42-28-163-89

• "ДЙАГНАГЕП .. , .. . .1 "ИФАавгти-ВГА. "У

• "ВЕКТОГЕП-А Г»М"'

• "ВЕКТОГЕП-А .-.У* ОСО42 -28-220-96

■ • "ИФА анти-ВГА ^М СГГ "-"

Тест-системьг иммунофермент-; ОСО 42-28-158 - 88 ные для выявления антител к

вг'А -

• "ИФАанти-ВГЛ ■; О;, ^

"ВЕКТОГЕП-А "

.Тест-система иммунофермент- -ная для выявления антигена к ' .ВГА "«Вектогеп-А-антиген" ; . Инактивированная вакцина ге- < иаотта Л -'ТЕП- А-ин-ВЛК

Номер БД;

• ВФС 42-218 ВС-89

• ВФС 42-331 ВС-92

• ВФС 42-364 ВС-92

• ФС 42-3304-96

• V; ВФС 42-2827 -96 :Л

ОСО 42-28-178 - 90

• ВФС 42-429 ВС-94

• ВФС 42/Д016 ВС-95

• ВФС-42-3678-97

V ВФС-42-2747-96

На основании проведенных нами лабораторных и клинико- эпидемиологических исследований препаратов для диагностики ГА в практику здравоохранения рекомендованы:

• Тест-системы иммуноферментные для выявления иммуноглобулинов класса М к ВГА, предназначенные для ранней дифференциальной диагностики гепатита А:

- «ДЙАГНАГЕП» (ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН, Москва);

- « ВЕКТОГЕП-А ^М» ( ЗАО « Вектор-Майстар», Новосибирск);

- « ИФА анти-ВГА IgM» (НПО «Диагностические системы» ,

Н.Новгород);

- « ИФА анти-ВГА IgM СП» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород»).

• Тест-системы иммуноферментные для выявления антигена вируса гепатита А в инфицированных ВГА клеточных культурах и их производных (в разовых и объединештых вирусных сборах на производстве препаратов для диагностики и вакцинопрофилактики ГА):

- «ИФА- антиген- ВГА» (НПО «Диагностические системы», Н. Новгород);

- « ВЕКТОГЕП-А-антиген» ( ЗАО « Вектор-Майстар», Новосибирск )

• Тест-системы иммуноферментные для выявления антител к ВГА в сыворотке, иммуноглобулинах и плазме крови людей и экспериментальных животных, предназначенные для изучения иммуноструктуры населения к ВГА , для оценки иммуногенной активности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях, а также для других научно- производственных целей, предполагающих определение уровня анти-ВГА антител в препаратах крови.

- " ИФА анти-ВГА "(НПО « Диагностические системы», Н.Новгород)

- " ВЕКТОГЕП-А-антитела" (ЗАО « Вектор-Майстар», Новосибирск).

Результаты экспериментальных и клинических исследований инактиви-

рованной вакцины против гепатита А "Геп-А-ин-Вак", свидетельствующие о ее специфической безопасности, слабой реакгогенности, выраженной иммуногенной активности, а также высокой профилактической эффективности , позволили обеспечить внедрение первого отечественного препарата для активной профилактики ГА в практику здравоохранения. Регламентировшшые утвержденными на вакцину "Геп-А-ин-Вак" нормативными документами ( ВФС) методы контроля и национальные требования к инактивированным вакцинам против ГА позволяют не только осуществлять надзор за качеством серийно выпускаемого

отечественного препарата , но и проводить аттестацию аналогичных зарубежных вакцин при их регистрации в РФ.

Основные положения, выносимые на защиту

Разработка и применение национальных стандартов для оценки качества препаратов для диагностики и профилактики ГА- ОСО сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГА,представленные иммуноглобулинами различных классов; ОСО сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГА , представленные преимущественно иммуноглобулинами класса М, приготовленные в виде моностандартов и панели сывороток с заданными характеристиками.

Сравнительная характеристика антигенной специфичности и репродуктивной активности производственных штаммов ВГА, используемых для получения диагностических и профилактических препаратов в промышленных условиях ; методы контроля и требования к их основным свойствам .

Критерии и методы контроля основных параметров качества препаратов для диагностики ГА:

- тест-систем для выявления иммуноглобулинов класса М к ВГА ;

- тест-систем для выявления суммарных антител к ВГА;

- тест-систем для выявления антигена к ВГА.

Система апробации и внедрения новых диагностических препаратов для выявления различных маркеров ГА , основанная на лабораторном изучении препаратов с помощью разработанных стандартов и клинико-эпидемиологичес-ких испытаний с использованием референс-препарата сравнения.

Унифицированный подход к оценке качества диагностических препаратов на основе математического алгоритма с использованием разработанной на его основе компьютерной программы «ДИАТЕСТ».

Сравнительная характеристика отечественных и зарубежных препаратов для диагностики ГА на основе лабораторных и полевых исследований.

Система национальных требований и методов оценки основных показателей качества инактивированных вакцин против ГА:

• подлинности антигена ВГА в вакцинных препаратах с помощью разработанных стандартов;

• специфической безопасности в тесте на полноту инактивации ВГА in vitro;

• специфической активности по определению содержания АГ ВГА по данным ИФА и иммуногешюй активности в опытах на лабораторных животных.

Сравнительные результаты оценки качества отечественной инактиви-рованной вакцин против ГА по результатам доклинических и клинических исследований в сопоставлении с зарубежными аналогами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационных исследований были представлены на Научной юбилейной конференции ГИСК им. JI. А. Тарасевича "Состояние и перспективы профилактики и диагностики инфекционных болезней человека" (Москва, 1988); на Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты" (Ростов, 1990); Всесоюзной конференции " Энтеро-вирусы, общетеоретические и медицинские аспекты." ( Киев, 1991 г.); на Всероссийской научно - практической конференции " Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" ( Пермь, 1993); на Международном симпозиуме "Разработка вакцин против вирусных инфекций " (Новосибирск, 1994), на Фальк симпозиуме №92 " Новые направления в гепато-логии " ( Санкт- Петербург, 1996). В завершенном виде диссертационная работа

и

была доложена и обсуждена на заседании Ученого Совета ГИСК им.Л.Л.Тарасевича ( Москва, 1997)

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 336 страницах и состоит из введения , обзора литературы ( 3 главы) , раздела собственных исследований (6 глав), обсуждения и выводов. Диссертация иллюстрирована 60 таблицами и 30 графическими рисунками. Библиографический указатель включает 498 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

Основные положепия диссертации отражены в 35 публикациях.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы л методы

Вирусы. Штаммы ВГА были представлены в ГИСК им.Л.А.Тарасевича в качестве кандидатов для производства диагностических и вакцинных препаратов: штамм ЛБА-86 получен в ИПВЭ им. М.ГТ. Чумакова РАМН в результате адаптации штамма НАБ-15 к перевиваемой клеточной линии 4647; штамм Л-2424 выделен группой авторов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН ( Балаян М.С., Кусов Ю.Ю. и др., 1988); штамм МБ-7 выделен группой исследователей НПО "Вектор" г. Новосибирск ( Майданюк А.Г. и др., 1993).

В ряде экспериментов при изучении специфичности тест-систем были использованы штаммы, полученные из музея вирусов лаборатории энтеро- и ротавирусных инфекций ГИСК им.Л.А.Тарасевича: штамм 1Ш ротавирусов группы А; штаммы Сэбина вирусов полиомиелита типов 1,2,3; штамм А-5 аденовируса.

Клеточные культуры. Линии перевиваемых клеток: 4647 ( клетки почек зеленой мартышки) и РШ)К-4 ( клетки почек эмбрионов макаки -резус), получены из ИПВЭ им М.П.Чумакова РАМН, Москва или НПО «Вектор» , Новосибирск.

Диагностикумы. В исследованиях были использованы тест-системы для выявления основных маркеров ГА , отечественного и зарубежного произ-

водства на уровне лабораторных, экспериментально- производственных и коммерческих серий: ИФА и РИА тест-систем для выявления анти-ВГА IgM (11 наименований) , ИФА и РИА тест-системы для выявления анти-ВГА антител (6 наименований), ИФА тест-системы для выявления АГ ВГА ( 4 наименования). В ряде исследований были использованы коммерческие тест-системы для выявления маркеров ВИЧ инфекции, гепатитов В и С отечественного и зарубежного производства.

Ватины. Инактивированная отечественная вакцина против гепатита А "Геп-А-ин-Вак" культуральная, концентрированная , очищенная и адсорбированная на гидроокиси алюминия ,полученная из штамма ЛБА-86 ВГА в культуре перевиваемых клеток 4647. В исследованиях были использованы первые лабораторные серии вакцины ( производства ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН) , а также экспериментально- производственные и коммерческие серии препарата (производства НПО «Вектор»). Препаратами сравнения являлись аналогичные коммерческие инактивированные вакцины гепатита A: "HAVRIX-1440 " (фирма "Smith Юте Beecham Biologicals", Бельгия ), приготовленная из штамма НМ-175 ВГА в культуре диплоидных клеток MRC-5 и «VAQTA» ( фирма «Merk Sharp & Dohme», США), приготовленная из штамма CR 326 F' на линии диплоидных клеток MRC-5

Лабораторные животные. Эксперименты проводились на морских свинках (массой 150-200г) , белых беспородных мышах (массой 15-20 г) , полученных из питомников РАМН; обезьянах мармозетах вида Saguinus mystax ( усатый тамарин) массой 500-600 г, которые содержались в условиях обезьяньего питомника ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН.

Контиигенты обследованных лиц . За период 1987-1997 гг., в соответствии с задачами исследований ( приготовления ОСО, проведение клинико-эпидемиологических испытаний диагностических или вакцинных препаратов) по различным лабораторным тестам было обследовано свыше 3 000 лиц.

( болыше ГА и другими заболеваниями , связанными и несвязанными с поражением печет , а также здоровые лица).

Биоматериапы . Материалом для исследований служили образцы сывороток крови и 10% фекальные экстракты , полученные от людей или экспериментальных животных; образцы воды, полученные из источников водоснабжения различных региопов РФ.

Вирусологические методы. Инфекционную активность штаммов ВГА определяли в клеточных культурах с последующем выявлением АГ ВГА в ИФА ( ТкИДзо/мл) , а для штамма МБ-7 и по бляшкообразованиго ( БОЕ/мл). Антигенную специфичность штаммов ВГА определяли с помощью стандартов анти-ВГА антител в реакции нейтрализации в клеточной культуре и в ИФА.

Илшунохштческие методы. Для анализа образцов сывороток , экстрактов фекалий использовали иммуноферментный или радиоиммунный методы , постановку которых осуществляли в соответствии с Инструкцией по применению тест-систем, предназначенных для выявления соответствующего маркера ГА.

Статистическую обработку результатов - определение средних величин, среднего квадратичного отклонения (8 ), ошибки средней (т), критерия X 2 , коэффициентов сопряженности и вариации , а также графическое оформление материала проводили на персональном компьютере на . базе процессора "Pentium 100/8М/ 850" с использованием прикладных программ «Диатест», «Statgraf» и «MS Office 95».

Разработка и аттестация средств и методов, определяющих качество препаратов для диагностики и профилактики гепатита Л.

Получение и аттестация отраслевых стандартных образков к основным маркерам ГА

Одним из обязательных условий при разработке методов контроля и требований к препаратам для диагностики и профилактики гепатита А является

получение и аттестация следующих национальных стандартов - отраслевых стандартных образцов (ОСО):

• ОСО сывороток, содержащие суммарные антитела к ВГА , представленных преимущественно иммуноглобулинами класса G (ОСО анти-ВГА антитела+) и ОСО сывороток, не содержащих антител к ВГА (ОСО анти-ВГА антитела-), предназначенных для опрсделешы подлинности производственных штаммов и культуральных антигенов вируса гепатита А, а также для разработки методов контроля и требований к подлинности и специфической активности тест-систем для выявления анти-ВГА антител;

• ОСО иммуноглобулинов класса М, содержащих и не содержащих антител к вирусу гепатита А {(ОСО анти-ВГА IgM(+) и ОСО анти-ВГА IgM(-)}, а также ОСО панели сывороток с заданными характеристиками - для разработки методов контроля и требований к качеству тест-систем для выявления анти-ВГА IgM

Для получения ОСО анти-ВГА IgM(+) отбирали сыворотки от больных ГА , полученные на 1-2 неделе клинических проявлений заболевания с максимальным содержанием анти-ВГА IgM (титр > 1/8000 в тест-системе HAVAB-M ELA Abbott, USA) при минимальном содержании анти-ВГА антител, представ-литых преимущественно IgG (титр <_1/20 в тест-системе HAVAB-EIA Abbott, USA).C использованием этих же тест-систем отбирались сыворотки для получения ОСО анти-ВГА IgM (-), которые не содержали анти-ВГА IgM , но имели титр анти-ВГА антител преимущественно IgG не менее 1:200. Отобранные сыворотки не содержали маркеры гепатитов В, С и ВИЧ инфекции.

Сыворотки, полученные от реконвалесцентов ГА, были использованы для получения ОСО анти-ВГА антитела (+) (титр не менее 1:4000 в тест-системе HAVAB-RIA Abbott, USA), а сыворотки от здоровых лиц, не содержащие анти-ВГА антител по данным той же тест-системы- для получения ОСО анти-ВГА антитела(-).

Полученные в результате отбора, разведения наполнителем до рабочего титра и последующей лиофилизации образцы по своим физико-химическим параметрам соответствовали требованиям ВОЗ для стандартных образцов биопрепаратов (коэффициент вариации массы сухого вещества 2,8%; остаточная влажность < 2,5%). СГТ специфических антител, определяемый при титровании не менее 20 ампул каждого ОСО в зависимости от чувствительности используемых тест-систем составил: для ОСО анти-ВГА IgM(+) - 1,42 Ig -1,99 Ig; для ОСО анти-ВГА антитела(+) - 1,16 Ig - 3,21 Ig. Стабильность характеристик при температуре хранении 4-8° С по результатам теста ускоренной термодеградации, (Kirkwood Т.,1984) не менее 10 лет.

С целью совершенствования методов контроля и повышения качества тест-систем для выявления анти-ВГА IgM в дальнейшем нами был разработан стандарт нового поколения - ОСО панели из 16 образцов сывороток с заданными характеристиками , предназначенных не только для оценки подлинности и специфической активности препаратов, но и для определения их диагностической эффективности на уровне лабораторных тестов. Учитывая, что основную нагрузку для дифференциации различных тест-систем по качеству несут сыворотки с пороговым значением ОП, формирование стандартной панели осуществлялось таким образом, чтобы в области, непосредствешю примыкающей к ОП критическому ( cut off), было максимальное представительство сывороток. Применительно к положительной части панели эта задача решалась методом кратных разведений высокоположительных анти-ВГА IgM сывороток нормальной сывороткой здорового донора в соответствии с теоретическим законом нормального распределения их ОП. Основой для его построения служили результаты наших исследований по испытанию различных иммунофермент-ных тест-систем для выявления анти-ВГА IgM, обработанные на ЭВМ по ранее разработанной программе ( Канев А.Н. и др. 1992 г.). Пример распределение ОП492 сывороток положительной части панели в различных тест-системах представлен на рис. 1.

Рис.1 Кратность отношения ОП сывороток положительной части панели кОП критическому в ИФАтест-системах различных фирм

5

4,5

о 4

з-

т 3,5

ГО 3

О.

2,5

Ю

О 2

С 1.5

О 1

-

■НПО "Диагно-стжеские системы"(РФ)

Ц "Вектор-Майстар"(РФ)

□"Organon Tehnika" (Нидерланды)

номера сывороток

Для формирования отрицательной части панели были использованы сыворотки от людей, не имевших заболевания печени в течение 2-х последних лет со значением ОП492 в интервале 0,100-0,200 ох.

Все образцы, отобранные для формирования панели не содержали маркеры к гепатитам В,С, ВИЧ инфекции и по своим физико-химическим показателям соответствовали требованиям, предъявляемым ВОЗ для лиофилизирован-ных стандартных образцов.

Аттестация панели была осуществлена практически во всех отечсстаен-ных и импортируемых в РФ тест-системах для выявления анти-ВГА IgM. Специфичность всех тест-систем, оцениваемая но отрицательной часта панели, составила 100%. В то же время их чувствительность (или выявляемость), оцениваемая по положительной части панели , была различной (табл.2). Максимальный процент выявления анта-ВГА IgM был установлен при использовании отечественных тест- систем фирм «Мультитест», «Лшех» и Израильской фирмы «Orgenics». Существенно не уступали им по своей диагностической эффективности тест-системы Российских фирм «Вектор-Бест», «Вектор-Майстар» и НПО "Диагностические системы" при использовании культурального АГ ВГА, а также тест-система «Organon Teknika» ( Нидерланды), «Abbott» ( США).

Т а б л и ц а 2'

Показатели диагностической эффективности тест-систем для выявления анти-ВГА ^М , полученные с помощью стандартной панели

Наименование фирм -изготовителей тест-истем Кол-во исслед. серий Чувствительность (%) Специфичность (%)

"Мультитест" (Москва, РФ) 3 100 100

НПФ «Литех» (Москва, РФ) 3 100 100

«Orgenics» (Израиль) 2 100 100

"Вектор-Майстар"( Новосибирск, РФ) 4 84,3 + 6,4 100

"Вектор-Бест" (Новосибирск, РФ) 3 95,8 ±4,1 100

"Диагностические системы", (Н. Новгород, РФ) 2 87,5 ± 2,5 100

5*) 80,0 ± 6,3 100

"Roche" (Швейцария) 1 25,0+15,3 100

«Organon Teknika» (Нидерланды) 1 87,5 ± 11,7 100

«Abbott» (США) 1 87,5 + 11,7 100

Таким образом, в процессе наших исследований были получены, утверждены и внесены в Реестр отраслевых стандартных образцов, допущенных к применению на предприятиях Минздрава РФ и других ведомств, выпускающих МИБП, первые ОСО к основным маркерам ГА, предназначенные для стандартизации и оценки качества препаратов для диагностики и профилактики ГА.

Изучение антигенной специфичности и репродуктивной активности производственных штаммов ВГА

Основополагающим звеном в последовательной цепи мероприятий по разработке и освоению препаратов для диагностики и профилактики ГА, является аттестация производственных штаммов. Нами было проведено изучение антигенной специфичности и репродуктивной активности трех штаммов вируса гепатита А (ЛБА-86, Л-2424, МБ-7), полученных в результате адаптации изо-лятов ВГА к клеточным культурам. Указанные штаммы были предназначены

*) В качестве АГ ВГА используются синтетические пептиды ВГА

для накопления вирусной массы и получения антигена ВГА на производстве МИБП.

В процессе размножения штаммов ВГА в культуре перевиваемых клеток FRhK-4 и 4647 было установлено, что штаммы ЛБА-86, JI-2424 ВГА не оказывали на них шшшатогешюго действия , в то время как при заражении их штаммом МБ-7 наблюдался цигопатогенный эффект.

Антигенная специфичность штаммов ЛБА-86, JI-2424, МБ-7 к ВГА после адаптации их к клеточным культурам была установлена в трех разновидностях реакции нейтрализации с помощью разработанных нами ОСО сывороток, содержащих и не содержащих анги-ВГА антител: нейтрализации АГ ВГА в конкурентном ИФА ( «блок вариант»); нейтрализации репродукции ВГА in vitro при последующем выявлении АГ ВГА методом ИФА; нейтрализации бляш-кообразования в клеточной культуре (для штамма МБ-7).

Нейтрализация различных штаммов ВГА стандартными образцами анти-ВГА антител проявлялась в подавлении их антигенной активности в блок- варианте ИФА на 85-90% ( при установленных для отечественных тест-систем не менее 50%), в то время как применение ОСО стандартной сыворотки, не содержащей анти-ВГА антител , вызывало снижение специфической активности исследуемых штаммов лишь на 1-7 %. Схожие результаты получены и при других вариантах реакции нейтрализации, что свидетельствовало о том, что адаптация указанных штаммов к линиям клеток FRhK-4 и 4647 не сопровождалась изменением их антигенной специфичности.

Репродуктивная активность исследованных штаммов оценивалась по накоплению инфекционного вируса и вирусного антигена в культурах перевиваемых клеток FRhK -4 и 4647 путем определения АГ ВГА в ИФА . Было установлено, что наибольшей репродуктивной активностью отличается штамм МБ-7, показатели накопления инфекционного вируса которого на 7 день культивирования в клеточных культурах FRhK -4 и 4647 превышали аналогичные показатели штаммов ЛБА-86 и Л-2424 на 1,5 IgTicHflso /мл. Однако к 14 дто титры

инфекционной активности исследуемых штаммов практически не отличались и составляли 6,3-6,9 ТкИД50/мл. Аналогичная динамика, но со сдвигом во времени отмечалась и в случае накопления АГ ВГА. Максимальный его уровень по данным ИФА для штамма МБ-7 отмечался на 8-9 день, для штаммов ЛБА-86 и Л-2424 - на 21-23 сутки.

В итоге, все исследованные штаммы были рекомендованы в качестве производственных с целью получения АГ ВГА для диагностических препаратов, а штамм ЛБА-86, с использованием которого были получены первые серии отечественной инакгавировапной вакцины 'Теп-А-ин-Вак", прошедшие все виды экспериментальных и клинических исследований, в качестве производственного вакцтпюго штамма.

Разработка и стандартизация методов контроля, а также требовании к качеству препаратов для диагностики гепатита А

Совершенствование системы аттестации новых препаратов для диагностики

ГА

С целью разработки и стандартизации национальных требовшгай и методов оценки качества препаратов для диагностики ГА нами проводились исследования по изучению их диагностической эффективности по общепринятой и усовершенствованной нами системе.

Первый этап исследований включал в себя предварительную аттестацию испытуемых тест-систем на уровне лабораторных тестов , а также отработку методов контроля и требований к основным показателям их качества с использованием разработанных нами стандартов.

Второй этап исследований , проводимый в рамках клинико- эпидемиологических испытаний в строго контролируемых шифрованных опытах, был направлен на всестороннее изучение и оценку диагностической эффективности испытуемых тест-систем для решения вопроса о целесообразности внедрения их в практику здравоохранения, а также для определения адекватности и эффективности требований к качеству препаратов, отработанных на первом этапе

исследований. В этом случае диагностическая эффективность испытуемых тест-систем оценивалась по отношению к референтному препарату. Последний представлял собой аналогичную, как правило, широко апробированную тест-систему, высокое качество которой устанавливалось с помощью существующих стандартов и подтверждалось результатами последующих исследований.

Для сравнительной оценки качества испытуемой тест-системы по отношению к референтному препарату нами в процессе исследований был отработан унифицированный подход к статистической обработке результатов на основе математического алгоритма с использованием таблиц 4-х полей. Эта методика исключает получение односторонних сведений о препарате , так как позволяет оценивать его диагностическую эффективность по нескольким критериям. В их число входят не только чувствительность( выявляемость) и специфичность , но и вероятность установления положительного и отрицательного диагнозов, а также суммарный показатель совпадения результатов испытуемого препарата по отношению к референтному. Кроме того она позволяет оценить достоверность и степень сопоставимости полученных данных путем определения критерия соответствия " %2 " и коэффициентов сопряженности «phi2» или «С» .

На основе полученных нами экспериментальных данных и предложенного алгоритма совместно с лаб. биофизических методов исследования ГИСК им. JI.A. Тарасевича ( руководитель д.б.н. В.Г. Петухов) была разработана и апробирована компьютерная программа "ДИАТЕСТ" . Указанная программа значительно расширяет возможности исследователя при проведении им статистической обработки полученных результатов, позволяя быстро и эффективно проводить сравнительную оценку нескольких испытуемых и референтных тест-систем одновременно (до 7), сохранять информацию о них в виде отдельного файла, определять оптимальность выбора ОП крит и т.д.) и может быть использована для оценки эффективности любых диагностических препаратов.

Тест-системы для выявления иммуноглобулинов класса М к ВГА Предназначенные для ранней диагностики ГЛ первые отечественные ИФА тест-системы для выявления анти-ВГА IgM («ДИАГНЛГЕП», ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН), «Вектогеп-А IgM» (НПО «Вектор»), «ИФА анти-ВГА IgM», (НПО «Диагностические системы») были разработаны по единому принципу на основе АГ ВГА , выращенного в культуре клеток. При лабораторном изучении различных серий препаратов с помощью моностандартов было установлено, что 95% доверительные интервалы варьирования отдельных показателей ОП ОСО анти-ВГА IgM(+) и ОП ОСО анти-ВГА IgM(-) для указанных тест-систем находятся практически в равных пределах. Это позволило установить единые требования к показателям их подлинности и специфической активности : ОП ОСО анти-ВГА IgM(+) не менее 0,600 o.e.; ОП ОСО анти-ВГА IgM(-) - не более 0,200 o.e.

Таблица 3.

Показатели оптической плотности ОСО антн-ВГЛ IgM(+) и ОСО анти-ВГА IgM(-) в ИФА тест-системах для выявления анти-ВГА IgM

Наименование ОСО Исследованные показатели Аттестуемые тест-системы

«ИФА аити-ВГА IgM» «Вектогеп A-IgM» «ДИАГНА ГЕП»

ОСО аити ВГА IgM(+) Число измерений 15 12 17

Средняя величина оптической плотности ( o.e.) 0,897 0,719 0.836

Среднеквадратичное отклонение 0,146 0,061 0,114.

95% доверительный интервал (o.e.) 0,605 -1,043 0,598-0,841 0,608-1,064

ОСО антн-ВГА IgM(-) Число измерений 15 12 17

Средняя величина оптической плотности( o.e.) 0,121 0125 0,131

Среднеквадратичное отклонение 0,038 0,039 0,033

95% доверительный интервал o.e.) 0,049-0,193 0,041-0,206 0,065-0,197

Адекватность лабораторных требований к качеству указанных диагности-кумов была установлена в клинико-эпидемиологических испытаниях тех же серий препарата при анализе показателей их диагностической эффективности по отношению к зарубежным аналогам: ИФА тест-системам «HAVAB-M-EIA» (Abbott, США) и «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс» (СП СССР - Швейцария).

Материалом для второго этапа исследований служили сыворотки людей опытной и 2-х контрольных групп, численностью 250-300 человек. Основную опытную группу составляли больные с различными формами ГА, а также контактные с ними лица . В первую контрольную группу входили больные с различными нозологическими заболеваниями, связанными и не связанными с поражением печени( гепатиты вирусной и др. этиологии, механические желтухи, ОРВИ и т.д.). Во вторую контрольную группу входили здоровые лица, не имевшие в анамнезе заболеваний печени в течение 2-х последних лет.

В результате проведенных исследований было установлено, что тест-системы, специфическая активность которых по лабораторным тестам отвечала разработанным требованиям , обладали высокой и вполне сопоставимой диагностической эффективностью (табл.4). Об этом свидетельствуют отдельные и общие показатели диагностической эффективности отечественных тест- систем «ДИАГНАГЕП» по отношению к тест-системе «HAVAB-М Е1А» , а также тест-систем «Вектогеп-А IgM» и «ИФА анти-ВГА IgM» по отношению к тест-системе «Анти-ВГА IgM ИФА ДИА-плюс»

В дальнейших исследованиях по изучению аналогичных тест-систем для выявления анти-ВГА IgM была применена разработанная нами стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих анти-ВГА IgM, позволяющая на уровне лабораторных тестов предварительно определять диагностическую эффективность препаратов. Ее эффективность была установлена при лабораторной аттестации и полевых испытаниях первой отечественной иммунофер-ментной тест-системы для выявления анти-ВГА IgM, разработанной на основе синтетических пептидов - "ИФА анти-ВГА СП". Основные показатели ее диаг-

Таблица 4

Показатели диагностической эффективности тест-систем для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А

Показатели диагностической эффективности по отношению к референтной тест-системе, диагностическая эффективность которой принята за100% Краткое наименование аттестуемых тест-систем для выявления анти-ВГА

"ДИАГНАГЕП "ИФА анти-ВГА ^М" "Вектогеп - А "ДИАГН АГЕП "ИФА анти-ВГА СП"

референтная тест-система "НАУАВ-М Е1А" референтная тест-система "Анти-ВГА 1дМ ИФА ДИАплюс" референтная тест-система "Вектогеп-А 1йМ"

Чувствительность 98,8% 97.0% 95.0% 62.3% 90,0%

Специфичность 98,2% 100.0% 100.0% 95.9% 100,0%

Вероятность установления положительного диагноза 98,9% 100.0% 100.0% 90.0% 100,0%

Вероятность установления отрицательного диагноза 98,7% 98.3% 97.1% 81.0% 95,5%

Совпадение результатов 98,6% 98.9% 98.1% 83.3% 97,1%

Коэффициент сопряженности "С" 0,97 0,98 0.96 0.64 0,91

Степень связи с референтным препаратом сильная сильная сильная средняя сильная

ностической эффективности, рассчитанные по результатам идентификации образцов стандартной панели, составили : чувствительность (выявляемость) -91,2% , специфичность- 100%. Практически тождественные результаты были получены и при ее клинико-эпидемиологических испытаниях ( табл. 4) по отношению к коммерческой серии тест-системы «Вектогеп-А IgM», обладающей по данным тех же лабораторных тестов 100% выявляемостью и специфичностью.

Таким образом, результаты сравнительного изучения тест-систем для выявления анти-ВГА IgM на основе отработанной и усовершенствованной системы их аттестации позволили разработать требования и методы контроля основных показателей их качества, что в итоге обеспечило условия для внедрения в практику здравоохранения первых отечественных тест-системы для ранней диагностики ГА, а также регистрацию в РФ аналогичных зарубежных препаратов.

Тест-системы для выявления суммарных антител к вирусу гепатита А.

Аналогичный подход , основанный на лабораторном изучении препарата и его клинико-эпидемиологических испытаниях , был использован при разработке требований и методов контроля тест-систем для выявления суммарных антител к ВГА, представленных преимущественно IgG (анти-ВГА антител). С этой целью были исследованы первые отечественные тест-системы «ИФА анти-ВГА» (НПО «Диагностические системы») и «Вектогеп-А антитела» ( ЗАО «Вектор- Майстар»), а также коммерческая тест-система «Cobas Core Anti-HAV EIA», любезно предоставленная нам для научно-исследовательских целей фирмой «ДИА- плюс».

В мировой практике с целью унифицированного подхода к оценке результатов, чувствительность тест-систем для выявления анти-ВГА антител принято выражать в мМЕ/мл. При этом минимально защитный уровень анти-ВГА антител , по которому судят об иммунном статусе населения к ВГА, а также оценивают эффективность вакцинопрофилактики в экспериментальных и

клинических исследованиях, по данным литературы (Flehmig В., 1990; Nalin D. et.al.,1992; Andre F. et.al., 1994). составляет 10-30 мМЕ/мл. В наших исследованиях по отработке методов контроля и требований к основным показателям качества тест-систем для выявления анти-ВГА антител мы ориентировались на эти показатели , используя при лабораторной аттестации препаратов разработанные нами ОСО сывороток, содержащие анти-ВГА антитела и откалиброван-ные в мМЕ/мл, а также ОСО сывороток , не содержащих указанный маркер ГА.

В результате проведенных исследований было установлено, что гшж-ний предел чувствительности, установленный на основании разброса ее отдельных показателей при 95% уровне значимости составил: для тест-системы «ИФА анти-ВГА» -21,3 мМЕ/мл ( п* = 14), а для тест-системы «Вектогеп-А антитела» - 18,3 мМЕ/мл ( п = 18), что позволило регламентировать их чувствительность на уровне < 20 мМЕ/мл. Использование ОСО сывороток, не содержащих анти-ВГА антитела, существенно не влияло на показатели ОП АГ ВГА, что свидетельствовало о специфичности реакции и подлинности тест-систем.

С целью изучения и сравнительной оценки диагностической эффективности указанных тест-систем были проведены их клинико- эпидемиологические испытания. Материалом для этого этапа исследований служили сыворотки людей опытных и контрольных групп, общей численностью » 400 человек. В первую опытную группу вошли больные с различными формами гепатита А. От лиц указанной группы были получены парные сыворотки, взятые на 1 и 4 неделе клинических проявлений заболевания ГА, диагноз которого был подтвержден наличием в сыворотках больных анти-ВГА IgM. Вторую опытную группу составили лица, изначально серонегативные или с пороговым уровнем анти-ВГА антител ( < 20 мМЕ/мл) в последующем иммунизированные отечественной инактивированной вакциной гепатита А «Геп-А-ин-Вак». Сыворотки от этих лиц были получены до иммунизации и в процессе курса вакцинации. Первую контрольную группу составили больные вирусным гепатитом В, С, а

* п - количество исследованных серий с учетом параллельных титрований

также другими нозологическими формами, связанными и не связанными с поражением печени. Вторую контрольную группу составили здоровые взрослые и дети, н& болевшие гепатитом в течение 2-х последних лет перед обследованием. Сыворотки людей этой группы были получены однократно и по лабораторным тестам не содержали анти-ВГА IgM, но имели различный уровень анти-ВГА антител. В две отдельные группы были выделены образцы плазмы и иммуноглобулинов .

. По данным клинико-эпидемиологических испытаний ( табл.5) диагностическая эффективность отечественных диагноста кумов с чувствительностью <20мМЕ/мл оцениваемая путем сравнения результатов выявления анти-ВГА антител в исследованных образцах по принципу «позитивные» или «негативные» оказалась вполне сопоставимой с аналогичной коммерческой тест-системой «Cobas Core Anti-HAV EIA», чувствительность которой в пролонгированном по времени варианте постановки ИФА составила 25-35 мМЕ/мл.

Таблица5

Показатели диагностической эффективности иммунофермснтных тест-систем для выявления анти-ВГА антител

ПОКАЗАТЕЛИ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ НАИМЕНОВАНИЕ АТТЕСТУЕМЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ

"ИФА анти-ВГА" "Вектогеп-А-антитела"

Выявляемость 98,50% 99,40%

Специфичность 79,40% 81,85%

Вероятность установления положительного результата 94,40% 95,62%

Вероятность установления- отрицательного результата 93,90% 97,20%

Общий показатель совпадения результатов 94,30% 95,90%

Коэффициент сопряженности. 0,93 0,94

Степень связи с референтной тест-системой сильная сильная

При определении уровня анти-ВГА антител в парных сыворотках от лиц в процессе вакцинации их инакгивированной вакциной «Геп-А-ин-Вак» было установлено, что указанные тест-системы позволяют выявлять динамику ан-тителообразования у привитых. В то же время отсутствие существешюй разницы в уровнях анти-ВГА антител в парных сыворотках от свежеинфицирован-ных ВГА людей, обусловленное резким нарастанием их титра (> 1/10000) в основном за счет анти-ВГА IgM уже на 1 неделе заболевания, а также более 80% положительных результатов выявления анти-ВГА антител в контрольных группах свидетельствовало об ограниченной возможности использования указанных препаратов для диагностики ГА.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что отечественные тест-системы для выявления суммарных анти-ВГА антител по своим основным качественным характеристикам соответствуют международным аналогам , что послужило основанием для внедрения их в практику здравоохранения для изучения иммуноструетуры населения к ВГА , для оценки иммуногенной активности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях, а также для других научно- производственных целей, предполагающих определение уровня анти-ВГА антител в препаратах крови (сыворотке, иммуноглобулинах, плазме).

Тест - системы для выявления антигена вируса гепатита А

Третьим видом препаратов для диагностики ГА, изученным в процессе наших исследований , являлись ИФА тест-системы для выявления АГ ВГА: отечественные тест-система «Вектогеп-А-антиген» (ЗАО "Вектор - Май-стар "); «ИФА-антиген ВГА» ( НПО «Диагностические системы»); «ИФА-ВГА-АГ» (ГП«ИМБИО»); а также зарубежная ИФА тест-система "HAV antigen ELA" фирмы «Mediagnost» (ФРГ).

При лабораторной аттестации тест-систем для определения их чувствительности был использован референс-препарат АГ ВГА, представляющий собой лизат клеток, полученный в результате инфицирования клеточной культуры

4647 штаммом МБ-7 ВГА со стабильной шггигенной активностью в ИФА при температуре хранения минус 20° С не менее 2 лет. Содержание вирусного белка в референс препарате (39 + 2,5 нг/мл) было определено в ИФА путем параллельного его титрования с концентрированным , высокоочищенным , но низкостабильным препаратом АГ ВГА. Последний был получен из того же штамма, и представлял собой по данным иммуноэлектронной микроскопии гомогенную фракцию вирусных частиц , содержал 82±5мкг /мл вирусного белка, имеющую ОП 0,640 + 0,02 при длине волны 260 нм, что по данным литературы соответствовало характеристике очищенного ВГА ( Robertson В. с соавт., 1988). Использование референс препарата АГ ВГА при лабораторном изучении тест-систем позволило определить их чувствительность, средние показатели которой оказались статистически равнозначными и составляли 5,8- 7,3 нг/мл.

Предполагаемым назначением указанных тест-систем являлось определение АГ ВГА в инфицированных ВГА клеточных культурах и их производных; в экстрактах фекалий , полученных от больных ГА и контактных с ними лиц; а также в образцах питьевой воды. Применительно к последним, учитывая предельно низкую концентрацию антигена при возможной контаминации ВГА источников водоснабжения , предполагалось использовать системы по концентрированию АГ ВГА в воде. С целью оценки их эффективности нами были проведены модельные исследования с применением референс препарата АГ ВГА. Разведения его готовили с использованием водопроводной воды г. Москвы, после чего концентрировали различными концентрационными системами ( табл.6). По результатам модельных исследований с использовавшем тест-системы «Вектогеп-А-антиген» было установлено, что тест-системы с чувствительностью 5-7 нг/мл позволяют выявлять АГ ВГА в образцах воды при условии его минимальной концентрации 4-8 пкг /мл и последующем концентрировании в 1600-3600 раз. Однако при проведении полевых испытаний тест-систем «Вектогеп-А-антиген» и «ИФА АГ ВГА» в образцах воды, полученных из различных эндемичных в отношении ГА регионов России (110 образцов

Таблица 6

Определение эффективности различных систем по концентрированию АГ ВГА в образцах воды

Наименование концентрационных систем ОП образцов воды из источников центрального водоснабжения г. Москвы (контроль) Содержание АГ ВГА до концентрирования 40 пкг\мл Содержание АГ ВГА до концентрирования 8 пкг/мл

Значения ОП концентрата в различных разведениях по данным тест-системы «Вектогеп-А-антиген»

цельный (кратность концентри -рования 180) 1/2 (кратность концентри -рования 360) 1/4 (кратность концентрирования 720) цельный (кратность концентри -рования 900) 1/2 (кратность концентрирования 1800) 1/4 (кратность концентри -рования 3600)

"Sartorius" (Германии) 0,023 0,05 0 0,652"'' 0,606 0,337 0,040 0,062 0,039

"CUNO" (Франция) 0,011 0,030 0,010 0,575 0,353 0,206 0,086 0,058 0,063

"'МПС" ( РФ) 0,012 0,02 0,020 0,013 0,004 0,004 0,007 0,005 0,002

'Вектор" (РФ) 0,010 0,030 0,020 0,053 0,094 0,076 0,061 0,057 0,037

1 Жирным шрифтом обозначены значения ОП, превышающие ОП критическое для данной тест-системы

включал контрольные) и сконцентрированных наиболее эффективными системами («CUNO», «Sartorius», «Вектор») АГ ВГА выявить не удалось. Не исключено, что даже при наличии в образцах АГ ВГА и последующего его эффективного концентрирования, количество АГ ВГА оказывалось ниже предела чувствительности использовашшх тест-системах. Вероятнее всего, малой концентрацией АГ ВГА, а также кратковременностью его выделения с фекалиями, был обусловлен незначительный процент выявления указанного маркера у 75 больных ГА па 1-й неделе заболевания, а также 36 контактных с ними лиц, исследованных при испытаниях тест-системы «ИФА антиген ВГА».

В то же время нами было установлено , что указанные тест-системы позволяют определять АГ ВГА в инфицированных различными штаммами ВГА клеточных культурах и их производных , и получать достаточно сопоставимые результаты (табл.7). Тождественность результатов титрования АГ ВГА в аналогичных вируссодержащих материалах была установлена и при испытании других ИФА тест-систем, построенных по такому же принципу , в частности отечественных тест-систем «ИФА антиген ВГА» и тест-системы «Вектогеп-А-антиген» по отношению к тест-системе «HAV antigen EIA» ( фирма "Mediagnost", ФРГ). Именно для этих целей, т.е. для выявления АГ ВГА в инфицированных ВГА материалах и их производных, обогащенным АГ ВГА в процессе его культивирования, исследованные тест-системы были рекомендованы в практику.

В итоге, проведенные исследования по сравнительному изучению диагностической эффективности тест-систем для выявления различных маркеров ГА позволили с одной стороны разработать требования и методы оценки их качества для внедрения их в практическую медицину, с другой стороны использование аттестованных тест-систем позволило обеспечить стандартные условия для другого важнейшего направления наших исследований, связанного с разработкой и стандартизацией национальных требований и методов контроля инакгивированных вакцин против ГА.

Та б л и ц а 7.

Показатели содержания АГ ВГА в исследуемых образцах по данным тест-систем " Вектогеп- А- антпгеп'" и "ИФЛ- ВГА -АГ"

Исследуемый обра- Штамм Кол- Тест-система Тест-система

зец ВГА во "Вектоген-А- "ИФА-ВГА-АГ"

проб антаген" (ГО " ИМБИО")

(ЗАО "Майстар")

СГТ Кол-во АГ СГТ Кол-во АГ

ВГА (нг/мл) ВГА нг/мл)

АГВГА диагности-

ческих тест-систем

сер 34 МБ - 7 10 1:16 116,8 ±20,4 1:18 122,4±19,8

сер 35 МБ - 7 10 1 :20 146,0 ±24,2 1:20 136,0+21,8

сер 36 МБ - 7 10 1 :20 146,0 ±34,2 1:20 136,0±21,8

сер 37 МБ - 7 10 1 : 16 116,8 ±20.4 1:17 115,6+19,8

сер 39 HAS-15 6 1 :32 233,6 ±34,5 1:32 217,6±32,7

Полуфабрикаты вак- ЛБА-86

цины "Геп-А-ин-

Вак"

ПС 700 3 1: 6 43,8 ±15,5 1:12, * 85,0±28,7

ПС 704 3 1:& 58,7 ±13,4 J 1:8 54,4±18,7

ПС 713 3 1:10 73,0 ±24,4 1:8 85,0+28,5

ПС 719 3 1: 64 467,2 ±49,1 1:52 435,2±42,8

ПС 740 3 1:13 9А,9 ±21,7 1:14 95,2±24,8

Полуфабрикаты вак- НМ-175

цины "HAVRIX 1440

сер. 5225 5 1:26 189,8±23,6 1:27 190,4±25,8

сер. 5241 5 1:32 232,6±36,4 1:30 204,8±32,4

Разработка и стандартизация методов контроля и требований к качеству ннактивированных вакцин против ГА.

Узловым вопросом при разработке ннактивированных вакцин против ГА является оценка их специфической безопасности и специфической активности. Методы контроля и требования к ним разрабатываются в процессе создания препаратов , совершенствуются по мере освоения их производства и оцениваются по результатам доклинических и клинических испытаний вакцин. Ис-

следования по этому разделу работы выполнены совместно с коллективом авторов - разработчиков первой отечественной вакцины "Геп-А-ин-Вак" под руководством член-корр. РАМН, профессора М.С. Балаяна.

Разработка и стандартизация теста на полноту инактивации ВГА in vitro для определения специфической безопасности вакцины "Геп-А-ин-Вак"

Основным критерием специфической безопасности вирусных инакги-вированных вакцин служит полнота инактивации вируса, которая в случае вакцин против ГА может быть оценена как в тестах in vitro на чувствительной к ВГА клеточной культуре, так и в тестах in vivo на чувствительных к ВГА обезьянах, например мармозетах. Учитывая практическую недоступность последних для рутинного контроля препарата, основные наши исследования были направлены по пути разработки метода in vitro . Поскольку производственный штамм ЛБА-86 ВГА не обладал цитопатическим действием, мы изучили возможность оценки полноты его инактивации по отсутствию вирусного антигена в клеточных культурах, инокулированных экспериментальными сериями вакцины "Геп-А-ин-Вак". АГ ВГА определяли в ИФА с помощью отечественных тест-систем.

С целью разработки и стандартизации условий постановки теста, которые гарантировали бы его надежность, мы провели предварительные исследования по определению интенсивности накопления АГ ВГА в клеточной культуре 4647 при заражении ее минимальными дозами производственного штамма ЛБА-86 ВГА. Схема накопления АГ ВГА включала первичное заражение и последующие 2-а пассажа с тремя вариантами культивирования по 14, 21, 28 дней каждый. В процессе культивирования ВГА накопление АГ ВГА определяли в клеточных лизатах, а также выборочно в культуральной жидкости.

Результаты проведенных исследований показали, что максимальное накопление АГ ВГА в лизате клеток отмечалось после 2-го пассажа ( табл.8 )• При этом 14 дневная схема репродукции ВГА обеспечивала определяемое в ИФА накопление АГ ВГА в клетках, изначально зараженных ВГА в дозе 10-

Таблица 8

Накопление антигена штамма ЛБА-86 ВГА в клеточной культуре 4647 при различных дозах инокуляции

и времени культивирования по данным ИФА.

Вид Оптическая плотность образцов лизатов клеток,полученных при различных условиях заражения их ВГА

культивирования и времени культивирования

Время Количество ВГА в Время Количество ВГА в Время Количество ВГА в

культи- инокуляте культиви инокуляте культиви инокуляте

вировани я (в ТкИД50/мл) рования (в ТкИДбо/мл) рования (в ТкИДя/мл)

100- 10-20 1-2 0 100- 10-20 1-2 0 100- 10-20 1-2 0

200 200 200

Первичное 14 сут 0,179 0,136 0,116 0,121 21 сут 0,194 0,334 0,124 0,133 28 сут 0,847 0,632 0,126 0,141

культивирование 0,177 0,131 0,113 0,154 0,310 0,354 0,132 0,125 0,662 0,638 0,103 0,113

0,118 0,162 0,112 0,162 0,166 0,148 0,152 0,142 0,536 0,225 0,121 0,125

0,113 0,178 0,117 0,131 0,412 0,142 0,140 0,112 0,564 0,237 0,114 0,126

Первый пасссаж 14 сут 0.3411 0,196 0,111 0,141 21 сут 0,520 0,603 0,124 0,114 28 сут 0,998 0,871 0,226 0,121

0,216 0,200 0,129 0,113 0,543 0,641 0,391 0,122 0,945 0,712 0,214 0,154

0,131 0,428 0,093 0,125 0,498 0,541 0,105 0,141 0,808 0,531 0,321 0,162

0,161 0,404 0,105 0,126 0,538 0,581 0,093 0,131 0,841 0,634 0,423 0,131

Второй пассаж 14 сут 0,521 0,211 0,211 0,133 21 сут 0,701 0,801 0,405 0,141 28 сут 1,123 1,071 0,513 0,133

0,361 0,197 0,231 0,125 0,632 0,731 0,421 0,142 0,901 0,921 0,412 0,125

0,211 0,528 0,178 0,142 0,531 0,654 0,592 0,132 0,834 0,803 0,711 0,142

0,197 0,631 0,131 0,112 0,701 0,623 0,341 0,121 0,791 0,844 0,410 0,112

Контроль клеток 2 час 0,115 0,120 0,113 0,121 2 час 0,150 0,199 0,146 0,150 2 час 0,146 0,151 0,140 0,166

с адсобирован-

ным ВГА

'Показатели , обозначенные жирным шрифтом указывают о превышении ОП опытных образцов по отношению ОП контрольных в 2,1 раза, что свидетельствует о накоплении в них АГ ВГА

200 ТкИДзо/мл , а при 21 и 28 дневных циклах - во всех опытных образцах независимо от дозы заражения. В культуральной жидкости на различных пассажных уровнях АГ ВГА не обнаружен. В итоге для проведения теста на полноту инактивации ВГА in vitro как наиболее оптимальная была выбрана 21 дневная схема накопления АГ ВГА, включающая первичное заражение и 2-а последующих пассажа по 21 дню с последующим выявлением АГ ВГА в лизате клеток.

С помощью разработанного теста in vitro была установлена Полнота инактивации ВГА в первых 5-и сериях вакцины "Геп-А-ин-Вак", при исследовании не менее 5% количества доз каждой серии. Доказательством их специфической безопасности , а также подтверждением эффективности разработанного метода являются результаты опытов in vivo с использованием восприимчивых к ВГА обезьян- мармозетД ..Saguinus mystax). Вакцину и препарат « Плацебо» вводили мармозетам внутримышечно по одной дозе 3-кратно-, с интервалом в 28 дней, используя по 4 обезьяны на каждую серию вакцины и «Плацебо». В ответ на введение препаратов у экспериментальных животных на протяжении всего курса иммунизации и последующих двух месяцев наблюдения признаков ГА отмечено не было: уровень сывороточных ферментов.( изо-цитратдегидрогиназы) не превышал порогового значения ; АГ ВГА в экстрактах фекалий по данным ИФА не выявлялся. В то же время, все серии вакцины индуцировали у обезьян образование сывороточных анти-ВГА антител (СГТ 1/150- 1/1082), которые обеспечивали животным защиту от инфицирования патогенным для них штаммом MS-1 ВГА в дозе 100 JID50. В ' контрольной группе животных , инфицированных тем же штаммом , через 10-20 дней после заражения были отмечены все выше перечисленные признаки гепатита А.

Совершенствование и стандартизация требований и методов контроля специфической активности вакцины "Геп-А-ин-Вак".

Для изучения специфической активности инактивированных вакцин против гепатита А нами были использованы методы in vivo и in vitro. Основой метода in vitro являлось количественное определение АГ ВГА в ИФА, а метод in

vitro состоял в оценке иммуногенной активности препарата на лабораторных животных. С целью разработки методов контроля и требований к специфической активности несомненный интерес представляло определение корреляции между результатами, полученными в опытах in vitro и in vitro.

При определении АГ ВГА в вакцине «Геп-А-ин-Вак» содержание его в лабораторных сериях ( ЛС) варьировало от 10 до 40 ИФА ед. на дозу, а в экспериментально - производственных сериях ( ЭПС) - от 54 до 120 единиц ИФА на дозу.

На первом этапе наших исследований для оценки иммуногенной активности инактивированной вакцины ГА были использованы морские свинки. При 4-х кратной иммунизации их одпой дозой вакцины по схеме 0,14, 28 и 56 дней было установлено, что индукция специфических анти-ВГА антител у животных находится в прямой зависимости от содержания антигена ВГА в прививочной дозе препарата (рис.2).

Рис.2. Зависимость СП" анти-ВГА антител у морских свинок от содержания АГ ВГА в вакцине

120

I I Количество АГ ВГА в одной дозе ( ИФА единицы) —»—СГПобратная вели-чина) _

Коэффициент корреляции между количеством АГ ВГА в исследованных сериях вакцтпш и СГТ анти-ВГА антител у иммунизированных животных составил 0,764 (р<0,05). Установленная нами прямая корреляционная зависи-

мость между содержанием АГ ВГА в вакцине и уровнем анти-ВГА антител у иммунизированных ею лабораторных животных позволила разработать требования к указанным показателям, определив их лимиты. Последние рассчитывались на основании содержания АГ ВГА в различных сериях препарата и индуцированным ими уровнем анти-ВГА антител у экспериментальных животных в соответствии с 95% интервалом варьирования СГТ анти-ВГА антител .

При изучении первых лабораторных серий он составил 1:329 - 1:1958 и нижний лимит СГТ анта-ВГА был установлен на уровне 1: 300. По мере совершенствования промышленной технологии производства вакцины "Геп-А-ин-Вак" и увеличения содержания АГ ВГА в прививочной дозе нами были повышены требования к ее иммуногенности . В настоящее время вакцина «Геп-А-ин-Вак должна содержать в прививочной дозе препарата не менее 50 ИФА ед. АГ ВГА, которые, в свою очередь, должны индуцировать образование анти-ВГА антител у морских свинок при 4-кратной схеме их иммунизации в титре не ниже 1: 600.

В дальнейших наших исследованиях была установлена корреляция между количественным содержанием антигена ВГА в прививочной дозе препарата и его иммуногенной активностью на другой экспериментальной модели животных - аутбредных мышах. Это позволило нам предложить более экономичный и информативный метод определения иммунизирующей дозы, способной вызывать образование анти-ВГА антитела у 50% животных (ИД50) при однократной введении препарата. Именно с использованием этого метода было проведено сравнительное изучение иммуногенной активности трех инактивированных вакцин против гепатита А - "Геп-А-ин-Вак" ( Россия), "HAVRIX - 1440" ( Бельгия), « VAQTA»( США). Эти исследования представляли существенный интерес прежде всего из-за различных показателей количествешюго содержания АГ ВГА в прививочных дозах вакцин, согласно их спецификации: «HAVRIX-1440» - не менее 1440 ИФА ед., "Геп-А-ин-Вак" и « VAQTA» - не менее 50 ИФА ед. Следует отметить, что для определения содержания АГ ВГА авторы зарубеж-

ных вакцин использовали различные по чувствительности тест-системы и свои ( национальные) стандарты АГ ВГА. При отсутствии международного стандарта АГ ВГА только исследования на основе унифицированных лабораторных тестов могут ответить на вопрос об их сравнительной специфической активности.

Результаты проведеш1ых нами исследований с использованием разработанных методов, национальных стандартов и единых коммерческих тест-систем показали, что количественное содержание АГ ВГА в прививочных дозах исследованных вакцин различалось не более , чем в два раза. В таких же пределах находились и показатели иммуногенной активности препаратов - ИД50, рассчитанные в принятых у нас в стране ИФА ед. , а также выраженные в % от прививочной дозы вакцины (табл. 9).

Таблица 9.

Показатели специфической активности различных серий вакцин отечественного и зарубежного производства

№№сери й Показатели специфической активности

Наименование препарата Номера серий Количество АГ ВГА поданным тест-системы «Вектогеп- А-антиген» (ИФА ед на дозу.) Показатели иммуногенной активности по данным тест-системы «В екто гсп-Л- а I п ите л а» (ИДзо /в % от прививочной дозы)

01 80 12 / 15%

«Геп-А-ин-Вак» 02 80 29 / 37%

(Россия) 03 80 28 / 36%

495 109 21 / 19%

«HAVRIX -1440» 505 114 15 / 14%

(Бельгия) 515 118 11 / 10%

0621357 160 21/ 13%

«VAQTA» 0621358 160 24 / 15%

(США) 0620940 160 23/ 14%

Таким образом, сопоставимость показателей по данным тестов in vitro и in vivo свидетельствовала о практически равной специфической активности исследованных вакцин.

Сравнительное изучение и оценка качества инактивироваиной вакцины "Геп-А-ин-Вак" по данным клинических исследований на добровольцах

Адекватность и эффективность предложенных нами лабораторных методов и требований к основным параметрам качества инактивированных вакцин - специфической безопасности и специфической активности была оценена на основании результатов клинических испытаний вакцины "Геп-А-ин-Вак", проводимых на добровольцах совместно с лабораторией испытания МИБП в полевых условиях ГИСК им.Л.А. Тарасевича ( руководитель д.м.н. Горбунов М.А.)

В испытаниях отечественной вакцины "Геп-А-ин-Вак" приняли участие взрослые лица, которые дали информированное согласие и получили вакцину или препарат «Плацебо» трехкратно внутримышечно в область дельтовидной мышцы с интервалом в 1 мес ( 0-1-2) в объеме 1,0 мл - 55 человек (лабораторные серии) или в объеме 0,5 мл - 58 человек (экспериментально- производственные серии).

Результаты изучения реактогенности и безопасности ЛС и ЭПС вакцины "Геп-А-ин-Вак" в условиях клинико-лабораторных наблюдений не выявили у привитых отклонений от физиологической нормы в показателях клеточного состава периферической 1фови, кала, мочи, а также уровня сывороточных ами-нотрансфераз. О специфической безопасности препарата свидетельствовали также статистически незначительные различия в частоте соматической и инфекционной заболеваемости в опытных и контрольных группах. Умеренная ре-актогенность вакцины "Геп-А-ин-Вак" проявлялась единичными общими реакциями (от 0 до 4%) в виде повышения температуры тела до субфебрильных цифр, головной боли, головокружения преимущественно после 1-го и 2-го введения препарата. Местные реакции у привитых на введение как вакцины,

так и препарата плацебо регистрировались в равном проценте случаев ( от 3% до 32%) и проявлялись в виде незначительной болезненности и фибриллярных подергиваний мышц в месте введения препарата.

При анализе результатов иммуногенной активности было установлено, что трехкратное введение ЛС и ЭПС вакцины "Геп-А-ин-Вак" обеспечивало образование анти-ВГА антител у серонегативных добровольцев практически в равном проценте случаев ( 87,3% - 94,2%). В то же время у привитых ЭПС вакцины процент сероконверсий после 1 прививки ( 47,3 %) по сравнению с ЛС ( 23,5%) нарастал интенсивнее и с более высоким уровнем анти-ВГА антител при последующих введениях препарата ( рис.3 ). Следует отметить, что в контрольных группах лиц, получивших препарат «Плацебо», каких либо существенных изменений в показателях содержания анти-ВГА- антител отмечено не было. Эти результаты вполне согласуются с данными, полученными при изучении иммуногенной активности ЛС и ЭПС в опытах на лабораторных животных и свидетельствуют об адекватности разработанных требований и методов коптроля па уровне лабораторных тестов.

Профилактическая эффективность вакцины Геп-А-ин-Вак" была изучена в условиях контролируемого эпидемиологического опыта на эндемичной по гепатиту А территории. Методом случайной выборки. среди организованных контингентов взрослых лиц были сформированы 2 группы, одна из которых (917 человек) была привита вакциной "Геп-А-ин-Вак", другая - группа сравнения (952 человек) была иммунизирована рекомбинантной вакциной против гепатита В. Вакцины вводились трехкратно по схеме 0-1-6 мес. При наблюдении за привитыми, которое осуществлялось в течение 8 мес после окончания курса иммунизации, в период сезонного подъема заболеваемости ГА в группе привитых вакциной "Геп-А-ин-Вак" был зарегистрирован лишь один случай ГА. Заболеваемость в этой группе составила 1,1 на 1000 привитых, а в группе сравне-

РиС. 3. Процент серокоНверсии и соотношение титров антит-ВГА антител в группах привитых ЛС и ЭПС ёакцины "Геп-А-ин-Вак"

3-я прививка ЭПС 3-я прийивка Л(3

■ ■. - < - . - г-

2-я прививка ЭПС 2-я прививка ЛС 1-я прививка ЭПС 1-я прививка ЛС

В Процент сероконвер сии в целом по группе

В! % лиц с уровнем анти-ВГА антител >100 мМЕ/мл

8% лиц с уровнем анти-ВГА антител от 40 до 80 мМЕ/мл

□ %лицс уровнем анти-ВГА антител >20 до 40 мМЕ/мл

ния - 48,3 на 1000 человек (коэффициент эффективности вакцины "Геп-А-ин-Вак" - 97,7%).

Таким образом , на основании проведенных исследований при использовании утвержденных национальных стандартов и атгестоватшх отечественных тест-систем разработаны и стандартизованы методы контроля, а также требования к основным показателям качества инактивированных вакцин против гепатита А. Результаты доклинических и клинических исследований отечественной вакцины "Геп-А-ин-Вак", свидетельствующие о ее безопасности, слабой реактогенности, выраженной иммуногенной активности и профилактической эффективности позволили подтвердить адекватность и эффективность разработанных тестов. Разработанные национальные требования и методы оценки основных показателей качества инактивированных вакцин против ГА, введены в утвержденную на вакцину «Геп-А-ин-Вак» нормативную документацию (ВФС и ЭПР). Это обеспечило внедрение в практику здравоохранения первого отечественного препарата и осуществление надзора за его качеством при последующем серийном выпуске, а также возможность проведения аттестации в соответствии с национальными требованиями аналогичных зарубежных препаратов при их регистрации в РФ.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработаны национальные требования и стандартизованы методы контроля препаратов для диагностики и профилактики гепатита А, позволяющие обеспечивать надзор за их качеством при внедрении в практику и серийным выпуске.

2. Разработаны принципы получения и аттестации национальных стандартов -отраслевых стандартных образцов к основным маркерам гепатита А, а также панели сывороток с заданными характеристиками. Получены и применены на практике : ОСО иммуноглобулинов класса М, содержащие и не содержащие антитела к ВГА (ОСО-42-28-162-89 и ОСО-42-28-163-89) ; ОСО сывороток, содержащие и не содержащие антитела к ВГА (ОСО 42-28-158 -88 и ОСО 42-28-178-90); ОС О панели сывороток, содержащие и не содержащие ан-ти-ВГА 1дМ (ОСО 42-28-220-96).

3. Определена антигенная специфичность и изучены биологические свойства производственных штаммов ВГА (ЛБА-86, Л -2424, МБ-7 ). Установлено, что они различаются по репродуктивной активности, а также по накоплению вирусного антигена в клеточных культурах. Аттестованы в качестве производственных : штамм ЛБА-86 - для получения вакцины "Геп-А-ин-Вак"; штаммы Л -2424 и МБ-7 - для получения диагностических препаратов.

4. Стандартизована и усовершенствована система аттестации препаратов для диагностики ГА в лабораторных тестах и клинико-эпидемиологических испытаниях, позволяющая дифференцировать их по качеству. Предложен и апробирован унифицированный подход к сравнительной оценке их диагностической эффективности в полевых условиях , математический алгоритм которого явился основой для разработки компьютерной программы «ДИАТЕСТ».

5. С помощью полученных стандартов разработаны и усовершенствованы лабораторные критерии оценки качества тест-систем для выявления различных маркеров гепатита А , эффективность которых подтверждена результатами

сравнительной их оценки в полевых испытаниях. При онсшсс качества тест-систем для выявления анти-ВГА 1£М показано преимущество стандартной панели сывороток с заданными характеристиками по сравнению с моностандартами. Установлено, что отечественные препараты по своей диагностической эффективности не уступают зарубежным изученным аналогам.

6. Экспериментально обоснованные , впервые сформулированные и введенные в нормативные документы ( ВФС, ФС, ЭПР, ПР) требования, методы и критерии оценки основных показателей качества тест-систем для выявления различных маркеров ГА позволили обеспечить условия для внедрения в практику здравоохранения первых отечественных препаратов для диагностики гепатита А ( четырех ИФА тест-систем для выявления анти-ВГА 1§М ; двух ИФА тест-системы для выявления суммарных антител к ВГА; двух тест-систем для выявления АГ ВГА), а также установить постоянный мониторинг за их качеством.

7. Разработана система стандартизации, методов контроля и требований к основным вирусологическим параметрам качества инакгивированных вакцин против ГА, основанная на использовании национальных стандартов и аттестованных отечественных тест-систем для выявления маркеров ГА..

8. Исследована динамика накопления АГ ВГА в культуре клеток 4647 при заражешга их минимальными дозами производственного штамма ЛБА-86, позволившая отработать и стандартизовать метод контроля полноты инактивации ВГА в вакцине, гарантирующий ее специфическую безопасность. Эффективность метода и критерии его учета подтверждены результатами изучения специфической безопасности вакцины "Геп-А-ин-Вак" на чувствительных обезьянах мармозетах, а также результатами испытания препарата на добровольцах.

9. Разработаны методы контроля и критерии оценки специфической активности инакгивированных вакцин , оцениваемой по количественному содержанию АГ ВГА в ИФА и иммуногенной активности в опытах на лабораторных

животных ( морские свинки, мыши). Предложен более экономичный и информативный метод оценки иммуногенной активности вакцин на мышах по определению 50% иммунизирующей дозы (ИД 50).

10. Адекватность разработанных лабораторных методов контроля и лабораторных критериев оценки основных показателей качества инактивирован-ных вакцин против ГА подтверждена результатами клинико-эпидемиологических испытаний вакцины "Геп-А-ин-Вак" на различных этапах ее разработки и освоения промышленного выпуска.

11. Разработанные национальные требования и методы оценки основных параметров качества инакгивированных вакцин против ГА , позволяющие гарантировать получение специфически безопасного и профилактически эффективного препарата , соответствующего исследованным нами зарубежным аналогам, введены в нормативную документацию ( ВФС и ЭПР) на первую отечественную вакцину «Геп-А-ин-Вак».

* * *

Приношу глубокую благодарность академику АЕН РФ, профессору Т. А. Бектимирову и член -корреспонденту АЕН РФ, профессору Л. Г. Карпович за ценную консультативную помощь в работе и при оформлении диссертации.

Основные результаты , изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ГИСК им.Л.А.Тарасевича : д.м.н. МАГорбуновым , д.б.н. В.Г. Петуховым и др.; ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН : профессором Балаян М.С., д.б.н. Ю.Ю.Кусовым и др; ГНЦВБ: к.б.н. А.Г. Майданюком, к.х.н. А:Н. Каневым и др., которым я искренне благодарна за содействие в проведении исследований.

Искренне признательна всем соавторам и коллегам лаборатории энтеро-и ротавирусных инфекций, а также сотрудникам других подразделений ГИСК им.Л.А.Тарасевича за поддержку и помощь в проведении настоящей работы

Список научных работ, опубликовашгых по теме диссертации

1. Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Ефимова О С. Современное состояние проблем!,г разработки, стандартизации и контроля препаратов для диагностики гепатита А. - В кн.: Тез Респуб. конф. "Новые методы диагностики СПИД и др. инфекций в практике инфекционной и противоэпидем. службы"- Алушта.-1990.-С.50-51

2. Калашникова Т.В., Карпович Л.Г., Алейник М.Д., Быстрова Т.Н., Копнена И.О. Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца суммарных антител к вирусу гепатита А - В кн. : "Вопросы эпидемиологии, иммунологии и диагностики вирусных инфекций-Свердловск-1990,- часть 2 -С130-133

3. Карпович Л.Г., Калашникова Т.В. Проблема разработки, стандартизации и контроля препаратов для диагностики вирусного гепатита А Итоги науки и тех. ВИНИТИ : Сер. Вирусология. - 1990. - т.22. - С.12.

4. Кусов Ю.Ю., Эльберт Л.Б.Б Казачков Ю.В., Полещук В.Ф., Крутянская Г.В., Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Балаян М.С. Изучение специфической активности , реактогенности и безопасности культуралыюй инактивированной вакцины против гепатита А. Итога науки и тех. ВИНИТИ: Сер. Вирусология. - 1990. - т.22. - С. 14.

5. Калашникова Т.В., Карпович Л Г., НикитюкН.М. , Горбунов М.А., Евреинова Е.Э. Сравнительное изучение чувствительности и специфической активности иммунофермент-ной тест-системы для выявления антител класса М к вирусу гепатита А. - ЖМЭИ.-№ 5,1991.- С.36-38

6. Калашникова ТВ., Карпович Л.Г., Никитюк Н.М., Горбунов М.А., Евреинова Е.Э., Нельга И.В., Кусов Ю.Ю., Балаян С.С. - Изучение диагностической эффективности иммуно-ферментной тест-системы для выявления антител класса М к вирусу гепатита А. - Мат-лы Всесоюзной конф. «Экгеровирусы. Общетеоретические и медицинские аспекты» Киев -1991-С.54.

7. Карпович Л.Г., Калашникова Т.В.,-Ефимова О.С. Состояние проблемы разработки, .стандартизации и контроля препаратов для диагностики и профилактики гепатита А в СССР. - Тез. док. в сб. " Теоретические и прикладные аспекты молек. биологии"- Самарканд .-1991,- С.87

8. Кусов В В., Казачков Ю.А., Панина Л.И., Орлова Т.М., Нельга И.В.„ Эльберт Л. Б., Крутянская Г Л., Лисицина Е.А., Карпович Л.Г., Калашникова Т В., Балаян М.С. Вакцина для профилактики вирусного гепатита А. - Тез.док. УТ Всероссийского съезда микробиологов и паразитологов.-Н. Новгород - 1991,- том.2- С. 183-184

9. Карпович Л.Г., Калашникова ТВ., Кусов Ю.Ю., Балаян М М. Принципы совершенствования методов ко I про ля специфической безопасности новой инактивированной вакцины против гепатита А. - В кн.: "Поствакцинальные осложнения: патогенез, профилактика, лечение" -Мат-лы. Всесоюз. научно-, прак. коиф,- Ленинград -1991,- С.49.

10. Кусов Ю.Ю., Орлова Т.М., Панина Л И., Казачков Ю.А., Полещук Б.Ф, Соболь А.Б., Титова И.П., Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Балаян М.С. Специфическая безопасность культуральной инактивированной вакцины против гепатита А. - Ж Вопр. вирусологии - 1991- № 2 - С. 156-159.

11. Кусов Ю.Ю., Эльберт Л.Б., Казачков Ю.В., Валько Н.М., Нельга И.В., Гришина Г.К., Крутянская Г Л., Лисицина Е.А., Полещук Б.Ф., Соболь А.Б Титова И. П.,, Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Балаян М.С. Иммуногенность культуралыюй инактивированной вакцины гепатита А. - Ж.. Вопр. вирусоло-гии - 1991.- № 3- С.206-209.

12. Горбунов М.А., Никитюк Н.М., Соловьев Э.И., Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Рейзин Ф.Р., Ананьев В.А., Дорошенко Н.В., Донец М.А., Фаворов М.О. Результаты полевого контролируемого испытания диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сухого для выявления антигена вируса гепатита А - 2КМЭИ - 1991.-№ 11.-С.43-45

13. Калашникова Т.В., Карпович Л.Г., Евреинова Е.Э., Карпова Е.В., Левина В.Д. Аттестация препаратов для ускоренной диагностики вирусного гепатита А - иммуноферментной тест-системы для выявления иммуноглобулинов класс M к ВГА - «Вектогеп-A-IgM» -Тез. конф. "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии .-Махачкала. -1992.-С. 145-146

14. Калашникова Т.В., Карпович Л Г., Евреинова Е.Э., Карпова Е.В., Левина В.Д. Сравнительное изучение диагностической эффективности вновь разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления иммуноглобулинов класса M к вирусу гепатита А ("Векгогеп-AIgM)-- В кн.." Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций"

- Сб. тр. ЕНИИВИ. - Екатеринбург- 1992,- С.177-180.

15. Калашникова Т.В., Карпович Л .Г., Левина В.Д., Ермолаева Т.Н. Изучение диагностической эффективности иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу гепатита А- В кн.:" Состояние и перспективы развития препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых спец. средствами профилактики" . - Мат-лы докл. Всероссийской конф.-Пермь-1993.-С.51

16. Карпович Л.Г., Калашникова Т В., Левина В.Д., Ермолаева Т.Н. К вопросу о разработке и стандартизации методов контроля, препаратов для диагностики вирусного гепатита.

- В кн.:" Состояние и перспективы развития, препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых спец. средствами профилактики" . - Мат-лы докл. Всероссийской конф.-Пермь-1993,- С.53

17. Карпович Л.Г., Петухов В.Г., Евреинова Е.Э., Калашникова Т.В., Карпова Е.В. Разработка математического подхода и компьютерной программы для оценки эффективности препаратов для диагностики ротавирусной и других инфекций . - В кн.:" Состояние и перспективы развития, препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых спец. средствами профилактики" . - Мат-лы докл. Всероссийской конф -Пермь-1993 -С.54

18. Калашникова Т В., Карпович Л.Г., Левина В.Д., Ермолаева Т.Н. Результаты полевых испытаний первой отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления суммарных антител к вирусу гепатита А.-В кн.: «Диагностика и профилактики ВИЧ- инфекций и вирусных гепатитов» -Хабаровск- 1993,- С.73-75.

19. Карпович Л.Г., Калашникова Т В., Левина В.Д., Ермолаева Т.Н. Состояние проблемы разработки препаратов дня профилактики вирусного гепатита А -В кн.: «Диагностика и профилактики ВИЧ- инфекций и вирусных гепатитов» -Хабаровск- 1993 - С. 67-69

20.Калашникова Т.В., Карпович Л.Г., Евреинова Е.Э., Карпова Е.В., Левина В. Д., Ермолаева Т.Н. Оценка диагностической эффективности отечественных иммуноферментных тест-систем для выявления иммуноглобулинов класса M к вирусу гепатита А,- В кн.: «Диагностика и профилактики ВИЧ- инфекций и вирусных гепатитов» -Хабаровск- 1993,-С. 70-72

21.Майданюк А.Г., Тюнников Г.Н., Конакова В.Е., Бондаренко Е.П., Немцов Ю.В., Карпович Л.Г., Калашникова Т.В., Мамаева Н.В., Сосновцев C.B., Чижиков В.Е. Выделение и изучение характеристик цигопатического штамма вируса гепатита А . - Ж. Вопр. вирусологии - 1993. - №3. - С.101-105