Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и применение нерадиоактивных систем выявления нуклеотидных последовательностей в молекулярной гибридизации

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание и применение нерадиоактивных систем выявления нуклеотидных последовательностей в молекулярной гибридизации"

-V* и 3 ?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ Н.АУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

Институт цитологии и генетики

на правах рукописи УДК 576.316:577.113.4

КАЛАЧИКОВ Сергей Михайлович

СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НЕРАДИОАКТИВНЫХ СИСТЕМ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОТВДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1992

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск.

Научный руководитель - кандидат биологических наук, доцент

Г.М. Дымшиц,

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Б.П. Уланов,

Институт химической физики РАН, г. Москва

кандидат химических наук Каргинов Владимир Андреевич, Институт клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г.Новосибирск

Ведущее учреждение -

Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится " 3 " 1992 г.на

VгУг^ц^^иы-с.* заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) при Институте цитологии и генетике СО РАН в конференц- зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан " -АЛ " ¿>7гпгиЛ-^^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.Д. Груздов

Актуальность тепы определяется широтой применения метода молекулярной гибридизации в клеточной и молекулярной биологии. Использование радиоактивно меченных зондов при их высокой чувствительности создает ограничения для применения метода в исследовательской практике и диагностике ряда наследственных и инфекционных заболеваний. Эти ограничения связаны с плохой стабильностью зондов, их низким пространственным разрешением при гибридизации in altu, дороговизной и опасностью для персонала. Замена радиоактивных систем выявления адекватными по чувствительности флуоресцентными или колориметрическими, помимо преодоления приведенных выше проблем, позволяет повысить информативность гибридизационного анализа, поскольку применение различных меток в одном эксперименте позволяет с большей точностью определять расположение различных последовательностей.

Цель и задачи исследования. Дэль данной работы заключалась в создании нерадиоактивных методов выявления результатов гибридизации, чувствительность которых была бы адекватной для решения различных задач молекулярной и клеточной биологии. При выполнении работы были изучены разные пути введения репортер-ных групп в полинуклеотиды; определена чувствительность различных нерадиоактивных меток, вводимых в ДНК; исследованы разные способы иммобилизации ДНК на нерастворимых матриксах. Научная новизна. Создан ряд оригинальных неферментных способов получения флуоресцентных и биотиновых полинуклеотидных зондов для молекулярной гибридизации. Найден оптимальный уровень мочения ДНК флуорохромами и биотином. Впервые продемонстрировано использование флуоресцентно меченных ДНК в качестве зондов для гибридизации in vitro на микропористых мембранах и in situ с препаратами хромосом. Продемонстрирована возможность одновременной гибридизации in altu с ДНК-зондами, несущими флуорохромы с эмиссией при разных длинах волн. Предложен и защищен авторским свидетельством универсальный способ иммобилизации ДНК для экспериментов по молекулярной гибриди-. зации. Полученные в работе результаты были использованы автором при создании метода выявления микоплазменных контаминаций клеточных культур.

Теоретическое, научно-практическое и прикладное значение.

Теоретическое значение работы заключается в том, что полученные параметры мечения и чувствительности выявления предложенных зондов позволяют выбирать адекватные подходы при анализе структуры генома методами молекулярной гибридизации и прогнозировать результаты такого анализа.

Научно-практическая ценность работы заключается в том, что в ней предложен ряд простых и эффективных методических решений, позволяющих повысить точность и чувствительность гибридизационного анализа при изучении структурно-функциональной организации генома.

Прикладное значение данной работы заключается не только в создании конкретного диагностикума для тестирования микоплаз-менных контаминаций клеточных культур, но и в том, что изложенные в ней принципы являются общими при создании других нерадиоактивных ДНК-диагностических тест-систем для биотехнологии, медицины и сельского хозяйства.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены или представлены на различных всесоюзных конференциях,. симпозиумах и совещаниях: I и II Всесоюзные совещания по использованию ДНК- и РНК-зондов (Москва, 1987, 1990); Всесоюзный симпозиум "Вакцины, диагностические средства и новая биотехнология" (Пущино, 1988); VI Всесоюзное совещание "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1988); I и II Всесоюзные конференции "Современные направления создания медицинских диагности-кумов" (Москва, 1988, 1990); I и II Всесоюзные конференции "Геном человека" (Переславль-Залесский, 1990, 1991); Всесоюзная конференция "Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии" (Новосибирск, 1991); Всесоюзное совещание по использованию флуоресценции в реализации программы "Геном человека" (Москва, 1991).

Кроме того, автор делал доклады на семинарах в Институте цитологии и генетики СО РАН , на конференции молодых ученых ИЦиГ СО АН СССР (Новосибирск, 1987), и на .семинаре в Институте медицинской генетики Университета имени Эрнста-Морица Арндта. (Грайфсвальд, Германия, 1989).

Проекты по получению высокочувствительных нерадиоактивно

меченных зондов для молекулярной гибридизации In vitro и In situ, в которых автор принимал участие, прошли экспертную оценку и финансируются с 1989 года в рамках Государственной научно-технической программы "Геном человека" . Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 16 научных работ и получено одно авторское свидетельство. Структура и объем работы. Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН. Фактический материал, представленный в диссертации, получен автором лично. Диссертация состоит из введения, пяти глав, разделенных на параграфы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы 166 страниц, 3 таблицы и 35 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Изучение различных способов иммобилизации ДНК на микропористых мембранах.

Нанесение ДНК на микропористые мембраны. Перед нанесением на мембранные фильтры готовили серию разведений ДНК в воде. ДНК денатурировали 5 мин при ЮО°С, охлаждали во льду и наносили на фильтры через аппарат для микрофильтрации "MInliold I". В некоторых случаях к раствору денатурированной ДНК добавляли 3,5 M NH40AC, 5 M NaCl, Z0% SDS или 1 M NaOH до желаемой концентрации. При работе с нитроцеллюлозными фильтрами во всех случаях ДНК наносили в растворах,содержащих 1,5 M NH^OAc. При изучении иммобилизации фрагментов ДНК различной длины ДНК фага X гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Hind III и Eco RI. ДНК плазмиды pBR 322 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Sau ЗА I. Полученные фрагменты Д12{ метили 33Р по концам. Sau3A I- фрагмента ДНК pBR 322 ргз-вляли электрофорезом в 12% ПМГ и проводили злектроперонос па капроновые мембраны. Hind III/Eco RI-фрагменты ДНК фага А. раздоляли электрофорезом в 1 % агарозном гело и проводили элоктроперонос па капроновые мембраны. После переноса ДНК денатурировали на фильтрах, как описано в паисй работе [91, затем проводили иммобилизацию.

Кш!об;и21зацшэ ДНК на капроновых и питроцеллюлозных фильтрах

после нанесения или переноса проводили, высушивая их в вакууме при 80°С и давлении 6-8 мм рт.ст., либо освещая различное время четырьмя ртутными лампами низкого давления ЭДБ-30 с расстояния 17 см. Мощность источника ультрафиолета составляла 44 Вт/м2 при длине волны 260 нм.

Для определения количества ДНК, необратимо связавшейся с фильтром, фильтры отмывали в растворе, содержащем 50% форма-мида, 1,2 М NaCl, 100 мМ трис-HCl pH 8,0, 4% SDS, две смены по 20 мин при 50°С. После этого фильтры разрезали, высушивали и просчитывали в диоксановом сцинтилляторе, либо по Черенкову на счетчике Minibeta (1KB, Швеция).

Гибридизация. Нитроцеллюлозные и капроновые фильтры с иммобилизованной ДНК фага А. предгибридизовали 1 час при 37°С в растворе, содержащем 50 мЫ трис-HCl pH 8,0, 50% формамида, 10% декстрансульфата, 0,5% SDS, 4-кратный раствор Денхардта, 300 мМ NaCl, 50 мкг/мл озвученной денатурированной негомоло-гичноЯ ДНК. Затем добавляли меченый зонд и вели гибридизацию 16 часов при 37°С. Фильтры отмывали дважды в 1% SDS при 65°С, и затем в 150 мМ NaCl при 20°С.

Радиоавтографа) фильтров проводили в кассетах с рентгеновской пленкой РМ-1 и усиливающими экранами ЭУ-И1 при -20°С, после чего фильтры разрезали и просчитывали в сцинтилляторе. При величине счета ниже 2000 имп/мин количество гибридизовавшейся ДНК определяли денситометрически, сравнивая значения оптической плотности, получаемые в опытах, со значениями оптической плотности на калибровочных кривых, полученных из радиоавтографии известных количеств меченого зонда, иммобилизованного на капроновом фильтре.

2. Введение репортеркых групп в полинуклеотиды. Алкшшрование ДНК или РНК проводили при различных соотношениях 4-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)-бензиламин/полинуклеотид (в молях). Реакции с РНК проводили в ЗОмМ NaAc рНб.О 30 мин при 37°С. РНК осаждали спиртом.

Алкшшрование ДНК вели в 10мМ трис-HCl рН7,5 20 мин при 37°С. ДНК осаждали спиртом.

Присоединение аыинооксибутилашша к ДНК вели в растворе, содержащем 0,5 мкг/мл ДНК и 0,5М аминооксибутиламина при рН5,5,

А

5 мин при 100°С. ДНК осаждали спиртом.

Очистку ДНК от кепргсоздгшлгпзксл репгентов проводили гель-фильтрацией на БерЬайех С-75.

Олусрохрокгровашэ полинуглеотэдсв флуоресцеинизотиоцианатсм, тетраметилродакинизотиоцианатом или дансилхлоридом осуществляли в 0,1М КсНСО^ при концентрации флуорохромов 1мг/мл 2 часа при 37°С. Очистку от неприсоединившихся флуорохромов проводили гольфильтрацией на БерЬайех С-75. Бтютшсгрозанке поллнтклеотидов проводил! при концентрации ДНК 0,25 ггкг/мл в растворе, содержащем 5мМ М-оксисукцинимидкого эфира биотина и ЮОмМ фосфатного буфера рН7,5. Реакцию вели 1 час при 37°С. Очистку от неприсоединившегося биотина проводили гельфильтрацией на БерЬабех С-75.

При получении [~-Р]-меченных зондов ДНК метили ик-трансляцией или со статистической олигонуклеотидной затравкой, как наш; описано в работе [81 до удельной активности 5 ■ Ю8-109имп/ (ют-мкг).

3. Проведение дот-, Слот- или 1п эМи гибридизации с нерадиоактишкжзчогаглги зоцдся.

Дот- и блот-гибрлдазацгта проводили 16-75 часов при 37°С в растворах, содержащих 50 мМ трис-НС1 рН 7,2, 400 мМ МаС1, 50% формамид, 0,5% БРЭ, 5 мИ ЭДТА, 2 - 0,02 мкг/мл зснда. После отмывок в случае зондов, меченных флуоресцекном, фильтры просматривали под ультрафиолетом и фотографировали на фотопленку РФ-3 через светофильтр КЗС-6. В случае зондов, мечешшх биотагом, после отг.явок фильтры шгкуб1фовали 30 вш в растворе, содерна'дем 50 мМ трис-НС1 рН7,5, 100 м.4 НаС1, 5 мМ 0,2" ксзеина. Затем фильтры инкубировали 20 мин а растворе, содоркадаа конъвгат стрептавядин-щедочная фосфатазэ в концентрации 1 гдсг/мл^и после отмывок проявляли 16 часов в растворе, содорж&цгм 50 ¡/Л! трис-НС1 рПЭ,5, 100 :/.". МаС1, 5

0,3 мг/мл нитротетразолиевого синего и 0,2 мг/мл 5-бром-4-хлор-З-индолилфосфатэ.

Гибридизации 1п зИи. проводили в растворе, содержащем 50 мМ гафофосфата натрия рН6,5, 600 кМ N201, 1«кг/мл зонда. В случае гибридизации с флуоресцентно-меченными зондами препараты просматривали под микроскопом и фотографировали. В случае

зондов, меченных биотином, препараты проявляли как описано выше.

4. Клонирование ДНК-зондов для выявления микоплазменного заражения клеточных культур.

Фрагменты рибосомных генов AcTxoleplaama laldlawii получали в полимеразной цепной реакции.

Полииеразную цепную реакцию проводили в растворе, содержащем 50мМ КС1,100мМ трис-HCl, рН8,4, 1,5мМ MgCl2, по 200мМ дез-оксирибонуклеозид-5'-трифосфатов, при концентрации праймеров 3 мкг/мл, матрицы 1мкг/мл и ДНК-полимеразы Taql 50 е.а./мл. Реакцию проводили в температурном режиме Э4°С, 2 мин. -*■ 5fi°C, 2 мин —75°С, 2 мин.

Лигирование полученных фрагментов в плазмиду pUC 18 проводили при концентрации вектора 43 нг/мкл и концентрации вставок 500 нг/мкл в стандартном буфере для лигирования (50мМ трис-HCl,рН7,8, 5мМ MgCl2, 0,5мМ АТФ). Концентрация фермента составляла 7,5 е.а./мкл. Реакцию вели при 16°С 15 часов. При трансформации компетентные клетки coli (штамм TG-1 ) оттаивали на льду, добавляли 1/100 объема раствора реакционной смеси после лигирования и инкубировали 20 мин при 4°С. Затем к клеткам добавляли 9 объемов среды LB и глюкозу до концентрации 20 мМ, и инкубировали 1 час при 37°С. Затем клетки рассовали на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин и IPTG/X-gal. Отобранные колонии подращивали в LB/ампициллине, Еыделяли плазмидные ДНК, которые затем анализировали рестрикцией и электрофорезом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Иммобилизация ДНК на микропористых мембранах при облучении ультрафиолетом.

Нитроцеллюлозные микропористые мембранные фильтры широко используются для иммобилизации нуклеиновых кислот в экспериментах по молекулярной гибридизации. Серьезными недостатками нитроцеллюлозных мембран являются: необходимость денатурации образцов ДНК перед нанесением на фильтр, плохая первичная сорбция коротких фрагментов, хрупкость мембранного фильтра после его высушивания в вакууме. Капроновые мембранные филь-

б

тры МИФШ1 (Эстония) лишены перечисленных недостатков, но известные условия иммобилизации, применяемые для нитроцеллюлоз-ных фильтров или модифицированных нейлоновых подложек (Gene Screen Plus, Hybond N+ и т.п.), оказываются неэффективными в случае капроновых мембранных фильтров. В условиях гибридизации и отмывок большая часть сорбированой ДНК смывается с них. Облучение капроновых фильтров ультрафиолетом приводит к практически количественной иммобилизации ДНК на мембране.

Анализ кинетики фотоиммобилизации 19 фрагментов ДНК различной длины (от 40 до 24000 п.о.), позволил получить зависимость, связывающую дозу ультрафиолета, достаточную для иммобилизации фрагмента ДНК, с его размером:

1?=(22,3±4,8)-— , где 1 1

р

I - доза ультрафиолета при длине волны 254 нм (кДж/м ), с - доля фрагмента (в процентах), которую необходимо

иммобилизовать, 1 - длина фрагмента в нуклеотидах.

Облучение капроновых фильтров ультрафиолетом в сравнении с другими способами иммобилизации имеет более высокую

о.

о I I . . I .... 1 .... I .... О к

О 5 10 15 20 „ с-Доза ультрафиолета (кДж/ы ) Рис.1. Зависимость эффективности гибридизации от дозы облучения ультрафиолетом при иммобилизации ДНК.

1. Эффективность гибридизации (отн.ед.).

2. Эффективность иммобилизации зонда (средний размер фрагментов 600 нуклеотидов).

;»$1>зктивность и, при использовании оптимальных доз облучения,

позволяет значительно повысить чувствительность гибридизации.

- Использование более высоких доз облучения приводит к падению чувствительности гибридизации. На Рис.1 представлена зависимость эффективности гибридизации, выраиенной как отношение количества гибридизовавшэгося ДНК-зонда к количеству ДНК, нанесенной на фильтр, от дозы ультрафиолета при иммобилизации. Для сравнения на этом ке рисунке приведена кинетика иммобилизации самого зонда (средний размер фрагментов около 600 нуклеотидов). Несмотря на то, что количество иммобилизованной ДНК при дозе 2,6 кДж/м'' достигает 74%, гибридизацион-ннй сигнал падает. Причиной падения эффективности гибридизации после длительного облучения ультрафиолетом могут служить повреадения, вносимые в ДНК. Кроме того, введение большого числа сшивок ДНК с мембраной при больших дозах ультрафиолета так же может снижать эффективность гибридизации.

Облучение фильтров ультрафиолетом при иммобилизации ДНК

ч20

¡-15-

а

я 10

К

ч

5-

0 12 3

Нанесенная ДНК (нг)

Рис.2. Величина гибридизационного сигнала на нитроцеллю-лозных фильтрах в зависимости от способа иммобилизации, высушивание в вакууме 1 ч при 80 С (I) 9 облучение ультрафиолетом в дозе 0,6 кДж/м (II).

на нитроцеллюлозных мембранах так же позволяет повысить чувствительность гибридизации. На Рис.2 приведен результат эксперимента по сравнению чувствительности гибридизации ДНК

gara X с гомологичной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллвлоз-ном фильтре как высушиванием з вакууме, так и при фотонммоби-лизации ультрафиолетом в дозе 0,6 кДд/м2. Использование ультрафиолета для ижобилизацни ДНИ в случае нитроцеллмозных фильтров позволяет повысить чувствительность гибридизации в 4,5 раза.

Автор с одинаковым успехом использовал ультрафиолет для фотоиммобилизащш ДНК на нитроцеллюлозных мембранах HAHY я BA-S5 (Schleicher & Shueli), кодифицированных нейлоновых мембранах Gene Screen Р1из (NEN),' а также на матриксах, не использовавшихся ранее для иммсбилизацш! ДНК: капроновых мом-бранах МИШЛ, фильтрационных мембранах НАТЯГ, из смеси нитроцеллюлозы и' ацетатцоллюлозы (Millipore), тефлоновых мембранах МТЕФ-З разных типов и иммунологических планшетах Titerteck (Flow Laboratories).

2. Исследование различных путей введения репортерных групп в пол-щухлеотлд-i.

3 сравнении с ферментативными химтгче ciare способы не радиоактивного мэчония ДНК прэдставляются более перспективным! в силу большой воспроизводимости и меньшей дороговизны, по крайней мере в тех случаях, когда требуется получить значительные количества меченного зонда. При разработке химических способов мэчения га придерживались двустадайной схеш - на первой стадии в ползшуклеотид вводили аминогруппы, к которым затем можно было присоединить различные сигнальные соединения.

Для введения аминогрупп в полинуклаотиды использовали несколько реакций:

- алкилирование 4- (К-2-хлорэтил-11-метила;,а1но)-бензила;яшом

- трансаминированив цитозина 4-аминооксибутилпминсм,

- фотомодификация ДНК аминобутиларилазидом.

При изучении модификации полинуклеотидов указанными ре-'агентами было показано, что использование реакций алкилирова-1шя и переаминирования позволяет вводить в ДНК более 10% ре-портерных групп (по отношению к числу азотистых оснований в ДНК), в то время как использование фотоактивных реагентов не

позволяет вводить в зонды более \% репортерных групп.

Перечисленные реагенты с высокой эффективностью модифицируют полинуклеотиды по азотистым основаниям, поэтому была определена степень модификации полинуклеотида, которая не сказывается на его способности к комплементарным взаимодействиям. В качестве модели была использована полиинозиновая кислота, после введения аминогрупп модифицированная дансилхлори-дом или флуоресцеинизотиоцианатом. Характер кривых смешения поли(Ц) с образцами поли(И), несущими до 17% флуорохромиро-ванных нуклеотидов, позволил заключить, что комплементарные комплексы образуются при молярном соотношении полинуклеотидов 1:1, как и в случае с немодифицированной полиинозиновой кислотой. Однако гипохромизм дуплексов падает после достижения 8% модификации. Отсюда, а так же из экспериментов по обработке комплементарных комплексов с модифицированной полиинозиновой кислотой РНКазой Т1, следовало, что совершенные дуплексы образуются при меньших степенях модификации.

3. Чувствительность флуорохромированных зондов в дот-блот гибридизации и гибридизации 1п в!1;и.

При сравнительном изучении флуоресценции образцов рРНК Ск1гопотиз tШпmi, несущих дансил или флуоресцеин, был определен выбор флуорохрома и границы, в которых имеет смысл модифицировать полинуклеотид для дальнейшего использования его в качестве зонда при молекулярной гибридизации. Регистрируя изменение интенсивности флуоресценции от степени модификации зонда, было установлено, что максимальные значения флуоресценции достигаются при уровне модификации РНК флуоресцеином, •составляющем 4%. Чувствительность образцов, несущих дансил, на порядок ниже (Рис.3). Гидролиз флуорохромированной РНК до нуклеотидов приводит к росту интенсивности флуоресценции; причем этот рост тем значительнее, чем выше степень модификации полимера. Это указывает на концентрационное гашение флуоресценции, объясняемое взаимным влиянием соседних остатков флуорохромов, расположенных на одной полинуклеотидной цопи. Гашение начинается уже при степенях модификации выше 1,5%.

Совокупность дашшх о способности флуорохромиронэншх полинуклеотидов к комплементарным взаимодействиям, об от-

200

100-

II -о-о

2 4 6 8 10

Процент модификации

Рис.3. Зависимость чувствительности зонда от степени модификации флуоресцеином (I) или дансилом (II). На оси ординат величина пропорциональная чувствительности -1/А, где I - интенсивность флуоресценции в отн.ед., А-поглощение РНК при 260 нм.

сутствии гашения флуоресценции в дуплексе и об уменьшении квантового, выхода в связи с концентрационным гашением, указывает на целесообразность использования в качестве зондов для молекулярной гибридизации полинуклеотидов, модифицированных флуоресцеином в диапазоне 3-5%.

Для определения чувствительности таких зондов была проведена дот-гибридизация [Р^ДНК, в которую флуоресцеин был введен после ее реакции с 4-аминооксибутиламином (степень модификации 4%),с немеченой гомологичной ДНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозных фильтрах. Зонд позволял детектировать 2 '

до 200 пг ДНК на I мм'. Большую чувствительность при гибридизации на мембранных 'фильтрах получить невозможно из-за низкого соотношения сигнал/фон. Это связано как с собственной флуоресценцией фильтра, так и с рассеянием возбуждающего света микропористой структурой мембраны. После гибридизации Ы зИи при том же количестве ДНК на единицу площади в случае флуоресцентной микроскопии чувствительности флуорохромированного зонда должно быть достаточно для выявления последовательностей ДНК в ядрах и хромосомах.

Возможность использования при гибридизации 1п зНи флуоресцентных зондов, сконструированных по предложенной схеме,

□

о

О

о

была продемонстрирована в экспериментах, выполненных совместно с сотрудниками лаборатории генетики онтогенеза ИЦкГ СО РАН Л.Д.Матяхиной и О.Л.Серовым. Мы провели гибридизацию in situ. смеси клеток из разных культур мышл и норки (линии LMTK- и KV соответственно) с тотальной ДНК мыши, меченной тетрамэткл-родамином, и одновременно с ДНК корки, меченной флуоресцепном. Под лкдшэсцентншг микроскопом были видны ядра мышиных клеток, кмэщкэ оранжевую флуоресценцию, и зеленые ядра клеток норки. После гибридизации In situ с этими s:e зондами клеток гибридом, содержащих хромосомы и мыши и норки, мояно было дифферэнцировать по свечению хромосом разшх видов.

4. Чувствительность бкотшшровышых зондоз в дот-блот гкбрздизацни к гкбргдазацни in situ.

Чувствительность биотинированных ДНК-зондов, полученных в результате модификации 4-(Ы-2-зиоратил-Н-м8тиламшю)-0энзил-акином или 4-аминооксибутиламином с последующим присоединением биотина, была определена при дот-гибридизации с гомологичной плазмидой. Для выявления биотина после гибридизации использовали коммерческие конъюгаты стрептавидина с перокси-

илк щелочной фосфатазой, а такке

Рис 4. Чувствительность выяв-Л81ШЯ ДНК pBPi322 различными конъюгатами стрептавидина после гибридизации с биотиниро-вашюй ДНК pBR322.

1. Стрепт&зидин -щелочная фос-фатаза.

2. Стрептавидин - ¡3-галактози-даза.

3. Стрептавидин - пероксидаза.

конъюгат стрептавидик-щелочная фосфатаза, приготовленный по оригинальной методике с использованием гетеробифункционально-го сшивающего реагента К-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-про-пионата (SPDP). Было показано, что чувствительность выявления

дазой, р-галактозидазой

пкг ■ 1 2 3

930,0 0 0 с

460,0 е ч «

230,0 с &> м>

110,0 е q г*

55,0 f-

30,0 Q

15,0 ©

7,5 ©

3,8 Ь

1,6 •9

ДНК растет линейно с ростом степени модификации зонда и достигает максимума при степени модификации 4%. Конъюгаты стрептавидина со щелочной фосфатазой обладают наибольшей чувствительностью, позволяя выявлять после гибридизации 0,03 пг/мм2 иммобилизованной ДНК. Конъюгаты с ß-галактозидазой или пороксидазой дают соответственно в 30 и 100 раз худшую чувствительность (Рис.4.).

Во многих экспериментах было показано отсутствие сигнала от негомологичных ДНК, что указывает на сохранение зондами высокой специфичности.

Чувствительность созданной нерадиоактивной системы мочения - выявления ДНК позволила в дальнейшем использовать био-тинированные зонды для локализации различных последовательностей ДНК на хромосомах при гибридизации in situ и при создании ДНК-гибридизационного теста для выявления микоплазмен-ных заражений клеточных культур.

В гибридизации in situ с препаратами хромосом из слюнных :келез хирсномуса высокое разрешение биотшшрованного зонда позволило выявить различие в размере прицентромерных гетерохроматиновых блоков у видов-близнецов Chironorma agllia-1 Chironomua agill3- 2.

5. Создание ДНК-гибридизационнсго теста для выявления ыикоплазиешшх контаыинаций клеточных культур.

Спонтанное инфицирование киноплазмами культивируемых in vitro клеток человека и животных (часто-называемое микоплаз-менной контаминацией) является причиной гибели клеточных культур л потенциальным источником артефактов в цитологических и биохимических экспериментах. Помимо экспериментальной практики контаминация клеточных культур создает серьезные проблета в таких областях биотехнологии, как селекция гибридом и приготовление вакцин.

Схема нерадиоактивного выявления результатов гибридизации, описанная выше, была использована при создании тест-систсмы для обнаружения микоплазменного заражения в культурах эукариотических клеток.

Чтобы обеспечить широкий спектр выявления различных видов мгаюплазм при клошфовании зондов для детекции мшсоплазмепно-

го заражения были выбраны гены агРНК микоплазм. Уровень гомологии между рибосомными генами различных видов микоплазм достаточно высок, чтобы обеспечить необходимую универсальность метода. Однако гомология между отдельными сегментами рибосом-ных генов микоплазм и млекопитающих также весьма значительна. По этой причине автором совместно с сотрудником Отдела теоретической молекулярной генетики ИЦиГ СО РАН А.Э. Келем, был перед клонированием проведен анализ термодинамических параметров формирования гетеродуплексов между 18S рРНК человека и ДНК, комплементарной 16S рРНК Ulcoplasma capricolum. В результате этой работы были найдены фрагменты гетародуплекса, свободная энергия (AG) формирования которых была близка к нулю. Части рибосомного гена 16S РНК, соответствующие найденным областям гетеродуплекса, были получены в полимеразной цепной реакции, где в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из референтного штамма Acholeplasma laldlawli в лаборатории структурной организации генома (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), и клонированы.

С целью определения условий гибридизации полученных зондов их метили Р и гибридизовали в мягких условиях с денатурированными рРНК мыши и E.coll, иммобилизованными на капроновых фильтрах. После гибридизации фильтры разрезали и отмывали при различных температурах. Температура диссоциации дуплексов с эукариотической рРНК была равна 41,8°С, и, как и следовало ожидать, оказалась ниже температуры диссоциации дуплекса с рРНК E.coll - 56°С. Проведение гибридизации при температуре 42°С должно исключать гибридизацию полученного зонда с эукариотической рРНК; в то же время эти условия являются достаточно мягкими для гибридизации зонда с рРНК микоплазм и других прокариот.

Специфичность и универсальность полученного зонда в указанных условиях была продемонстрирована его блот-гибридизацией с образцами рРНК, выделенными из неконтаминиро-ванных культур эукариотических клеток, и образцами рРНК из референтных штаммов микоплазм нескольких различных видов. Результат представлен, на Рис.5. Зонд был мечен биотином и выявлен после гибридизации конъюгатом стрептавидин-щолочная

1 2 3 4 5 б 7

Рис.5. Блот-гибридизация биотинированного зонда рА1334 с образцами рРНК выделенными" из неконтаминированных культур эукариотических клеток (1-3), и образцами рРНК, выделенных из референтных штаммов нескольких различных видов микоплазм (4-8).

фосфатаза. Надежно выявляются все исследованные виды микоплазм в то время как сигнал с эукариотичесними рРНК отсутствует.

Использование биотинированного зонда в варианте дот-гибридизации позволяет выявлять микоплазмы при уровне зараженности культуры от 1 до 0,1 микплазменных частиц на клетку. Такой зонд вследствие консервативности рибосомных генов прокариот может быть использован для обнаружения но только мико-плазменного, но и другого бактериального заражения культур клеток человека или животных.

. ВЫВОДЫ

1. Создан метод количественной иммобилизации ДНК на капроновых, нитроцеллюлозных и тефлоновых мембранах, позволяющий повысить чувствительность гибридизации в 5-50 раз, в сравнении с другими известными способами иммобилизации.

2. При изучении различных путей введения репортерных групп в ДНК показано, что использование реакций алкилирования и пореаминирования позволяет вводить в ДНК более 10% репортерных групп. Вводимые в зонд аминолинкеры ориентированы в раствор. Обнаружено, что введение в ДНК до Ь% репортерных групп

не препятствует образованию комплементарных комплексов между модифицированными полинуклеотидами.

3. Оптимальный уровень мечения ДНК флуорохромами и биотином составляет 4-5% относительно числа оснований в ДНК. При этом в дот-блот гибридизации предел чувствительности выявления с флуорохромированными зондами составляет 200 пг/мм2, а с био-тинированными зондами - 0,1-0,03 пкг/мм2, при использовании конъюгатов стрептавидина со щелочной фосфатазой.

4. В гибридизации In altu флуоресцентных зондов со смесью ядер разных видов животных продемонстрирована чувствительность их прямого выявления и возможность дискриминирования различных последовательностей с зондами, меченными различными флуорохромами. Гибридизацией In situ с биотинированным зондом pludl выявлено различие в размере прицентромерных гетерохроматиновых блоков в политенных хромосомах у видов-близнецов Chlronomus aglHs-1 - Chironamua aglUs- 2.

5. Из рибосомного оперона Acholeplaama laidlawii клонирован фрагмент, дающий низкий уровень неспецифической гибридизации с эукариотическими рРНК. В гибридизации с образцами рРНК из референтных штаммов микоплазм показана специфичность и универсальность клонированного зонда. На его основе создан нерадиоактивный гибридизационный тест для обнаружения бактериального заражения культур, позволяющий выявлять от 1 до 0,1 микоплазменных частиц на эукариотическую клетку.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ

опубликованных по теме диссертации

1. Фрумгарц Л.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М. Введение флуоресцентной метки в поли нуклеотиды и исследование влияния их модификации на способность к комплементарным взаимодействиям. // Молекулярная биология. 1985. том 19. вып.5. -С. 1394-1399.

2. Фрумгарц Л.А., Киприянов С.М., Калачиков С.М., Дуда-рева H.A., Дымшиц Г.М., Карпова Г.Г., Салганик Р.И. Получение флуоресцентно меченной ДНК и использование ее в качестве зонда при молекулярной гибридизации. // Биоорг. химия. 1986. том 12. N 11. - С.1508-1513.

3. Ддаричев В.А., Дымшиц Г.М., Калачиков С.М., Поздня-

ков П.И., Салганик Р.И. Получение ДНК, несущей алифатические аминогруппы, и использование ее флуоресцентного производного в качестве зонда при молекулярной гибридизации. // Биоорг. химия. 1987. том 13. N 8. - С.1066-1069.

4. Фрумгарц Л.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Добриков М.И., Шишкин Г.В. Перенос и фотоиммобилизация фрагментов ДНК на п-азидобензоилцеллшозе. // Известия СО АН СССР, серия хим. наук, 1988. N 2. вып. 1. - С.81-87.

'5. Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Адаричев В.А., Салганик Р.И. Способ гибридизации дезоксирибонуклеиновых кислот. // Авторское свидетельство N 1640995. 1990.

6. Дымшиц Г.М., Адаричев В.А., Калачиков С.М., Киселева А.В., Мишина Е.С., Попов А.Н. Получение нерадиоактивно меченых ДНК-зондов для молекулярной гибридизации и разработка системы их выявления. // Первая Всесоюзн. конф. "Геном человека - 90". тезисы докл. и стендов, сообщ.. Пере-славль-Залесский, 1990. - С.213.

7. Калачиков С.М., Дымшиц Г.М., Кель А.Э., Попов А.Н., Борхсениус С.Н. Универсальные ДНК-зонды для тестирования ми-коплазменных контаминацнй. // Тезисы докл. II Всесоюзн. конф. "Современные направления создания медицинских диагностику-пов". Москва, 1990. - С.70.

о. Протопопов М.О., Калачиков С.М. Ник-трансляция и метод статистической затравки. // Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990.- С.29-34.

9. Иванов С.В.,Потапов В.А. Калачиков С.М. Блот-гибридизэция ДНК на капроновых мембранах. // Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990.- С.35-33. '

10. Кнкнадзе И.И., Сиирин М.Т., Филиппова М.А., Гунде-р!ша Л.П., Калачиков С.М. Изменение массы прицентромерного гетерохроматина один из важных путей эволюции кариотипа у ."лрономид. // Цитология. 1991 . т.33. N12. - С.90-93.

11. Калачиков С.М., Адаричев В.А., Дымшиц Г.М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембранах с помощью УФ-облучения. // Биоорг. химия. 1992. т.18. N 1. - С.52-62.