Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание нерадиоактивного высокочувствительного гибридизационного метода детекции вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Создание нерадиоактивного высокочувствительного гибридизационного метода детекции вируса клещевого энцефалита"

РГВ од РГ6 од

- 8 ОПТ «9Б

На правах рукописи

ОРЛОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

СОЗДАНИЕ НЕРАДИОАКТИВНОГО ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ГИБРИШЗАШОННОГО МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

(03.00.04 БИОХИМИЯ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

НОВОСИБИРСК-I996

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители: проф., д.х.н. Зарытова В.Ф.

к.х.н. Годовикова Т.е.

Официальные оппоненты: проф., д.б.н. Дымшиц Г.М.

к.х.н. Беклемишев А.Б.

Ведущая организация: Государственный научный центр

вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится " г. в _часов

на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирской институте биоорганической химии СО РАН по адресу. 630090, Новосибирск-90, проспект акад.Лаврентьева, 8.

С диссертацией мокно-ознакомиться в библиотеке Новосибирске института биоорганической химиш СО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного

совета к.х.н. Федорова О.С.

актуальность проблемы, в последние годы в диагностике клещевого энцефалита (КЭ) получили распространение иммунологические методы, основанные на взаимодействии антигена и антитела. Однако, их чувствительность часто недостаточна для прямой детекции вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в исследуемом материале от больных, в связи с чем требуется предварительное накопление вируса в биологической системе, увеличивающее длительность анализа. Кроме того, указанные методы не обеспечивают ранней диагностики заболевания, необходимой для выбора рационального метода лечения, из-за низкой концентрации антигена, с одной стороны, и латентного периода при образовании антител, с другой. Существенный недостаток при обнаружении антигена в клиническом материале - возможность получения ложноположительных результатов за счет полиспецифических антител, присутствующих в сыворотке как больных, так и здоровых людей.

Радиоактивный вариант точечной дот-гибридизации с использованием 32Р-меченого ДНК-зонда выявляет около Ю6 молекул РНК ВКЭ, что соответствует 10 пг вирусной РНК. Однако, он не нашел широкого применения в клинике ввиду проблем, связанных с нестабильностью метки и радиационной опасностью при работе с ней. цель работы, цель данной работы - создание нерадиоактивного высокочувствительного высокоспецифичного метода выявления РНК ВКЭ в клинических образцах. Для увеличения чувствительности использовалась полимеразная цепная реакция (ПЦР), высокую специфичность обеспечивали анализом продуктов ПЦР обратной дот-гибридизацией.

Для достикешя поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: I) получить мембраны с ковапентно присоединенными олигонуклеотидами-зондами для специфического связывания амплифици-рованного фрагмента; 2) сконструировать праймеры, меченные биоти-ном, эффективно и специфично инициирующие реакции обратной транскрипции (ОТ) и пцр, универсальные для исследования широкого спектра штаммов ВКЭ; 3) разработать технологию получения стрептавидина, необходимого для синтеза его конъюгатов с ферментами, обеспечивающих выявление комплементарного дуплекса; 4) оптимизировать условия гибридизации биотинилированного амплифицированного фрагмента кДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами и последующего выявления гибрида; 5) апробировать созданный метод выявления РНК ВКЭ в кли-

нических образцах (индивидуальные клещи, кровь больных). Научная новизна и практическая ценность, впервые для использования в гибридизационном анализе получены аффинные мемораны на основе отечественного полимерного материала - лавсана с ковалентно присое динёнными олигонуклеотидами, способными образовывать прочные комплементарные комплексы. Аффинные лавсановые мембраны были применены при выявлении определённых нуклеотидных последовательностей, также они могут быть использованы для выявления точечных мутаций и выделения индивидуальных НК.

Для биотинилирования олигонуклеотидов по предварительно введенной аминогруппе спейсера впервые использованы водорастворимые реагенты (2-нитро-4-сульфофеншговый и п-сульфотетрафторфениловый эфиры биотина), позволяющие получать продукты с высокими выходами в течение 1 ч в водно-щелочной среде (рН 9.2), благодаря тому, что время аминолиза данных реагентов на порядок меньше времени их гидролиза.

Впервые получена кДНК (1427 нуклеотидных звеньев) с РНК ВКЭ штамма Софьин с использованием в качестве ревертазы фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы I и осуществлена последующая амплификация фрагмента кДНК в но нуклеотидных звеньев.

Разработан практически важный нерадиоактивный метод для выявления РНК ВКЭ в клинических образцах, основанный на обратной дот-гибридизации в сочетании с реакциями ОТ и ПЦР с биотинилированными праймерами. Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, универсален для исследования широкого спектра штаммов ВКЭ. Практическая ценность разработанного метода продемонстрирована на примерах выявления вирусной РНК в индивидуальных клещах и крови больных.

Предложен способ выделения стрептавидина с высоким выходом гель-хроматографией на Сефадексах типа что исключает очистку на аффинных сорбентах, получение которых трудоёмко. Полученный стреп-тавидин может использоваться в генно-инженерных работах и в ИФА. Производство стрептавидина внедрено в НИКТИ БАВ. публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, получены положительные решения по з заявкам на изобретения. Результаты докладывались на Международном симпозиуме по проблемам и перспективам применения синтетических

олигонуклеотидов (Москва, 1991); II Всесоюзной конференции "Геном человека-91" (Переславль-Залесский, 1991).

объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 15Л страницах машинописного текста, состоит из введения, двух глав, выводов и списка цитируемой литературы из 176 наименований, содержит 7 таблиц и 24 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для создания высокочувствительного нерадиоактивного метода детекции РНК ВКЭ в биологических образцах исследована возможность обогащения анализируемого материала посредством последовательного проведения реакций ОТ и ПЦР с биотинилированными праймерами, локализованными в консервативной области вирусного генома, кодирующей белок Е оболочки (ТП - б'САСААТСЗСТСССТТТТССАА и то -б'ОАССТСХСТСТТГСХЗСТСАА в положениях 1408-1427 и 1318-1337 с 5'-конца +РНК). С целью достижения высокой специфичности разрабатываемого метода, биотинилированшй продукт ПЦР выявляли обратной дот-гибридизацией по схеме, представленной на рис.1. Для выявления обеих цепей амшмфицированного фрагмента кДНК РНК ВКЭ одновременно иммобилизовали два "20"-звенных олигонуклеотидных зонда ТС и ТИ, комплементарных "плюс"- и "минус"- цепям РНК ВКЭ в положениях 1386-1405 и 1338-1357 с 5'-конца +РНК (структуры см. в табл.1)

СУБСТРАТ ОКРАШЕННЫЙ ПРОДУКТ

Рис. 1. Схема обратного дот-гиоридизационного анализа

I. ПОЛУЧЕНИЕ АФФИННЫХ МЕМБРАН НА ОСНОВЕ ЛАВСАНА

Для проведения обратной дот-гибридизации получены аффинные мембраны на основе полимерного материала отечественного производства - лавсана. Он доступен, недорог, сохраняет эксплуатационные свойства в температурном интервале от -60°С до +170°С. Структура лавсана представлена сложным .эфиром этиленгликоля и терефталевой кислоты. Наличие карбоксильных груш на поверхности лавсана позволяет после активации их пентахлоридом фосфора, конденсировать полученные хлорангидриды с аминоспейсером, предварительно введённым по 5'-концевому фосфату олигонуклеотида. Присоединение по концевому фосфату позволяет максимально сохранить комплементацион-ные свойства олигонуклеотидов, а введение' протяжённого спейсера (Ы,Ы'-бис(3-аминопропил)-1,2-этандиамина) между подложкой и зондом увеличивает эффективность гибридизации. Иммобилизацию олигонуклеотидов на лавсане проводили в присутствии третичного амина;, необходимого для депротонирования аминогруппы спейсера (рис.2).

I

С1

н2ы—и '-ин—

■Р-ОЯ

НИ-К "-ИН—р-оя

А-

Б - олигокукдеоиидныа остаток

Я' - (сн2)3ш(сн2)2ш(сн2)3 -Рис.г. Схема иммобилизации олигонуклеотийов на лавсан

ор

За ходом иммобилизации следили по [5'- Р]-метке, введенной с помощью киназы в иммобилизованные олигонуклеотида. Результаты представлены в табл. 1. Максимальная ёмкость полученных мембран составила около 300 пмоль/см^. Показано, что иммобилизация протекает равномерно.

Таблица 1. Результаты определения уровня ковадекшкого связывания олигонушеотивов с лайсаноОой мембраной

Название олигонуклеотида Нуклеотидная по с ле до в ате льно с ть Количество кова-лентно связанного олигонуклеотида, пмоль/см^

ТС 5'-рААТССАСААГССТТСССССА 260,0

ТИ 5' -рСАССАССАСАСССМСАСАСТ 300,0

Г1 5'-рАССТСТССАССТТСАТТ 280,0

ТС + ТИ 230,0

Гибридазадаонные свойства иммобилизованных олигонуклеотидов исследовали по возможности образовывать дуплекс с комплементарным ^Р-меченым олигонуклеотидом по схеме, указанной ниже:

(Г2) 5'-32рСССАСССАСААСТААТСААТСААССТССАСАСет IГ1) ТТАСТТССАССТСТССАр-

Эффективность гибридизации иммобилизованного олигонуклеотида составила не менее 50%. Выявлено, что некомплементарный олигонук-леогид не связывался с модифицированной мембраной. Таким образом, совокупность трех факторов: высоких ёмкости и гибридизационной эффективности, а также отсутствие неспецифической сорбции олигонуклеотидов обеспечивает возможность использования аффинной лавсановой мембраны для специфического связывания амплифицировэнного фрагмента.

2. УСЛОВИЯ ЭФФЕКТИВНОГО И СПЕЦИФИЧНОГО ПРОТЕКАНИЯ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ НА РНК ВКЭ И ПОЛИМЕРАЗНОИ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ НА кДНК* 2.1. Выбор праймеров

Для обеспечения детекции разрабатываемым методом широкого спектра штаммов ВКЭ принципиальное значение имеет рациональный выбор праймеров, предназначенных для осуществления ОТ и ПЦР.

* Данный раздел работы выполнен совместно с сопруйникали дайора тории А.Г.Рода!щенко: Н.В.Воройьевоа и Н.А.Сероюковоа (ИЦиГ СО РАН)

Первичная структура праймеров должна соответствовать наиболее консервативным участкам генома данного вида вирусов. Высокая степень гомологии характерна для структуры белка Е оболочки вирионов различных штаммов ВКЭ, что подтвердилось и при сравнении первичных структур участков геномов, кодирующих белок £ некоторых исследовании х штаммов. Исходя из этого, для данной области генома выбраны две пары 20-звенных праймеров, инициирующих реакцию ОТ и ПЦР: ТП/ТО и Т1/Т2. В качестве матрицы использована РНК ВКЭ высокопатогенного штамма Софьин в составе суммарной РНК, выделенной из мозга инфицированных мышей (содержание РНК ВКЭ 0,1%). Эффективность и специфичность реакций полимеризации определены выявлением кДНК ВКЭ или ее амплифицированного фрагмента блот-гибридизацией с ^Р-вирусспещфическим зондом (рекомбинантная плазмида рТВЕ 51.1, содержащая фрагмент генома ВКЭ штамма Софьин размером 2000 пар оснований, кодирующий область структурных генов) после электрофо-ретического разделения продуктов реакций. На рис.3 представлен радиоавтограф анализа продуктов реакции обратной транскрипции, осуществленной с помощью праймеров Т1 и ТП (дорожки I и 2, соответственно) и обратной транскриптазы из Е. coli. Аналогичные результаты наблюдались при использовании фрагмента Кленова, который, как известно, способен считывать гетегополимерную РНК. Применение в качестве праймера олигонуклеотида ТП приводит к накоплению единственного продукта ожидаемого размера (142? нуклеотидных звеньев ). Появление низкомолекулярных продуктов при использовании праймера Т1 может быть обусловлено либо деградацией матрицы, либо ее структурированностью.

Успешный синтез кДНК с праймером ТП позволил перейти к испытанию олигонуклеотидов ТП/ТО на праймерную активность в ПЦР. Условия проведения последней подобраны эмпирическим путем: денатурация - 95°С, 0,6 мин; отжиг - 55°С, I мин; полимеризация - ?0°С, 2 мин, 25 циклов. На рис.4 представлен радиоавтограф блот-гибридизашонного анализа продуктов, образующихся в ходе ПЦР. При использовании Праймеров ТП/ТО наблюдается высокоэффективный специфичный синтез ожидаемого продукта в 110 нуклеотидных звеньев как в случае небиотинилированных (дорожка 1), так и биотинилированных праймеров (дорожка 2).

12 3

I 2 3

Pue.4.

Pue. з. Радиоавтограф <5лои-гийри<)изации лроаукпой обратной транскрипции на РНК ВКЭ в присутствии праймера Т1 (Оорохка 1), Г//

о р

(2) с Р-вирусспецифическиж ЗНК-зондож. з - маркеры спривеойк разлер в п.о. )

Рис.4. Радиоавтограф блои-гиОрийизации продуктов реакции ОТ-ПЦР S присутствии праажероа ТП/ТО (Порожка 1) диотинилирован-ных прайжеров ТП/ТО (г) с згР-вирусспеиифическиж ДНК-зонйож , з -ларкеры (приведен разяер в и.о.).

2.I.I. Биотинилирование олигонуклеотидов с использованием

водорастворимых активированных эфиров биотина

Для получения оиотинилированных олигонуклеотидов впервые были использованы водорастворимые 2-нитро-4-сульфофениловый и п-сульфо-тетрафторфениловый эфиры биотина*. Их присоединяли по аминогруппе спейсера, предварительно введённого по 5'-концевому фосфату олиго-нуклеотида. Показана относительная устойчивость активированных эфиров биотина в водно-щелочных растворах при их высокой реакционной способности в отношении аминов.

Синтез биотинилировашшх олигонуклеотидов проводили в борат-ном буфере (рН 9,2) в течение I ч при комнатной температуре (рис.5). Биотинилированные производные олигонуклеотидов выделяли

*Получены В.Н.МеОвебкиныж (Институт белка, г.Пущино)

обращенно-фазовой ВЭЖХ с выходом 88-91%. Содержание биотина, оцененное по методу, основанному на изменении экстинкции 2-(4'-гидроксифенилазо)-бензойной кислоты (HABA) при вытеснении её из комплекса с авидином, соответствовало присоединению его к олигонуклеотиду в соотношении 1:1. Полученные биотинилировэнные олигонуклеотиды являются достаточно стабильными соединениями: их использование, по крайней мере, в течение трех месяцев, не уменьшало чувствительности ГА.

С KN^NH

h2n-r'-nh-h-or + l-j рн

o2N

hn^NH

'H í Я + -0~C>-S03-

s^-ч ch2) f-í—hn—r .-n^lojj 02i¡

Е - олигонушеотионыа остаток Е' - (СНг)3Ш(СН2)2Ш(СН2)3 -Рис.5. Схела синтеза биовинлеченого производного олигонуклеотийа

2.2. Исследование универсальности праймеров *

Под универсальностью праймеров подразумевается их способность инициировать реакции ОТ и ПЦР на геномных РНК различных штаммов ВКЭ. Для оценки универсальности выбранных праймеров, последние испытаны на способность инициировать реакцию ОТ и ПЦР на РНК двадцати восьми различных штаммов ВКЭ в условиях, оптимизированных для анализа РНК штамма Софьин. В качестве отрицательного контроля использовали РНК, выделенную из мозга неинфицированных мышей. На рис.6 приведен радиоавтограф анализа блэт-гибридизацией продуктов ОТ-ПЦР на РНК некоторых штаммов ВКЭ с 32Р-вирусспецифическим ДНК-

* Данный и посаейуюиие разведи выполнены содлестно с Н.М.Пиценко (НИИПЯ. г.Олек.)

зондом. Все остальные исследованные штаммы также выявляются данным тестом. Полученные данные позволяют говорить о достаточной универсальности выбранных праймеров.

12345678 9 Ю 11

Рис.6. Радиоавтограф анализа блот-гибридизацией продуктов реакции ОТ-ПЦР на'РНК ВКЭ 8 сосиаве сулларноа РНК. выделенной из лоз га мышей, инфицированные различными шталлахи ВКЭ: Софьин (2), 205 (3). Таяари-1 (4), ПриЛ0рье-2 (5). ТвНиС-4 (6). 4072 (7), Волхов-г (в), Сесирорецк-2 О), А6сеттаров( Ю) с

о 2

Р-виру с специфическим МНК-зондом. Контроль - I якг суммарной РНК из мозга неинициированных лыяеа ш. II - маркер.

2.3. Исследование видоспецифичносги праймеров

Критерием надежности метода, наряду с универсальностью, является специфичность. Для исследования праймеров на специфичность проведены реакции ОТ-ПЦР на РНК десяти различных флавивирусов. Продукты ПЦР проанализированы блот-гибридизацией с 32Р-вирусспецифическим зондом. Показано, что синтез продуктов ПЦР наблюдается при использовании в качестве матриц РНК эталонного штамма Софьин и РНК двух вирусов, относящихся к комплексу КЭ-Нэгиши и ШЭО. Наличие продуктов ПЦР у вирусов Нэгиши и ШЭО объясняется тесным генетическим родством с вирусом КЭ. У остальных испытанных вирусов комплекса КЭ и более дальних флавивирусов сигналы гибридизации отсутствуют. Вследствие географической отдаленности мест выделения вирусов ШЭО и Негиши (Шотландия и Япония, соответственно), вероятность перекрестных реакций с ними мала, что обусловливает надежность метода.

3. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИИ ПРОВЕДЕНИЯ ОБРАТНОЙ ДОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ

Условия проведения обратной дот-гиоридизации подбирали с использованием Ей 3+-меченого продукта амплификации, так как флюоресцентная метка обеспечивает прямую количественную детекцию. Для этого ПЦР проводили с Еиа+-мечеными праймерами (известно, что Еиа+-меченые олигонуклеотиды обладают праймерной активностью). Последние получали присоединением 1-(п-изотиоцианофенил)-этилендиаминтетраацетата Еиа+'*'к аминоспейсеру, предварительно введённому по 5'-концевому фосфату олигонуклеотида. Продукт выделяли из реакционной смеси последовательно сбращённо-фазовой и ионнообменной хроматографией с выходом около 80%.

Температуру и продолжительность реакции гибридизации Еи3+-меченого продукта ПЦР с иммобилизованными олигонуклеотидами определяли эмпирическим путём. Максимальное соотношение сигнал/фон наблюдается при проведении гибридизации 7-9 мин при 53°С. Высокий сигнал гибридизации при коротком времени её проведения обусловлен осуществлением реакции в малом объёме (2 мкл)- "в капле" и доступностью олигонуклеотидов, благодаря их иммобилизации по 5'-концевому фосфату с помощью протяжённого спейсера.

3.1. Определение чувствительности детекции РНК ВКЭ методом

обратной дот-гибридизации

Для определения предела детекции образцы, содержащие от I фг до 100 пг РНК ВКЭ штамма Софьин, приготовленные последовательным десятикратным разведением раствором суммарной РНК из мозга неинфи-цированных мышей, подвергали ОТ и ПЦР с биотиыилировэнными праймерами. Полученные биотинмеченые амплифишровэнные фрагменты гибри-дизовали с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на лавсане. Параллельно был проведён анализ дот-гибридизацией на капроновых мембранах с а!:!Р-меченым вирусспецифическим ДНК-зондом. Результаты, представленные на рис.7 (нижние ряды), показывают, что минимальный предел детекции РНК ВКЭ в материалах от экспериментальных животных при гибридизации биогинилированного продукта ПЦР на аффинных лавсановых мембранах с последующей детекцией биотинового

Получен сотруоникали лаборатории Г.В. Шишкина ¡НИВХ СО РАН)

Рис.7. Сравнительные результат овух мешобоа аетекции РНК ВКЭ, выселенных аз 12 инйийиоуальныг кдеяа. Ах йетениия методол обратной дош-гибриОиэаиии на аффинной лавсановой жеябране. Б: Непекиия

12

яешодож ёот-гибрийизаиии на капроне с Р-вирусспецифическил ЦНК-зонбоя. Внизу привеоены результаты деяекции указанных количесяй РНК ВКЭ тажш Со<рьик соотбетсгабующили детобали. К - 1 лкг суджар-ноа РНК из лозга неинфицированных лышей

остатка с помощью конъюгата стрептавидин-пероксидаза сопоставим с чувствительностью выявления продукта ПЦР с помощью ^Р-ДНК-зонда, составляет около 0,1 пг (Юа-Ю4: молекул; вирусной РНК. Это свидетельствует о пригодности аффинных лавсановых мембран для нерадиоактивной детекции РНК ВКЭ методом обратной дот-гибридизации. Полученные результаты позволили перейти к испытанию разработанного метода на клинических образцах.

4. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТАВИДИНА.

Поскольку к началу данной работы отечественное производство стрептавидина отсутствовало, нашей задачей явилась разработка

простого способа его получения. Разработанный способ включает 3 стадии: I) выращивание культуры в^ер^тусез аухсПпИ на простой питательной среде (компоненты отечественного производства) в течение 72 ч ; 2) осаждение белков из культуральной жидкости 70%-ным сульфатом аммония и 8) очистку целевого продукта на Сефадексе 6-100. Зная, что молекулярная масса стрептавидина 60 кД, анализировали сорбенты с соответствующим пределом зксклюзии (табл.2).

Для установления места выхода стрептавидина с колонки в концентрат культуральной жидкости добавляли [^Шбиотин, хроматог-рафировали и во фракциях определяли ^¿ю и радиоактивный счет. На рис.8 представлен хроматографический профиль выделения стрептавидина на Сефадексе с-100. Видно, что фракции с максимальной концентрацией комплекса стрептавидин [3Н]биотин выходят в интервалах относительных объемов 1,4-1,9. Результаты выделения стрептавидина на различных сорбентах представлены в табл.2.

Таблица г. Результаты выделения стретавивина на различных сорбентах

Тип сорбента Предел экск-., люзии, кДа Ю Скорость тока, мл/ч Степени очистки Относительный объём элюции

Р-ЮО 5-100 14,3 12 1,1-1,5

Р-150 15-150 30,0 13 1,2-1,6

0-75 3-70 57,0 1? 1,2-1,7

0-100 4-150 73,0 18 1,4-1,9

0-150 5-400 48,0 15 1.7-2,3

*Изленение биотинсвязыващеа активности на лг белка в процессе гель-фильтрации

Показано, что наибольшую степень очистки обеспечивают сорбенты типа Сефадекса б. После хроматографического выделения объединяли фракции, содержащие стрептавидин. Препарат концентрировали упариванием либо лиофильно высушивали. Гомогенность продукта проверяли электрофорезом в ПААГ в присутствии ЭКЗ-Иа. Результаты представлены на рис.9. Как видно из рисунка, препараты гомогенны и имеют молекулярную массу 60 кД, что согласуется с литературными данными. Биотинсвязывающая активность полученных препаратов, опре-

Обьёмоднойфракции

имп мин

600

400

200

Г,13 1,40 1,92 2,17 2.43 2,70 2,90 3,20 3,48

Относительный объём элюции

"280 -

счет И биояина границы целевой фракции

Рис.в. Профиль хроматографического выделения стрептавийина на Сефаоексе с-юо. Колонка (8X450 мм). элюент - г мМ карбонат аммония (рН 8,9)

1 2 3 4 5

_ 67000

* 43000

Г 30000

20000

Рис.9. Электрофореграмма препаратов стрептавибина, выбеленных в аналитическом масштабе на Сефабексах 075 (Мг й-100 (2); 0-150 (3); препаративно на Сефавексе й-юо «), Порожка 5-даркбры жочекухярных масс. Электрофорез провезен й аенатурирущих условиях в ю% 31®-(ШГ

делённая по связыванию с [аН]биотином, составила не менее 1 ед/мг, что соответствует этому показателю для зарубежных аналогов Выход стрелтавидина составил 40-50 мг/л культуралъной жидкости Показано отсутствие примесей нуклеаз, что позволило использоват: его для выявления биотиншшровэнных НК-зондов.

5. ДЕТЕКЦИЯ РНК ВКЭ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ* 5.1. Детекция РНК ВКЭ в клещах

Разработанный метод апробирован для анализа 111 образцов РНК выделенной из клещей, снятых с людей после укуса. Параллельно полученные продукты ГЩР детектировали дот-гибридизацией на капрон с ^Р-виру с специфическим ДНК-зондом. На рис.7 представлены типичные результаты анализов, свидетельствующие о том, что иммобилизо ванные олигонуклеотидные зонды и вирусспецифический зонд длиной : 2000 нуклеотидов выявляют амплифицированные фрагменты, получены» на РНК разных изолятов из клещей, с равной эффективностью.

5.2. Детекция РНК ВКЭ в клинических образцах крови

С использованием разработанного метода проанализировано 3' образцов РНК из крови людей с клиническим диагнозом КЭ, подтверж денным результатами серологического исследования в реакции тормо жения гемааглютинации. РНК ВК5 выявлена в 93% образцов. При анали зе 50 препаратов суммарной РНК из крови людей, проживающих в неэн демичных по КЭ районах [г. Омск) показана высокая специфичност: разработанного метода - ни в одной из проб РНК ВКЭ не обнаружена.

*Работа выполнена совместно с сотруОниками Клинического центра Сi РАН

ВЫВОДЫ

Для детекши РНК вируса клетевого энцефалита в клинически образцах разработан нерадиоактивный высокоспецифичный и высокочув ствительный метод, основанный на обратной дот-гибридизаши н лавсане в сочетании с обратной транскрипцией и полимеразной цепно реакцией.

I. Впервые получены и испытаны в обратной дот-гибридизаши дл

¡ыявления амплифицированного фрагмента кДНК с РНК ВКЭ аффинные гембраны на основе отечественного полимерного материала - лавсан с :овалентно присоединёнными 20-звенными олигонуклеотидными зондами комплементарными "плюс" и "минус" цепям РНК ВКЭ). Аффинные мемб->анн обладали высокими ёмкостью (Ю'^моль/см^) и эффективностью •ибридизации с комплементарной последовательностью (не менее 50%).

Осуществлена обратная транскрипция РНК ВКЭ с использованием кратной транскриптазы из е.coli и фрагмента Клёнова в качестве >евертазы. Образующийся фрагмент кДНК (1427 нуклеотидных звеньев) шлифициирован с применением меченных биотином праймеров, локали-ованных в наиболее консервативной области генома (I3I8-I337 и 408-1427 с 5'-конца +РНК), кодируицей белок Е вирусной оболочки, йотинилированные олигонуклеотиды синтезированы с использованием одорастворимых реагентов (2-нитро-4-сульфо- и п-сульфотетра-торфениловых эфиров биотина), позволяющих получить требуемые оединения в водной среде в течение 1 ч с выходом не менее 90%. . На примере анализа РНК 28 штаммов ВКЭ и 10 различных флавивиру-ов установлены высокие специфичность и универсальность выбранного абора праймеров ( ■

. Для выявления биотиновых остатков посредством конъюгатов перок-идаза-стрептавидин разработана технология получения стрептавидина

высокой биотинсвязывающей активностью (не менее II ед/мг). роизводство стрептавидина внедрено в НИКТИ БАВ. . Показано, что чувствительность метода обратной дот-гибридизации остигает I0S-I04 молекул вирусной РНК при использовании в качест-е детектирующей системы конъюгата стрептавидин-пероксидаза и ромогенного субстрата. Это сопоставимо с чувствительностью анали-а амплифицированного фрагмента дот-гибридизацией с использованием 32Р]-ДНК-зонда.

Метод апробирован на клинических образцах: клещах (111 Зразцов), крови людей. Из 30 образцов крови людей с клиническим яагнозом КЭ, подтверждённым серологическими исследованиями. РНК Ю выявлена в 93$ образцов. Анализ 50 препаратов суммарной РНК из рови людей, проживающих в неэндемичннх по КЭ районах (г.Омск), эк аз ал высокую специфичность метода: ни в одной из проб РНК ВКЭ э обнаружена.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Авторское свидетельство СССР N. 1604861 (приоритет от 14.12.88). Способ получения стрептавидина. / Орлова Т.Н., Живоглядова Я.А., Загребельный С.Н., Старостина В.К., Селина А.В., Серов Г.Д.

2. Патент России N.I8080I4 (приоритет от 28.03.91). Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот на полимерной подложке. I Годовикова Т.е., Орлова Т.Н., Щеголь Н.Ю., Куликова

B.Ф., Венер Т.И., Сабуров В.В., Мчедлишвили Б.В., Зубов В.П.

3. Godovikova T.S., Orlova T.N., Zarytova V.P., Shamanin Y.A., Yorobjova N.V., Serdjukova N.A. , Eomash.cb.enko A.G. Direct non-radioactive detection of virus ENA by a novel RNA-PCR test. Nucl. Acids Res. 1991. V.19. Suppl. N.24. P.284.

4. Vener T.I., Turchinsky M.F., Zubov V.P., Godovikova T.S., Orlova T.N., Shamanin У.А., Kulikova Y.F. Development of nonradioactive methods of nucleic acids hybridization assay on polymer supports of a new type using poly- and oligonucleotide probes. Nucl. Acids Pes. 1991. V.19. Suppl. N.24. P.26?.

5. Годовикова Т.е., Орлова Т.Н., Добрикова Е.Ю., Шаманин В. А., Зарытова В.Ф., Воробьева Н.В., Сердпкова Н.А., Шаманина М.Ю., Петрусева И.О., Пиценко Н.Д. Высокочувствительная нерадиоактивная детекция вируса клещевого энцефалита // Биоорган, хим. 1994. Т.20.

C.1196-1205.

6. Заявка на изобретение N.94004932 (положит, решение о выдаче патента от 19.03.96.). Способ получения биотинмеченых олигонуклеотидов. / Годовикова Т.С., Орлова Т.Н., Абрамова Т.В., Куликова В.Ф., Залите И.К., Медведкин В.Н.