Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование биотинированных зондов для детекции геномной РНК вируса гепатита А

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование биотинированных зондов для детекции геномной РНК вируса гепатита А"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

РГ в од

. - к-.-..., -.опс;

и I • I ■-. ..7.1

на правах рукописи удк 577 02 08. 577.323.422 616 26-02

БУДЯК Евгения Валентиновна

использование биотинированных зондов для детекции геномной рнк вируса гепатита а

03 00 04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК, 1995

Работа выполнена в Клинико-диагностическом отделе Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Н.П. Мертвецов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Г.М. Дымшиц

кандидат биологических наук А.Б. Беклемишев

Ведущая организация - Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии "Вектор". Научно-исследовательский институт молекулярной биологии.

Защита диссертации состоится " <&( " 1995 р. в час.

на заседании специализированного Ученого Совета К 001.37.01. Института биохимии СО РАМН по адресу: 630117 Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН.

Автореферат разослан "__"_ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного Совета; кандидат медицинских наук

Т.Г. Филатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность_ проблемы^ Вирусный '. апатит А СТТЛ} остается одной из самых распространенных инфекций как в нашей стране, так и за рубежом. В России максимальная заболеваемость ГА регистрируется в Западно-Сибирском, Восточно-Сибирском и Дальневосточном регионах. По ущербу, наносимому населению, ГА сравним с гриппом и ОРЗ. Полной и завершенной концепции патогенеза ГА до сих пор не разработано и на сегодняшний день ГА остается недостаточно изученной и неуправляемой инфекцией. Рутинные методы детекции вирусов (выращивание на культуре тканей) в случае ВГА не пригодны, так как данный вирус размножается лишь на культурах клеток приматов, и условия его стабильной и высокой репликации до сих пор окончательно не выяснены. Тесты ИФА не всегда достаточно чувствительны и специфичны. Кроме того, с помощью ИФА невозможно детектировать непосредственное инфекционное начало вируса - его нуклеиновую кислоту.

Разработка высокочувствительных и специфичных методов детекции ВГА представляет научный и практический интерес в плане исследования молекулярных основ вирусного патогенеза, выявления вирусоносителей в инкубационном периоде и на ранних стадиях заболевания, при безжелтушной.и бессимптомной формах болезни.

Для выявления вирусных заболеваний, регистрации вирусных НК в образцах окружающей среды и других целей широко используется метод гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК). Для научных исследований применяют, как правило, радиоактивномеченые зонды в связи с их высокой чувствительностью и специфичностью. Однако, как показала практика, использование таковых зондов для рутинных клинических определений крайне затруднено.

и§5ь_Е§$°тыг_ Настоящее исследование посвящено разработке нерадиоактивного способа детекции РНК ВГА на основе МГНК с использованием биотинированных ДНК-зондов на основе оцДНК бактериофага М13. Работа направлена на создание тест-системы, которая нашла бы широкое применение в условиях клинической лаборатории и могла бы послужить основой при комплектации тест-набора на РНК ВГА.

5_2а8§2й_исследования_входили]_

конструирование биотин-меченых ДНК-зондов на основе одно-цепочечной (оц) и двухцепочечной (дц) ДНК бактериофага М13;

определение чувствительности и специфичности гибридизационного теста с использованием упомянутых зондов на модельных системах и клинических образцах; апробация МГНК с использованием биоти-нированных зондов в очагах вспышки гепатита А; сравнение метода с другими способами детекции ГА; разработка рекомендаций по созданию тест-набора на РНК ВГА.

_Н§£таая_новизна_и_практическ Впервые

получены биотинировэнные зонды для детекции РНК ВГА на основе оцДНК бактериофага MI3 со вставкой кДНК (позиции I372-1781), комплементарной участку генома РНК ВГА, кодирующему часть обо-лочечного бежа 7Р1. Зонды исследованы в реакции МГНК на модельных и клинических образцах. Установлено, что упомянутые зонды позволяют детектировать до 5 пг (0,25 пг/мм2) контрольной ДНК и 100 пг вируса ГА на пятно (последняя цифра соответствует около 30 пг (1,5 пг/мм2) РНК ВГА и 3-7х106 физических вирусных частиц). Зонды апробированы в очагах вспышки гепатита А, причем, вирусоносители были выявлены не только среди больных с клиническими проявлениями заболевания,но также и среди контактировавших с больными лиц, находящихся в инкубационном периоде болезни. Практическая ценность разработанного теста про--демонстрирована созданием на его основе опытного образца тест-набора для детекции РНК ВГА.

По ложетя^ _выдаигаеше _на_з ащи ту^

1. Впервые сконструирован нерадиоактивный (меченый биотином) молекулярный зонд для детекции геномной РНК вируса гепатита А.

2. Разработан способ детекции геномной РНК вируса гепатита А на основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислотс использованием вышеназванного зонда.

3. Метод апробирован на модельных системах и клинических образцах от больных и контактировавших с ними лиц из очагов вспышки гепатита А; проведено сравнение метода с другими способами детекции ГА.

4. Разработаны комплект реактивов для создания тест-набора на РНК ВГА и инструкция по его применению.

_Публжауия_и_апробация_работ^ По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, получено положительное решение на заявку об изобретении N 5055815/13 (035382) от 22.07.92. Результаты работы докладывались на YIII Всесоюзном

__________симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ

т. Рига, I989 г.); на I и II Всесоюзных""конференциях'""Совре--ыешше направления создания медицинских диагностикумов" (г. Москва, 19ВЗ, 1990 г.г. ); на Международной конференции "Биология, иммунопатология и клиника вирусных гепатитов" (г.Парма, 19ЭЗ г. ).

^р;/ктура_и_ооЪем_р§боты^ Диссертация изложена на 100 страницах, машинописного текста, содержит введение, обзор литературы. главы, включающие материалы и методы, результаты и обсуждение исследований, выводы II список литературы (158 ссылок). Работа иллюстрирована 17 рисунками и 4 таблицами.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Новосибирского институте биоорганической химии СО РАН, N государственной регистрации темы 01.86.0 114478

Содержание _работы._

I. Получение ДНК-зондов.

Молекулярные зонды на основе оц и дц ДНК бактериофага М13

(М13 НАУр I и КГ М13 НАУ р1), содержащие фрагменты кДНК длиной 390 и.о., комплементарные участку генома вируса ГА, кодирующему часть оболочечного белка УР1, были сконструированы, как описано ранее (Каргинов и др, 1988). Для проверки чувствительности зондов использовали оц ДНК М13 НАУр19 и оц ДНК М13 НАУр2, содержащие последовательности кДНК длиной 240 и 390 н.о. соответственно, идентичные вирусным и комплементарные вставке зондов.

Биотинирование оц и дц фаговых ДНК осуществляли химическим путем по двум схемам:

I )- с использованием переаминирующего реагента

о-аминобутил-О-гидроксиламина (аминооксибутиламина (АБА), ЫНгО(СНг)4ЫН2) и последующей реакцией собственно биотинирования ДНК с помощью ы-оксисукцинимидного эфира биотин-е-аминокапроновой кислоты. 2)- с помощью фотоактивируемого реагента Ы-(4-азидо-2-

нитрооензоил1-1,7-диаминогептана (лампа ХВ0-150 со светофильтром СЗС5) и также Ы-оксисукцинимидного эфира биотин-е-аминокапроновой кислоты.

Реакции по схеме ц) были проведены по модифицированной методике (Адаричев и др., 1987); по этой схеме была биотиниро-вана оцДНК М13НАУ р1 с получением био-зонда I. Биотинирование

по схеме (2) осуществляли с- использованием методики (Бейко и др.,. 1989); в последнем случае были помечеш биотином как оцДНК MI3 HAV р1, так и Rf MI3 HAV р1, с получением, соответственно, био-зондов 2 и 3.

2. Сравнение систем визуализации биотин-меченых ДНК.

Метод детекции ДНК-зондов при постановке реакции гибридизации является одним из ключевых моментов, которым в значительной мере определяется чувствительность всего метода (Кнорре, 1989). В связи с этим нами было проведено детальное исследование 3-х доступных проявляющих систем:

Пконъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена с субстратом орто-дианизидином в присутствии перекиси водорода (Ст-ПХ + Hg02+ оДА) ■ 2)конъюгата стрепгавидин щелочная фосфатаза из кишечника теленка с субстратом 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатом и хромогеном нитроголубым тетразолием (Ст-11й + BCIP (BIP) + nbt, импортного и отечественного производства) 3)конъюгата авидин-коллоидное золото с системой физического серебряного усиления (Ав-КЗ + ФСУ). Нами была исследована чувствительность вышеприведенных систем визуализации относительно биотинированной ДНК, в качестве которой использовался био-зонд I. Последний был сгибридизован с контрольной ДНК, иммобилизованной в 10-кратных разведениях на полосках нитроцеллшозных (НЦ) фильтров, и проявлялся с помощью вышеуказанных 3-х методов. Данные этого эксперимента приведены на рис. На.б,в).

Рис. На) демонстрирует более низкую чувствительность проявляющей системы I (Ст-ПХ + HgOg+ ОДА), составляющую лишь 500 пг био-зонда I на пятно. Чувствительность 2-х других систем визуализации оказалась приблизительно одинаковой и достигала 5 пг био-зонда I на пятно. Учитывая более низкую чувствительность конъюгата Ст-ПХ, а также его недостаточную стабильность при хранении, мы отказались от его использования и в дальнейших исследованиях применяли проявляющие системы 2 и 3.

Однако, при дальнейшей работе с проявляющей системой Ав-КЗ+ФСУ, несмотря на ее высокую чувствительность, равную импортной системе ct-uii+bcip+nbt, мы столкнулись со следующей проблеск

I

^ ^

а)

К

^ ^ ^ ^ ^ , i ,11 i i. n

О'б'О ^ « 3'- л

*.«. >>,<. Ьч >!4

^ 5? § ^ Ч «Л <л ^ 'о

5)

ё)

а ^ $

'о 1г>

к

MLU.11

в о

Рис.1. Результаты визуализации био-зонда I, сгибридизо-вавшегося с контрольной ДНК, с помощью проявляющих систем:

Ст-ПХ+Н202+оДА (а) Ст-ЩФ+ВЫР+ШГ (б) Ав-КЗ+ФСУ (в)

К -ДНК фага- х в количестве I мкг мой: Ав-КЗ+ФСУ хорошо работала при проявлении био-зонда I, сги-бридизованного с РНК ВГА в составе суммарной РНК, выделенной из образцов сывороток крови (СК) вирусоносителей и с РНК ВГА, выделенной непосредственно из суспензии очищенного вируса; однако, чувствительность этой системы при выявлении био-зонда I, сгибридизовавшегося с контрольной ДНК, не всегда воспроизводилась в высокой степени (см.рис. 2; сравнить с рис. I и 3). Мы не проводили детального исследования этого явления, однако предполагаем, что оно вызвано стерическими факторами в связи с относительно крупными размерами частиц коллоидного золота по

Г

НЛ. ^ «S ^ ^

s ^ $ 5 s ^ „

le ^ u loi «O l\

\ 1 m m 1

<9 kb?««

t. ;

«... Г4

t, C, Q Й g S

V- v- V,

li 1« !с| ^ ^ 'f', ^

i L I II I. I

8) ç* # • 9 <

S)

2)

Рис.2. Результаты гибридизации био-зонда 1 с контрольной ДНК (а,в), суммарной РНК из 4-х клинических образцов СК (б,г); системы детекции: Ав-КЗ+ФСУ (а,б) и Ст-11Й+ВС1Р+ЫВТ (в,г).

К - ДНК фага х. в количестве 5хЮ_6 г.

сравнению с молекулами ферментов.

В связи с вышеизложенным, в дальнейших ответственных экспериментах по поиску вирусоносителей в очагах вспышки ГА мы использовали только конъюгаты Ст-ШФ с субстратами BCIP (BIP) + NBT импортного либо отечественного производства.

3. Исследование оц биотинированных зондов в реакции гибридизации.

Нами были исследованы чувствительность и специфичность био-зондов I и 2 в реакции гибридизации с контрольной ДНК, РНК ВГА и суммарной РНК из 12 клинических образцов СК. Проявляющими системами были: для био-зонда I - Ав-КЗ + ФСУ, для био-зонда 2 - Ст-ШФ+BCIP+NBl. Конъюгат Ав-КЗ с системой физического серебряного усиления был приготовлен И.В.Сафроновым (НИБХ), конъюгат Ст-ИЙ в был импортного производства (фирмы "Calbiochem", США), субстраты - фирмы "Sigma"(США). Био-зонды I и 2 были сгибриди-зованы с контрольной ДНК, иммобилизованной на полосках НЦФ в 10-кратных разведениях. Для оценки чувствительности относительно собственно ВГА был поставлен опыт по гибридизации био-зонда

2-С-РНК_ВГА,_выделенной из очищенной суспензии вируса ГА и нанесенной на НЦФ также в 10-кратных разведениях. Результаты "этих" экспериментов показаны на рис. 3 (а,в,г). Из рис. 3 (а,в,г) видно, что био-зонды I и 2 позволяют определить 5хЮ-11-5хЮ"12г (50-5 пг) контрольной ДНК и Ю~10г (100 пг) вируса в

с

пятне, что соответствует 3-7x10 физических вирусных частиц

(ИиеокегЧ, 1976) и около 30 пг (1,5 пг/мм") вирусной РНК (Феннер и др., 1977).

В заключение данного эксперимента были проанализированы 12 образцов СК от больных с клиническим диагнозом вирусного гепатита А, отобранных на 1-2-ой неделе желтушного периода (рис.3 (б,д)). В качестве положительного контроля использовали РНК ВГА, выделенную из I нг, 500 пг и 100 пг очищенного препарата ВГА, в качестве отрицательных - суммарную РНК из СК здорового донора, а также гетерологичную ДНК фага х в количестве 5x10 г. Из рис.3(6,д) видно, что в 2-х из 12 образцов достоверно обнаруживается наличие РНК ВГА, причем обе методики показали одинаковые результаты. Полученные данные согласуются с литературными, свидетельствующими о кратковременности вирусемии и низком титре ВГА в клиническом материале (Приказчиков, 1987).

Показанная в этом эксперименте высокая чувствительность и специфичность оц био-зондов I и 2 на РНК ВГА была в дальнейшем подтверждена в опытах на значительном количестве образцов от больных и контактировавших с больными лиц из очагов вспышки ГА; кроме того, разрабатываемый нами способ был рассмотрен в сравнении с другими методами детекции вируса ГА.

Однако, как было уже указано выше, чувствительность проявляющей системы Ав-КЗ+ФСУ не всегда воспроизводилась в высокой степени, поэтлму в дальнейших экспериментах для выявления био-зондов мы использовали только конъюгаты Ст-ЩФ с субстратами ВС1Р (В1Р)+ЫБТ импортного либо отечественного производства.

4. Апробация био-зондов на клиническом материале.

Био-зонды 1,2 и 3 были апробированы на клинических об-

разцах от больных и контактировавших с больными лиц из очагов

вспышки гепатита А, а также образцах здоровых доноров из пункта

переливания крови. Полученные нами результаты были проверены в

сравнении с другими доступными способами детекции ГА. Всего

a) «é ё • ё о~д 6

ШШ i

2 о «a S S> "м

v >- ^ v v i

<-г> 'Г) ló ^ 'О 'Á

ШЩ I

о сэ S> '«з> 'О Р

S¿ 1

W> »о ^ «о

2)

JJJ

V

(гр. 8ГА)

f • '

5) i • •••

'гф $ Ш

I I i

к3 К^ Ц

I

к2

д)

О»

• • •

I I !

к* к, к«

4

Рис.3. Результаты гибридизации био-зондов I и 2 с

контрольной ДНК (а,в), суммарной РНК, выделенной из 12 клинических образцов СК (б,д); и био-зонда 2 -с РНК ВГА; проявлявшие системы: Ав-КЗ+ФСУ) (а, б) и Ст-ЩФ+BCIP+NBT (в.г.д)

—fi

Kj- ДНК фага х в количестве 5x10 г.

Kg- РНК из СК здорового донора

Kg 4 5- РНК из I нг, 500 пг и 100 пг очищенного

препарата ВГА

было проведено 3 расширенных обследования, проанализировано, в общей сложности, 603 клинических образцов.

Для работы со значительным количеством клинических образцов мы оптимизировали методику выделения суммарной РНК из проб сы-

... ' --»Г—"ЗТ

V . - > -

г б.

ф/0 9 ^ & & ^^

о

«г

I I к. к.

Рис.4. Результаты гибрилизаши био-зонда 2 с суммарной РНК, выделенной из 70 образцов СК от больных и контактировавших с ними лиц из очага вспышки ГА (в); К2 - РНК из I нг очищенного препарпта вируса ГА, К3 - суммарная РНК из образца СК здорового донора.

СК также и с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР) с реак цией обратной транскрипции (РОТ). РОТ-ПЦР была проведена Н.В. Мамаевой (ВНИИ МБ, НПО "Вектор", ПГТ Кольцове, Новосибирской) по методикам (ЮоЬехЧу е1 а1., 1989, За1к1 а1, , 1988). Для этого из 70 образцов были отобраны 20 (на рис. 4 и 5 прону мерованы), из них 17 проб положительные по тесту ИФА на нали-

вороток крови. За основу нами был взят метод фенольной экстракции, в котором мы опустили стадию высаживания РНК (Исе11ш^ et а1., 1987); мы также адаптировали методику к нанесению суммарной РНК на аппарате типа "М5л1:Го1(1". Количество СК для проведения одного анализа составляло 100 мкл. В процессе работы нами были также оптимизированы стадии гибридизации, блокирования фона и др. Выявление биотинированных зондов проводилось согласно предложенным инструкциям.

4 а).Апробация био-зонда 2 на клиническом материале.

Био-зонд 2 был апрбирован на 100 клинических образцах.

Первоначально с помощью био-зонда 2 были проанализированы 70 образцов сывороток крови (СК), из них 62 образца - от больных с желтушными формами и другими признаками гепатита из госпиталя Сиб ВО г.Новосибирска и очага вспышки ГА и 8 - от практически здоровых лиц, бывших в контакте с заболевшими (обследованный контингент - военнослужащие Сиб ВО). Данные этого эксперимента приведены на рис. 4, в рамку обведены результаты, полученные от контактировавших с больными лиц. В качестве положительного контроля использовалась РНК из I нг вируса ГА, в качестве отрицательного - суммарная РНК из СК здорового донора.

Из рис. 4 видно, что, по крайней мере, 22 пробы из 62 (35,5«) от больных и 4 пробы (50$) от контактных лиц из очага вспышки гепатита А дали положительные результаты на наличие РНК ВГА.

Параллельно с реакцией гибридизации вышеуказанные 70 проб были тестированы в ИФА на наличие к вирусу ГА. ИЗ 62 образцов от больных 43 пробы (70$) дали положительные результаты, все 8 проб от контактировавших с больными лиц были в ИФА отрицательны. 16 проб из 43 оказались положительными как на наличие РНК вируса ГА по разрабатываемой нами методике, так и в тесте ИФА на присутствие анти-ВГА Совпадение результатов

ИФА^и МГНК составило 37,2 %, что соответствует литературным данным о приблизительно 30$-ном вируссносительстве среди больных ГА (Сои1ер1Б et а1., 1987).

Кроме того, для проверки разрабатываемого нами способа молекулярной гибридизации с использованием биотинированных зондов был проведен эксперимент по поиску РНК вируса ГА в пробах

чие -к_вирусу_ ГА_(то есть от больных с подтвержденным диаг-

нозом вирусного ГА) и 3 пробы - от контактировавших с больными лиц , отрицательные в ИФА, но положительные на наличие РНК вируса ГА в нашем исследовании. Эти результаты приведены на рис. 5.

Сравнительный анализ данных рисунков 4 и 5 продемонстрировал совпадение 17 результатов из 20 (85%), причем 3 пробы от контактировавших с больными лиц оказались положительными в обоих случаях.

На заключительном этапе работ с био-зондом 2 бкли поставлены опыты с СК здоровых доноров из пункта переливания крови. Для этого 30 образцов СК были тестированы в МГНК с использованием био-зонда 2 и 10 из этих 30-ти - в реакции амплификации на наличие вирусной РНК. Результаты анализов в обоих случаях оказались отрицательными.

Таким образом, испытания био-зонда 2 показали его высокую чувствительность и специфичность.

Однако, как было выяснено позднее (см. ниже), био-зонд 2, несмотря на высокую чувствительность и специфичность, был неустойчив при хранении, поэтому в следующих экспериментах мы использовали био-зонды I и 3.

4 6). Апробация био-зонда I на клиническом материале.

Био-зонд I с отечественной проявляющей системой Ст-ЩФ + В1Р+ ывт был апробирован в очаге вспышки ГА, которая имела место в военном городке.. Сиб ВО в октябре-ноябре 1992 г. Всего было проанализировано 286 образцов СК от практически здоровых людей, из них выявлено 25 вирусоносителей ГА (14 образцов дали положительный результат анализа, Ц - слабоположительяый, рис. 6).

Анализируемые образцы также были предварительно тестированы на наличие к ВГА, результаты по данному тесту оказались все отрицательны, поскольку обследование было проведено в самом начале вспышки (литературные данные также свидетельствуют о низкой эффективности (0-30$) этого метода при попытках ранней диагностики ГА (Донец и др., 1988).

Рис. 5. Электрофоретическое разделение в ПААГ продуктов

полимеразной цепной реакции - фрагментов кДНК, полученных с РНК вируса ГА. выделенной из СК больных (дорожки 1-Ю, 14-20) и контактировавших с больными лиц (дорожки 11-13). Кт - амплифицированный фрагмент плазмидной ДНК.

Рис.6. Результаты гибридизации био-зонда I с суммарной РНК из образцов СК контактировавших с больными лиц из' очага вс-пышки ГА (выборочно).

Кроме того, из проверенных нами образцов были отобраны 30 (из них 13 - положительные и слабоположительные на присутствие РНК ВГА, 17 - отрицательные) и тестированы с помощью РОТ-ПЦР. Последний эксперимент был также проведен Н.В.Мамаевой. Из 30 результатов совпали 22 (73%); полученные данные коррелируют с результатами, полученными при испытании био-зонда 2. Несколько более низкая сходимость результатов 2-х методик (МГНК и РОТ-ПЦР) в данном эксперименте: 73?, против 85 в предыдущем, на наш взгляд, закономерна и может быть объяснена более низкой чувствительностью тест-системы: био-зоцд I + Ст-ЩФ отечественного производства по сравнению с системой: био-зонд 2 + Ст-Щу фирмы "СаГЫосЬет". Однако, несколько пониженная чувствительность био-зонда I +Ст-ЩФ отечественного производства компенсируется устойчивостью при хранении первого и доступностью и относительной дешевизной второй, поэтому последующий эксперимент мы про-

водили также с использованием био-зонда I, конъюгата Ст—ЩФ и субстратов отечественного производства.

С использованием био-зонда I был также проведен эксперимент по поиску вирусоносителей среди 149 практически здоровых детей из очага вспышки ГА. бывших в контакте с детьми, заболевшими ГА в желтушной ферме и госпитализированными в инфекционный стационар. Вспышка была зарегистрирована в школе N 162 Советского района г.Новосибирска в декабре 1991 г. Данные описываемого опыта представлены на рис. 7.

Из последнего рисунка видно, что на момент отбора проб 4 ребенка (пробы 1-4) были явными носителями вируса ГА.

Параллельно нашему анализу образцы СК обследованных детей были тестированы на определение уровней активности аланинамино-трансферазы и аспартатаминотрансферазы (АлТ и АсТ соответствен-

Рис 7. Результаты гибридизации био-зонда I с суммарной РНК из 149 образцов СК от контактировавших с больными детей из очага вспышки ГА (а,б) (выборочно);

4

2

но). Известно, что повышение уровней активности этих ферментов является характерным признаком "поражения ""паренхимы-печени,—В. результате этого эксперимента было найдено, что уровень активности АлТ у 4-х детей-вирусоносителей ГА оставался в норме (в пределах 0,1-0,68 ммоль/л), уровень АсТ был незначительно повышен (до 0,88 ммоль/л) у одного ребенка (проба 3). Полученные данные соответствуют литературным, свидетельствующим о резком подъеме активности трансаминаз лишь в период острого гепатита; однако, при остром гепатите А вирусемия, как правило, уже не имеет места (Ticelщгstet а1., 1986, Ляшенко, 1987). Из остальных 145 обследованных детей у 5-ти было обнаружено повышение активности хотя бы одного из вышеприведенных ферментов (в пределах от 0,68 до 1,16 ммоль/л), однако, ни один из этих детей не заболел впоследствии ГА.

Также никто из детей с положительным по нашим данным анализом на наличие вируса ГА в СК не заболел впоследствии ГА в желтушной форме, однако у одного ребенка наблюдались диспепти-ческие явления, у другого- лихорадка (пробы 3 и 2 соответственно'!. Полученные данные также соответствуют литературным, свидетельствующим о преимущественно мягком или вообще бессимптомном течении этого заболевания у детей (Жданов и др., 1986, Сои1ер1з et а1., 1987, И др.).

Кроме того, у двоих из 4-х детей (пробы I и 3) через 1,5 месяца после обнаружения в СК РНК вируса ГА была отобрана кровь из пальца для тестирования в ИФА на присутствие 18М (ранних антител) к вирусу ГА. Данные анализа оказались положительными, то есть можно сделать вывод о перенесенном ГА, по крайней мере, этими двумя детьми.

Био-зонд I был также проверен на возможность регистрации ложно-положительных сигналов, при гибридизации с суммарной РНК из СК 12 доноров; 6-ти - здоровых здоровых, и 6-ти - с отклонениями в данных анализа крови: из них - 3-х - с положительным анализом на присутствие нъэ Ав (+нъз к£) и 3-х - с повышенным содержанием биллирубина (+ ВЫп), рис.8 . Из рисунка 8 видно, что пробы доноров положительных сигналов не дали.

Таким образом, нами была показана также высокая чувствительность и специфичность био-зонда Г

i г ъ 4 s с

к< к2

Рис.В. Результаты гибридизации био-зонда 1 с суммарной РНК из образцов СК здоровых доноров: А(1-6); +HbS Ag - доноров: Б(1—3) и +ВЫп - доноров: Б(4-6) Kj - РНК из I нг очищенного препарпта вируса ГА, Kg - ДНК фага х в количестве 5хЮ~6г.

4 в). Апробация био-зонда 3 на клиническом материале (сравнение чувствительности оц и дц биотинированных ДНК-зондов).

Апробация био-зонда 3 и сравнение чувствительности оц и дц биотин-меченых ДНК-зондов были проведены относительно контрольной ДНК, РНК ВГА и на образцах СК от больных гепатитом.

Контрольную ДНК в 10-кратных разведениях, РНК ВГА в количестве I нг (+контроль) и суммарную РНК, выделенную из 49 образцов СК от больных гепатитом нанесли на два НЦ фильтра и гиб-рдизовали с био-зондами 2 (оц ДНК MI3 HAVp I) и 3 (дц ДНК MI3 HAVp I). Выявление зондов после гибридизации проводили с помощью коныогата Ст~ШФ ("Calbiochem") и субстратов BCIP и NBT (фирмы "Sigma", США). Отрицательными контролями служили ДНК фага х

/б

^ ^

^ <5>

сг, ^ ^ г4

„1111111 а] |Лг® т ® > ,

0 « о й 5

^ ^ ^ к

1 I I М I I

[о ® ® ® •

О, О '—к2 ^^ ^ ГО—к,

о

о о

К!*.

ф ~ »— к, _ ' —-к,

Я @ » ~

^ О "

# О " О О' г; О о

** и ]

с

ООО" о о ..

"" "О " Г\

^ & д Л-'

Рис. 9. Результаты гибридизации био-зондов 2 и 3 с контрольной ДНК (а,в) и суммарной РНК из 49 клинических образцов СК (б,г) соответственно;

К - ДНК фага х в количестве I мкг.

К^ - РНК из I нг очищенного препарата вируса ГА;

К2 - суммарная РНК из образца СК здорового донора.

в количестве 0,1 мк1 , а также суммарная РНК из образца СК здо рового донора, положительным контролем - РНК из I нг очищенного препарата вируса ГА;

Результаты сравнительного анализа чувствительности обоих зондов относительно контрольной ДНК приведены на рис. 9 (а,б), относительно клинических образцов - на рис 9 (в,г). Первый рисунок показывает фактически одинаковую чувствительность обоих зондов относительно контрольной ДНК, достигающую 50 пг на пятно (2,5 пг/мм2), однако, второй со всей очевидностью демонстрирует значительно более высокую чувствительность био-зонда 2 по сравнению с био-зондом 3. На наш взгляд, подобное явление объяснимо с точки зрения строения испытуемых ДНК-зондов и контрольной ДНК.

Таким образом, био-зонд 3 при работе с клиническими образцами продемонстрировал чувствительность более низкую, по сравнению с био-зондами 2 и I.

5. Попытка использования био-зонда I для уточнения клинического диагноза "вирусный ГА"

В ише 1991 г. был проведен эксперимент по поиску РНК ВГА в СК и фекалиях ребенка из инфекционного отделения ЦКБ СО РАН с целью уточнения диагноза "вирусный ГА". Для этого выделенные из образцов СК и фекалий ребенка пробы суммарной РНК были нанесены на НЦ фильтр и сгибркдизованы с био-зондом I. Выявление зонда после гибридизации проводили с помощью конъюгата Ст-ЩФ и субстратов В1Р+№Т (НИКТИ БАВ, НПО "Вектор"). Результаты эксперимента представлены на рис. 10; из рисунка видно, что РНК ВГА в пробах СК и фекалий ребенка отсутствуют.

Полученный отрицательный результат был затем проверен с помощью РОТ-ПНР (опыт был поставлен Н.В. Мамаевой) и в ИФА на присутствие к ВГА (последний анализ был проведен в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов, г.Москва, в лаборатории Ю.Ю. Кусова с помощью тест-набора "Диагн-А-геп"). Результаты проверочных анализов оказались также отрицательными. Таким образом, клинический диагноз "вирусный ГА", поставленный ребенку, результатами всех трех анализов не был подтвержден. Подобные случаи имеют место (Файзуллоев и др., 1991; Учайкин и др., 1993; и др.), поскольку сходные симптомы болезни могут быть вызваны вирусами гепатитов В, С, Е, дельта (БееНз et а1., 1992), а также цитомегаловирусом (Иванова и др., 1990) и другими вирусами.

12 Кг К< к3

1111 з Кц ч К«

Рис.-¡6. Результаты гибридизации био-зонда I с суммарной РНК из СК (пятна 1,2) и фекалий (пятна 3,4) ребенка с клиническим диагнозом "вирусный ГА". К|- РНК из I нг очищенного препарата вируса ГА Кг,- суммарная РНК из образца СК здорового донора Кд- суммарная РНК из образца фекалий здорового ребенка

К4~ ДНК из молок лосося в количестве I мкг

6. Исследование стабильности биотинированных 'зондов. Устойчивость модифицированных зондов во времени является

их важнейшей характеристикой, поэтому био-зонды I, 2 и 3 проверялись нами на целостность ДНК с помощью горизонтального электрофореза непосредственно после биотинирования и через I, 2 и 3 месяца хранения при -20°С. Анализ качества био-зондов I, 2 и 3, сделанный непосредственно после биотинирования ДНК с помощью горизонтального гель-электрофореза приведен на рис. 9(а,б).

Б качестве контролей были взяты исходные оиЦНК MI3 HAVp 1 и дц ДНК (репликативная форма) MI3 HAVp 1, количество ДНК составляло во всех случаях около I мкг. Pnciät(a,6) демонстрирует стабильность модифицированных ДНК.

В процессе дальнейших исследований нами было выяснено, что био-зонд I был достаточно стабилен в течение, по крайней мере, 3-х месяцев хранения и чувствительность его в гибридизации практически не изменялась.Исследование стабильности био-зонда 2 выявило его деградацию уже через 2 недели хранения при -20°С. Наши результаты согласуются с. данными работ (Dykes D.D., 1988 и др.) о частичном разрушении НК при фотобиотивировании. При ис-

О)

г г Кг 3 «з

M ! M

5}

Рис .42. Электрофоре граммы биотинированных зондов:

био-зонда I, дорожка I (а) и био-зондов 2 и 3, дорожки 2,3 (б): Кр К£- контрольная немеченная оц ДНК (М13 НАУр 1) Ко - контрольная немеченная дц ДНК (Ш М13 НАУр I).

ZÛ

"" - ' - следовании-био-зонда 3 нами также была показана его стабильность по крайней мере, в течение^ 3-х месяцев.-Стабильность 2-хцепочечной ДНК, меченой с применением фотоактивного реагента, на наш взгляд можно объяснить следующим образом: несмотря на однонитиевые разрывы в обеих цепочках ДНК, разрушения меченого биотином биополимера не происходит из-за сцепленности 2-х комплементарных цепей ДНК между собой. Наши результаты согласуются также с данными работы (Синагатуллина, 1992); Однако, как было показано выше (см. рис.8), чувствительность био-зонда 3 при анализе клинических образцов была значительно ниже таковой био-зондсв I и 2. Учитывая вышеизложенное, для лабораторных исследований мы рекомендовали бы как био-зонд I, так и био-зонд 2 (непосредственно после биотинирования), но для комплектации тест-набора может быть рекомендован только био-зонд-1 в связи с его достаточной чувствительностью и стабильностью во времени.

7. Выбор основных компонентов для комплектации тест-набора на РНК ВГА.

Таким образом, после всестороннего исследования биотин-меченых зондов и проявляющих их систем, а также оптимизации процессов выделения суммарной РНК из клинических образцов, гибридизации, блокирования фона и других, мы остановили свой выбор на следующих основных компонентах для тест-набора на основе МГНК для детекции РНК ВГА в клинических образцах; таковыми компонентами, на наш взгляд, должны быть: -сам биотия-меченый зонд, -контрольная ДНК, имитирующая вирусную РНК, -система визуализации биотинированной ДНК. Для выделения суммарной РНК из клинических образцов мы предложили укомплектовать тест-набор протеиназой К (либо одним из ее аналогов), а также основными буферами и нитроцеллюлозными фильтрами для нанесения образцов.

Состав и краткая характеристика компонентов гибридизацион-ного тест-набора на РНК ВГА приведены в таблице I.

Л*

Таблица I.

Характеристика компонентов гибридизационного тест-набора для выявления РНК ВГА с помощью биотинированного ДНК-зонда.

N Наименование компонента Количество

и его состав

I 2 3

I ДНК-зонд, меченый биотином

(рекомбинантный бактериофаг) 50 мкл

2 Положительная контрольная проба

(контрольная ДНК) 10 мкл

3 Отрицательная контрольная проба

(ДНК фага х) 10 мкл

4 Конъюгат Ст-ЩФ 6 мкл

5 BIP 13 мг

6 NBT 21 мг

7 Гибридизационный буфер 25 мл

8. Раствор протеиназы К 0,5 мл

9. Блокирующий буфер 20 мл

М.Отмывочный раствор 20 мл

П.Нитроцеллюлозный фильтр 5x10 см2

Один набор рассчитан на анализ 50 клинических проб (проведение не менее 5 гибридизаций). Составлена инструкция по применению тест-набора, ведется активная работа по его испытанию и разработке научно-технической документации для представления тест-системы в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Следует подчеркнуть универсальность вышеприведенной тест-системы: при замене только биотинированного зонда и контрольной ДНК она может быть использована для детекции других инфекционных вирусов, например, вирусов гепатита В,С,Д,Е,Г, цитомегало-вируса и др.

При использовании биотинированной котрольной ДНК (М13 НАУр 2, либо М13 НАУр 19) в качестве зонда можно осуществлять поиск минус цепи РНК ВГА.

XZ

----------------------------------------Заключение.

Таким образом, мы провели исследованиеГсогласно поставлен------------------

ной цели и задачам по разработке методики гибридизационного анализа с использованием биотин-меченых зондов, сконструирован-шх на осноье оц и дц ДНК бактериофага N113, для детекции РНК вируса гепатита А в клинических образцах.

В процессе работы нами была модифицирована и адаптирована для постановки большого количества анализов (до 96) методика выделения суммарной РНК из клинических образцов (сыворотки крови. мочи, слюны, вытяжки из фекалий). Значительного упрощения методики мы достигли, исключив стадию высаживания суммарной РНК, а также применяя для нанесения образцов аппарат типа "М1п1Го1й".

Нами были биотинированы оц и дц ДНК-зонды на основе бактериофага М13: М13 НАУр I и В! М13 НАУр I с помощью переаминирую-щего реагента и-аминобутил -О-гидроксиламина и через фотореагент. (биотинтрованные ДНК-зонды были нами обозначены как биозонд I, био-зонд 2 и био-зонд 3). Бкотинированные ДНК-зонды исследовались на стабильность в процессе хранения, причем, биозонды I и 3 оказались устойчивыми в течение, по крайней мере, 3-х месяцев хранения при температуре -20°С, в то время как ДНК био-зонда 2 деградировала уже через 2-3 недели после закладывания на хранение.

Для выявления биотинированных ДНК-зондов мы исследовали 3 системы визуализации: ПСт-ПХ+НзОд + ОДА,

2 )Ст-1Щ?+ВС1Р(В1Р)4МВТ (отечественного и импортного

производства), 3)Ав-КЗ+ФСУ.

Проявляющая система (I) оказалась наименее чувствительной и, кроме того, недостаточно стабильной в хранении, поэтому, в дальнейших исследованиях мы ее не использовали. Системы (2) и (3) показали приблизительно одинаковую чувствительность, достигающую 5-50 пг контрольной ДНК, однако, результаты с использованием системы (3)- Ав-КЗ+ФСУ - не всегда воспроизводились. Учитывая эти обстоятельства, в последующих экспериментах на клинических образцах мы использовали только конъюгат Ст-ЩФ с субстратами ВС1Р+ЫВТ. Кроме того,с учетом меньшей стоимости и

большей доступности отечественных компонентов второй проявляющей системы при несколько более низкой ее чувствительности мы отдали предпочтение последней. Бесферментная система Ав-КЗ+ФСУ, несмотря на низкую стоимость, нуждается, на наш взгляд, в дальнейшем усовершенствовании.

Био-зонды I, 2 и 3 были испытаны в МГНК на модельных (контрольная ДНК, РНК ВГА) и клинических (сыворотка крови, фекалии) образцах, а также в очагах вспышек гепатита А. Чувствительность МГНК с использованием биотинированных зондов I, 2, 3 и систем их проявления (I) и (2) оказалась высокой и достигала 5-50 пг контрольной ДНК и 100 пг вируса ГА (последняя цифра соответствует около 30 пг (1,5 пг/мм2) РНК ВГА и 3-7x10® физических вирусных частиц). При испытаниях МГНК с биотин-мечеными зондами I и 2 в очагах вспышек гепатита А удалось выявить вирусоносите-лей гепатита А не только среди больных с желтушными формами и другими признаками острого гепатита, но также среди практически здоровых людей, бывших в контакте с заболевшими, а также среди лиц с безжелтушными и бессимптомными формами ГА. Чувствительность дц био-зонда 3 при испытаниях на клиническиз образцах оказалась много ниже чувствительности оц биотинированных зондов I и 2.

Разрабатываемый нами способ гибридизации с использованием биотинированных ДНК-зондов был проверен в сравнении с другими методами детекции вируса ГА: РОТ-ПЦР, ИФА, а также с методом определения печеночных аминотрансфераз АлТ и АсТ в СК (последний неспецифически указывает на воспалительный процесс, протекавший в печени). Была показана хорошая сходимость результатов разрабатываемой нами методики и метода ПЦР (73-85$), корреляция с ИФА на определение 1&1 к ВГА составила 37,2« (по литературным данным приблизительно 308 больных ГА являются вирусоносите-лями). Корреляции вирусоносительства ГА с повышением уровня трансаминаз у контактировавших с больными лиц найдено не было, что также соответствует литературным данным о резком подъеме уровня АлТ и АсТ лишь в период острого гепатита; однако, при остром гепатите А вирусемия, как правило, уже не имеет места.

После всестороннего исследования основных компонентов, необходимых для постановки анализа по разрабатываемой нами методике, нами были даны рекомендации по комплектованию тест-

набора для детекции РНК ВГА. Результаты исследований были переданы в НИКТИ БАБ НПО "Вектор" ( в лаб. С.Ф.Орешковой)",~"где~на---------------

их основе был создан опытный образец тест-набора для детекции РНК ВГА. Составлена инструкция по применению тест-набора, ведутся активные исследования по проверке и дальнейшему использованию тест-наборов, подготовка научно-технической документации в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что метод детекции вируса гепатита А с помощью биотин-меченых зондов на основе бактериофага М13 и стандартной системы проявления обладает высокой чувствительностью (5-50 пг контрольной ДНК и 100 пг вируса ГА на пятно), специфичностью, и, после расширенных испытаний, может быть рекомендован к использованию в условиях клинической лаборатории. Данный метод, по нашему мнению, может служить ценным дополнительным инструментом при диагностике ГА, при дифференциальной диагностике желтух. Детекция СК на наличие РНК ВГА легкобольных ГА могла бы помочь также в решении вопроса с необходимости госпитализации таких больных, либо лечении их на дому. Особую ценность метод представляет в связи с возможностью выявления вирусоносителей в инкубационном и раннем периодах болезни (что невозможно при использовании ИФА), а также при безжелтушной и бессимптомной формах ГА.

Метод позволяет альтернативный анализ: либо СК (при массовом обследовании взрослого населения, например, воинского контингента), либо фекалий (у маленьких детей, при обследовании вспышек гепатита в детских дошкольных учревдениях).

Метод несомненно перспективен для поиска ВГА в объектах окружающей среды (вода, продукты питания).

Практическая ценность метода бесспорна, однако, вышеописанная тест-система могла бы быть использована также для исследовательских целей: например, при тестировании динамики накопления вируса в крови больных ГА, при проверке эффективности антивирусных препаратов; для поиска внепеченочных депо размножения вируса; и других.

Метод несложен в постановке, не требует дорогостоящего оборудования, чувствительность методики может быть повышена, например, при использовании люминесцентных субстратов для щелочной фосфатазы.

Выводы.

1. Впервые получены биотинированные зонды для детекции РНК ВГА на основе ДНК бактериофага MI3 со вставкой кДНК (позиции 1372-1781 ), комплементарной участку генома РНК ВГА, кодирующему часть оболочечного белка VP 1.

2. Впервые разработан способ детекции РНК ВГА на основе метода гибридизации нуклеиновых кислот с использованием вышеуказанных биотин-меченых зондов.

3. Метод апробирован на модельных и клинических образцах; показана высокая чувствительность (5-50 пг контрольной ДНК и 100 пг вируса ГА) и специфичность метода, проведены его испытания в очагах вспышки гепатита А. Выявлена высокая корреляция метода с другими способами детекции ГА. Особая ценность метода заключается в возможности выявления вирусоносителей ГА среди контактировавших с больными лиц, находящихся в инкубационном периоде болезни, а также среди больных со стертыми и бессимптомными формами ГА.

4. На основании разработанного метода предложен комплект реактивов для создания тест-набора на РНК ВГА. Изготовлен опытный образец тест-набора, написана инструкция по его применению.

Z6

_Основще_резу^таты_диссертад^ ______

_след$гших_ваботах :

1. Будяк Е.В., Сафронов И.В., Батурина И.И. и др./ Использова ние нерадиоактивных биотиа-меченых зондов для детекции вируса гепатита А // Мол.генетика, микробиол. и вирусол., 1992, N9-IO, С.5-8

¿. Будяк Е.В., Синагатуллина Н.М., Карпухин А.В. и др. / Ис-поль-зование биотинированного зонда для детекции геномной РНК вируса гепатита А в клинических образцах // Вопр. вирусол., 1994, N 4, С. 17-21

3. Будяк Е.В., Зеленин С.М., Каргинов В.А. и др. /Способ детекции РНК вируса гепатита А. / Заявка N 5055815/13 (035382) от 22.07.92, положительное решение от 24.09.93

4. Budjak E.V., Karpuchin A.V.. Shishkin G.V. et al./ Detection of Hepatitius A Virus by Molecular Hybridization with Biotinyl-ated Probes // Abst.: Int Meet, on Biology, Immunopathology and Clinic of Hspatitis Viruses. Parma, June 3-5, 1993.

Z?