Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот как диагностический тест при вирусных инфекциях человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот как диагностический тест при вирусных инфекциях человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ГРИППА

На правах рукописи УДК 616.988—092.0

НОЛАНДТ

Ольга Валерьевна

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ТЕСТ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ ЧЕЛОВЕКА (НА ПРИМЕРЕ ГРИППА А И ГЕПАТИТА В)

Специальность: 03.00.06 — Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1990

Работа выполнена в Ленинградском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Пастера МЗ РСФСР.

Научные .руководители: доктор медицинских наук, профессор Ф. С. Носков; кандидат биологических наук А. 3. Плюснин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук М. А. Бичурина, кандидат химических наук Ю. П. Зеров.

Ведущее учреждение — Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Минмедбиопрома СССР,

Защита состоится « /У» ** 1991 года в « » часов на заседании Специализированного совета Д.07-4.48.01 по защите диссертаций при Всесоюзном научно-исследовательском институте гриппа МЗ СССР (197022, Ленинград, улица профессора Попова, 15/117).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ гриппа.

Автореферат разослан «

//» о л 1991 года.

Ученый секретарь Специализированного совета

И. Н. Жилинская

ОШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современная вирусология не мояет спешно развиваться без использования допти-ташй молекулярной ¡тологпи и генетики, биохимии, клеточной биологии и биотехноло-ни. Поэтому метода, которые ранее использовались только в фун-эменталышх исследованиях, кгкроко применятся в самих раэнооб-' аз них прикладных вирусологических и медицинских экспериментах.

Определение вирусных нуклеиновых кислот (НК) методом молекулярной гибридизации. (ММГ) представляет собой новый подход в ' ^следовании вирусов - диагностику на генетическом уровне (Бек-змиров Т.А., 1988). ММГ впервые вошёл в практику исследований 1965 году ( Gillespie D. , Speigelnran S. , 1965), И С Т9Х эр различнне его модификации активно используются в молекуляр-)й биологии. Позднее этот метод стали применять для изучения tpycoB и диагностики различных инфекционных и наследственных за-хчеваний ( larval I»., Bingham ti.'.v. , 1987). Быстрое разви- ' ie методов получения рекомбинантных молекул и химического син-зз а олигоиуклеотидов позволило использовать ММГ для диагностики фокого круга инфекциогашх агентов с охарактеризованным гено-)м, в первую очередь - вирусов. К достоинствам ММГ следует от->сти возможность проведения теста без выделения вируса в чувст-1телыюй системе. ШГ является высокочувствительным и специфич-га тестом, позволяющим выявлять До I пг нуклеиновых кислот -мишеней (r.einkoth .т., v/ahl о. , 1984).

Для того, чтобы оценить возможности ММГ как диагностическо-> теста и определить его место в ряду ср(ествущих диагности->ошх методов, необходимо определить чувствительность и специ-гаюсть ММГ, а также сравнить его с другими тестами. Это помо-!Т понять преимущества, недостатки и потощиальные возможности IT в решении ряда проблем диагностики вирусов.

.Вирусы гриппа и гепатита В (ВГВ) широко распространены в ловеческой популяции и ириачекяют к собе пристальное внимание следователей и практиков. Несмотря на это, в вирусологии и идемиолопш гриппа и гепатита В многое пока невозможно или удно объяснить. Так, но всегда удаётся быстро охарактеризовать вый эпидемический вирус гриппа, до сих nbp не предложено полстью удовлетворяющего объяснештя феномену сохранности вируса в жэпидемичоокии и шяашидешческий периоды. При исследовании русо в гепатита'В зач петую трудно оценить эшдошческу» опас-

кость источника инфекции, реальные размеры и динамику эпмдеш-ческого процесса, создать определённую схему, объясняющую взаимодействие структур вируса и организма. Можно надеяться,- что широкое распространенно методов диагностики на уровне генома аудех способствовать прогрессу в изучении данных вирусных инфекций.

Цель п задачи исследовании. Целью данной работы явилось изучение возможностей лабораторной диагностики гриппа и гепатита В (вызываемых, соответственно, РНК- и ДНК-содержащими вирус; ми) с использованием метода молекулярной гибридизации.

Б соо1 -')тствии с поставленной целью были оптюделен» следу! щие задачи.

1. Выбор ДНК-зондов для определения ПК вирусов гриппа и гепатита В, подбор условии проведения диагностического теста с использованием отечественных материалов и определение параметров реакции образования дуплексов.

2. Оценка чувствительности и специфичности ММГ как диагностического теста на грипп А по результатам комплексного обследования биопроб (носоглоточные смывы и т.п.).

3. Изучение корреляции между генетическим и имыуномшичвс-ними маркерами НТВ, выявляемыми в сыворотка крови хронических больных и бессимптомных носителей; исследование интенсивности 1 динамики эпидемического процесса в семейных очагах гепатита В по выявлению вирусной ДНК.

Научная новизна работы. В результате изучения свойств отечественной полимерной мембраны (ПМ) она рекомендована в качестч оригинального носителя в реакции МГ в двухфазной системе. Бред-ложен также новый упрощённый вариант методики иммобилизации НК на данной мембране. Впервые в сравнении исследованы свойства

ор Трс

ДНК-зондов, содержащих-радиоактивные изотопы Р и I. На основании этих исследований разработана принципиальная компоновке диагностического набора для детекции ДНК вируса методом МГ.

Подобраны ДНК-зонды для тяпо-А-специфическод и субтипоспе-цифической (в пределах серотипа А) диагностики гриппа. Такой бор является оригинальным. Установлено, что зонды на основе ко1 рервативных генов вируса гриппа А позволяют проводить типоспещ фическую детекцию гриппа, а зонды на основе вариабельных генов - субтипоспецифическую детекцию.

Впервые проведена оценка диагностических возможностей мол«

сулярной т'иЗртдизащш с пто~А-с1ц.д:.'ги i;-ck;: га зондами d эгшдг-ми-юсто по гриппу сезоны. Установлено, что использование МГ при анализе смывов от больных 0F3, особенно при расшифровке вспышек, шляется эффективным. Результаты согласуются с данными, получен-шми традиционными мотодаш, и дополняют их.

Впервне проведено обследованно сывороток крови людей из се-Г9Й1ШХ очагов вирусного гепатита В с использованием метода МГ и щраллалышм определением иммузюлоглческлх маркеров. Доказано, [то такой подход позволяет дать комплексную опенку течения эпи-;емического процесса при вирусном гепатите В и изучить естественно механизмы циркуляции вируса.

Детекция ДИК ВГВ и одновременное определенно иммунологичес-юс маркеров в сыворотке крови больных хроническими формами ГВ озволшго оценить корреляцию между наличном ДНК ВГВ и имглунологи-еских маркеров для этой категории больных. Впервые установлено, то'наличие ДНК ВГВ в большей степени коррелирует с полиальбумин-вязывающей активностью сыворотки и начичием в ней нвел^, чем с аличием в ней irBoigtfAb и нвзЛя • •• . •

Исследовшше методом МГ сшороток крови доноров и людей груп-i риска г .Риги с детектированными в mix нвсАъ, но не нвя/и*, поз- ' 5лило обнаружить, что около 20% этих сывороток содержат ДНК ВГВ. ги сведения являются оригинальными.

Практическая значимость работы. Получено авторское свидетель-:во СССР на изобретение за № I47IC62 от 08.12.88 "Носитель для ¡акции гибридизации нуклеиновых кислот".

С учётом изобретения и изучения свойств различных зондов, а шее условий проведения реакции МГ разработана принципиальная мпоновка набора химреактивов для определения ДЕЕК ВГВ в сыворот-крови, основанного на отечественных материалах. Подготовлено утверждено "Наставление по применению набора химреактивов для ределения ДНК ВГВ методом МГ". Следует отметить универсальность едлагаемого набора: при соответствующей замене ДНК-зонда возмож-проводить детекцию других вирусных геномов (грипп, СПИД и др.).

Получены акты о внедрении- технологии гибридизации на полимер-. ft мембране из Ленинградского института ядерной физики АН СССР, статута' цитологии АН СССР (Ленинград) и Института цитологии и ieтики СО АН СССР (г.Новосибирск), а также акт о внедрении в актику метода МГ при определении ДНК ВГВ (Горьковский мединсти-р).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Зондй с ДНК-копиями консервативных и вариабельных гено) вируса гриппа А обладают, соответственно, типовой и субтиповой (в пределах оеротипа А) селективностью. Зонд, содержащий полноразмерную копию генома НТВ (штамм ау« ), позволяет выявлять ви-русснецифические последовательности 1ПС в сыворотках крови больных и бессимптомных носителей. Предложена полимерная мембрана-носитель, которая в сочетают с "^Р-меченными ДНК-зондами позволяет выявлять 1-10 пг молекул-мишеней в исследуемой пробе (hí соглоточный сшв, сыворотка крови и т.п.).

2. ММГ является высокочувствительным и специфичным лабора' торным диагностическим тестом на грипп А. Его чувствительность определённая по результатам комплексного обследования биопроб от больных в эпидемию и межэпидемичоский период,составляет око' ло 1Ь% при специфичности, близкой к 100$. Использование ММГ эф фективно в эпидемиологии, особенно при расшифровке вспышек.

3. Использование ММГ в клинической практике позволяет оце нять связь различных иммунологических маркеров ú ЩШ ЕГБ, опра даляемнх в сыворотке крови хронических больных гепатитом В. Пр. демонстрировано, что около 20$ клинически здоровых людей, соде жащихиВсАЪ в сыворотке крови, являются носителями вирусной ДН Обоснована эффективность применения ММГ при эпидемиологическом обследовании очагов вирусного гепатита Б и активном поиске источников инфекции.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международных симпозиумах "Молекулярно-биологические аспект взаимодействия паразит-хозяин" (Ленинград, 1987 г.), " Antl-virt -87" (Хельсинки, Финляндия, 1988 г.), "napid inethods and Autoi.f tion in liicrobioiogy nnd lrmaunoio«y -SO" (Хельсинки, Финляндия, 1990 г.) и на 8-ом Меадународаом конгрессе вирусологов (Берлин, 1990 г.), а также на всёсоюзных конференциях "Совреме ше проблема медицинской вирусологии" (Рига, 1987 г.), "Генная клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехно логии" (Тарту, 1988 г.), "Современные направления создания мед цинских диагностикумов" (Москва, 1986 г.).

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изло жены на 142 страницах машинописного текста, иллюстрированы 15 сунками и Птаблицаш. Работа состоит из введения,, обзора лите ратуры, трёх глав собственных исследований (включая "Материал! методы", "Результаты" и "Обсуждение"), выводов и списка литере

рн, включающего 101 работу на русском и английском языках.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛВДОВШЩ

Материалы и методы. В качество молекулярных зондов при детекции РНК вирусов гриппа использовались рекомбттантнне бакте-риальше влазмидш, содержащие ДНК-котти различных генов вируса гриппа А (РА, НА, ''А, «Р, М, »3) (Плпсшга Л.З. и др., 1983, 1904; Беклемишев А.Б. и др., 1985). Для детекции ДНК ВГВ использовалась плазмида рНВ320, содержащая полноразмерный геном вируса гепатита В (ВГВ) (штамм ау» ) (Ц. Пушен и др., 1982). Плазмида била любезно предоставлена П.Пумпеком из Рижского института оргоинтеза АН Латв.ССР.

В модельных экспериментах использовались культуры инфици-ровалкшс вирусами гриппа ¡теток ВДСК и ТП (получены от Е.В.Кузнецовой, ВНИИ гриппа) и вируссодержицие аллалтоишше жидкости куриных эмбрионов (ВАЖ КЭ) (получеи! от Е.А.Брявдевой, НИИЭМ лтл.Пастера). Для детекции РИК вируса гриппа использовались вирусологически, серологически и иммунохишчеиш охарактеризованные биопробы (отделяемое слизистой носа), полученные от Е.А.Врянце-вой и 0.И.Кубарь (НИИЭМ им.Пастера), А.А.Сошгошой, Н.В.Липиной, Т.Я.Лузяшшой и Э.Л.Зибиной <ВШМ гриппа), М.Гавличковой (Институт гигиены и эпидемиологии, г.Прага, ЧССР). Ддя детекции ДНК ВГВ использовались охарактеризованные по иммунологическим маркерам сыворотки крови людей, полученные от Г.М.Герасимова (Центральный военный госпиталь им.Бурденко, Москва), С.В.Жаворонка (Витебский мединститут), В.В.Цибиногнна и В.Я.Лосевой (Институт оргсинтеза, АН Латв.ССР, Рига), В.Р.Шагинян (Самаркандский мединститут) .

Выделение НК вирусов гриппа и гепатита В из соответствующих биопроб проводили Фенольно-детергентшм методом, затем выделенные НК денатурировали, наносили на мембрану и иммобшшзиро-вали-на ней. В некоторых случаях материал сывороток крови дена-; турировали без предварительной очистки.

Гибридизацию проводили в 1>0% формамиде (Маниатис Т. и др., 1984). Рекоыбинантнне плазмидн выделяли щелочным методом ( вггп-Ьозр! л.с. > ^ » 1979) и глетили 32Р в реакции иик-трансля-ции ( К1,г1,у р. о^ а1. , 1977). Учет результатов проводили с помощью рздиоалтогра|)Пи.

Изучение возг'р"аюстей полшгорной мембраны (ГОЛ). При изуче-Н1Ш кюгетпкп реакция >Т с исподьзовоияом Ш в качестве твердого

носителя установлено, что для получения сильного гибридиааццон-ного сигнала время течения роакдш' должно быть ш менее 24 часов. При проведения гибридизации с пробили, нанесёнными на Ш, 'kiXlipore " ( Eil] i pora UK mid Watar Aaaooiatera) ,"Geiia Serben Plus" (New England Nuclear Corp. ),"Biodyne l'i-aiiHfer hßr.ibraue"(PAIL), "Нуbond 1Í" ( Ajiisrshain International pie )

было показано, что Ш практически не уступает мембранам ишгорт-ного производства. Это позволяет рекомендовать её в качестве твёрдого носителя в реакции МГ.

Были подобрали условия дая денатурации депротешшзирован-нше PKK-содержащих проб (5-10 мин. инкубации при 60°С в 7^-ном формальдегиде и ОД М "а-фосфатном буфере с последующим охлаждением до 0°С) и ДНК-содержащих проб (5-10 шш, инкубации при 60°С в 0,3» и аОН с последующим охлаждением до 0°С) при нанесе-нш их на полимерную мембрану. Для ускорения проведения анализа подобраны условия прямого нанесения сывороток крови на Ш, без предварительной очистки, при денатурации в 0,6-1,0л/ паОН и условия иммобилизации 15К на IIM ультрафиолетовым облучением.

При сравнении свойств молекуляршх зондов, меченных 32Р и оказалось, что с течением времени при. использовании -мечйнного зонда происходит значительное увеличение фоновых реакций. Использование зонда, меченного 32Р, позволяет получать стабильные результаты гибридизации по крайней мере в течеше месяца со дня синтеза зонда в реакции шш-трансляции.

ММГ при детекции РНК вирусов гцптаа. При исследовании препаратов РНК, выделенных из очищенных вирионов гриппа, показано, что чувствительность ШГ составляет 1-10 нг вирусной РНК, что - о учётом молекулярного веса генома вируса гриппа - эквивалентно 10^-106 вирионов или 103-104 инфицированных вирусо!л клеток. Следует отметить, что уровень специфичности гибридизанионного сигнала контролировался по уровню сигнала от нанесённого в точку-I мкг гетерологичной РНК (дрожжевой).

На препаратах РЖ вируса гриппа различных штаммов, ввделен-ных из BAI КЗ и инфицированных вирусом гриппа клеток ВДСК и ТП продемонстрирована тапо.-А-селективность молекулярных зондов с ДНК-копиями консервативных генов РА, ИР; М iiKS и суп,шю-А-селок-тивность зовдов HI, НЗ, ц1, н2, содержащих ДНК-копии вариабельных генов НА и нА соответственно. Результаты данного исследования суммированы в таблице I.

Опыт расшифровки вспышек методом МГ иллюстрируется следущи-

Таблица I.

Селективность ДНК-зондов, содержащих нуклеотидше последовательности различных генов вируса гриппа А

Серо (под) тот к вируса" ДНК - зонды

РЛ л/Р м //5 нз1 нз11 Н1 Л/1 Л/2

А(Н 1Ы1) + + + + _ + + -

А(Н21\1 2) + + + + _ +

А(НЗГ\12) + + + + + + +

В

'V - ДНК-зонд гибридизуется с препаратом РНК, выделенным из очищенных вирионов, вяруссодержащей аллантоисной жидкости КЭ или инфицированных клеток в культуре (минимальное количество специфической РНК, с которой происходит реакция гибридизации - 1-10 пг);

- ДНК-зонд не гибридизуется с препаратом И Ж (сюда же отнесены случал, когда реакция гибридизации протекает приблизительно в 100 раз слабее, чем с эквивалентным количеством специфической РНК, дающей положительную реакцию).

Использованы следующие штаммы вирусов гриппа:

. III Щ: А/РЕ/б/34,- Л/свшгья/1976/34, АДвнинграц/607/56, А/Ленинград/4648/77, А/Чили/1/83, А/Ленинград/ ' /3316/84, А/Гайваяь/1/86..

Н2Ы2: А/Сгаггапур/1/57, А/Лешшград/2852/57, А/Ленин-град/1458/65, А/Лешшград/549/80.

ПЗМ2: А/Викторля/35/72, А/ТехасД/77, А/Бангкок/1/79, А/Лелинград/385/80, Л/Ленинград/385/80Р, А/Моск-ва/2851/86, А/Ленинград/2/86.

В: В/Лекинград/489/80, В/Ленинград/104/84, В/Анн ■ Эрбор/1/05, В/Лештнград/90/8б, В/Ленинград/181/ /4/86.

ми тремя примерами. При исследовании носоглоточных материалов полученных в январе 1986 г. от группы детей из школы, где била зарегистрирована одна из первых вспышек, оказалось, что 6 из 8 образцов гибридиэуются с РА-зондом. При пассировании одного из смывов в КЭ удалось выделить В1фус (впоследствии названный А/Лени нград/158/86), при изучении антигенных характеристик которого было установлено, что он принадлежи' к бангкоко-фшшпинской разновидности вируса гриппа А(НЗН2). Однако, идентификация этого штамма'была затруднена в связи с изменённым профилем ингиби-г торочувствительности вируса. Таким образом, участие вируса гриппа А в развитии вспышки было продемонстрировано раньше методом' №. В дальнейшем при исследовании смывов от взрослых больных удалось также изолировать штамм В/Летншрад/181/86 причём, из смыва, не содержащего по данным № РНК вируса гриппа А. Ретроспективно (Обзор центров, сотрудничающих с ЮЗ по вирусным инфекциям 1-Й кв.1986 г.) можно утверждать, что эпидемия гриппа этого периода в Ленинграде была смешанной этиологии А(НЗЫ2) + + В. •

Другой опыт расшифровки гриппозной вснишки относится к декабрю 1986 г. С помощью суммарного (М + МР) зонда было проанализировано 12 смывов от детей из стационара, причём во всех была обнаружена вирусная РНК. Выделить вирус из этого материала не удалось. Позднее анализ сероконверсий продемонстрировал достоверный прирост антител к вирусу, родственному штамму А/Гайвань/1/86 (Н1НI) как в пар(шх сыворотках больных этой группы, так и других обследованных в этот период времени, В дальнейшем из сшвов взрослых удалось выделить вирус А/Яенинград/219/86, который по антигенной характеристике представлял собой дрейф-вариант вируса А/Гайвань/1/86 - эталонного штамма этого периода. При обследо-вшши материала третьей вспышки также не возникло разногласий между серологическими и вирусологическими методами, с одной стороны, и методом МГ - с другой. В отличив от двух предыдущих примеров достаточно быстро бил выделен и охарактеризован вирус гриппа А(НЗ (! 2), а с использованием зонда (М + ИР) ¡готоктирова-но наличие РНК вируса гриппа А. Так.1а1 образом, ММГ может быть' полезен при расшифровке вспишок гриппа, особенно смешанной этиологии .

Для определения чувствительности и специфичности ШГ как диагностического теста боло проведено комплексное обследование биопроб в эпидемические и меиэнвдемические пи гриппу периоды.

Помимо детекции РНК вируса гриппа проводилось выделение вируса в КЭ, определялись вирусные маркеры иммуноферментным (ИФА) и иммунофлюоресцентным (Ш?А) методами. В некоторых случаях в ре~ акции торможения гемагглютинации (РТГА) исследовались парные сыворотки.

При исследовшши методом МГ образцов носоглоточных смывов или мазков от здоровых ^подей (волонтёры^первд вакцинацией), а также от больных ОРЗ негршшоэной природы (аденовирусная, РС--¿йнфекция, простой герпес) не получено ни одного ложноположитель-ного результата, что свидетельствует о высокой специфичности ШТ. При комплексном обследовании материалов, взятых от больных ОРЗ, оказалось, что ММГ является наиболее чувствительным методой в ряду: ЮТ, ИФА, 1/И'А, РТГА, вирусовыделение, причём чувствительности Bff и ИФА практически не отличаются. В совокупности с ИФА ММГ позволяет документировать почти все (98$) случаи гриппа А в эпидемию и около 90% случаев в межэпидемический период. Сочетания других методов дают худшие показатели. Чувствительность метода МГ, рассчитанная с использованием критерия v/aisa et al. (1985), составляет от(87,2 + ЭЛ? в эпидемию до (62,5 ± 12,2$ в межэпидемический период. Полученные данные о чувствительности ММГ в эпидемию хорошо совпадают со значениями, рассчиташыми по результатам работы Вукринской А.Г. с соавт. (1985) (87,2 + 9,%. и(89,5 + 9,9$ соответственно) Этот факт подтверждает достоверность полученного значения чувствительности MfíT, т.к. результаты были получены в различных лабораториях, в разные периоды времени и при использовании разливших молекулярных' зондов.

Таким образом, ШГ является полезным в качество пнструмен-та эпидемиологического наблюдения, особенно эффективно его использование в сочетании с иммуноферментным методом определения антигенов. Следует отметить, что ММГ не призван вытеснить традиционные вирусологические и серологические методы, а является дополнением к ним.

Наиболее перспективным представляется использование ММГ при попытках обнаружить вирусспецифичесшю ПК в биопробах можзпидеми-ческий пб 1'ринпу период у внешне здоровых ладей, а также у лиц с некоторыми видами хронической патологии (например, с хроническими заболеваниями органов дыхания). Так,-по результатам исследования с применением ММГ биопроб от детей с патологиями - центральной нервной системы, матера которых перенесли грипп в период беременности, было вискаяано предположение о существовании пиру-

са гриппа в античной форме - в виде нуклеокапсида ( Теп-иот/-Уи. Уи. е* аХ.,1989).

В этой связи заслуживают интереса результаты, полученные совместно с коллегами из Пражского института гигиены и эпидемиологии. Методом КГ было детектировано наличие РНК вируса гриппа А в 14 из 26 мазков, взятых с задней стенки глотки и носовых ходов людей в предэпвдешческий период (эпидемия гриппа А(НЗМ2) + А(Н1н I)). В то же время другие методы (вирусовыделение в КЭ, поиск сероконверсий к различным респираторным вирусам, иммуно-ферментный анализ с использованием поликлональных сывороток на наличие антигенов вирусов гриппа) не позволили обнаружить вирус шш его иммунологические маркеры ( нот11сЫсо1га и. еь п1., 1990).

Таким образом, высокочувствительный и специфичный ММГ может оказаться полезным (особенно в сочетании с техникой ПЦР) . для изучения циркуляции вирусов гриппа в природе.

МИГ при детекции ДНК вирусного гепатита В (НТВ). Чувствительность молекулярной гибридизации, или минимальное Выявляемое количество ДНК-шшеней, составляла 1-10 пг специфической ДНК, что эквивалентно около Ю6 копий геномной ДНК ВГВ. Отрицательным контролем неспецифического сигнала при проведении реакции КГ служила гибридизация с I мкг гетерологичной ДНК (ДНК спермы лосося или тимуса телёнка). Высокая специфичность ММГ как диагностического теста была продемонстрирована при исследовании сывороток крови лвдей, но"содержащих по результатам радиоиммунного обследования (тест-системы фирмы "АЪЪо1Л ") иммунологических маркеров вирусного ГВ: НВаАз , НВеАе , НВеАЪ , НВсАЬ, НВс^плъ и дольта-лъ. При исследовании 43 таких сывороток ни в одном случае но был зафиксирован ложноположителышй результат.

При исследовании 127 сывороток крови больных в основном хроническими формами вирусного ГВ с охарактеризованным иммунологическим профилем были установлены следующие коэффициенты корреляции (г ) наличия ДНК ВГВ и иммунологических маркеров в сыворотке крови: 'ДОС ВГВ и нвзАд г«= 0,12, при г < 0,2; ДНК НТВ

и нво1;:?.'АЪ т* 0,51, р<0,01; ДНК ВГВ и. нвоАз г = 0,68, р< < 0,01; ДНК ВГВ и полиальбуминсвязываклцая активность сыворотки (ПЧСА) г = 0,74, Р<0,01. Полученные результаты свидетельствуют в пользу участия реплицирующего вируса в развитии патологического процесса' при хроническом вирусном гепатите В и подтверждают высокую чувствительность и специфичность метода, поскольку

наличие ииоа.^ начнется маркером активной вирусной репликации, а ЛЧСА указывает на наличие полноценных вирионов в крови ( а »г-lieh W.U. et а!., 1987).

Среди 116 сывороток доноров Ленинграда, в кото рык но данный ВИЭФ нэ содержится нйзЛд , методом МГ было показано, что 8 из них (6,9%) содержат ДНК ВГВ. Этот результат указывает на необходимость использования болеа чувствительных, чем ВИОФ, методов для скршщипга крови.

^ Ври исследовании методом МГ 46 сывороток крови клинически здоровых доноров г.Риги, в которых били детектированы (РИА) и/или пооАЬ (ВФА), обнаружено, что 7 из шх (14,62) содержат ДИК ВГВ. По результатам этого исследования мо:кло такав сделать вывод, что(18,2 ± 11)10лъ - позитивных сывороток (при отсутствии нваА^ в них) содержат вирусную ДНК. Близкое значение -(21,2 + 7,М получено при исследовании методом Г,{Г Ь'ВсЛЪ -содержащих сиьороток (на содержащих, по данным 1Щ, псил^ ) людей группы риска - клинически здоровых врачей станции скорой помощи г.Риги.

МЫТ применялся также при изучении интенсивности зпидомичес-кого процесса в семейных очагах вирусного гепатита В. Параллельно образны исследовались на наличие - лэоЛ« и ;гезЛЪ в ШГЛ. Для исследования отбирались сыворотки крови клинически здоровых людей из семейных очагов вирусного ГВ в Узбекистане, среди которых, согласно анамнезу, было не более 7;2 людей с парентеральными вмешательствами. Забор сывороток производился двавды с интервалом в 4 месяца. Группа, включающая 138 сывороток (см.табл.2), была получена при первом заборе материала, а группа из 187 сывороток (табл.3) - при втором. Частота обнаружения исследуемых маркеров в очагах варьировалась в достаточно широких продолах. Так, irouAg обнаруживался в пределах от 8,6$ 'до 31,4$, нваАъ от 1,7$ до 23, Cl%, ДНК ВГВ от 15,5$ до 83,2$. Такой разброс связал с различной интенсивностью эпидемического процесса в различных очагах. Суммарно, нньлл; был обнаружен в (21,8 + 2,3)$ сывороток, а ШГ позволил обнаружить ДНК ВГВ в (57,8 + 2,7);?, т.е. в 2,7 раза чаще. Следует отметить, что ДНК ВГВ отсутствовала в (21,1 + 4,9)^ сывороток, содержащих ни а iß . Возможно, содержание частиц Дейла в этих пробах ниже порога чувствительности МИГ. У (81,8 5,2)% обследованных лиц наряду с п^чль в крови была обнаружена вирусная ДНК. В окружении носителей !№пЛ/» , в крови которых была обнаружена ДНК ВГВ, порлжтюсть-"контактных составила (4Э,1±6,6)$,

Таблица 2.

Результат» изучения корреляции обнаружения пвпЛв (А),

НЕэЛЪ (в) и ДНК ВГВ в сыворотках крови здоровых людей

из семейных очагов вирусного ГВ А В

ВГВ + - 5

+ 39 4 43

- 85 10 95

51 124 14 138

~\Ш1К ВГВ + - 2

+ 30 2 32

- 55 8 63

2 85 10 95

Таблица 3.

Результаты изучения корреляции обнаружения НВзАе (А), НВяАЪ (В) и ДНК ВГВ в сыворотках крови здоровых людей из семейных очагов ГВ Л В

ВГВ + - 51

+ 21 9 30

- 59 98 157

5: 80 - 107- 187

ВГВ + - 5

+ 20 5 25

- 60 102 162

2 80 107 187

а в окружении носителей нвяАв без вирусной ДНК лишь (18,1+8,2)$. Разница - статистически достоверна. При этом было установлено, что через четыре месяца после первого обследования в окружении тех источников инфекции, которые, по данным ММГ, освободились от вирусной ДНК, выявлено (32,0 + 9,3)% контактных людей с ДНК ВГВ в сыворотке крови. В окружении источников инфекции, в крови которых ДНК ВГВ обнаруживалась и при втором обследовании, этот показатель был значительно выше - (83,3 + 8,8)$, р.с 0,05.

Таким образом, использование ММГ позволяет получить информацию об интенсивности эпидемического процесса, его источниках и-динамике на качественно новом уровне.

ВЫВОДЫ

1. ШГ - чувствительный и специфичный метод диагностики вирусных инфекций, позволяющий детектировать 1-10 нг вирусной НК в^иопробе. Зонды с ДНК-копиями консервативных генов вирусов гриппа А (PA, KP, М, КО обладают типовой селективностью, а с ДНК-копиями вариабельных генов вирусов гриппа А(Н1, ИЗ, lfI, "2) - субтиповой селективностью. Зонд на основе рекомбинантной плаз-миды, содержащей полноразмерный геном ВГВ (штамм "У™ ), позволяет определять ДНК ВГВ в сыворотках крови болышх и бессимптомных носителей.

2. Отечественная полимерная мембрана рекомендуется для использования в качества носителя в реакции молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. На основе этой мембраны и ^Т-меченной плазмидной ДНК возможна компоновка набора для детекции вирусных нутслеиновых кислот методом МГ.

3. ММГ является высокочувствительным и специфичным лабораторным диагностическим тестом на rpinm А. Его чувствительность составляет 1Ь% при специфичности, близкой к IOOfî. Метод эффокти-

' вен в эпидемиологических наблвдениях, особенно при расшифровке вспышек.

4. Наличие ДНК ВГВ в сыворотке крови болышх хроническими формами ГВ в большей степени коррелирует с полиальбуминсвязываю- ' щей активностью сыворотки и наличием в ней HBeAg f чем с нали-.чием HBoïgb'Àb . Корреляция между наличием ДНК ВГВ и HBsAg

в'этих сыворотках'Практически не наблюдается. . ■ 5. Определение ДНК ВГВ позволяет более адекватно оценить интенсивность и динамику эпидемического процесса, а также реальную эпидемическую опасность различных источников вирусного ГВ. Доля ДНК-содержащих среди 1ШсЛЪ -позитивных сывороток крови клинически здоровых людей составляет около 205S.

ОСНОБНЬЩ ПУЬШЖДЦШ АНГОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Авторское свидетельство СССР на-изобретение № I47IE62 от 08.12.88 (приоритет 4127274/13 от 30.09.86) "Носитель для реакции гибридизации нуклеиновых'кислот", авт.изобрет. Артюхов А.П., Ноландт О.В., Носков Ф.С., Нлнснин А.З., Роякова С.А., Ска-

кун В.Н.

2. Плюснин А., Рожкова С., Ноландт 0. И др. Molecular hybridisation ne a laboratory test for influença virupoa.//Rov. Roura. t:od.-Virol. - 1987, '-V.39. ,112.-P. Ml-1'14.

3. Плюснин A.3., Ноландт O.B., Рожкова С.A., Брянцева Е.А., Носков Ф.С. Анализ возможностей молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот как метода лабораторной диагностики гриппа// МЭИ. - 1988. -ЯЗ.- С.32-36.

4. Плюснин À.3., Ноландт О.В., Кузнецова Е.В., Брянцева Е.А., Фридман Э.А., Носков Ф.С. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот кай метод лабораторной диагностики гриппа в модельных экспериментах на культурах клеток и при исследовании носоглоточных смывов, полученных от больных// ВШИ. - 1988. -

• - » 8. - С.19-22.

5. Плюснин А., Ноландт 0., Брянцева Е. и др. Uolooulnr hybridization with DlU-probos рз n laboratory diaenostio test for influenza virufiooi futhor investigations of method n pOP?ibilitiës.//

' ' Rev.Roum. l/od.-Virol. -1909. -V.40. ,111 ,-P. 33-42.

6. Сомшшна A.A., Пдюснян A.3., Лшшна Н.Б., Леонов В.M., Медведева H.A., Ноландт О.В., Писарева М.М., Войцеховская Е.М., Зибина Э.А., Жамсрангийн М. Использование иммуноферментной тест-системы и метода гибридизации нуклеиновых кислот для детекции независимых маркеров вируса гриппа в клинических материалах// Генетическая инженерия иммуномодуляторов и вакцин- '

1 ных препаратов/ Сб.трудов ВНИИ'гриппа. - Л., 1989. - С.90-97.

7. Плюснин А.З., Ноландт О.В., Липина Н.В.,' Соминина A.A., Зибина Э.А., Жамсрангийн М., Лузянина Т.Я., Носков Ф.С. Результаты использования молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в комплексном обследовании носоглоточных смывов от больных гриппом и другими 0P3// НИ. - 1990. -HZ.- С. 14-17.

8. Плвскин А., Ноландт 0., Добрецова А. И Др. D"A-prol,<;a in influenza diarnontio.//AT;fjtraot book of O-th International Congrcos of Viroloey. Eariin.-1990.-''O'J-8.

9. Плюснин А., Ноландт 0., Добрецова А. и др. Spot-hytriaization as a Method for dctseUon of hepatitis В viruo DilAi inveoUgti-tion of oanto and per:iintant infection,' donor blood omlyuia.//

' Abefruot book of O-th Inter rational Сопсум1? of Virology .1'orlln.' -1990.-P30-002.

10. Ноландт O.B., Плюснин A.3., Мукомолов С.Л., Добрецова А.Г., Жаворонок C.B., Соминская И.В., Шагинян В.Р., Лернер П.М.,Ар-твхов А.Й., Носков Ф.С. Возможности и перспективы использования методов определения специфической ДНК для изучения вирусного гепатита В// Успехи гепатологии. - 1990. - Вып.ХЛ, в печати.