Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование нерадиоактивных зондов для исследования структуры генома

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование нерадиоактивных зондов для исследования структуры генома"

и С.—1 31

• I ч'

РОССИЙСКАЯ АКАДЕЖ НАУ1С Сибирское Отделенно Институт цитология а гекэтики

На правах рукописи УДК 576.316$ 5Т7.113.4

АДАРИЧЕЗ Вячеслав Анэтояьзшч

КОНСТРУИРОВАНИЕ нерадеоактевия зондов ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА

клеточная биологая - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1993

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Г.М. Дымшц

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук» профессор

И.И. Кикнадзе

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор химических наук, профессор Э.Г. Малыгин

ВНИИ молекулярной биологии, п. Кольцово, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН,

г. Санкт-Петербург

Защита состоится "с) * <М/Ы$7к 1993 г на ^Ы^Н^кЛ^ заседании специализированного совета то защите диссертаций на соискание учЭной степени доктора наук (Д-002.11.01) при Институте цитологии я генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090. НовосиСирск-90, проспект Академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Учбный секретарь

специализированного совета, ,_____/

доктор биологических яаук " у ^ .....А.Д. Груздев

Актуальность тепы определяется широтой применения метода молекулярной гибридизации а клеточной и молекулярной биологии. Использование радиоактивно меченных зондов, несмотря на их высокую чувствительность, наталкивается на ряд ограничений, связанных с естественным распадом зондов, низким пространственным разрешением при гибридизации на хромосомах, дороговизной радиоактивной метки, а также опасностью облучения персонала. Замена радиоактивных зондов адекватными по чувствительности флуоресцентными или колориметрическими, помимо преодоления приведенных выше проблем, может также повысить информативность гибридизационного анализа. Так, использование в одном эксперименте зондов, несущих разные мотки, позволяет с большей точностью определять относительное расположение различных нуклеотидных последовательностей на хромосомах и в интерфазных ядрах.

Цель м задачи исследования. Цель денной работы заключалась в конструировании высокочувствительных нерадиоактивных зондов для молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Непосредственными задачами были: 1) изучение реакции перо шинирования двуцепочечных полинуклетидов 4-вминооксибутиламином и другими реагентами для нахождения условий получения устойчивых производных, модифицированных на оптимальную глубину; 2) получение флуорохромированных и биотинилированных зондов и определение их чувствительности при решении конкретных задач молекулярной и клеточной биологии.

Научная новизна. Создан метод конструирования полинуклеотид-них зондов для молекулярной гибридизации, основанный на введении в полинуклеотиды алифатических аминогрупп с последующим присоединением к ним различных репортЭрных соединений. Изучена реакция переаминирования двуцепочечных нуклеиновых кислот различными реагентами и найдены условия получения высокочувствительных нерадиоактивномеченных зондов. Полученные с помощью разработанного метода зонды позволили достоверно и с большей точностью, чем при использовании радиоактивной метки, локализовать ген хорионического соматомаммотропина человека в районе q22 хромосомы 17. Предложен способ нерадиоактивного

малэкулярно-гибриднзадаонного анализа тропической ' малярии человека. Проведено конструирование зондов, позволяющих с помощью полимеразной цепной рэакции к последующей нерадиоактивной гибридизации выявлять цровнрус льйкоза кругшого рогатого скота в лейкоцитах периферической крови животных. Теоретическое, научно-краюятческоа ш яршиэдаое авзчвннв.

Теоретическое значение работы заключается в исследовании различных факторов и условий, оназаванцих влияние на скорость реакции пэрааминирования двуцепочечянх нуклеиновых кислот, а такаэ на выход устойчивых и модифицированных на значительную глубану полануклаотидов.

Нвучно-практическая ценность работы заключается в том, что првдлозэнный в ней способ конструирования нерадиоактивно-меченных зондов универсален как с точки зрения выбора оптимального дяя какдой конкретной задачи сигнального соединения, так и в плане выбора исходного материала для приготовления зонда (дву- или одноцэпочечяый рибо- или дезоксиркбополи-нуклеотид).

Прикладное значение данной работы заключается не только в создании простого и универсального способа нерадиоактивного качания ДНК, позволяющего получать значительные (до одного миллиграмма) количества зонда, но и в разработке моделей гибридазациоиннх способов диагностики вирусных инфекций аявотных (на примере выявления провируса лейкоза крупного рогатого скота) и протозойных инфекций человека (на примере тестирования тропической малярии).

, Апробация работа. Материалы диссертации были доложены или представлены на различных всесоюзных конференциях, симпозиумах и совещаниях: I в II Всесоюзные совещания па использования ДНК- и РНК-зондов (Москва, 1987, 1990); Всесоюзный симпозиум "Вакцины, диагиостичэские средства и новая биотехнология" (Пущине, 1988); VI Всесоюзное совещание "Структура и Функции хромосом" (Бущино, 1988); I и II Всесоюзные конференции "Современные направления создания медицинских диагности-кумов" (Москва, 1988, 1990); I Всесоюзная конференция "Геном

человека" (Переалавль-Эалесский, 19S0); Всесоюзная конференция "Использование достшсегшй биотехнологии в животноводстве и ветеринарии" (Новосибирск, 19Э1); Всесоюзное совещание по использованию флуоресценция в реализация программы "Геном человека" (Москва; 1991). Кроуэ того, автор делал доклада на семинарах в Институте цитологии и генетики СО РАН, на конференции молодых учбшх ИЦнГ (Новосибирск, 1937)

Проекта по получению высокочувствительных нерадиоактивш меченных зондов для молекулярной гибридизация 1л vitro и in situ, в которых автор принимал участие, прошла экспортную оценку и ^Енансируются с 1989 года в ргмквх Государственной научно-технической программы "Геном человека". Публикации. По материалам дассертзции автором опубликовано 10 научных работ и получено одно авторское свидетельство. Структура и оОьёы работы. Диссертация состоит из введения, четарЗх глав, раздедЭнных на параграфы, выводов в списка цитируемой литература. Общий объём работы« -Уу^,'страниц, ¿fi таблиц и ¿¡^рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение ДНК из крови пациентов (Вьетнам) и крови крупного рогатого скота проводили по (Mathew, 1984) с модификациями. ДНК плазкид Rep 2, pHCS-3, pBL12 и др. выделяли методом щелочного лизиса (Маниатис й др., 1984). Переамнкированке поланухлеотидов 4-аминооксибутиламином (АГА) и другими реагентами проводили при 80°С в течение 1-10 мин. Реакционная смесь содержала ДНК 0,1 г/л и 0,2 М АГА рН 3,7 при 80°С.

Присоединение бнотина и флуоресцеина к введённым в полинукле-отида аминогруппам проводили в условиях для мачения белков (Антитела, 1991).

ДНК иммобилизовали на нитроцеллюлозных мембранах запеканием в вакууме 60 мин при 80°С (Ritossa and Splegelman, 1965); на нитроцеллюлозных и капроновых мембранах освещением УФ дозой 2,8 кДк/м2, ртутные лампы ЭДБ-30 (Калачиков и др., 1992). Гибридизацию на фильтрах при 37°С проводили в растворе 0,4 -

0,9 U NaCl, 50 % формамвда, 0,02 % поливишшшрролидона,

0.02 % фихолла 400, 0,02 % BS А, 0,5 % SDS, 100 мМ Ыа-фосфата pH 7 при концентрации зонда 30-200 нг/мл, в течение 1-16 /ч. Гибрвддзациэ пз фильтрах при 100°С проводили в 2,5 М HCl, 50 Ш трис-HCl pH 8 при 25°С, 1 мМ ЭДТА, 0,05 % SDS, 0,1 % PIcoll 400 в течение 1-60 мин. ДНК-мишень к ДНК-зонд денатурировали нагреванием 5 мин при 100°С. Посла гибридизации фильтр отмывали 3 раза по 10 мин при 37°С в тех же растворах, но без зонда и блокаторов.

Гибридизация In ßitu с ыетафезншш хроиосоиаш человека. ДНК

хромосом денатурировали 4 мин при 70°С в 70% формамидэ, 2xSSC (1xSSC=0,15 Ы NaCl, 0,015 К Na-цитрэт); затем проводили по спиртам и высушивали на воздухе. Гибридизацию проводили в растворе, содержащем 50% формамвда, 10% декстрвнсульфата натрия, 2xSSC, 0,05 % Tween 20, 100 нг/мкл озвученной ДНК E.coli, 2 иг/мкл биотинилированного зонда. Смесь прогревали 3 мин при 90°С и вносили под покровное стекло. Препараты инкубировали при 37°С 16 ч, а затем отмывали в 50% формамидэ, 2xSSC при 42°С. Блокирование и последующие стадии осуществляли, как описано в разделе "Детекция результатов гибридизации".

Пояимеразную цепную' реакцию проводили по (PCR Technology, 1989), оптимизируя температуру откига праймеров. Детекция результатов гибридизации. При детекции флуоресцеина фальтры фотографировали при освещении УФ (260 либо 305 нм) через фильтр ЙЗС-6, Детекцию биотиновой метки проводом с использованием коныогата стрелтавидина со щелочной фосфатазой (Langer et al, 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПЕЗОДШШРОВАННЫЕ ПОЛШУКЛЕОТИДЦ В КАЧЕСТВЕ

ЗОНДОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

Переаминирование мономерных компонентов нуклеиновых кислот подробно изучалась рядом авторов (Будовский и др., 1968,

1971; Петренко к Спирин, 1982 и др). Пря исполъаовангз О-влкилгаяроксиламтюв реакция очепь спецгфгтла, и коди&ака-ции подвергаются лапь остатка цитезяна. На полинуклеотидЕХ скорость рэакцгя падает, и, кроме того, сайта модефгкнцил 2 дзуцепочэчных структурах когут быть блокированы участиетл екзоцикличеекоЗ группы гиримидаов в коншюментарнш. взаимодействиях и стшшггом оснований.

Переаминнрованиэ является удобшш способом введения в голянуклеоглды разлгеах сигнальных соединенна, и поэтому было важно подробно изучить реакцию двуцэпочэчнах нуклеотовнх кнелот о различными пзрваминЕрупцики агента*® в надззде получить устойчивые, кодвфш^рованнне на достаточную глубггау н дшещие хорошую чувствительность зонда для молекулярной гибридаза'ога.

О- (СНЯ) Ц.-НН-С- (СНа) в

I

N

II

J^

HHi ск

• I !!

JZ ск (Г-тГ

—о-сна

I -о«* I

сн сн сн-сн

! ч

о (он)

NH~S-(CH3)*-CH СМ

о ся—сн

I I

Hf¡k с

PííC. 1 .

Гипотетическое строение биотшилированного продукта реакции цятозина в составе полшуклеотвда с 4-вииноокси-бутилакином.

Были исслодозаны различные, факторы, оказывающие влияние как на скорость реакции, так и на еыход устойчивых и высокочувствительных зондов. Для модификации были использованы 4-аминооксибутилагаш (АГА), 1,4-ди(аминоокси)бутан и гидра-

зин; при этом оптимальным с точки зрения скорости реакции и отсутствия побочных реакций оказался АГА. Были прсварьарованы концентрации различных тареаминирующих реагентов, бисульфит-иона, полинуклеотвда и различных денатураатов, а также рН среда, температура реакции и длительность кодификации. В результате исследования и шогопараметрической оптимизации процесса перевманирования были найдены условия модификации двуцепочечных полинуклеотидов, позволяющие получать зонды с чувствительностью, сравнимой с радиоактивной меткой. Чувствительность биотинилированных зондов в экспериментах по дот гибридизации составляет 5x10-19 моля гомологичных последова,-тельностей, g чувствительность флуоресцентных зондов -. 3x10-15 моля.

Анализ собственного экспериментального материала и данных литературы позволяет сделать вывод о том, что основным продуктом реакции остатка цитозика с АГА в оптимальных условиях ( см. "Материалы и метода") является производное 4-(0-бутилаюн)сксима (рис.1).

2. ВЫЯВЛЕНИЕ в геноуе УНИКАЛЬНЫХ последовательностей С ИСПОЛЬЗОВАНИЕ,! ЗОНДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В РЕАКЦИИ ПгРЕАШННРОВАНИЯ

2.1. Детеквдя уникального гена при Слот гибридизации

Выявление уникального гена хорионического соматомаммо-тропного гормона человека (CSH)'b препарате суммарной ДНК человека методом Southern блот гибридизации было продемонстрировано на следушцей модели. Зондом служила плазмида pCSH-3, содержащая практически полную копию гена (2900 п.н.), а мишенью - ДНК человека, рестриктированная вндснуклеазой Eco R1. При гидролизе геномной ДНК рестриктазой Eco R1 ген CSH и гомологичный ему ген гормона роста локализуются в двух фрагментах ДНК размером 2600 и 2900 п.н. соответственно.

Зонд был приготовлен по двустадийной схеме: на первой стадии реакцией переаминировашя с 4-аминооксибуталамином в ДНК вводили алифатические аминогруппы, к которым на второй

стадии присоединяли биотин. После процедур рестргасции суммарной ДНК из лейкоцитов крови человека, гель электрофореза, переноса на мембрану и гибридизации с нерадиоактивномечешшм зондом получили картину, согласующуюся. с литературными данными (Hirt et al, 1987). Ген надбяко выявляется в 2 мкг суммарной ДНК человека (рис.2).

4 2 3 4 2 3

2900 п.н. абоо п.н.

Рис.2.

Слева: окрашенный бромистым этидиэм 1% агарозный гель с результатами электрофореза обработанной рестриктазой Eco R1 ДНК человека. Обозначение дорожек: 1 - маркЗр длины - бкотн-нилированный гидролизат (Htnd III и EcoR I) ДНК 2-10 мкг рестриктированной ДНК человека; 3-2 мкг рестриктировзнной ДНК человека. Справа: результат переноса на капроновую мембрану и блот гибридизации с рНСЗ-З зондом.

Таким образом, использование разработанной нами двуста-дийной схемы модификации нуклеиновых кислот позволяет получать высокочувствительные зонды, пригодные как для дот, так и для блот гибридизации с уникальными последовательностями.

2.2. Детекция уникального гена СЗН при гибридизации in situ с ыетафазныыи хроыосоыаии человека и свиньи

Локализация нуклеотидных последовательностей в пределах хромосомы позволяет решать не только многочисленные научные задачи, связанные, например, с картированием, организацией хроматина в интерфазном ядре и т.п., но также актуальна для

ШДИЦШ1СХ0Й генетики и даагЕостЕка. Поэтому разработка методов анализа нуклэотнданх последовательностей при гибридизации In situ ииеэт важное научное и практическое значение.

Праыэкэнио дея гибридизации In.situ зондов, полученных в рэакцаи пэрэамияироваяня, било продемонстрировано на примере локализации на катвфазаых хромосомах человека и свиньи гена хорговяческоро сшатшашотропшго гормона человека (CSE). Зондом слушав плаззгяда pHCS-З, тченная биотипом по двуста-дйёной сжэие. Шсзаньа являлась ДНЯ хромосом лофэцатов периферической крова человека или свиньи. Работа проводилась сов-мастно с сотрудяикама лаборатории цатогенэтани зешотннх ЩиГ БалтуавоЗ Л.С., ВоробьЗвой Н.В., Графодатоаш A.C., ЕрЗманой В.Р., Саблиной О.В. -

я

Рис.з.

Локализация гена СЗН на метафазных хромосомах человека при нерадаоактивной гибридизации 1п аИи.

Ранее было показано, что ген СБН находится в районе q21•^}24 хромосомы 17 человека (Хи ег а1, 1988). Более точная

локализация при использования в качества метки 3Я бала иэвоз-жзяа. Прз детешсга рэзу^твтов нерадяоактЕвной гибридазациа на ?'отафазгш" иласотнках были обварукэнн зЭрка - сгхствшше продукты ферментативной реакции щелочкой фосфатазц, конызгп-рованной со стрбптавиданоы. Анализ рзспределения збрзн» различима! на фоне С-скраекя, позволил с больпзой достоверностью локализовать ген СБЕ на хромосоме 17 человека (х2=2В0,5; ?<0,001) з районе 17д22 (рис.3). При гибридазацш с ^ро».хзсо-мачи свиньи впервые была проза,тана локализация локуса, гсш-логичного гену СЕН, в районе 11р13 -> 12. Отнесение картируемой последовательности к хромосоме 11 свиньи тагетэ достовэрно (Х2=23,4; Р<0,001).

Теним образом, нерадиоактивно?лвчоншо по разработанной нами схеме зонда можно успешно применять практически ш всех областях молекулярной биологии, где требуется провэлзшш дот-, блот- или 1п эИи гибрздизаднк. Кро;.',э очевид-зх преимуществ замены радионуклидов безопасны?® в работе и амещзип неограниченный срок хранения сигнальными ' совдкнениякн» использование последних позволяет существенно повысить • пространственное разрешение, что имеет принципиальное рнэчо-ние при картировании хромосом млекопитающих.

3. ШЯВЛЕНИЕ МАЛЯВ5Ш0Г0 ПШВОДКЯ В КРСЕЙ ЧВЛШ2КА ЫЗТОДШ ИСЯЗШЯРНОЙ ПЗРИДИЗАЦКЗ С К^АДНОШЯЕНаЕЧВЕЬМ ДНК-ЬСЦЦСУ

Около трети человеческой популяция подвергается ряску заболевания малярией (Еагкег ег а1, 1986) и -неудивительно поэтому, что значительнее усилия затрачиваются па контроль, профилактику и немедленное уничтожение этой болезни. Вэдукцуз роль в диагностике малярии продолжает играть мккроскоютэскоэ исследование мазка крови, хотя этот метод неудовлетворителен в первую очередь из-за трудоемкости и неприемлемой длительности анализа. Альтернативным способом выявления малярийного заражения, имеющим в сравнении с шпсроскошей большую производительность и легче подвергающимся автоматизации, является метод молекулярной гибридизации с суммарной ДНК человека.

Использование радиоактивномеченных зондов в массовой

диагностике заболеваний человека неприемлемо по ряду причин, поэтому особую актуальность приобретают работы по созданию нерадиоактивных тест-систем.

В качестве зонда мы использовали'плазмиду, содержащую специфичный для Р.Га1с1рагш! тандемный повтор (зонд Еер2), составляшдай генома'паразита и потому выявляющий малярийное заражение с высокой чувствительностью - 25 пг ДНК плазмодия (Ргапгеп еЪ а1, 1984). Работа проводилась совместно с сотрудником института тропической медицины им. Е.й. Марцинов-ского Минздрава России (Москва) Соханенковой Т.Л.

На рис.4 приведён результат гибридизации зонда Нер2, биотинилированным по разработанной нами двустадийкой схеме, с ДНК человека (рад А) и ДНК РЛа1с1рагит (ряд Б). Выявляется 100 пг ДНК плазмодия при отсутствии сигнала от 316 нг ДНК человека, нанесённой рядом для контроля специфичности. Таким образом, метод позволяет обнаруживать 250 паразитов в 10 мкл периферической крови человека.

А Б В Г Д Е Ж

1 " © ©

2 ' « © ©

3 е о

4 т © «>

Рис.4.

Результат гибридизации и проявления биотинилированного зонда на малярию: А - с ДНК здорового человека: 1 - 316; 2 -100; 3 - 32; 4 - 10 нг; ряд Б - с ДНК Р.ГаШрагит: 1 - 3160; 2 - 1000 ; 3 - 316; 4 - 100 пг; В, Г, Д, Е, Ж - с ДНК из крови пациентов.

Данные нерадиоактивной гибридизации зонда Нер2 с образцами ДНК пациентов, находящихся на разных стадиях/ лечения болезни (рис.4, ряда В - %), были выражены в количественной

форме в единицах оптической плотности. Это позволило построить зависимость результатов гибридизации от данных гессроско-пического анализа (рис.5). Коэффициент корреляции данных, полученных двумя независимыми методами, составляет 0,96 для плотностей заражения Солее 25 паразитов на 1000 лейкоцитов и 0,70 при меньшем уровне заражения.

Рйс.5.

Зависимость величины гибрвдизационного сигнала (по вертикальной оси) от плотности заражения малярийным плазмодием по данным микроскопиче ского исследования (по горизонтальной оси; количество кольцевых форм на 1000 пэйкоцитов).

Таким образом, используя облучение УФ как универсальный способ иммобилизации ДНК на микропористых мембранах, а также оригинальный метод введения нерадиоактивной метки в зонд, разработан высокочувствительный тест на малярийное зарееткго, основанный на дот-гибридизации нуклеиновых кислот. Тест применим для серийного анализа P.falciparum в периферической крови человека, позволяет проводить эпидемиологические исследования ззражЗнности комаров малярийным плазмодием. Разработанная схема гибридизации является моделью для анагаза других

арэтозо£шх и бактериальных инфекций и позволяет такеэ исследовать махаяйБШ внедрения патогенов в организм хозяина.

Ваоши^ашвретграак Еябрцдаззацая нуклекновыг. кислот

Проблема солучешш результата гжбрвдизации в возможно более короткие сроки является актуальной не только при установлении даагноза быстропротэкащих инфекций, но и в обычной молзкулярш-бнслогачесной практике: Известно, что . скорость рзакцш шгко повысить, вводя в гибрадазпцгокнуе смесь такие шликера, как декстрансульфат ели шлиэтЕленгяшкэль (Wetnr.iT, 1991). Уы использовали другой' ыоцный фактор увэличешхя скорости - пошаэшэ твмлзратуры раекцни.

12 10

о

О о

о о

•м

и в

Е

2 0

А

оЗ

©

©

10 го 80 40 50

«ос

20 40 60 60 кзга

Рас.б.

Кинетики габридазации при 37°С (А) и при 100°0 (Б).

При проведении гибридизации прн высоких температурах (около 100°) возникает необходимость стабилизировать гибридные дуплексы, и для втой цели мы использовали хлорид литил в концентрации более 1 М. Мы нашли, что концентрация ЫС1 2,5 М оптимальна для проведения гибридизации при 100°С, так как

обеспечивает максимальное отношение полезного габрядазацион-ного сигнала над неспецифической сорбцией зонда на мембране.

Сравнение кию гак гибридизации, проводимых при 37°С и при 100°с (рис.6), показало, что скорость реакции увеличивается в 17 раз.

Таким образом, повышение температуры является мгадаим фактором ускорения реакции гибридизации и позволяет уменьшить длительность последней до 30 мин.

4. ВЫЯВЛЕНИЕ Х-ГЕНА ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПОШШРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ И ПОСЛЕДУЮЩИЙ гаБРИДЙЗЩШ С БИОТИШУШРОВШШ зондом

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является экзогенным этиологическим агентом болезни крупного рогатого скота. Помимо того, что заболевание распространено во всем мире и борьба с ним имеет хозяйственное значение, близость ВЛКРС по функциональной организации и характеру развития вызываемой им Солэзни к ретровирусам человека HTLV-I/II, HIV (Chandra et al, 1990) придает проблеме изучения взаимоотношений ВЛКРС-хозяйский организм особое значение.

Для изучения закономерностей развития болезни и е§ диагностики мы использовали полимэразную цепную рэянцию (ЩР) участка Х-гена ВЛКРС и гибридизацию с олигонуклеотидным зондом, комплементарным к внутреннему району шплифщировашгаго участка. Как показали предварительное исследования, такая комбинация методов необходима для повышения чувствительности и специфичности выявления провируса в клетках животного.

При конструировании олигонуклеотэдных зондов для ПЦР фланкирующие праймеры и внутренний зонд на выбирали из области Х-гена, т.к. провирус часто несет делеции по другим областям генома. С другой стороны, Х-ген тлеет шсзогонное происхождение и ого наличие в исследуемом организме достоверно указывает на заражение (Kettman et al, 1982). При конструировании праймеров учитывали их температуры плавления, отсутствие комплементарности друг к другу, самокомплемвнтЕрности, а также возможную гомологию к другим областям генома ЕЯКРС.

Для определения чувствительности разрабатываемой тест-

система различные количества плазмиды рВЬ12, содержащей полную копию ВЛКРС, вносили б амгшфгеационную смесь, в которой в качестве балласта присутствовала ДНК из лейкоцитов человека. После электрофореза ашлифицироваккой ДНЯ проводили блот гибридизацию с бяотанилированным зондом. В качестве положительного контроля использовали ДНК из клеток овцы, зарак§нных ВЛКРС, а в качестве отрицательного - ДНК человека. На рис.7 представлены результаты электрофореза и блот гибридизации.

12345 6789 123456789

Fac.7.

Результаты электрофореза продуктов амплификации при различных начальных количествах рВИ 2, разведенной в 1 мкг ДНК человека (слева) и результаты блот гибридизации с биотиншш-рованным зондом (справа). Дорокхи 1 и'9: маркбр молекулярного веса Hind III/Eco RI гидролизат ДНК фага X. Дорожка 2: ттш-фикация 1 мкг ДНК из клеток овцы, заражЭнных* ВЛКРС. На дорожки 3 - 8 нанесены продукты амплификации: 3 - 300; 4 - БО; 5 -12; 6 - 2.4; 7 - 0.5; 8 - 0 фг плазмиды pBL12.

Данные электрофореза свидетельствуют о том, что в ПЦР выявляется 300 фг плазмиды рВЪ12 на фоне 1 мкг балластной ДНК, что соответствует определению около 16000 копий Х-гена на фона ДНК из 150000 клеток. Однако последующая блот-гибридизация с внутренним биотинилированным олигонуклеотидным

зондом позволяет сделать анализ болев надбзшым и чувствительным. С помощью ПЦР и гибридизации удаЗтся достоверно детектировать 12 фг плазмиды рВЬ12 в 1 мкг геномной ЛНК. Это соответствует определению 650 копий провируса в ДНК из 150000 клэток или 1 коши провируса на 230 клэтоя.

По данным Lagarlas и Еайке (1990), количество заражВнных вирусом клеток асимптомагических овец находится на постоянной уровне: около 1-ой заракбнной клетки на 2000 незараЕешшх. Принимая во внимание множественность заражения вирусом В-лимфоцитов (около 10 копий на клетку) (Кеитап ег а1, 1980), можно оценить, что для достоверного определения заражения-необходимо определять одну копию провируса в ДНК из 200 клеток. Таким образом, достигнутая нами чувствительность позволяет надежно детектировать еивотннх с ттарслстентннм лакфоци-тозом, являющихся основным источником инфекции в стаде.

Разработанная нами схема нерадиоактивного молакулярко-гибридизационного анализа ВЛКРС монет оказаться полезной не только для понимания механизмов развития лейкоза животных, но и в качестве модели для выявления нуклеотидаых последовательностей с очень редким представительством в геноме при других вирусных инфекциях или наследственных нарушениях.

ВЫВОДЫ

1. Предложен способ конструирования нерадиоактивных зондов для молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, основанный на химической модификации остатков цитозинй з полинуклеотиде с последующим введением различных рзпортбркых соединений. Чувствительность биотинилированных зондов в экспериментах по дот гибридизации составляет 5x10"19 моля гомологичных последовательностей и позволяет выявлять при гибридизации на фильтрах уникальные гены.Чувствительность флуоресцентных зондов при гомологичной дот гибридизации на Фчльтрах составляет 3x10-15 меля.

2.- Изучена реакция переаминировагая дву- к одноцепочочшх нуклеиновых кислот 4-аминосксибутила-кином, 1,4-ди(8Мшооксл)-бутаном и гидразином. Найдеш условия. получения устойчивых производных, степень модифицикации которых составляет дс 10 '%

оснований.

3. Показана возможность провздэния молекулярной гибридизации при 100°С в растворе хлорида лития с концентрацией более 1 М. Повышение температуры с 37°С до 100°С приводит к увеличению скорости реакции в 17 раз, что позволяет резко сократить длительность гибридизации.

4. Использование высокочувствительного бкотиншшрованного зонда, полученного в реакции переаминирования, позволило в высокой достоверностью локализовать ген хорионического сома-томаммотропина в районе q22 хромосомы 17 человека.

5. Разработана тест-система для нерадиоактивного молекулярно гибридазацконного анализа тропической малярии человека. Метод позволяет выявить 250 паразитов P. falciparum в 10 мкл периферической крови человека.

6. Предложена схема нерадиоактивного молекулярно-гибридизаци-онного выявления провируса лейкоза крупного рогатого скота на основе полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией. Метод позволяет специфично определять б геноме нуклеотид-ные последовательности с очень редким представительством, в частности, надёжно детектируются 650 копий провируса в образце, содержащем 150000 лейкоцитов животного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адарачев В. А., Дммшц Г. М., Калачиков С. М., Поздняков П.И., Салганик Р.И. Получение ДНК, несущей алифатические аткогругты, и использование ее флуоресцентного производного в качестве зонда при. молекулярной гибридизации // Биоорган. химия. 1987. Т.13, * 8. С.1066-1069.

2. Адарачев В.А., Калачиков С.М., Двизгац Г.М. Высокотемпературная гибридизация нуклеиновых киалст // Известия СО АН СССР, сер.биол.наук. 1988. » 14, вып. 2. С.113-116.

3. Дышиц Г.М., Калачиков С.М., Адаричев В.А. Конструирование нерадиоашивных ДНК-зондов для молекулярной гибридизации In situ // Тез.докл. Всесоюзн.конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Москва. 1988. С.113.

4. Калачиков С.М., Дьашщ Г.М., Ддаричев В.А., Салганкк Р.И.

Способ гибридизации дезоксщюбонуклеиновых кислая // Авторское свидетельство J4 164С995. 1990.

5. Дыншац Г. м., Адаричеа В. А., Калачиков С. II., Киселева А.В., Мштна B.C., Попов А.Н. Получение нераОгю-ашивно леченных ДНК-зондов для молекулярной гибридизаищ и разработка системы их выявления // Первая Всесоюзн.конф. "Геном человека-90". тезисы докл. и стенд, сообщ., Переславль-Залесский. 1990. С.213.

6. Адаричев В. А., Мишина S. С., Соханешсова Т. Л.. Калачиков С.М. • Диишц Г.М., Салганик Р.И. О возможности

нерадиоакшвной диагностики тропической малярии методом молекулярной гибридизации // Тез. докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медащшских диагностикумов". Москва. 1990. С.60.

7. Мишина B.C., Адарпчев В.А., Калачиков С.М., Дкгаиц Г.М.

Трехэондовая схема выявления провируса BIV // Тез. докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Москва. 1990. С.73.

8. Калачиков С.М., Адарнчев В.А., Дыноиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембранах с помощью УФ-облучения // Биоорган, химия. 1992. Т.18, Л 1. С.52-62.

9. Адаричев В.А., ДрмчиП Г.Ы., Шшша B.C., Сарганик Р.И., Соханешсова Т.Л. Ыерадиоантивкый гибриЗизационный тест на заражение человека Plasmodium falciparum. // Биополимеры и клетка. 1993. Т.9, » 2.

10. Попов А.Н., Адаричев В.А., Калачиков С.У., 5йпшна Е.С., Дьпшщ Г.М. Выявление провируса ВЛКРС методом полимерсзной цепной реакции с последующей нерадиоашивной блст-гибридизацией // Вопросы вирусологии. 1993. в печати.

11. Biltueva I.S., Sablina O.V., Vorobjeva H.V., Adarichev V.A., Dyrashlts G.M., Eremlna 7.R., Graphodatsky A.S. Localization of human chorionic acmatcmam-motropln hormone 2 (csh2) gene on the human. chromosome 17 and pig chromosome 11 by in situ hybridization // Cytogenetics and Cell Genetics. 1993. In press.