Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C

Эльберт, Елизавета Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C"

11-6 420

На правах рукописи

Эльберт Елизавета Викторовна

Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов В и С

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.Л.А.Тарасевича» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук Волкова Рауза Асхатовна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Михайлов Михаил Иванович доктор биологических наук Николаева Ирина Александровна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « /У» /¿¿/ceM-f 201в

на заседании

диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН (142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита, 27 км. Киевского шоссе)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН г. Москва (142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита, 27 км. Киевского шоссе)

Автореферат разослан «/^ »

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук O.A. Медведкина

^ - • ■ ■-> ■ • ' I I I тп

Ь;.:1 Л ÜCYEKA 1

гон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Вирусные гепатиты представляют собой серьезную проблему для здравоохранения ввиду их повсеместного распространения. Наибольшего внимания требуют гепатиты В и С [Соринсон С.Н., 1998, Sypsa V. et al, 2005, WHO Fact Sheet, 2000]. По последним данным в России на смену резкому подъему заболеваемости острыми формами вирусных гепатитов, наблюдавшемуся в 1995-1999 гг., [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И. с соавт., 1999] пришла эпидемия хронических вирусных гепатитов [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Для выявления этиологических агентов вирусных гепатитов все большее значение приобретает лабораторная диагностика, она позволяет выявлять возбудителя на ранних стадиях инфицирования и оценивать эффективность проводимой противовирусной терапии. Одним из перспективных методов в этом отношении является метод на основе амплификации нуклеиновых кислот, в частности, полимеразная цепная реакция [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003, Михайлов М.И., 2001, Момыналиев К.Т., Говорун В.М., 2000].

Активная разработка наборов реагентов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) как для качественного, так и количественного определения ДНК и РНК возбудителей инфекционных заболеваний и организация их производства требует стандартизации проведения их испытаний и оценки качества. При оценке качества наборов для выявления культивируемых микроорганизмов используют чистые культуры. С этой точки зрения стандартизация наборов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С затруднена.

В настоящее время в Российской Федерации проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание [ГОСТ Р ИСО 17511-2007, ГОСТ Р ИС015193-2007, ГОСТ Р ИСО 15194-2007]. Порядок проведения испытаний наборов реагентов изложен в ГОСТ Р 51352-99. Однако раздел, относящийся к наборам реагентов для «микроанализа нуклеотидных последовательностей», предусматривает оценку качества наборов только по положительному и отрицательному контрольным образцам [ГОСТ Р 51352-99 п.4.2.2], что недостаточно для объективной оценки наборов.

Таким образом, разработка системы проведения испытаний наборов реагентов на основе ПЦР с целью обеспечения единства требований к ним на модели вирусов гепатитов В и С является актуальной задачей.

Цель исследования

Разработка системы испытаний наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С методом ПЦР.

Задачи исследования

1. Разработать на основе принципов валидации аналитических методик систему лабораторных испытаний наборов реагентов для выявления и количественного определения ДНК/РНК вирусов гепатита В/С методом ПЦР, а именно: для неколичественного выявления нукпеиновых кислот оценку:

- специфичности;

- предела обнаружения (аналитической чувствительности); для количественного определения нуклеиновых кислот оценку

- специфичности;

- линейного диапазона определяемых величин;

- прецизионности;

- правильности.

2. Разработать отраслевой стандартный образец содержания РНК НСУ для определения аналитической чувствительности, специфичности, воспроизводимости соответствующих наборов реагентов методом ПЦР.

3. Провести оценку диагностической эффективности изученных наборов реагентов на клинических образцах.

Научная новизна

Впервые разработана система лабораторных испытаний ПЦР наборов реагентов, позволяющая по единому плану оценивать ПЦР наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности, линейного диапазона определяемых величин, прецизиониости, правильности и воспроизводимости.

Впервые с целью стандартизации наборов реагентов на основе ПЦР введен принцип оценки аналитической чувствительности по минимальной концентрации, выявляемой со 100 % воспроизводимостью при десятикратной постановке анализа.

Впервые разработан отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ ОСО 42-28-366-06П), с помощью которого стандартизован контроль наборов реагентов для выявления РНК НСУ.

Практическая значимость Методика определения аналитической чувствительности внесена в стандарты качества ФСП (с 2007 г - в ТУ) на наборы реагентов: для выявления ДНК вируса гепатита В

- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс НВУ-240/Вк0-770» (ТУ 9398-040-01897593-2009 ФСР 2007/00813 от 14.08. 2009); «Биоком-НВУскрин-пяПЦР-тест» (ФСП 42-0114-0276-00); «ДиаГен-НВУ» (ФСП 42-00400053-00) и «Авиценна-НВУ-ПЦР» (ФСП 42-0116-0279-00);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенс НВУ-РЯТ»( ТУ 9398-030-01897593-2007.ФСР 2007/00585 от 09.08. 2007) и «АмплиСенс НВУ-РЕР»( ТУ 9398-032-01897593-2007.ФСР 2007/00586 от 09.08. 2007>/

для выявления РНК вируса гепатита С:

- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс НСУ-240-/ВКО-440» (ФСП 42-0155-1135-01);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенсНСУ-РЯТ» (№ ФС 01032006/5667-06 от 26 декабря 2006 г) и «АмплиСенс НСУ-РЕР»(№ ФС 01032006/5670-06 от 27 декабря 2006 г);

для количественного определения РНК вируса гепатита С:

- с гибридюационно-фермептчой детекцией: «АмплиСенс НСУ-Монитор» (ФСП 42-0115-6363-05; № Л С-000918 от 18.11.2005 г.);

- с гибридизационно-фпуоресцентной детекцией:

«АмплиСенс НСУ-Монитор- РЯТ (№ ФСР 2007/00577 от 9 октября 2007 г).

Наборы реагентов зарегистрированы в РФ и разрешены к применению в диагностической практике.

Материалы диссертации были использованы при подготовке Методических указаний 3.3.2.1886-04 «Валидация методов контроля химических и физико-химических показателей качества МИБП: организация, порядок проведения и представления результатов», М. 2004

Разработанный и аттестованный Отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) 42-42-366-06П внесен в реестр отраслевых стандартных образцов МИБП.

Совокупность новых научных результатов и положений, выносимых на защиту

1. На основе принципов валидации аналитических методов разработана система лабораторных испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С в отношении специфичности, аналитической чуствительности, линейного диапазона, прецизионности и правильности.

2. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С позволяет оценивать качество наборов реагентов для выявления РНК НСУ в отношении аналитической чувствительности, воспроизводимости, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности и правильности

Апробация работы Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого совета ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России «31» марта 2011г. Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика в современной медицине», Москва, 2000, 2002, 2004; 2006; 2007, 2008, 2009 и 2010 гг.; Всероссийских конференциях по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2006, 2008,2010 гг.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 статей в научных журналах, из них 3 в реферативных изданиях, 6 публикаций в материалах конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 49 таблиц, 9 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 30 отечественных и 130 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы

В работе использовали: наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В с электрофоретической детекцией (I - IV):

«АмплиСенс HBV-470s/BKO-770» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора;

«Ьиоком-НВVrK|,HH-nsl II (Р-тест» ООО компания «Биоком»; «ДиаГен-HBV» ЗАО «Лагис»;

«Авиценна-НВУ-ПЦР» ООО Медицинский Центр «АВИЦЕННА» (12 серий).

Наборы реагентов для выявления РНК вируса гепатита С с электрофоретической детекцией (1-2): «АмплиСенс HCV-240-/BKO-44Û» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора и «БИОКОМ-НСУскриы ™ - nsRT-ПЦР тест» ООО «БИОКОМ» (6 серий)

Наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцеитной детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс HBV-FRT» (3 серии) и «АмплиСенс HBV-FEP» (3 серии), ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Наборы реагентов для выявления РНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс HCV-FRT» (3 серии) и «АмплиСенс HCV-FEP» (3 серии), ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Наборы реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С: набор реагентов с гибридизационно-ферментной детекцией «АмплиСенс ВГС Монитор» (ГИФА) - 3 серии, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

набор реагентов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс HCV-Монитор-FRT» (FRT) - 3 серии, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

набор реагентов «Cobas Amplicor HCV Monitor test» версия 2.0, Хоффманн Ла-Рош, Швейцария.

Рабочий стандартный образец ДНК вируса гепатита В (образцы АА; ВВ и СС), Национальный Институт биологических стандартов и контроля, (National Institute of Biological Standards and Control, (NIBSC), Великобритания, криопреципитированная плазма крови человека, содержащая вирус гепатита В (генотип А, субтип adw2) в концентрации 1-3 х I06 копий/мл (РСО HBV).

Рабочий стандартный образец РНК вируса гепатита С NIBSC RNA HCV 98/576 NIBSC, Великобритания, криопреципитированная плазма крови человека, содержащая вирус гепатита С (генотип lb) в концентрации Ю3 копий/мл (РСО HCV).

Международный стандартный образец РНК вируса гепатита С 96/750 UK ENG 63 О, NIBSC, Великобритания, криопреципитрованная плазма крови человека, содержащая вирус гепатита С (генотип lb) в концентрации 5х 104 МЕ/амп (МСО HCV).

Отраслевой стандартный образец содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В (ОСО 42-28-322-99) с концентрацией ДНК (1,5+0,4) х 10й копий/мл (ОСО ДНКНВ5А!; HB V).

Клинические образцы - плазма крови больных, охарактеризованная на наличие маркеров вирусных гепатитов - предоставлены клиническими инфекционными больницами № 1 и № 2 г. Москвы. Образцы донорской крови были получены с донорских пунктов г. Москвы. В качестве отрицательных образцов использовали сыворотку крупного рогатого скота для культуры тканей (ФС 42-3410-99) и ДНК плаценты человека (Sigma, США, кат № D3035).

Методы

ПЦР проводили в соответствии с инструкциями по применению исследуемых наборов реагентов.

Пятикратные разведения образцов готовили с помощью СКРС. Разведения готовили из образца с исходной концентрацией в 5; 25 и 625 раз. Разведение в 3125 раз готовили из разведения в 625 раз.

Оценку образцов на наличие маркеров вирусного гепатита В методом ИФА проводили совместно с лабораторией трансфузионных гепатитов и контаминантов ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича МЗ и CP РФ.

Статистическую обработку, построение графиков зависимости логарифма концентрации от логарифма разведения, расчет уравнения линии регрессии, коэффициентов детерминации и корреляции проводили общепринятыми методами (ГланцС., 1999; Дерфель К., 1994) при помощи программного обеспечения Excel.

Оценку линейности и параллелизма проводили методом параллельных линий (В.Г.Петухов, 2004 г) по программе «Парапайн» (Свидетельство № 2006612065 от 15.06.2006 г).

Оценку прецизионности и правильности проводили по ICH Q2A и Q2B.

Диагностическую эффективность оценивали по СП 3.3.2.561-96.

Испытания на клинических образцах проводили совместно с разработчиками изучаемых наборов реагентов. Экспериментальные материалы, необходимые для аттестации ОСО содержания РНК вируса гепатита С, были получены совместно с ФГУ11 ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Разработка системы испытаний наборов реагентов для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С методом ПЦР

Наборы реагентов на основе ПЦР - это многокомпонентные наборы, включающие в себя все необходимые реагенты для выявления ДНК или РНК, готовые к применению, т.е. это методика, обеспеченная стандартизованными реагентами. В связи с этим мы подошли

к ним с точки зрения валидации методики в соответствии с международными рекомендациями [ICH Q2A и Q2B, Eurochem 1998] и для [«количественных наборов изучили специфичность и аналитическую чувствительность. Для количественных наборов изучили специфичность, линейность, диапазон определяемых величин, прецизионность и правильность.

Для оценки специфичности изучаемых наборов реагентов в качестве положительных образцов использовали разработанный нами ранее ОСО ДНКНв5Ае HBV, рабочие и международные стандартные образцы содержания ДНК HBV и РНК HCV. В качестве отрицательных образцов использовали образцы сыворотки крупного рогатого скота для культуры тканей (СКРС), ДНК плаценты человека, образцы плазмы крови доноров и образцы плазмы крови от больных вирусными гепатитами другой, отличной от изучаемой •этиологии.

1.1. Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В с электрофоретической детекцией результатов

Изучение специфичности и предела обнаружения При тестировании 4-мя наборами реагентов образцов ОСО Д1 1KHBsas HBV и МСО HBV были получены положительные результаты. При тестировании образцов СКРС, ДНК плаценты человека, образцов плазмы крови от больных вирусными гепатитами С (5 образцов) и А (5 образцов) получены отрицательные результаты, что свидетельствует о специфичности наборов реагентов.

Для определения аналитической чувствительности использовали образцы ОСО ДНКНВ5А!. HBV и образцы PCO HBV. Анализ проводили на образцах, разведенных до концентрации 103 и 102 копий/мл. Результаты показали, что все исследуемые наборы реагентов выявляли ДНК HBV в концентрации 103 копий/мл как в образцах PCO HBV, так и в ОСО ДНК HBV, концентрацию 102 копий/мл наборы реагентов не выявляли.

В связи с тем, что полученные результаты не подтвердили аналитическую чувствительность, заявленную разработчиками, мы провели повторный опыте 10-кратным исследованием образцов с концентрацией ДНК 103 и 5x10" копий/мл (табл.1).

Таблица 1

Определение специфичности и предела обнаружения исследуемых наборов

реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с _электрофоретической детекцией результатов амплификации

Исследуемый материал Концентрация Результат ПЦР для набора реагентов

ДНК HBV общее число постановок/«+» результат

копий/мл 1 11 111 IV

PCO HBV 10/10 10/10 10/10 10/10

(АА) 5x10- 10/8 10/9 10/0 10/10

ДНЬС плаценты человека - - - - -

СКРС - - - - -

Плазма крови от больных HCV - - - - -

Плазма крови от больных HAV - - - - -

В образцах с концентрацией 103 копий/мл все наборы выявляли ДНК HBV, т.е., воспроизводимость составила 100 %. В образцах с концентрацией 5x102 копий/мл такой результат показал только набор IV, наборы I, II и III в этом случае выявляли ДНК HBV с воспроизводимостью 80 - 90 %.

Проведенные исследования показали, что для оценки аналитической чувствительности необходим статистический подход, т.е. установление минимальной концентрации, выявляемой со 100 % воспроизводимостью при многократном повторении. За рубежом в соответствии с Директивой ЕС Европейского парламента установлено количество повторов равное 24 при 95 % воспроизводимости. По нашему мнению 24-кратный повтор необходимо проводить при разработке набора. Для оценки аналитической чувствительности в лабораторных испытаниях при регистрации достаточен объем выборки, равный 10 с получением положительного результата во всех пробах.

В соответствии с этим критерием аналитическая чувствительность наборов I, II, III составила 103 копий/мл; набора реагентов IV - 5x102 копий/мл.

Таким образом, полученные результаты позволили нам ввести определение аналитической чувствительности по минимальной концентрации нуклеиновой кислоты, которая при десятикратной постановке выявляется с воспроизводимостью 100 %.

Для лабораторных испытаний наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР проведена оценка:

- специфичности с использованием в качестве положительного образца стандартного образца ДНК вируса гепатита В (нуклеиновой кислоты соответствующего вируса), в качестве отрицательных образцов - образцы ДНК человека и СКРС;

- аналитической чувствительности с использованием ОСО ДНКНВ5Л!, HBV в 10-5-2-кратных разведениях - в зависимости от точности, с которой необходимо установить аналитическую чувствительность.

Разработанный подход был применен для изучения двух наборов реагентов для выявления ДНК HBV с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» (в процессе амплификации) и по «конечной точке» (по окончании амплификации). Показана их специфичность, аналитическая чувствительность составила 102 копий/мл, воспроизводимость - 100 %.

1.2. Изучение наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С с электрофоретической детекцией результатов и с гибридизационно-ферментной детекцией продуктов ПЦР в процессе амплификации (в режиме «реального времени») или по окончании процесса амплификации (по «конечной точке»)

Разработанный подход был также использован для изучения наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С: двух - на основе электрофоретической детекции, двух - на основе гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме «реального времени» (в процессе амплификации) и по «конечной точке» (по окончании амплификации).

Для оценки специфичности изучаемых наборов реагентов в качестве положительных образцов использовали PCO HCV и ОСО РНК HCV. В качестве

отрицательных образцов использовали образцы СКРС, ДНК плаценты человека, образцы плазмы крови доноров и образцы плазмы крови от больных вирусными гепатитами другой, отличной от изучаемой этиологии.

Изучение специфичности и аналитической чувствительности Наборы реагентов для выявления РНК НСУ с электрофоретической детекцией (1 и 2) были специфичны. Аналитическая чувствительность составила 5x10 копий/мл. В образцах с концентрацией 5x10" копий/мл набор 1 выявлял РНК НСУ с воспроизводимостью 60-40 %, набор реагентов 2 РНК НСУ не выявлял.

Наборы реагентов для выявления РНК НСУ с гибридизационно-ферментной детекцией также были специфичны, аналитическая чувствительность наборов реагентов составила 102 копий/мл РНК НСУ при детекции в «режиме реального времени» и 5х102 копий/мл при детекции по «конечной точке». В образцах с концентрацией 5x10 копий/мл оба набора выявляли РНК НСУ с воспроизводимостью 50 %.

1.3. Изучение диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С с электрофоретической и гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов амплификации

Оценку диагностической эффективности изучаемых наборов реагентов провели с использованием клинических образцов, оценивая диагностическую чувствительность на образцах опытной группы и диагностическую специфичность на образцах контрольной группы. Каждый опыт проводили с соблюдением принципов контролируемого эксперимента, все изучаемые клинические образцы были зашифрованы и тестировались практически одновременно.

1.3.1. Изучение диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с электрофоретической детекцией

Опытная группа была представлена больными с различными формами гепатита В -52 образца. Контрольная группа была представлена больными гепатитами другой этиологии и образцами плазмы крови от здоровых лиц и пробами СКРС (95 образцов). Всего было исследовано 147 образцов.

При оценке результатов ПЦР-исследования клинических образцов проводили сравнение с установленным клиническим диагнозом, с результатами ИФА на наличие HBsAg, а также с результатами, полученными при исследовании образцов при помощи референтного набора. Проведенные исследования показали в целом совпадение результатов ПЦР испытуемых наборов с результатами ИФА на наличие HBsAg , диагнозом и результатами ПЦР референтного набора. При сравнении результатов, полученных при помощи исследуемых и референтного наборов, за истинно «положительные» и истинно «отрицательные» принимали все «положительные» и «отрицательные» результаты, полученные при помощи референтного набора.

Перед окончательной обработкой результатов все ложноположительные результаты, полученные в проведенных исследованиях, как по отношению к клиническому диагнозу,

так и к данным ИФА на наличие HBsAg (всего 21 образец), были повторно проверены в ГИСК методом ИФА на наличие HBsAg и антител к HBcAg.

В 6 образцах из 21 получены положительные результаты в ИФА на наличие HBsAg, что не позволило считать положительные результаты ПЦР, полученные в контрольной группе ложноположительными (табл. 2).

Таблица 2

Результаты дополнительного исследования методом ИФА на наличие маркеров вируса гепатита В образцов контрольной группы с ложноположительными результатами,

выявленными в ПЦР

№ образца Установленный клинический диагноз Результат ИФА

КИБ № 2 ГИСК

HBsAg аНВсоге HBsAg аНВсоге

1 острый вирусный гепатит А - + + +

2 вирусный гепатит смешанной этиологии В+С - - + +

3 острый вирусный гепатит С - + + +

4 острый вирусный гепатит смешанной этиологии А+С - + + +

5 острый вирусный гепатит С - - + -

6 острый вирусный гепатит А - + + -

Отрицательный результат ПЦР-анализа в образце от больного с диагнозом «вирусный гепатит В в анамнезе, контрольное исследование», полученный всеми исследуемыми наборами реагентов, является подтверждением выздоровления и не рассматривался как ложноотрицательный результат.

На основании скорректированной оценки исследованных образцов при сравнении результатов ПЦР-анализа с установленным клиническим диагнозом, данными ИФА на наличие HBsAg и результатами референтного набора реагентов были получены результаты, представленные на рис. 1.

Как видно из рис. 1, по сравнению с данными установленного клинического диагноза и результатами ИФА чувствительность составила 89,5 - 98 %; специфичность -96 - 98,1 %; по сравнению с референтным набором реагентов соответственно 90 - 92 % и 91 - 96,9 %.

Показатель силы связи сравниваемого параметра с результатами ПЦР (коэффициент Ф~) находился в пределах от 0,65 до 0,88, что свидетельствует о сильной связи сравниваемых результатов.

А диагностическая чувствительность Б диагностическая специфичность

IIIIIII

I II III IV

набор реагентов

• по сравнению с диагнозом 90.2-98.8% по сравнению с ИФА 89.9-98.0° о

• по сравнению с референтным методой 90,0-92,0%

нобор реагентов • по сравнению с диагнозом У6.9-97,9% по сравнеию с ИФА 96.0-9S.l% по сравнени-ос референтным набором 91,7-96,9%

Рис. 1 Оценка диагностической эффективности наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В

Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной диагностической эффективности изучаемых наборов реагентов.

Для оценки воспроизводимости наборов реагентов использовали в качестве отрицательных образцов образцы СКРС и HBV-отрицательной плазмы, в качестве положительных - стандартный образец PCO HBV с концентрацией ДНК, равной аналитической чувствительности наборов реагентов - 10" и 5x10" копий/мл.

Воспроизводимость для положительных образцов, содержащих ДНК на пределе обнаружения, составила 100 %. Воспроизводимость для отрицательных образцов составила: 87,0 % - 95,5 %. Суммарная воспроизводимость составила 92,1 - 97,3 %. Поскольку в лабораторных испытаниях на отрицательных образцах была получена воспроизводимость 100 %, меньшая воспроизводимость свидетельствует о качестве работы операторов и возможности контаминации при проведении анализа.

Установленные диагностическая специфичность, чувствительность и воспроизводимость позволили рекомендовать изученные наборы реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С для использования в медицинской практике.

1.3.2. Изучение диагностической эффективности наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С с электрофоретической детекцией результатов амплификации

Исследовали 3 группы образцов: опытную и 2 контрольные. Опытная группа была представлена 37 образцами плазмы крови от больных различными формами гепатита С и образцами стандартного образца РНК HCV с концентрацией 104 и 5x103 копий/мл - всего 47 образцов. Контрольная группа 1 была представлена образцами плазмы крови больных гепатитами другой этиологии - всего 80 образцов. Контрольная группа 2 включала образцы плазмы крови здоровых лиц, образцы HCV-отрицательной плазмы и образцы СКРС - всего 65 образцов.

Результаты изучения набора реагентов I При изучении чувствительности и специфичности на клинических образцах были получены следующие результаты (табл. 3).

Таблица 3

Результаты испытаний клинического материала поданным ПЦР-анализа и данным установленного клинического диагноза (а), результатов ИФА (б), а б

+ -

+ 40 7

- 9 136

^^ПЦР анти + -

+ 31 6

- 4 141

Главная диагональ - слева направо, сверху вниз

Значительное преобладание чисел на главной диагонали над числами вне ее свидетельствуют, в целом, о совпадении результатов ПЦР-анализа с клиническими данными и результатами лабораторных методов.

Однако, по сравнению с установленным клиническим диагнозом, было выявлено 7 ложноотрицательмых результатов и 9 ложноположительных результатов; по сравнению с результатами ИФА, 6 ложноотрицательных и 4 ложноположительных результата. Образцы с несовпадающими результатами (13 образцов опытной группы и 13 контрольной) были дополнительно исследованы методом ИФА на наличие маркеров вирусных гепатитов В, С и А и на наличие ДНК НВУ методом ПЦР. Пять образцов (табл. 4) оказались положитель-

Таблица 4

Результаты дополнительного исследования образцов с отрицательными результатами ПЦР-анализа в опытной группе

№ п/п первоначальный диагноз Данные ИФА уточненный основной днагноч

аНСУ аНСУ [цм НВяАц аНВс 1цМ аНАУ НВУ ДНК

1 Вирусный гепатит смешан-ной этиологии А+В+С, стадия реконвалесиенцпн + + + Острый вирусный гепатит А на фоне хронического гепатита В

2 Острый вирусный гепатит смешанной ■этиологии А+В+С, + + + Острый вирч'сный гепатит А на фоне хронического гепатита В

Л Вирусный гепатит смешанной этнологии В+С, + + + нд + Острый вирусный гепатит В

4 Вирусный гепатит смешанной этиологии В+С, + ил + Острый вирусный гепатит В

5 Острый вирусный гепатит смешанной этиологии В+С, + + нд + Острый вирусный гепатит В

Примечание: нд - показатель не определяли

ными по аНСУ но отрицательными по аНСУ ^М. Кроме того, у двух пациентов были выявлены маркеры острого гепатита А (аНАУ 1§М), а у остальных 3 - маркеры острого гепатита В (аНВс ^М и ДНК НВУ). Такие результаты не рассматривали как ложноотрицательные, так как наличие другого этиологического фактора (активная НВУ-имфекция) может подавлять репликацию вируса гепатита С, что ведет к отсутствию вирусной РНК в периферической крови [гагекл е1 а1. 1998]. Отрицательный результат ПЦР-анапиза у пациента с диагнозом «вирусный гепатит С, стадия ранней реконвалесценции, лечение Рофероном » является подтверждением эффективности противовирусной терапии Рофероном А и также не рассматривался как ложноотрицательный результат. Таким образом, в опытной группе зарегистрирован 1 ложноотрицательный результат.

При дополнительном исследовании образцов контрольных групп в 4-х образцах положительные результаты были подтверждены положительными результатами ИФА на наличие анти-НСУ ^М, а у 1 пациента положительные результаты подтверждены наличием положительного результата ИФА на наличие суммарных анти-НСУ, что позволило уточнить диагноз и не рассматривать эти результаты как ложноположительные (табл. 5).

Таблица 5

Результаты дополнительного исследования образцов, с положительными результаты ПЦР-анализа в контрольной группе I

№ диагноз HBsAg аНВс aHAV aD aHCV aHCV aHCV

п/п сум IgM сум сум IgG IgM

1 Острый вирусный гепатит А - + + нд - нд +

2 Острый вирусный гепатит А - + нд - нд +

3 Острый вирусный гепатит А - + нд - нд 4-

4 Хронический вирусный гепатит В.коинфекция + нд нд нд - нд +

5 Острый алкогольный гепатит - - - + + - -

На основании скорректированной оценки исследованных образцов сравнение результатов ПЦР-анализа с установленным клиническим диагнозом и данными ИФА на наличие антител к вирусу гепатита С чувствительность набора 1 по отношению к установленному клиническому диагнозу составила 97, 9 %, специфичность - 97,2 %.

По сравнению с результатами ИФА чувствительность составила 83,7 %, специфичность 97,2 %. Достаточно низкие показатели чувствительности (83,7%) согласуются с литературными данными [Alter M.J., 1995; Sherlok S., Dooley J. 1997; Zarski J-P. etal. 1998].

Коэффициент ф2 в пределах от 0,65 до 0,88 также свидетельствует о сильной связи сравниваемых результатов.

Воспроизводимость набора реагентов 1 для положительных образцов, содержащих РНК на пределе обнаружения составила 100 %. Для образцов с концентрацией ДНК ниже аналитической чувствительности в два и более раз воспроизводимость составила 60 % и не учитывалась при оценке общей воспроизводимости. Суммарная воспроизводимость набора реагентов 1 составила 95,1 %. Воспроизводимость на отрицательных образцах

составила 93,5 %. Как и в случае наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В, это свидетельствует о качестве работы операторов и возможности контаминации при проведении анализа.

Полученные результаты свидетельствовали об удовлетворительной диагностической эффективности изучаемого набора реагентов и позволили рекомендовать его к регистрации.

Результаты изучения набора реагентов 2

При исследовании клинических образцов было получено 23 ложноотрицательных и 13 ложноположительных результатов

Все образцы с несовпадающими результатами были дополнительно проверены методом ИФА на наличие маркеров вирусных гепатитов В, С и А и на наличие ДНК HBV методом ПЦР.

По скорректированным результатам проведенных исследований (табл. 4 и 5) специфичность составила 92,7 %, чувствительность набора реагентов 2 по сравнению с установленным диагнозом составила 76,5 %, а в группе с диагнозом «Острый вирусный гепатит С» - всего 57,1 %. Использование двустадийного (nested) варианта постановки ПЦР в наборе 2 не обеспечило более высокой аналитической и диагностической чувствительности, но увеличило риск контаминации образцов в процессе проведения анализа: воспроизводимость на отрицательных образцах составила 90,4 %.

Таким образом, несмотря на то, что в лабораторных испытаниях набор реагентов 2 показал удовлетворительную аналитическую чувствительность (5х103 копий/мл) и специфичность, в проведенных исследованиях на клинических образцах были получены неудовлетворительные результаты, что не позволило рекомендовать этот набор для регистрации в РФ.

Возможность получения ложноположительных результатов при выявлении ДНК/РНК вирусов гепатита В и С методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации должна учитываться при интерпретации результатов и диктует необходимость постановки при каждом анализе контрольного отрицательного образца. В сомнительных случаях требуется повторная постановка анализа на новых образцах и дальнейшее наблюдение за пациентом.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности при лабораторном изучении наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С проводить оценку воспроизводимости на зашифрованных модельных образцах с концентрацией нуклеиновой кислоты, равной аналитической чувствительности набора. В этом случае результаты оценки воспроизводимости являются подтверждением результатов оценки аналитической чувствительности, а также оценкой качества работы операторов, воспроизводимость результатов которых на зашифрованных отрицательных образцах должна составлять 100%.

1.3.3. Изучение диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов ПЦР в процессе амплификации (в режиме «реального времени») и по окончании амплификации (по «конечной точке»).

При изучении наборов реагентов для выявления ДНК HBV на 40 клинических образцах с установленным диагнозом чувствительность по отношению к референтному набору реагентов составила 100 %; специфичность- 100 %. При изучении наборов для выявления РНК HCV на 52 клинических образцах с установленным диагнозом чувствительность составила 100 %; специфичность -97-100 %.

Воспроизводимость наборов для выявления ДНК HBV определяли путем 5-10-кратного исследования образцов ОСО ДНК HBV и СОП ДНК HBV (плазма) с концентрацией ДНК 102; и 5x10 копий/мл и 10-кратном исследовании отрицательных образцов (плазма крови донора). Воспроизводимость на образцах, содержащих ДНК HBV на пределе аналитической чувствительности составила 100 %, на отрицательных образцах также - 100 %. Суммарная воспроизводимость составила 100 %. При исследовании образцов с концентрацией ДНК ниже аналитической чувствительности (50 копий/мл) воспроизводимость составила 40 - 60 % (2-3 положительных результата из 5 постановок) и при оценке общей воспроизводимости не учитывалась.

Воспроизводимость ПЦР наборов реагентов для выявления РНК HCV определяли путем 5-кратного исследования образцов ОСО РНК HCV с концентрацией РНК 5х102; 102; и 5x10 МЕ/мл и 14-кратном исследовании отрицательных образцов (плазма крови донора).

Воспроизводимость набора с детекцией в «режиме реального времени» с концентрацией РНК, равной аналитической чувствительности (102 МЕ/мл), составила 100 %. При исследовании образцов с концентрацией РНК ниже аналитической чувствительности (5x102 МЕ/мл) - 80 %. Воспроизводимость на отрицательных образцах составила 100 %. Суммарная воспроизводимость - 100 %.

Воспроизводимость при концентрации РНК, равной аналитической чувствительности набора реагентов с детекцией по «конечной точке» (5x10 МЕ/мл) составила 100 %. При исследовании образцов с концентрацией РНК ниже аналитической чувствительности (10 МЕ/мл) - 40 %. Воспроизводимость на отрицательных образцах составила 100 %. Суммарная воспроизводимость - 100 %.

Таким образом, результаты лабораторных испытаний и испытаний на клинических образцах позволили рекомендовать их использование в медицинской практике.

1. Разработка отраслевого стандартного образца содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК HCV) Для обеспечения единого подхода к контролю качества наборов реагентов необходимы стандартные образцы. Ранее нами был разработан ОСО содержания ДНК гена HBsAg вируса гепатита В. Для выявления РНК HCV такого образца не было. В связи с этим была

поставлена задача разработать соответствующий стандартный образец. Разработку провели совместно с ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Для создания ОСО использовали криопреципитированную плазму крови человека, больного гепатитом С с положительными результатами ИФА и ПЦР на маркеры вируса гепатита С и с отрицательными результатами на маркеры вируса гепатита В и ВИЧ.

Аттестацию кандидата в ОСО провели с использованием международного стандартного образца РНК НСУ и набора реагентов «АмплиСенс НСУ Монитор». Содержание РНК НСУ в ОСО РНК НСУ, рассчитанное методом параллельных линий (по программе «Паралайн»), составило (2+1)х[05 МЕ/мл.

Изучение стабильности ОСО в реальном времени показало, что аттестованная характеристика не менялась в течение 6 лет хранения (срок наблюдения) при температуре не выше минус 68 °С (табл. 6).

Таблица 6

Изучение стабильности ОСО РНК НСУ

наименование Год проведения анализа

ОСО РНК НСУ, МЕ/мл 2003 2004 2005 2006 2008

6x10"1 2,7x10' 3,63 хЮ"1 3,22x10' 3,05 хЮ'

3. Изучение наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С

Методология валидации количественных аналитических методик предусматривает оценку помимо специфичности и аналитической чувствительности оценку линейности и диапазона определяемых величин, прецизионности и правильности. Дальнейшая работа была посвящена установлению указанных характеристик ПЦР наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С на основе «ГИФА» и «РЯТ». 3.1. Изучение набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С с гибридизационно-ферментной детекцией результатов (ГИФА).

Специфичность набора реагентов подтвердили на образцах плазмы крови доноров с отрицательными результатами ИФА на наличие антител к НСУ и отрицательными результатами ПЦР на наличие РНК НСУ. Исследовали 12 образцов плазмы донорской крови. Во всех исследованных образцах получили отрицательные результаты (оптическая плотность (ОП) меньше ОП отрицательного контрольного образца К-).

Линейный диапазон оценили с использованием МСО НСУ и ОСО сер 1 с исходной концентрацией и разведениями в соотношении 1:5; 1:25; 1:125; 1:625, а также клинического образца с исходной концентрацией и разведениями в соотношении 1:10; 1:60; 1:200; 1:400; 1:800 и 1:1000. Каждый образец исследовали в двух повторах, для построения графиков использовали среднее значение количества РНК (рис.2).

Были рассчитаны уравнения линии регрессии и Я": уМсо = - 0,9355х + 5,4522 (Я2 = 0,9911); Уососер! =-0,98Их + 5,71 (Я2 = 0,9991); уКЛин.0БР= - 0,8424х + 6,2717 (Я2 = 0,9939).

Коэффициент детерминации (Я2) более 0,99 свидетельствует о линейности набора реагентов в диапазоне от 103 до 106 МЕ/мл.

Рис.2. График зависимости концентрации РНК НСУ МЕ/мл от разведения при исследовании МСО НСУ, ОСО сер 1 и клинического образца от пациента с установленным диагнозом вирусный гепатит С

12 3

Кратность разведение (1|)

МСО НСУ ■ ОСО сер1 А Клин.обр

Линейность также подтвердили при расчете концентрации с учетом фактора разведения. Рассчитанная и исходные концентрации практически совпадают во всех разведениях как в образцах ОСО, так и в образцах МСО НСУ Разница логарифмов не превышает 0,13 для ОСО РНК НСУ (рис. За) и 0,24 для МСО НСУ (рис. 36).

а б

о 1000000 -¡ц 800000

^ 5 «00000 "

|||||

о 600000 X

§5 «оооо к 5 Е *

ЗВ 200000

• X

Д »1

кратность рачведенш

q>eДIlee сучетомргшедеиш

0 :5 25 :125 :б25 кратность разведали

0 Хч>еднее сучегомрагзведения

Рис.3. Концентрация РНК НСУ в исходном препарате рассчитанная по результатам определения с учетом разведения в образцах МСО НСУ (а) и ОСО сер 1(6).

Прецизионность оценивали на образцах МСО НСУ и ОСО сер.1 с исходной концентрацией и на пределе обнаружения. Каждый образец исследовали в трех повторах. Определение проводили дважды при одинаковых условиях анализа в течение короткого промежутка времени.

Для образцов ОСО с исходной концентрацией коэффициент вариации (СУ) не превысил 32 %, для образцов МСО НСУ - 16 % (табл. 7).

Для образцов ОСО с концентрацией РНК на пределе обнаружения (103 МЕ/мл) СУ составил 30 %, СУ для референтного набора составил 85 % (табл. 8), т.е. разброс результатов исследуемого набора реагентов меньше, чем референтного набора.

Таблица 7

Оценка прецизионности набора реагентов ГИФА на образцах МСО НСУ и ОСО с исходной концентрацией РНК НСУ

№ Определения образец

МСО НСУ ОСОсер!

Результат ПЦР МЕ/мл Хер МЕ/мл 5 МЕ/мл СУ (%) Результат ПЦР МЕ/мл Хер МЕ/мл Б МЕ/мл СУ (%)

I 2,65х103 3,22х105 5,29x10" 16 4,61х105 5,26x105 1,31х105 24,9

3,45x10' 6,03 х10>

3,57хЮ5 5,16 хШ5

11 3,08х105 2,92x105 2,16х104 7,4 5,33 хЮ5 6,83x105 2,22x105 32,5

3,02x105 9.38x10'

2,68x105 5,78x10'

Примечания: Б - стандартное отклонение; СУ - коэффициент вариации

Таблица 8

Оценка прецизионности исследуемого и референтного наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С в образцах ОСО с концентрацией РНК НСУ 103 МЕ/мл

№ Набор реагентов

п/п ГИФА РЕФЕРЕНТНЫЙ

Результат Хер СУ Результат Хср Б СУ

ПЦР, МЕ/мл МЕ/мл (%) ПЦ0420, МЕ/мл МЕ/мл (%)

МЕ/мл МЕ/мл

1 1,01x10"' 9,1x10"

2 1,51 хЮ' 3,03 х10-

3 1,16 хЮ"1 0

4 7,13 хЮ" 1,009x103 3,06x102 30 3,44x10" 3,4x102 2,90x102 85

5 1,28x10"' 4,59x10"

6 6,08 хЮ" 0

7 1,03 хЮ' 2,51 хЮ"

8 7,62x10" 4,53 х10"

Примечания: 8 - стандартное отклонение; СУ - коэффициент вариации

Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной прецизионности изучаемого набора реагентов.

Правильность оценивали по смещению результатов количественного определения РНК в образцах МСО НСУ и ОСО НСУ относительно значения их аттестованных характеристик. Так же правильность оценивали по результатам сравнительного определения РНК в клинических образцах при помощи исследуемого и референтного

наборов реагентов в качестве, которого использовали набор «Cobas Amplicor HCV Monitor test» версия 2.0 производства фирмы Хоффмаин Ла-Рош, Швейцария.

Полученные результаты принимали за совпадающие, если разница между показателями концентрации РНК в образцах не превышала 0,5 lg. Коэффициент корреляции рассчитывали при помощи программы Excel.

При сравнении результатов определения концентрации РНК HCV в МСО HCV и ОСО HCV различие с значением аттестованных характеристик не превышало 0,34 lg, коэффициент корреляции составил 0,99

При сравнении результатов определения концентрации РНК HCV в клинических образцах при помощи исследуемого и референтного наборов коэффициент корреляции составил 0,7. Различие результатов, полученных указанными наборами реагентов, не превышало 0,5 lg в 90 % случаях, в среднем составило 0,3 lg, в 10 % случаев различие находилось в пределах 0,6 - 0,9 lg, т.е. было в пределах одного порядка. Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной правильности изучаемого набора реагентов.

Установленные характеристики набора реагентов: специфичность, линейность в диапазоне от 103 до 106 МЕ/мл, прецизионность CV не более 32 % и правильность в пределах 0,5 lg, позволяют использовать набор реагентов для количественного определения РНК HCV.

Определение вирусной нагрузки в образцах от 16 пациентов до начала противовирусной терапии и через месяц после начала лечения показало возможность оценки эффективности противовирусной терапии. У 13 из 16 пациентов вирусная нагрузка снизилась на 2 lg и более. У трех пациентов снижения вирусной нагрузки не наблюдалось.

3.2. Изучение набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов в «режиме реального времени» (FRT).

Изучение набора реагентов провели по той же схеме. Определение линейности в диапазоне определяемых величин и прецизионность изучали на образцах ОСО сер 1 и 2.

Специфичность набора реагентов подтвердили на 12 образцах плазмы крови доноров с отрицательными результатами ИФА на наличие антител к HCV и отрицательными результатами ПЦР на наличие РНК HCV. Во всех исследованных образцах получили отрицательные результаты (Ct не определялось).

Определение линейности набора реагентов показало, что в диапазоне концентраций от 5x102 до 108 МЕ/мл коэффициент детерминации R2, равный 0,9829, свидетельствует о линейности изучаемого набора (рис.4).

Рис. 4. График зависимости концентрации РНК НСУ МЕ/мл от ^ разведения при исследовании ОСО сер 1 и сер 2. Уравнения линии регрессии : Уососер! =-0,8139х + 5,1789 Я2 = 0,9016;

Уососерз = - 0,855х +5,4421 Я2 = 0,9829

Расчет исходной концентрации с учетом фактора разведения для образцов ОСО сер 1 (разведение пятикратным шагом) показал, что разведение более, чем в 25 раз, приводит к завышению концентрации, разница логарифмов находилась в пределах от 0,22 до 0,86.

Изучение прецизионности проводили с использованием ОСО cepl с исходной концентрацией и разведенным до концентрации 5x102 МЕ/мл и пяти клинических образцов с различной концентрацией от пациентов с диагнозом вирусный гепатит С с положительными результатами ИФА и ПЦР на наличие маркеров вирусного гепатита С. Анализ повторили в течение 4-х дней.

Для образцов ОСО cepl с исходной концентрацией и клинических образцов коэффициент вариации (CV) составил от 25 до 56 %, стандартное отклонение (S) так же, как и для многих химических методов, возрастает с увеличением концентрации.

При оценке прецизионности на образцах с концентрацией РНК на пределе обнаружения (5x10" МЕ/мл) CV составил 41 %.

Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной прецизионности набора реагентов.

Правильность оценивали по результатам сравнительного определения РНК в клинических образцах при помощи исследуемого и референтного наборов реагентов в качестве, которого использовали набор «АмплиСенс HCV-Монитор», ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Полученные результаты оценивали как совпадающие, если разница между показателями концентрации РНК в образцах не превышала 0,5 lg. Коэффициент корреляции рассчитывали при помощи программы Excel. Всего было изучено 20 образцов. В 8 образцах концентрация РНК HCV оказалась выше рабочего диапазона референтного набора. В связи с этим эти результаты не учитывали.

Разница между результатами, полученными двумя наборами реагентов на 12 образцах, не превышала 0,5 lg в 92 % случаях. В среднем разница между полученными результатами (Д lg) составила 0,22 lg. Для 1 образца разница была больше 0,5. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной правильности изучаемого набора реагентов.

При определении вирусной нагрузки в образцах от 10 пациентов до начала противовирусной терапии и через 12 недель после начала лечения у 7 из 10 пациентов было выявлено снижение вирусиой нагрузки более, чем на 2 У двух пациентов вирусной нагрузка снизилась менее, чем на 2 у одного снижения не наблюдалось (Д ^ 0,25).

Проведенные исследования показали возможность и целесообразность использования принципов валидации аналитических методов при изучении наборов реагентов, как для качественного, так и для количественного определения ДНК НВУ и РНК НСУ. При исследовании ПЦР наборов реагентов установлены специфичность и аналитическая чувствительность наборов для неколичественного выявления (табл. 9) и валидационные харатеристики наборов для количественного определения (табл. 10) ДНК/РНК вирусов гепатита В и С.

На основании проведенных исследований разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для выявления и количественного определения ДНК НВУ и РНК НСУ, включающая в себя оценку специфичности, аналитической чувствительности, диагностической эффективности наборов реагентов для неколичественного выявления и специфичности, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности и правильности наборов для количественного определения.

Таблица 9

Характеристики наборов реагентов для неколичественного выявления ДНК/РНК

вирусов гепатита В и С методом ПЦР

характеристика Наборы реагентов для выявления

ДНК НВУ 4 набора РНК НСУ 1 набор ДНК НВУ (РЬ) 2 набора РНК НСУ (И.) 2 набора

специфичность специфичен специфичен специфичен специфичен

аналитическая чувствительность 5х10-103 копий/мл 5x10-' копий/мл 102 копий/мл 102 -5x102 копий/мл

диагностическая чувствительность 91,0-98,0 83,7 - 97,6 100 100

диагностическая специфичность 92,0-98,1 97,3 100 97-100

воспроизводимость на (+) образцах 100 100 100 100

на (-) образцах 87- 95,5 90,4 - 93,5 100 100

Таблица 10

Характеристики наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С методом ПЦР с гибридизационно-ферментной и гибридизационно-флуоресцентной детекцией

характеристика набор реагентов

ГИФА РЯТ

линейный диапазон определяемых величин 10-10 ме/мл > X 5x10 - 10 ме/мл

прецизионность (СУ %) в верхнем диапазоне концентраций в нижнем диапазоне концентраций < 30 < 36 <36 <56

правильность (смещение относительно референтного набора и значения аттестованных характеристик стандартных образцов) ¿0,5 1ё <0,5 1В

Разработанный ОСО содержания РНК вируса гепатита С позволяет оценивать валидационные характеристики наборов реагентов для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С: аналитическую чувствительность, специфичность, линейность, прецизионность и правильность.

Методика определения аналитической чувствительности была положена в основу методов контроля изученных наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С. По результатам проведенной работы 6 наборов реагентов для выявления ДНК НВУ; 3 набора реагентов для выявления РНК НСУ и 2 набора реагентов для количественного определения РНК НСУ были зарегистрированы в Российской Федерации, на них разработан стандарт качества в виде фармакопейных статей, с 2007 г - ТУ, в которых отражаются требования и методы контроля по основным показателям качества.

Разработанная нами система испытаний была применена для оценки валидационных характеристик еще 8 наборов реагентов для выявления РНК/ДНК возбудителей инфекционных заболеваний вирусной природы и 15 наборов для выявления ДНК возбудителей бактериальной природы. Все наборы реагентов зарегистрированы в Российской Федерации, на них разработан стандарт качества в виде фармакопейных статей, с 2007 г - ТУ, в которых отражаются требования и методы контроля по основным показателям качества.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для неколичественного выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости с использованием стандартных образцов.

2. Впервые разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для количественного определения РНК вируса гепатита С на основе принципов валидации аналитических методов, включающая оценку специфичности, линейного диапазона определяемых величин, правильности и прецизионности с использованием стандартных образцов.

3. С целью стандартизации наборов реагентов впервые введена оценка аналитической чувствительности по минимальной концентрации ДНК или РНК, которая выявляется с воспроизводимостью 100 % при 10-кратной постановке анализа.

4. Разработан и аттестован отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ), позволивший провести валидацию и унифицировать методы контроля наборов реагентов для неколичественного и количественного определения РНК НСУ методом полимеразной цепной реакции.

5. На основании разработанной системы испытаний установлена аналитическая чувствительность наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С: для семи наборов с злектрофоретической детекцией - 5х102- 5х103 копий/мл и для четырех наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией - 10 - 5x10" МЕ/мл.

6. Установлены на основе разработанной системы испытаний характеристики двух наборов реагентов на основе ПЦР для количественного определения РНК вируса гепатита С: линейный диапазон 103- 106 МЕ/мл (набор на основе ГИФА) и 5x102 - 108 МЕ/мл (набор на основе П1Т), коэффициент вариации не более 36 % (набор на основе ГИФА) и не более 56 % (набор на основе Н1Т) и правильность - смещение результатов относительно референтного набора не более 0,5

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПЕЧАТНЫХ РАБОТ Г10 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волкова, P.A. Тест-системы для выявления ДНК вируса гепатита В методом полимеразной цепной реакции / P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, И.В. Шалунова, Н.Г. Бочарова, В.Г. Петухов, Е.Е. Мусина, А.Х. Асади Мобархан, С.М. Беглова, В.В. Покровский, Г.А., Шипулин, О.Ю., Шипулина, Г.О. Шайхаев, А.Б.Комаров, Г.В.Спирина, М.Ю.Кириллов//Биопрепараты.-2001.-№2.-С. 14- 18.

2. Гущин, А.Е. Стабильность РНК вируса гепатита С в плазме крови человека в панели контрольных образцов / А. Е. Гущин, О.Ю. Шипулина, Г.А. Шипулин., P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, Н.В. Шалунова // Вопросы вирусологии -2002 - № 5. - С. 38-40.

3. Бектимиров, Т.А. Оценка диагностической эффективности тест-системы для выявления РНК вируса гепатита С методом полимеразной цепной реакции "АмплиСенс™ HCV-240/BKO-440" / Т.А. Бектимиров, P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, М.А.Горбунов, Н.В. Шалунова, Г.А.Шипулин, О.Ю. Шипулина, В.П. Чуланов, Н.Г.Бочарова, Е.Е. Мусина, Н.М.Никитюк // Вопросы вирусологни-2002-№5-С.12-16.

4. Эльберт, Е.В. Результаты испытания ПЦР тест-системы «АмплиСенс В ГС Монитор» для количественного определения РНК вирусного гепатита С в плазме крови пациентов / Е.В. Эльберт, P.A. Волкова, М.М. Гринэ, Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова, Г.М. Цыганова., Г.А. Шипулин // Биопрепараты - 2005 -№ 2( 18) июнь - С. 7- 10.

5. Безруков, В.М. К оценке диагностической ценности ПЦР тест-систем по результатам Государственных испытаний / В.М. Безруков, P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, Т.С. Шобухова //Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. -2005. - № 2. - С. 53 - 55.

6. Бектимиров Т.А. Оценка ПЦР тест-систем для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вирусов гепатита С и D / Волкова P.A., Шалунова И.В., Эльберт Г.В., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю. и др. // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов и паразитологов, Москва, 2002- Т.З.

7. Волкова P.A. Современные препараты для выявления генетического материала возбудителей инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции / P.A. Волкова, Е.В. Эльберт // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007: сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. коиф. - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 11 - 12.

8. Волкова, P.A. Результаты испытамий препарата «Амплисепс HCV Монитор-FRT» тест-системы для количественного определения РНК вируса гепатита С методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцеитной детекцией в режиме «реального времени» /' P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, В.Г. Петухов, Н.В. Шалунова, B.C. Зайцев, Г.А. Михайловская, Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007: сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2007 . - Т. I. - С. 296 - 297.

9. Эльберт, Е.В. Результаты испытаний препарата «Амплисепс HBV Моиитор-FRT» тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом

ПЦР с гибридизациомно-флуоресцептиой детекцией в режиме «реального времени» / Е.В. Эльберт, P.A. Волкова, В.Г. Петухов, Н.В. Шалунова, B.C. Зайцев, Г.А. Михайловская, Е.В. Богословская, Г.А. Шипулин // Генодиагностика инфекционных болезней - 2007: сб. науч. трудов VI Всероссийской науч. - практ. конф. - Москва, 2007 . - Т. 1. - С. 325-326.

10. Волкова, P.A. Разработка лиофилизированной формы стандартного образца содержания РНК вируса гепатита С / P.A. Волкова, Е.В. Эльберт, В.Г. Петухов, Н.В. Шалумова, Н.В. Зубкова, Е.В. Филатова, Е.В. Силин // Молекулярная диагностика 2010 Москва, сб. научи, трудов, Москва, 2010. - Т. IV. - С.356.

11. Эльберт, Е.В. Применение методики валидации химических методов для методики количественного определения РНК вируса гепатита С на модели набора реагентов для полимеразной цепной реакции с гибридизационно-ферментной детекцией результатов «АмплиСенс HCV-Монитор» / Е.В. Эльберт, P.A. Волкова, В.Г. Петухов, Н.В. Шалунова, Е.В. Богословская, Л.Ю. Башкирова, Цыганова Г.М., Г.А. Шипулин // Молекулярная диагностика 2010 Москва, сб. научн. трудов, Москва, 2010- Т. IV. - С.357.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Анти-HCV IgG - антитела класса G к белкам вируса гепатита С

Аити-HCV IgM - антитела класса М к ядерным белкам вируса гепатита С

Анти-HCV - суммарные (IgG + IgM) антитела к белкам вируса гепатита С

Аити-НВсоге - суммарные антитела к ядерному антигену вируса гепатита В

ГИФА - гибридизациоино-ферментная детекция результатов амплификации

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

копий/мл - копий в 1 мл

ME/мл - международные единицы в 1 мл

МСО - международный стандартный образец

ОСО - отраслевой стандартный образец

РНК - рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PCO - рабочий стандартный образец

СКРС - сыворотка крупного рогатого скота для культуры тканей

СОП - стандартный образец предприятия

ТУ - технические условия

ФСП - фармакопейная статья предприятия

HBV - вирус гепатита В

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В

HBcAg - ядерный «соге» антиген вируса гепатита В

HCV - вирус гепатита С

FRT - детекция результатов амплификации в процессе амплификации

в режиме «реального времени»

FEP -детекция результатов амплификации по окончании процесса

амплификации по «конечной точке»

RT - реакция обратной транскрипции

2010014998

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Эльберт, Елизавета Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Эпидемиология и этиологические факторы.

1. Вирус гепатита В.

2. Вирус гепатита С.

II. Лабораторная диагностика вирусных гепатитов В и С.

1. Серологическая диагностика ВГВ.

2. Серологическая диагностика ВГС.

3. Молекулярно-биологические методы.

4. Выявление ДНК/РНК вирусов гепатита В и С в крови, плазме, сыворотке.

III. Валидация аналитических методов.

IV. Стандартные образцы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С.

3.1.1. Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

3.1.2 Изучение наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов ПЦР в процессе амплификации в режиме «реального времени» или по окончании амплификации по «конечной точке».

3.1.3. Изучение наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С методом ПЦР с электрофоретической детекцией.

3.1.4. Изучение наборов реагентов для выявления РНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов ПЦР в процессе амплификации в режиме «реального времени» или по окончании амплификации по «конечной точке».

3.2 Разработка системы испытаний наборов реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С.

3.2.1. Разработка отраслевого стандартного образца содержания РНК вируса гепатита С.

3.2.2. Изучение набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С с гибридизационно-ферментной детекцией результатов амплификации.

3.2.3. Изучение набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С с гибридизационно-ферментной детекцией результатов амплификации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C"

АКТУАЛЬНОСТЬ

Вирусные гепатиты представляют собой серьезную проблему для здравоохранения ввиду их повсеместного распространения. Наибольшего внимания требуют гепатиты В и С [Соринсон С.Н., 1998, Sypsa V, Touloumi G. et al, 2005, WHO Fact Sheet, 2000]. По последним данным в России на смену резкому подъему заболеваемости острыми формами вирусных гепатитов, наблюдавшемуся в 1995-1999 гг., [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И. с соавт., 1999] пришла эпидемия хронических вирусных гепатитов [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003]. Для выявления этиологических агентов вирусных гепатитов все большее значение приобретает лабораторная диагностика, она позволяет выявлять возбудителя на ранних стадиях инфицирования и оценивать эффективность проводимой противовирусной терапии. Одним из перспективных методов в этом отношении является метод на основе амплификации нуклеиновых кислот, в частности, полимеразная цепная реакция [Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003, Михайлов М.И., 2001, Момыналиев К.Т., Говорун В.М., 2000].

Активная разработка изделий медицинского назначения (наборов реагентов) на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) как для качественного, так и количественного определения ДНК и РНК возбудителей инфекционных заболеваний и организация их производства требует стандартизации проведения их испытаний и оценки качества. При оценке качества наборов для выявления культивируемых микроорганизмов используют чистые культуры. С этой точки зрения стандартизация наборов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов В и С, затруднена.

В настоящее время в нашей стране проблемам обеспечения качества лабораторных исследований уделяется большое внимание [ГОСТ Р ИСО 175112007, ГОСТ Р ИС015193-2007, ГОСТ Р ИСО 15194-2007]. Порядок проведения испытаний наборов реагентов изложен в ГОСТ Р 51352-99. Однако раздел, относящийся к наборам реагентов для «микроанализа нуклеотидных последовательностей» предусматривает оценку качества наборов только по положительному и отрицательному контрольным образцам [ГОСТ Р 51352-99 п.4.2.2], что недостаточно для объективной оценки наборов.

Таким образом, разработка системы проведения испытаний наборов реагентов на основе ГТЦР с целью обеспечения единства требований к ним на модели вирусов гепатитов В и С является актуальной задачей. Цель исследования

Разработка системы испытаний наборов реагентов для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов В и С методом ПЦР. Задачи исследования 1. Разработать на основе принципов валидации аналитических методик систему лабораторных испытаний наборов реагентов для выявления и определения ДНК/РНК вирусов гепатита В/С методом ПЦР, а именно: для неколичественного выявления нуклеиновых кислот:

- специфичности (специфической активности)

- предела обнаружения (аналитической чувствительности); для количественного определения нуклеиновых кислот:

- специфичности;

- линейного диапазона определяемых величин;

- прецизионности;

- правильности.

3. Провести оценку диагностической эффективности изученных наборов реагентов на клинических образцах.

Научная новизна

Впервые разработана система лабораторных испытаний ПЦР наборов реагентов, позволяющая по единому плану оценивать ПЦР наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности, правильности и воспроизводимости.

Впервые разработан отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ ОСО 42-28-366-04П), с помощью которого, стандартизован контроль наборов реагентов для выявления РНК НСУ. Практическая значимость

Методы контроля внесены в стандарты качества ФСП, а с 2007 г в ТУ, на наборы реагентов: для выявления ДНК вируса гепатита В:

- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс НВУ-240/ВКО-770» (ТУ 9398-040-01897593-2009 ФСР 2007/00813 от 14.08. 2009);

Биоком-НВУскрин-пзПЦР-тест» (ФСП 42-0114-0276-00); «ДиаГен-НВУ» (ФСП 42-0040-0053-00) и «Авиценна-НВУ-ПЦР» (ФСП 42-0116-0279-00);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенс НВУ-РКТ»( ТУ 9398-030-01897593-2007.ФСР 2007/00585 от 09.08. 2007) и «АмплиСенс НВУ-¥ЕР»(ТУ 9398-032-01897593-2007.ФСР 2007/00586 от 09.08. 2007); для выявления РНК вируса гепатита С:

- с электрофоретической детекцией результатов амплификации: «АмплиСенс НСУ-240-/ВКО-440» (ФСП 42-0155-1135-01);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «АмплиСенсНСУ-ЕКТ» (№ ФС 01032006/5667-06 от 26 декабря 2006 г) и «АмплиСенс НСУ-РЕР»(№ ФС 01032006/5670-06 от 27 декабря 2006 г); для количественного определения РНК вируса гепатита С:

- с гибридизационно-ферментной детекцией: «АмплиСенс НСУ-Монитор» (ФСП 42-0115-6363-05; № ЛС-000918 от 18.11.2005 г.);

- с гибридизационно-флуоресцентной детекцией:

АмплиСенс НСУ-Монитор- БЯТ (№ ФСР 2007/00577 от 9 октября 2007 г).

Наборы реагентов зарегистрированы в РФ и разрешены к применению в диагностической практике.

Разработанный и аттестованный Отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) 42-42-366-06П внесен в Реестр Национальных стандартов МИБП.

Совокупность новых научных результатов и положений, выносимых на защиту

1. На основе принципов валидации аналитических методов разработана система лабораторных испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С в отношении специфичности, предела обнаружения, линейного диапазона, прецизионности и правильности.

2. Разработанный отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) позволяет оценивать качество наборов реагентов для выявления РЕПС НСУ в отношении аналитической чувствительности, воспроизводимости, линейного диапазона определяемых величин, прецизионности и правильности

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 49 таблиц и 9 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключений, выводов и списка цитированной литературы. Библиография включает 30 отечественных и 130 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Эльберт, Елизавета Викторовна

выводы

1.Впервые разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для неколичественного выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С, включающая оценку специфичности, аналитической чувствительности и воспроизводимости с использованием стандартных образцов.

4. Разработанный и аттестованный отраслевой стандартный образец содержания РНК вируса гепатита С (ОСО РНК НСУ) позволил провести валидацию и унифицировать методы контроля наборов реагентов для неколичественного и количественного определения РНК НСУ методом полимеразной цепной реакции.

5. На основании разработанной системы испытаний установлена аналитическая чувствительность наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатита В и С: 7 наборов с

2 3 электрофоретической детекцией 5x10 - 5x10 копий/мл и 4 набора с

2 2 гибридизационно-флуоресцентной детекцией -10 - 5x10" МЕ/мл.

6. Установленные на основе разработанной системы испытаний характеристики двух наборов реагентов на основе ПЦР для количественного

3 6 определения РНК вируса гепатита С: линейный диапазон 10 - 10 МЕ/мл л о набор на основе ГИФА) 5x10 - 10е МЕ/мл (набор на основе П1Т), коэффициент вариации не более 36 % (набор на основе ГИФА) и не более 56 % (набор на основе ЖТ) и правильность - смещение результатов относительно референтного набора не более 0,5 ^ - позволили рекомендовать их к регистрации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований разработана система испытаний наборов реагентов на основе ПЦР, позволяющая по единому плану оценивать наборы реагентов для неколичественного выявления и количественного определения ДНК вирусного гепатита В и РНК вирусного гепатита С методом ПЦР, включающая оценку:

- специфичности, предела обнаружения, диагностической эффективности (диагностическую специфичность, чувствительность и воспроизводимость на клинических образцах) наборов реагентов для неколичественного выявления генетического материала методом ПЦР;

- специфичность, линейность, линейность в диапазоне определяемых величин, прецизионность и правильность наборов реагентов для количественного выявления ДНК/РНК на основе ПЦР.

Таким образом, показана возможность использования принципов валидации метода при изучении наборов реагентов, как для неколичественного, так и для количественного определения ДНК НВУ и РНК НСУ.

Для стандартизации наборов реагентов на основе ПЦР впервые введено для установления аналитической чувствительности определение минимальной концентрации нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), выявляемой с воспроизводимостью 100 % при 10-кратной постановке.

Кроме того, при оценке диагностической эффективности введена оценка воспроизводимости с использованием модельных образцов, концентрация которых соответствует аналитической чувствительности набора реагентов.

Если наборы реагентов в лабораторных испытаниях показали удовлетворительную специфичность, то результат, полученный при оценке воспроизводимости на зашифрованных отрицательных образцах (90,0 - 95,5,0 %) в условиях диагностической лаборатории при использовании наборов с электрофоретической детекцией, свидетельствует о возможной контаминации в процессе анализа. Таким образом, ложноположительные результаты, полученные при проведении оценки диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С методом ПЦР с электрофоретической детекцией на клинических образцах должны учитываться при интерпретации результатов. В сомнительных случаях требуется повторная постановка анализа на новых образцах и дальнейшее наблюдение за пациентом.

Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности оценки воспроизводимости наборов реагентов на модельных образцах с известной концентрацией определяемой нуклеиновой кислоты с обязательной шифровкой анализируемых образцов. Кроме того, использованную схему можно рекомендовать не только при проведении медицинских испытаний, но и для организации внутрилабораторного и внешнего контроля качества ПЦР-анализов, так как данная схема позволяет оценить работу оператора при условии использования сертифицированных наборов реагентов. Критерием для положительной оценки качества работы оператора или лаборатории в отношении контаминации может, видимо, стать воспроизводимость не менее 95 % при использовании отрицательных образцов. Критерием качества работы оператора в отношении чувствительности должна быть способность выявлять ДНК или РНК на пределе обнаружения, характерной для данного набора реагентов.

В результате проведенных исследований установлены валидационные характеристики наборов реагентов для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С (табл. 48) и количественного определения РНК НСУ методом ПЦР (табл.49).

Из таблицы 48 видно, что аналитическая чувствительность наборов реагентов для неколичественного выявления ДНК вируса гепатита В составила 102 - 103 копий/мл; для РНК вируса гепатита С - 102 - 5x103 копий/мл Все наборы реагентов были специфичны и показали удовлетвоврительную диагностическую эффективность. Воспроизводимость на отрицательных образцах составила 87,0 - 95,5 % (для наборов реагентов с электрофоретической детекцией результатов амплификации) и 100 % (для наборов реагентов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией). Таким образом, наборы реагентов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией показали более высокую аналитическую чувствительность и диагностическую эффективность.

Из таблицы 49 видно, что для наборов реагентов для количественного л п определения РНК НСУ характерна линейность в диапазоне 5x10 - 10 МЕ/мл; удовлетворительную правильность (смещение относительно результатов референтного набора реагентов и МСО не более 0,5 и прецизионность (коэффициент вариации в верхнем и нижнем диапазонах не более 56 %).

Разработанный и аттестованный нами ОСО РНК НСУ (ОСО 42-28-366-06П) позволил оценить валидационные характеристики 2-х наборов реагентов для неколичественного выявления РНК НСУ в отношении:

- специфичности;

-аналитической чувствительности;

- воспроизводимости и 2-х наборов реагентов для количественного определения РНК НСУ:

- линейности в диапазоне определяемых величин;

- правильности;

- прецизионности.

Таким образом, проведенная работа показала возможность и целесообразность использования принципов валидации аналитических методов при изучении наборов реагентов, как для качественного, так и для количественного определения ДНК НВУ и РНК НСУ. При исследовании ПЦР наборов реагентов установлены валидационные харатеристики наборов для неколичественного выявления и наборов для количественного определения ДНК/РНК вирусов гепатита В и С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Эльберт, Елизавета Викторовна, Москва

1. Аммосов А.Д., Гришаев М.П., Рукавишников М.Ю., Порьшаева В.А., Данилюк Н.К., Биоинженерные методы в разработке и производстве иммуноферментных и ПЦР-зондовых тест-систем для определения маркеров гепатита В., Вопр.вирусол., 1997, № 5, С. 200-202.

2. Балаян М.С, Михайлов М.И., Энциклопедический Словарь Вирусные Гепатиты (Второе издание), М., "Амипресс", 1999.

3. Вирусные гепатиты (методическое пособие для врачей) под редакцией главного инфекциониста МЗ РФ профессора М.Х. Турьянова., Москва: Агар, 1992, С. 13.

4. Гепатит С: Консенсус 2002., Вирусные гепатиты: достижения и перспективы: Информ. бюл., 2002, № 2, С. 3-11.

5. Гланц С., Медико-биологическая статистика, М., Практика, 1999, 455 С.

6. ГОСТ Р 52249-2004 Национальный стандарт Российской Федерации. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. М., 2004, С. 211.

7. ГОСТ Р 51352-99 Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики. Методы испытаний

8. ГОСТ Р ИСО 17511-2006 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в биологических пробах. Метрологическая прослеживаемость значений, приписанных калибраторам и контрольным материалам

9. ГОСТ Р ИСО 15193-2007, Национальный стандарт Российской Федерации. Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в пробах биологического происхождения. Описание референтных методик выполнения измерений"

10. ГОСТ Р ИСО 15194-2007 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в пробах биологического происхождения. Описание стандартных образцов.

11. Государственный отчет «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2004 году».

12. Государственный отчет «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2005 году».

13. Деррфель К., Статистика в аналитической химии, М., Мир, 1994, 270 С.

14. Иванов A.B., Кузякин А.О., Кочетков С.Н. Молекулярная биология вируса гепатита С, 2005, Т. 45, С. 37-86.

15. Исаева О.Н. Разработка системы внешней оценки качества лабораторных исследований при диагностике вирусных гепатитов В и С: Автореф. дис. канд. биол. наук., М., 2003, С. 11-12

16. Львов Д.К. Вирусные гепатиты от А до G и далее. Журн. микробиол., 1997, № 1, С. 70-77.

17. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С (Серологические маркеры и методы их выявления), Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы, 2001, № 2(12).

18. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Клиническая лабораторная диагностика, 2000, № 4, С.25-32.

19. Мукомолов С.Л., Калинина О.В. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов (часть 2). Мир вирусных гепатитов, 2003, № 12 (декабрь), С.3-10.

20. Нетесова И.Г., Swenson P.D., Осипова О.Л., Посух М.А., Казаковцева М.А., Питомец Г.А., Четырена A.A., Киселев H.H., Нетесов C.B., Фаворов М.О. Субтипы HBsAg в Западной Сибири, Информационный бюллетень «Новости «Вектор-Бест», июнь 2000, № 2(16).

21. Петухов В.Г. Метод параллельных линий для количественной оценки качества стандартных образцов и других медицинских иммунобиологических препаратов в иммуноферментном анализе, Биопрепараты, 2004, № 1 (март), С. 19-23.

22. Рахманова А.Г.Яковлев А.А., Виноградова Е.Н., Демиденко Т.П., Стуков Б. В. Хронические вирусные гепатиты (вопросы классификации и регистрации) . Эпидемиология и инфекционные болезни, 1999, № 1, С. 3825 42.

23. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ. Соросовский образовательный журнал, 1999, Т 5, № 2, С. 9-15.

24. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты, Теза, 1998.

25. Попова О.В., Семененко Т.А., Михайлов М.И. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов. Мир вирусных гепатитов, 2003,12 (декабрь), С.3-13.

26. СП 3.3.2.1.1288 03 «Надлежащая практика производства медицинских иммунобиологических препаратов», Минздрав России, М., 2003, С 80.

27. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. «Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины» глава 3 диагноз, М., Медиа Сфера, 1998,С. 60-97.

28. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Оншценко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика), М., ГОУ ВУНЦ МЗ РФ, 2003, С. 13; 24-26;76-77;101; 132.

29. Abravaya К., Carrino J.J., Muldoon S., Lee H.H. Detection of point mutation with a modified ligase chain reaction (GAP-LCR), Nucleic Acids Research, 1995, V. 23, P. 675-682.

30. Alter M.J., Epidemiology of hepatitis С in the West., Semin. Liver Desis., 1995, V. 15(1), P. 5-14.

31. Aoyagi K., Iida K., Ohue C., Matsunaga Y.,Tanaka E, Kiyosawa K, Yagi S. Performance of a conventional enzyme immunoassay for hepatitis С virus core antigen in the early phases of hepatitis С infection., Clin Lab., 2001,V. 47(3-4), P.119-127.

32. Arauz-Ruiz P., Norder H., Robertson ВН., Magnius L.O.Genotype H: a new American genotype of hepatitis В vims revealed in Central America. J.Gen. Virol, 2002, V. 83 (Pt 8), P. 2059-73.

33. Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem., 1992; V. 61, P. 131-156.

34. Arrieta J J, Rodriguez-Inigo E, Casqueiro M, Detection of hepatitis C virus replication by In situ hybridization in epithelial cells of anti-hepatitis C viruspositive patients with and without oral lichen planus. Hepatology., 2000, V. 32(1), P.97-103.

35. Arrieta J J, Rodriguez-Inigo E, Ortiz-Mo villa N, Bartolome J, In situ detection of hepatitis C virus RNA in salivary glands.Am J Pathol., 2001, V. 158(1), P. 259264.

36. Beer N., Shinar E., Novack L.,Safi J., Soliman U., Yaari A., Goldman-Levi R, Yahalom V, Bolotin A, Sarov B .Accuracy of hepatitis C virus core antigen testing in pools among seroconverters. Transfusion, 2006, V. 46 (10), P. 1822-1828.

37. Beck J, Nassal M. Hepatitis B virus replication. World J Gastroenterol., 2007, V.13(l), P.48-64.

38. Blum H.E., Galum E., Liang T.J., von Weizsäcker F., Wands J.R. Naturally 2occurring missense mutation in the polymerase gene terminating hepatitis B virus replication. J Virol., 1991, V. 65, P. 1836-1842.

39. BLAST www.ncdi.nim.nih.gov; EMBL www.ebi.ac.uk./embl.html

40. Bockisch B,Grunwald T, Spillner E, Bredehorst R.Immobilized stem-loop structured probes as conformational switches for enzymatic detection of microbial 16S rRNA. Nucleic Acids Res., 2005, V. 33(11), P. 101.

41. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990, V. 28(3), P.495-503.

42. Bukh J., Miller RH., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Semin Liver Dis, 1995, V. 15(1), P.41-63.

43. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates collected worldwide. Proc. Nat.l Acad. Sei. USA., 1993, V 90, P. 8234-8238.

44. Bukh J., The hepatitis C virus. American Association for the Study of Liver Diseases Post-graduate Course 2000, Update on Viral Hepatitis, October 27-28, Dallas, Texas. 2000, P. 102-111.

45. Bustin S.A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M.W. Quantitative real-time RT-PCR a perspective. J Mol Endocrinol., 2005, V. 34(3), P. 597-601.

46. Cai Z., Liang T.L., Luo G. Effect of mutations of the initiation nucleotides on hepatitis C virus RNA replication in the cell., 2004, V 78, V. 7, P. 3633-3643.

47. Carman W.F., Jacyna M.R., Hadziyannis S., Karayiannis P, McGarvey MJ, Makris A, Thomas HC.Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989, V. 2(8663), P. 588-591.

48. Chamberlain RW, Adams N, Saeed AA, Simmonds P, Elliott RM. Complete nucleotide sequence of a type 4 hepatitis C virus variant, the predominant genotype in the Middle East. J Gen Virol., 1997 Jun.,78 (Pt 6), P. 1341-1347.

49. Chang L.J., Hirsch RC., Ganem D., Varmus H.E. Effects of insertionaland point mutations on the functions of the duck hepatitis B virus polymerase. J. Virol., 1990, V. 64, P.5553-5558.

50. Chang M., Marquardt A.P., Wood B.L., Williams O. In situ distribution of hepatitis C virus replicative-intermediate RNA in hepatic tissue and its correlation with liver disease. J Virol., 2000, V. 74(2), P. 944-955.

51. Chen W.N., Oon C.J. Changes in the antigenicity of a hepatitus B virus mutant stemming from lamivudine therapy. Antimicrob Agents Chemother., 2000, V. 44(6), P. 1765.

52. Chen W.N., Oon C.J. Hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) mutants in Singapore adults and vaccinated children with high anti-hepatitis B virus antibody levels but negative for HBsAg. J Clin Microbiol., 2000, V. 38(7):2793-2794, ;

53. Cheng S., Fockler C., Barnes W.M., Higuchi R. Effective amplification of longtargets from cloned inserts and human genomic DNA.Proc Natl Acad Sci V. 91(12):5695-5699,1994.

54. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis geno38me. Science., 1989,V. 244(4902), P.359-362.

55. Clarke B. Molecular virology of hepatitis C virus: review. J. Gen. Virol., 1997, V 78, № 10, P. 2397-2410.

56. Coleman PF. Surveillance for hepatitis B surface antigen mutants. J Med Virol., 2006, 78 Suppl 1, P.56-58.

57. Deiman B, van Aarle P, Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Mol Biotechnol., 2002, V. 20(2), P. 163-179.

58. Don R.H., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker R„ Mattick J.S. "Touchdaun" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic. Acids Res.,1991,V. 19 (14), P. 4008.

59. EURACHEM Guide. The fitness for purpose of analytical methods. A laboratory guide to method validation and related topics., 1998.

60. Fabris P, Biasin MR, Infantolino D, Tositti G, Venza E, Floreani A, Zanetti A, de Lalla F., TTV infection in patients with acute hepatitis of defined aetiology and in acute non-A-E hepatitis. J.Hepatol., 2000, V. (32)4, P.661-665.

61. Fahy E., Kwoh D.Y., Gingeras T.R. Self-sustained sequence replication (3SR): ai isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCF Methods Appl., 1991, V. 1(1), P.25-33.

62. Francois G., Rew M., Van Damme P., Mphahlele MJ, Meheus A. Mutant Hepatitis B viruses: a matter of academic interest only or a problem with farreaching implications?, Vaccine, 2001,V. 19, P. 3799-3815.

63. Gerlich W.H. Diagnostic problems caused by HBsAg mutants-a consensus report of an expert meeting. Intervirology., 2004, V. 47, P. 310-313.

64. Gerlich W.H., Lu X., Heerman K.H. Studies on the attachment and penetration of hepatitis B virus . J. Hepatol., 1993, 17 suppl V. 3, P. 10 14.

65. Ghendon Y.Z. World health organization strategy for control jn Hepatitis B In: Control of virus disease. Ed .E Kustran 2nd ed. Marcel Dekker Inc. N.-Y., 1993, P. 141-164.

66. Gilbert F., Mandart E., Fitoussi F., Tiollais P., Charnay P. Nucleotide sequence of hepatitis B virus genome (subtype ayw) cloned in E.col. Nature, 1979, V. 281, P. 646-650.

67. Grethe S., Monazahian M., Bohme I., Thomssen R. Characterization of unusual escape variants of hepatitis B surface antigen-negative subject. J. Virol., 1998,V. 72(9), P. 7692-7696.

68. Hasegawa K., Huang J., Rogers S.A ., Blum HE, Liang TJ. Enhanced replication of a hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis. J Virol., 1994, V. 68(3), P. 651-1659.

69. He Y., Yan W., Coito C., Li Y., Gale M. J.r, Katze M.G. The regulation of hepatitis C virus (HCV) internal ribosome-entry site-mediated transletion by HCV replicons and nonstructural proteins. J Gen Virol., 2003, V. 84 № 3, P. 535543.

70. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res., 1996, V. 6, P. 986-994.

71. Hijikata M, Kato N, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Shimotohno K. Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C vims. Biochem Biophys Res Commun., 1991, V. 175(1), P.220-228.

72. Hou J., Liu Z., Gu F. Epidemiology and prevention of hepatitis B virus infection. Int J Med Sci., 2005,V. 2(1), P.50-55.

73. Hou J., Wang Z., Cheng J., Lin Y. Prevalence of naturally occurring surface gene variants of hepatitis B virus in nonimmunized surface antigen-negative Chinese carriers. Hepatology., 2001,V. 34(5), P. 10271034.

74. Houghton M., Weiner A., Han J., Kuo G., Choo Q.L. Molecular biology of the heptitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology ,199,. V.14, P. 381-388.

75. Hsu H.Y, Chang M.H, Lee C.Y, Hsieh K.H., Ni Y.H., Chen P.J., Chen D.S. Precore mutant of hepatitis B virus in childhood fulminant hepatitis B: an infrequent association. J Infect Dis., 1995, V. 171, P. 776-781.

76. Hunt C.M., McGill J.M., Allen M.I., Condreay L.D. Clinical relevance of hepatitis B virus mutations. Hepatology, 2000, V. 31, P. 1037-1044.

77. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures, ICH-Q2A. 1994, 5p.

78. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B. 1996, 8p.

79. Kamisango K., Kamogawa C., Sumi M., Goto S, Hirao A, Gonzales F, Yasuda K, lino S. Quantitative detection of hepatitis B virus by transcription-mediated amplification and hybridization protection assay. J. Clin. Microbiol., 1999, V. 37 (2), P. 310-314.

80. Karthigesu V.D., Mendy M., Fortutin V., Whittle HC, Howard CR, Allison LM. The ligase chain reaction distinguishes hepatitis B virus S-gene variants. FEMS Microbiol. Lett., 1995, V. 131 (2), P. 127-132.

81. Kato N., Oosueama Y., Ohkoshi S., Nakazawa T, Sekiya H, Hijikata M, Shimotohno K. Characterisation of hypervariable regions in the putative envelope protein of hepatitis C virus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, V. 189(1), P. 119-127.

82. Kato N., Ootsueama Y. , Tanaka T., Nakagawa M., Nakazawa T., Muraiso K.,

83. Ohkoshi S., Hijikata M., Shimotohno K. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatits C virus. Virus Res., 1992, V. 22(2), P. 107-123.

84. Komatsu F., Takasaki K. Determination of serum hepatitis C virus (HCV) core protein using a novel approach for quantitative evaluation of HCV viraemia in anti-HCV-positive patients. Liver., 1999,V. 19(5), P.375-380.

85. Krajden M., Comanor L., Rifkin O., Grigoriew A., Minor J.M., Kapke G.F. Assessment of hepatitis B virus DNA stability in serum by the Chiron Quantiplex branched-DNA assay. J Clin Microbiol., 1998, V. 36(2), P.382-386.

86. Kramvis A., Kew M.C. The core promoter of hepatitis B virus. J. Viral. Hepat., 1999,V.6, P. 415-427.

87. Kuo G., Choo Q.L., Alter H.J., Gitnick G.L. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis. Science., 1989, V. 244(4902), P. 362-364.

88. Lang T.J., Hasegawa K., Rimon N., Wands J.R., Ben-Porath E. A hepatitis B virus mutant associated with an episode of fulminant hepatitis. N Engl J Med., 1991,V. 324, P. 1705-1709.

89. Laperche S., Le Marrec N., Simon N., Bouchardeau F., Defer C. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infection. Transfusion., 2003,V.43(7), P.958-962.

90. Laskus T., Persing D.H., Nowicki M.J., Mosley JW, Rakela J. Nucleotide sequence analysis of the precore region in patients with fulminant hepatitis B inthe United States. Gastroenterology, 1993, V. 105(4), P. 1173-1178.

91. Lau J.Y.N., Wright T.L. Molecular virology and pathogenesis of hepatitis B. LANCET, 1993, V. 342, P. 1335-1340.

92. Lauer G., Walker B. Hepatitis C virus infection. Review. N Engl J Med., 2001, V. 345(1), P. 41-52.

93. La'ulu S.L., Roberts W.L. The analytic sensitivity and mutant detection capability of six hepatitis B surface antigen assays. Am J Clin Pathol., 2006, V. 125(5), P.748-51.

94. LeBouvier GL, McCollum RW. Australia (hepatitis associated) antigen: physcochemical and immunological characteristics, Adv. Virus Res. V. 16: 357396, 1970.

95. Lee J.W., Kim K., Jung S.H., Lee K.J., Choi E.C., Sung Y.C., Kang C.Y. Identification of a domain containing B-cell epitopes in hepatitis C virus E2 glycoprotein by using mouse monoclonal antibodies. J Virol., 1999, Jan;73(l), P. 11-18.

96. Ling R, Mutimer D., Ahmed M., Boxall E.H., Elias E., Dusheiko G.M., Harrison T.J. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. Hepatology., 1996, V. 24(3), P. 711-713.

97. Loeffler J., Henke N., Hebart H., Schmidt D., Hagmeyer L., Schumacher U., Einsele H. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the light cycler system. J Clin Microbiol., 2000, V. 38(2), P. 586- 590.

98. Lok A.S.F., McCachon D.J. Chronic Hepatitis B. Hepatology., 2007, V. 45(2), P.507-539.

99. Lunel F., Cresta P., Vitour D., Payan C., Dumont B., Frangeul L., Reboul D., Brault C., Piette J.C., Huraux J.M. Comparative evaluation of hepatitis C virus

100. RNA quantitation by branched DNA, NASBA, and monitor assays. Hepatology., 1999 Feb, V. 29(2), P.528-535.

101. Ly T.D., Servant-Delmas A., Bagot S. Sensitivities of four new commercial hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) assays in detection of HBsAg mutant forms. J Virol Methods., 2006, V. 135(1), P. 109-117.

102. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Survey fad Summary Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research., 2002,V. 30(6), P. 1292-1305.

103. Magnius L.O., Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. Intervirology., 1995,V. 38, P.24-33.

104. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., Zhu N., Lai M.M. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C virus core protein. Virology., 1996 Apr., V. 218(1), P.43-51.

105. Mizokami M., Ohba K., Gojobori T., Lau J. Y. At least 7 types and 16 subtypes of hepatitis C virus based on molecular evolutionary analysis. Hepatology., 1994,V. 20, P. 245A.

106. Morishima C., Gretch D.R. Clinical use of hepatitis C virus tests for diagnosis and monitoring during therapy.Clin Liver Dis., 1999Nov., V.3(4), P. 717-740.

107. Nassal M. Hepatitis B virus replication; Novel roles for virus-host interactions. Intervirology., 1999,V .42, P. 100-116.

108. Nolandt O., Kern V., Muller H. et al. Análisis of hepatitis C virus core protein interaction domains. J Gen Virol., 1997,V. 6, P. 1331-1340.

109. Nouri Aria K.T., Sallie R., Sangar D., Alexander G.J, Detection of genomic and intermediate replicative strands of hepatitis C virus in liver tissue by in situ hybridization. J Clin Invest., 1993,V. 91(5), 2226-2234.

110. Ogata N. Miller R.H., Ishak K.G., Purcell R.H. The complete nucleotidesequence of a precore mutant of hepatitis B virus implicated in fulminant hepatitis and its biological characterization in chimpanzees. Virology, 1999, V. 194 (1), P. 263-276.

111. Ohba K., Mizokami M., Ohno T. et al. Relationships between serotypes and genotypes of hepatitis B virus: genetic classification of HBV by use of surface genes. Virus Res., 1995, V. 39, P.25-34.

112. Okamoto H., Mishiro S. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus. Intervirology., 1994,V. 37(2), P. 68-76.

113. Omata M, Ehata T., Yokosuka O., Hosoda K., Ohto M. Mutations in the precore region of hepatitis B virus DNA in patients with fulminant and severe hepatitis. N Engl J Med., 1991, V. 324(249), P. 1699-1704.

114. Onganer PU. Genotypes of the hepatitis B virus: Basic aspects. Ann. Microbiol., 2004, V. 54 (3), P. 325-334.

115. Peterson J., Green G., Iida K., Caldwell B. Detection of hepatitis C core antigen in the antibody negative 'window' phase of hepatitis C infection. Vox Sang., 2000, V. 78(2), P. 80-85.

116. Pileri P., Uematsu Y., Campagonoli S., Galli G, Falugi F, Petracca R, Weiner AJ, Houghton M, Rosa D, Grandi G, Abrignani S. Binding of gepatitis C virus to CD81. Science., 1998, V. 282 (5390), P. 938-941.

117. Robinson W.S., The role of hepatitis B virus in the development of primary hepatocellular carcinoma: Part I. J. Gastroenterol. Hepatol., 1992, V. 7(6), P. 622-638.

118. Roccasecca R., Ansuini H., Vitelli A. Binding of the hepatitis С virus E2 glycoprotein to CD81 is strain specific and is modulated by a complex interplay between hypervariable regions 1 and 2. J Virol., 2003, V. 77(3), P. 1856-1867.

119. Saldahna J., Gerlich W., Lelie P.N., Heerman К and Heath A. An International$

120. Collaborative Study to esteblish a World Health Organization International Standard for Hepatitis В virus DNA Nucleic acid Amplification Techniques. Vox Sanquinis, 2001, V. 80, P. 63-71.

121. Saldahna J., Lelie P.N., Heath A., and the WHO collaborative study group. Establishment of the First International Standard for Nucleic Acid Amplification Technology (NAT) assays for HCV-RNA. Vox. Sang, 1999, V. 76, P. 149-158.

122. Saldanha J, Heath A., Collaborative Study Group.Collaborative study to calibrate hepatitis С virus genotypes 2-6 against the HCV International Standard, 96/790 (genotype 1). Vox Sang., 2003 Jan., V. 84(1), P.20-27.

123. Saldanha J. Standardization: a progress report. Biologicals, 1999 Dec., V. 27(4), P. 285-289.

124. J.Sambrook, E.F.Fritsch, T. Maniatis, «Молекулярное клонирование», 1989

125. Santolini E, Migliaccio G, La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein. J Virol., 1994 Jun., V. 68(6), P. 3631-3641.

126. Scaglioni P.P., Melegari M., Wands J.R. Biologic properties of hepatitis В viral genomes with mutations in precore promoter and precor open reading frame. Virology, 1997, V. 233, P. 374-381.

127. Seeger C., Ganem D„ Varmus H,E. Biohemical and genetic evidence for hepatitis В virus replication strategy. Science, 1986,V. 232, P.477-484.

128. Seeger C., Mason WS. Hepatitis В virus biology. Mycrobiol Mol Biol Rev., 2000,V. 64, P.51-68.

129. Sherlok S., Dooley J. Diseases of the liver and biliary system. 10th edition. Blackwell Science, 1997, P. 714

130. Simmonds P. Variability of hepatitis C virus. Hepatology., 1995, V. 21, P. 570-583.

131. Soguero C., Joo M., Chianese-Bullock K.A., Nguyen D.T., Tung K., Hahn Y.S. Hepatitis C virus core protein leads to immune suppression and liver damage in a transgenic murine model. J Virol., 2002, V. 76 (18), P. 9345-9354.

132. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley A.A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques, 1992 Sep., V. 13(3), P.444-449.

133. Taswell C. Limiting dilution assays for the determination of immunocompetent cell frequencies. J. Immunology., 1981, V. 126 (4) , P. 1614-1619.

134. Tiolais P., Charmay .P, Vyas Gn. Biology of hepatitis B virus. Science, 1981,V. 213, P.406-411.

135. Triyanti M., Saunier B., Maruvada P., Davis AR, Ulianich L, Heller T, Patel A, Kohn LD, Liang TJ Interaction of hepatitis C virus-like particles and cells: a model system for studying viral binding and entry. J Virol., 2002, V. 76 (18), P. 9335-9344.

136. Tsukiyama-Kohara K., Iizuka N., Kohara M., Nomoto A. Internal ribosome entrysite within hepatitis C virus RNA. J Virol. V. 66: 1476-1483, 1992.

137. Tyagi S, Kramer FR. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol., 1996, V.14(3), P.303-308.

138. Umemura T, Yeo AE, Sottini A, Moratto D, Tanaka Y, Wang RY, Shih JW, Donahue P, Primi D, Alter HJ. SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis. Hepatology, 2001, V. 33(5), P. 1303-1311.

139. Walker G.T. Empirical aspects of strand displacement amplification. PCR Methods Appl., 1993, V. 3, P. 1-6.

140. Wang A.M., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci U S A., 1989, V. 86(24), P. 9717-9721.

141. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact. J Clin Virol., 2005, V. 32(2), P. 102-112.

142. Weber B., Dengler T., Berger A., Doerr H.W., Rabenau H. Evaluation of two new automated assays for hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) detection: IMMULITE HBsAg and IMMULITE 2000 HBsAg.J Clin Microbiol., 2003, V. 41(1), P.135-143.

143. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)--amplification of specific DNA sequence s using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics., 1989, V. 4(4), P. 560-569

144. Xie L., Wu XD., Huang DZ., Chen HL., He LX, Wang J, Han DK.

145. Clinical application and analysis of hepatitis C virus NS3 antigen detection by ELISA in human serum. Chin Med J (Engl)., 2007; V. 120(4), P.294-299.

146. Zarski JP, Bohn B, Bastie A, Pawlotsky JM, Baud M, Bost-Bezeaux F, Tran van Nhieu J, Seigneurin JM, Buffet C, Dhumeaux D. Charakteristics of patients with dual infection by hepatitis B and C viruses. J. Hepatol., 1998, 28(1), P. 27-33.

147. Перечень наборов реагентов, испытания которых проводились в соответствии с разработанной системойп/п набор реагентов аналитиеская чувствительность специфичность суммарная воспроизводимость (%) диагностическая

Информация о работе

Эльберт, Елизавета Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Разработка системы испытаний наборов реагентов на основе ПЦР для выявления ДНК/РНК вирусов гепатитов B и C - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы