Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов"
На правах рукописи
Щербо Сергей Николаевич
I
Разработка и применение гибридизационных и ПЦР ' технологий для молекулярного анализа геномов
микроорганизмов
03.00.15 - Генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА 2005
Работа выполнена на кафедре биологии и общей генетики медицинского факультета Российского университета дружбы народов
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Иткес Александр Веньяминович. Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Тищенко Андрей Леонидович Ведущая организация:
Государственное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук
на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского
университета дружбы народов
по адресу: 117198, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.
Автореферат разослан «_»_2005 г.
доктор биологических наук доктор химических наук
Голимбет Вера Евгеньевна Потапов Виктор Кузьмич
Защита диссертации состоится «_»
2005 г. в_часов
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент
О.Б. Гигани
Л/УоьУУ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В ряду современных генетических технологий особое место занимают методы генодиагностики, среди которых выделяются гибридизационный анализ (ГА) нуклеиновых кислот (НК) и амплифи-кационные методы, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выяснение закономерностей организации геномов микроорганизмов необходимо как для понимания природы и течения инфекционных процессов, так и создания лекарств нового поколения, действие которых направлено на специфические, определяющие патогенность мишени. В мире отмечается не только рост урогенитапьных инфекций, микозов и других, но и возникновение новых, ранее не известных, что требует совершенствования подходов для быстрой разработки наборов реактивов для молекулярного анализа геномов (МАГ) микроорганизмов, прямого выявления возбудителя и правильной постановки диагноза. Разнообразие амплификационных подходов в генодиагностике делает актуальной задачу исследования оптимального состава компонентов наборов реагентов для МАГ с целью выявления микроорганизмов.
Существенным преимуществом молекулярно-генетических методов проведения анализа является возможность одновременной и независимой детекции нескольких различных нерадиоизотопных гибридизационных меток или проведение мультипраймерной ПЦР. Развитие методов ГА и амплификации НК потребовало поиска новых, эффективных и доступных нерадиоизотопных меток, способов их введения в ДНК-зонды и праймеры, а также систем детекции образовавшихся продуктов.
Для успешного применения и правильной интерпретации результатов молекулярно-генетических методов в клинической лабораторной диагностике решающее значение имеет разработка оптимальных схем анализа клинического материала.
Таким образом, выяснение возможностей, преимуществ и ограничений в практическом применении гибридизационных и ПЦР технологий и необходимость повышения их информативности в множественном МАГ микроорганизмов представляет актуальную проблему.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилась разработка, создание, внедрение и повышение информативности методов множественного
нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.
Задачи работы:
1.Создание способов модификации ДНК различными гаптенами, используя химические и фотохимические реакции, исследование спектрально-люминесцентных и фотохимических свойств предложенных биотинилирующих агентов, с целью повышения чувствительности ДНК-зондов в нерадиоизотопном гибридизационном анализе.
2. Разработка эффективных нерадиоизотопных методов детекции гибридизационных ДНК-зондов не уступающихся по чувствительности радиоизотопным, исследование механизмов образования межмолекулярных ассоциатов и коллоидных частиц красителей с целью внедрения указанных подходов в диагностическую практику.
3. Создание новых теоретических и практических подходов в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.
4. Внедрение оптимальных схем применения молекулярно-генети-ческих технологий на основе сравнительной оценки эффективности нерадиоизотопного гибридизационного анализа, ПЦР и других методов в клинической лабораторной диагностике. Разработка новых приемов пробоподготовки различных клинических образцов, содержащих грибы, микроорганизмы, бактерии, вирусы.
5. Исследование оптимального состава компонентов, унификация и стандартизация подхода к способу формирования наборов для оценки структурно-функционального состояния геномов микроорганизмов.
Научная новизна работы
1. Созданы новые способы модификации ДНК различными гаптенами с использованием химических и фотохимических реакций. Разработаны эффективные и чувствительные методы детекции нерадиоизотопных гибридизационных ДНК-зондов, сопоставимые с радиоизотопными, с целью внедрения указанных подходов в диагностическую практику.
2. Разработаны теоретические и практические подходы в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов
3. Выявлена роль нерадиоизотопного гибридизационного и ПЦР анализов в системе методов клинической лабораторной диагностики, определена их информативность и эффективность в молекулярном анализе геномов микроорганизмов, грибов и вирусов.
4. Впервые сформулирован унифицированный подход к способу создания наборов реагентов для молекулярного анализа геномов микроорганизмов на основе информационных технологий и формирования биотехнологической структуры.
Практическая значимость полученных результатов
1. Разработаны, созданы, утверждены и внедрены в практику здравоохранения России и Украины наборы реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей хламидия трахоматис, микоплазма гоминис, микоплазма гетниталиум, уреаплазма уреалитикум, нейссерия гонорея, вируса простого герпеса, цитомегаловируса, трихомонас вагиналис, кандида альбиканс, гарднерелла вагиналис, вируса папилломы человека высокого риска, вируса папилломы человека низкого риска, гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита гепатита О, гепатита ТТ\/, лактобацилл и гарднереллы, микобактерий туберкулезного комплекса, боррелии, вируса Эпштейн-Барра, генотипов вируса гепатита С, вируса герпеса 6 типа методом полимеразной цепной реакции, а также набор реагентов для выделения ДНК из биологического материала для последующего анализа методом ПЦР (ДНК-АМ-ускоренная пробоподготовка). Указанные наборы реагентов внедрены в отечественную медицинскую практику впервые.
2. Создан и сертифицирован (№ РОСС Яи. ИМ02.В07420) первый отечественный комплект лабораторных приборов для проведения ПЦР-анализа (программируемый термостат, термостат для температурной подготовки проб к проведению ПЦР-анализа, центрифуга-вортекс для осаждения и перемешивания биологических проб для ПЦР-анализа, прибор для электрофореза образцов ДНК при проведении ПЦР-анализа, столик с УФ-подсветкой для визуального контроля результатов гель-электрофореза при проведении ПЦР-анализа).
3. Материалы исследования стали основой методических рекомендаций МЗ РФ № 95-106 "Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции".
4. По материалам диссертационной работы в основное и постдипломное медицинское образование внедрены: учебное пособие «Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии», пособие для врачей «Папилломавирусная инфекция Клиника, диагностика, лечение».
Основные положения, выносимые на защиту.
Новый подход к применению нерадиоизотопных гибридизационных и ПЦР технологий для МАГ микроорганизмов, включая множественный нерадиоизотопный гибридизационный и мультипраймерный ПЦР методы, а также способ формирования наборов для МАГ, позволяет проводи (ь высокоспецифичную и высокочувствительную идентификацию различных возбудителей инфекционных заболеваний человека.
1. Способы модификации ДНК различными гаптенами с использованием химических и фотохимических реакций, с целью наиболее эффективного применения (повышения чувствительности ДНК-зондов и ускорения
проведения реакции) в нерадиоизотопном гибридизационом анализе геномов.
2. Чувствительные и эффективные методы детекции нерадиоизотоп-ных гибридизационных ДНК-зондов, сравнимые по чувствительности с радиоизотопными, с целью их внедрения в клиническую диагностическую практику.
3. Новые теоретические и практические подходы в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.
4. Оптимальные схемы применения молекулярно-генетических методов и результаты сравнительной оценки эффективности нерадиоизотопного гибридизационного, ПЦР-анализа в клинической лабораторной диагностике. Изучение наиболее рациональных подходов к пробоподготовке и проведению ПЦР для различных клинических образцов, содержащих грибы, микроорганизмы, бактерии, вирусы.
5. Оптимальный состав компонентов наборов реагентов для унификации и стандартизации подхода к способу формирования набора для оценки структурно-функционального состояния геномов микроорганизмов.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1 -ой, 2-ой и 3-ей Всероссийских научно-практических конференциях "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (1996, 1998, 2000 гг.) в г. Сочи и Москве, 20th Meeting of FEBS, Budapest (1990), IX Всесоюзном съезде дерматовенерологов (1991), 2-ой конференции "Геном человека", Переяславль-Залесский (1992), 4* International Symposium on Analytical Methods Systems and Stratequies in Academic and Industrial Biotechnology. Anabiotech 92, Amsterdam (1992), 3-ой конференции "Геном человека" Черноголовка (1993), III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва (1996), IV Российском съезде дерматологов и венерологов, Казань (1996), IV Национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва (1997), 1-й Всероссийской конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" Саратов (2000), 1-ом, 2-ом и 3-ем Всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва (2002, 2004, 2005 гг.), Конференции «Лабораторные исследования в хирургии, акушерстве и травматологии», Саратов (2002), 4-ой и 5-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" Москва (2002, 2004), Всесоюзной конференции дерматовенерологов Нижний Новгород (2004), 4-ой научной конференции «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии и косметологии» Москва (2004).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 43 печатных работы. В 1995 году утверждены Методические рекомендации № 95-106. Министерством здравоохранения и медицинской промышленности РФ "Диагностика хламидийной, микоплазменных и герпесвирусных инфекций методом цепной полимеразной реакции". Получено авторское свидетельство 4652161/30-13/026980/ (положительное решение от 25.08.1989) " Способ проведения гибридизационного анализа".
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста;
состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов. Иллюстрированный материал включает 15 таблиц и 55 рисунков. Список литературы содержит 385 библиографических источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
В главе 2 представлены материалы и методы, использованные в настоящей диссертационной работе.
Методы гибридизационного анализа: получение дигидразида янтарной кислоты, полимерного фотобиотина и проведение химической и фотохимической реакции с ДНК; ферментативное включение Вю-4-сШТР в плазм иду рВЯ322; получение комплекса биотинилированная щелочная фосфатаза-стрептавидин и конъюгата красителей линейного хинакридона и люминофора 59 с авидином, содержащего 80% и 20% красителя, и иммуноглобулинами 1§-0 кролика; мечение ДНК биотином, иммобилизация биотинилированной ДНК на нейлоновые фильтры и детекция ее конъюгатами красителя люминофор 59 с авидином; перенос биотинилированной ДНК с агарозного геля на нейлоновый фильтр и ее детекция конъюгатом красителя люминофор 59. Представлен метод изготовления полиакролеиновых латексов (ПАЛ) и получение конъюгатов ПАЛ со стрептавидином; спектрально-люминесцентные свойства ПАЛ, гибридизация и детекция образовавшегося гибрида ДНК на нейлоновой мембране латексным конъюгатом, модификация целлофановой пленки.
Представлены методы проведения ПЦР: пробоподготовка с использованием лизирующего буфера, муколитического реагента и ускоренная пробоподготовка для различных клинических образцов, в частности выделение ДНК для соскобов ногтевых пластинок и культур грибов. Описано определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов, полученных из клинических образцов, и методы получения положительных контрольных образцов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Разработка и оптимизация способов модификации ДНК биотином, производными платины, красителями, для проведения множественного нерадиоизотопного гибридизациоиного анализа нуклеиновых кислот.
Для получения гибридизационных зондов нами предложен двухстадийный химический метод модификации ДНК с использованием дигидразидов дикарбоновых кислот, как в присутствии бисульфита, так и без него, на примере дигидразида янтарной кислоты. Биотин в ДНК, модифицированные дигидразидом янтарной кислоты, вводили с помощью Ы-оксисукцинимидного эфира е -амидокапроилбиотина. Этим же методом в ДНК легко могут быть введены разнообразные гаптены, используемые в качестве нерадиоизотопных меток для гибридизационных зондов. Установлено, что оптимальная степень модификации составляет 1 - 4% от всех оснований, так как при более высоких степенях модификации понижается степень гибридизации и стабильность гибридных молекул.
Для повышения числа биотинилированных остатков в зонде при сохранении низкого процента модификации можно вводить кластер биотинов, используя полимерные молекулы, несущие несколько остатков биотина. Нами предложено использовать полимерный фотоактивируемый биотинилирующий агент - производное низкомолекулярного олиго-этиленимина (ОЭИ бОО, средняя молекулярная масса 600 Да), содержащее остатки е-амидокапроилбиотина и 4-азидосалициловой кислоты в качестве фотоактивируемой группы. Этот реагент позволяет за один акт фотохимической модификации вводить сразу несколько остатков биотина в ДНК. Полимерные фотобиотины на основе ОЭИ(бОО) (ПФБ) были получены при действии на указанный реагент смеси ацилирующих агентов — Ы-оксисукцинимидных эфиров е-амидокапроилбиотина и 4-азидосалициловой кислоты в различных соотношениях.
Проведено сравнение в различных экспериментальных условиях спектральных и фотохимических свойства синтезированного нами ПФБ и (4-азидо-2-нитрофенил) - (3-биотиниламинопропил) - метил -1,3-пропанди-амина (фотобиотин Фестера - ФБ ) фирмы «С1оп1есЬ» (США), который является наиболее широко применяемым коммерческим препаратом. Исследованы структурные изменения, происходящие при фотооблучении (X =360 нм, 40 мин) ФБ и ПФБ, методом ядерного магнитного резонанса. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что для ПФБ интегральная интенсивность полосы поглощения групп, а следовательно и содержание групп, с которыми происходят фотохимические превращения под воздействием света, не превышает 10—20%.
Проведенный нами нерадиоизотопный гибридизационный анализ (НГА) с использованием фотобиотинилированных ДНК фага М-13 показал, что
чувствительность анализа при применении ФБ и ПФБ оказывается одинаковой и составляет 1 пг нанесенной на нейлоновый фильтр ДНК М-13 М7. Однако время облучения пробы оказалось в 2 раза меньше при использовании для мечения ПФБ. Для ДНК плазмиды рВЮ22 было проведено сравнение двух биотинилированных зондов: полученного с помощью ПФБ и изготовленного путем ферментативного включения в ДНК Шо-4-<1иТР, которые были использованы в Саузерн-блот-гибридизации с ДНК рВЯ322, гидролизованной эндонуклеазой рестрикции СМ, в качестве ДНК-мишени. Результаты НГА свидетельствуют о том, что оба зонда одинаково эффективны и чувствительность анализа составляет около 1 пг.
Предложено использовать некоторые комплексы двухвалентной платины: транс-диаминодихлорплатина (тДДП), цис-диаминодихлор-платина (цДДП), диэтилентриаминохлорплатина (диенП) в качестве меток-гаптенов в НГА нуклеиновых кислот. Оказалось, что чувствительность метода при применении цДДП составляет около 1 пг в варианте дот-гибридизации, что ниже, чем в методе НГА с использованием тДДП Тем не менее, как было показано нами, метод с использованием цДЦП дает хорошие результаты в скрининге бактериальных колоний и фаговых бляшек. Для исключения возможности внутрицепочечного и межцепочечного взаимодействий указанных производных с ДНК была использована диэтилентриаминохлорплатина (диенП). Сравнение методов НГА с использованием тДДП, цДДП и диенП в дот-гибридизации показало, что зонды, модифицированные диенП наиболее эффективны, при этом чувствительность метода составляет около 10 фг. Было выяснено, что при 10% модификации ДНК как и в случае с тДДП можно получить наиболее высокоэффективные зонды.
Проведенная работа по разработке нескольких нерадиоизотопных меток позволила предложить и внедрить метод множественного НГА, в котором могут использоваться одновременно два или три зонда, меченых дегоксигенином, тДДП и биотином. Для демонстрации возможности множественной гибридизации использовались три различных зонда с заведомо неперекрывающимися последовательностями: рВЯ322, ДНК фага X, ДНК фага М13мр18. Гидролизаты этих ДНК ферментами рестрикции (Рви-^аИ, Нт(Ш1 и ЕсоШ соответственно) служили мишенями в Саузерн-блот гибридизации, а зонды модифицировали лигоксигенином ( М13мр18), тДДП ( ДНК фага А.) и биотином ( рВЯ322). Зонды вводили в гибридизационную смесь одновременно. Для детекции использовали коньюгаты двух ферментов - щелочной фосфатазы и пероксидазы хрена. Детекцию каждой метки осуществляли химико-ферментативными методами последовательно, так как каждый фермент работает в определенных условиях.
Таким образом, предложены новые способы модификации ДНК дигидразидом янтарной кислоты, комплексными соединениями платины и
синтезирован новый биотинилирующий реагент - полифотобиотин для получения гибридизационных зондов. Исследованы спектральные и фотохимические свойства ПФБ с целью наиболее эффективного использования в НГА нуклеиновых кислот.
Нами разработаны эффективные и чувствительные методы детекции нерадиоизотопных гибридизационных ДНК-зондов с применением коллоидных частиц и полимерных маркеров. Использование красителей ввиду разнообразия их физико-химических (в частности флуоресцентных) свойств дает при наличии соответствующих методов введения гаптенов уникальные возможности для множественного НГА, однако применение одиночных молекул неэффективно ввиду наличия неспецифического фона. Поэтому для увеличения чувствительности анализа необходимо было приготовить стабильные коллоидные или полимерные системы, включающие достаточное количество молекул красителя, что предполагает необходимость исследовать механизмы образования межмолекулярных ассоциатов и коллоидных частиц, а также разработать приемы их стабилизации. Повышение чувствительности анализа достигается тем, что: во-первых, частицы получаемые предлагаемым методом и используемые для образования конъюгатов путем иммобилизации лиганд -специфичных белков, содержат 20 - 80% масс, флуоресцентного красителя (до миллиона молекул красителя) и во-вторых, после связывания конъюга-та, фильтр можно помещать в пары органического растворителя (диоксана, диметилформамида) или использовать разные длины волн возбуждения флуоресценции и светофильтры. В настоящей работе использовали линейный хинакридон и люминофор 59 (1-фенил-5-(п-метоксифенил)-3-[ 1,8-нафтоилен-1 ',2'-бензимидазолил-4] пиразолин-Дг), обладающие необходимыми физико-химическими свойствами.
Таким образом, предложен метод множественного НГА нуклеиновых кислот, основанный на одновременном использовании двух или более гибридизационнных зондов, каждый из которых несет свою нерадиоизотопную метку, а также коллоидных частиц флуоресцентных красителей и их конъюгатов с различными белками.
Нами впервые предложен новый способ проведения НГА нуклеиновых кислот - гибридизационный анализ с использованием латексных часгиц (ЛГА), содержащих флуоресцентный краситель. Применение полиакролеиновых латексов (ПАЛ) для НГА требует решения ряда задач: оптимизации размеров латексных частиц при их синтезе, поиска флуоресцентных красителей, обладающих лучшими спектрально-люминесцентными характеристиками и получения стабильного конъюгата ПАЛ со стрегггавидином (СА). Экспериментально подобран оптимальный размер ПАЛ частиц (1,5-2 мкм.) для гибридизации на нейлоновых мембранах.
В связи с необходимостью получения максимальной чувствительности в НГА нами проведено систематическое исследование
спектрально-люминесцентных свойств ПАЛ, содержащих флуоресцентные красители акридиновый оранжевый, родамин Ж, флуоресцеинизотиоци-анат и установлено, что введение указанных красителей в ПАЛ, приводит к существенному изменению их спектрально-люминесцентных характеристик по сравнению с водными растворами. Результаты анализа дали возможность предположить, что с увеличением содержания красителя в ПАЛ происходит развитие процессов межмолекулярного взаимодействия. Причем для родамина Ж спектральные изменения качественно сходны с теми, которые наблюдаются в водных растворах при ассоциации молекул. Таким образом, нами были экспериментально установлены условия получения и хранения оптимальных по размеру и спектрально-люминесцентным характеристикам, высокоактивных, механически и химически устойчивых, содержащих флуоресцирующий краситель родамин Ж или пиронин Ж и несущие на своей поверхности молекулы СА (рис. 1).
При сравнении чувствительности ЛГА для зонда меченного биотином с разной длиной спейсерной группы показано, что гибридизационный сигнал для Шо-4-<ШТР не детектировался, в отличие от зонда меченного Вю-11 -¿ЦТР, где минимально обнаруживаемое количество ДНК составляло 1,6 пг. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что для осуществления связывания биотиновых остатков дуплекса, иммобилизованного на одном полимерном носителе (мембране) с СА, иммобилизованном на другом полимерном носителе (ПАЛ), необходима определенная пространственная ориентация и расстояние между лигандом и биотином за счет удлиненной спейсерной группы, что обуславливает хорошее связывание их со СА.
После гибридизации иммобилизованной на мембране НК-мишени с ДНК-зондом, несущим метку - биотин, детекция гибридов осуществляется с помощью коньюгата ПАЛ-СА визуально в видимом или УФ-свете. Для проведения гибридизации в качестве модельной тест-системы использовали ДНК фага X, иммобилизованную на нейлоновом фильтре в количествах от 1 нг до 1,6 пг (рис.2). Иммобилизованную ДНК гибридизовали биотинилированным зондом — комплементарным фрагментом ДНК фага X. Биотин вводили реакцией бисульфит-катализируемого трансаминирования по цитозиновым остаткам с последующей обработкой продуктов реакции производным 1М-оксисукцинимидного эфира биотина. После гибридизации НК-мишени с ДНК-зондом биотинилированный гибрид проявляли суспензией латексного коньюгата ПАЛ-СА, затем фильтр отмывали, рассматривали и фотографировали в УФ-свете (X. =365 нм).
Рис. 1. Опосредованная детекция биотинилированного гибрида с помощью латексного конъюгата ПАЛ-стрептавидин.
Рис. 2. Дот-гибридизация ДНК фага К иммобилизованной на нейлоновом фильтре (А) и ПЭИ-целлофане (Б). Проявление с помощью конъюгата ПАЛ-стрептавидин. Фотография в УФ-свете (365 нм). А: 1 — контрольная ДНК из спермы лосося (10 нг), 2-6 - ДНК фага X. 1 нг, 200 пг, 40, 8, 1,6 пг, Б: 8 — контрольная ДНК из спермы лосося (10 нг), 2-7 - ДНК фага X: 1 иг, 200 пг, 40, 8,1,6 и 0,3 пг соответственно.
На фотографии фильтра, на котором проводили дот-гибридизацию ДНК фага X (рис. 2 ), в местах нанесения ДНК в УФ- свете хорошо видны флуоресцирующие пятна и отсутствие неспецифического связывания латексного конъюгата с ДНК спермы лосося. Нами использовались ПАЛ размером 2 мкм, содержащие пиронин Ж, так как применение латексных частиц меньшего диаметра (0,4 мкм) приводило к существенной потери чувствительности анализа: 1,25 нг в УФ свете. После ЛГА в местах нанесения ДНК в УФ- свете хорошо видны флуоресцирующие пятна, а чувствительность анализа для нейлонового фильтра 1,6 пг, а для модифицированного полиэтиленимином целлофана (ПЭИ-целлофана) 0,3 пг ДНК. В видимом свете окрашенные пятна в местах нанесения ДНК обнаруживаются вплоть до 200 пг ДНК. Использование конъюгата ПАЛ-СА при концентрации выше, чем 0,001%, не давало повышения чувствительности анализа и приводило к усилению фона.
Полученные нами результаты показывают, что использование флуоресцентных латексных частиц, применяющихся для детекции
биотинилированных гибридов на синтетических мембранах, позволило повысить чувствительность ГА нуклеиновых кислот на 3-4 порядка в сравнении с методом, применяющим флуоресцентно- меченные зонды, т.к. полимерная частица содержит 105 молекул флуорофора. Уменьшение размеров пор мембраны также привело к повышению на порядок чувствительности ЛГА, поскольку большая часть ДНК оказывается адсорбированной на поверхности мембраны, а не в ее порах, как в случае нейлоновой мембраны.
Для оценки чувствительности разработанного нами метода JITA было проведено сравнение с двумя другими известными методами НГА: применение конъюгатов коллоидного золота со CA с последующим усилением серебром дает минимально детектируемое количество ДНК фага X. при проведении гибридизации на нейлоне 8 пг, в то время как при использовании латексных конъюгатов со стрептавидином - 1,6 пг при тех же условиях проведения анализа. Сходным по чувствительности, однако более трудоемким и продолжительным по времени (90 минут) проведения анализа, является двухстадийный метод НГА, использующий аналогичные экспериментальные условия (химически биотинилированные ДНК-зонды и дот-гибридизацию на нейлоновом фильтре) с ферментативным проявлением гибридов конъюгатом щелочной фосфатазы со CA. Предложенная методика с использованием ПАЛ является одностадийным и быстрым процессом (30 минут), отличается простотой в выполнении, т.к. не требует специальной аппаратуры для визуализации гибридизационного сигнала, а в анализе используются стандартные мембраны.
Разработка и совершенствование способов пробоподготовки. условий проведения ПЦР и мультипраймерной ПЦР реакции.
Проведена сравнительная оценка эффективности способов выделения НК из клинического материала. Быстрым в постановке оказался метод выделения ДНК с применением лизирующего буфера, который используется нами в большинстве зарегистрированных ПЦР наборов для диагностики урогенитальных инфекций. Нами разработаны наборы "ИоноМикс" и ДНК-АМ-ускоренная пробоподготовка ( рекомендован МЗ РФ к применению в медицинской практике, ТУ 9398-012-56751480-2004, НПФ "ГЕНТЕХ") на основе Chelex-100 и протеиназы К в первом и смеси ионообменников и протеолитических ферментов во втором случае, которые обеспечивают практически равную эффективность выделения ДНК при работе с соскобами уретры и цервикального канала.
Другие требования предъявляются к набору пробоподготовки при выделении ДНК из мокроты, что необходимо при анализе клинических образцов больных неспецифическими пневмониями и туберкулезом. В связи с этим в состав набора реагентов для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
bovis) в мокроте человека методом ПЦР (Тубам) (ТУ 9398-011-567514802004, НПФ «Гентех») включен указанный набор реагентов для пробоподготовки. Результаты испытания набора пробоподготовки представлены в таблице 1. Всего было обследовано 99 пациентов противотуберкулезного диспансера г. Коломны, из них 79 человек, находившихся на стационарном и амбулаторном лечении с диагнозом туберкулез легких, 14 человек, проходивших обследование на туберкулез в данном диспансере и 6 человек клинически излеченных от туберкулеза легких. Образцы пациентов (мокрота) исследовались тремя методами: микроскопическим, культуральным и методом ПЦР с использованием набора ТубАм.
Таблица 1.
Результаты обследования больных туберкулезом легких методами микроскопии бактериологического посева и ПЦР. __
Всего Диагноз К-во Положит. Положит. Положит.
микроскопия бак. посев ПЦР
Туберкулез легких 79 20(25%) 23(29%) 44(56%)
Клинически
99 излеченный туберкулез легких 6 0 0 0
Обследование 14 0 0 1 (7 %)
Таким образом, проведенное исследование показало высокую эффективность наборов для выделения ДНК из мокроты и ТубАм для выявления бактерий туберкулезного комплекса при сравнении с результатами микроскопического и бактериологического методов.
Мокрота, как и другие биологические образцы содержат как общие, так и специфические ингибиторы ПЦР, которые согласно ряду исследований в 1-3% биологических проб вызывают ложноотрицательный результат анализа. В связи с этим необходимо вводить в реакцию специальные конструкции универсального внутреннего контроля. В настоящей работе разработаны несколько вариантов такого контроля для разных наборов реагентов для ПЦР-анализа с различной величиной амплифицируемого фрагмента.
На основе МАГ микроорганизмов и вирусов были выбраны нуклеотидные последовательности фрагментов геномов и разработаны наборы реагентов для выявления возбудителей некоторых урогенитальных инфекций. Анализ имеющихся в базе данных ОепВапк нуклеотидных последовательностей генов хламидий позволил нам выделить набор генетических локусов, изученных у большинства представителей семейства: гены, кодирующие 168 и 238рРНК, гены ОМР1, ОМР2 и Кёо-трансферазы, а также спейсерный участок между генами, кодирующими 16Б и 238рРНК. В качестве оптимальной мишени для разработки метода видовой дифференциации хламидий может служить ген ОМР 2 (степень
гомологии между различными видами семества Chlamydiaceae колеблется в пределах от 46,3 до 85,9%), размером от 1643 до 1676 п.н. у разных видов хламидий, кодирующий цистеин-богатый белок размером 60 кДа, локализованный в наружной мембране элементарных телец хламидий. К сожалению, ни одна из выбранных пар праймеров не дала стабильных удовлетворительных результатов на клиническом материале из-за наличия неспецифических сигналов.
Необходимую для ПЦР диагностики Chlamydia trachomatis высокую чувствительность и специфичность можно получить с использованием праймеров на мультикопийную критическую плазмиду (10-20 копий на геном) и ген 16S р РНК (20 копий на геном). Поэтому для С. trachomatis первые варианты праймеров были выбраны и синтезированы нами на мультикопийную криптическую плазмиду, малоразмерная ДНК которой кроме того, более эффективно связывается сорбентами при выделении. В 1995 г. впервые был зарегистрирован МЗ РФ (ТУ 9398-404-29032954-96) высокочувствительный и высокоспецифичный отечественный набор реагентов для обнаружения ДНК С. trachomatis в клиническом материале методом ПЦР. Проведенная клиническая апробация показала более высокую чувствительность и специфичность ПЦР по сравнению с широко применяемым иммунофлуоресцентным методом.
Проведенный нами молекулярный анализ генома Mycoplasma hominis показал, что наиболее эффективной мишенью для амплификации является фрагмент гена фактора элонгации Tu и был создан диагностический набор реагентов (ТУ 9398-403-29032954-96). В качестве положительного контрольного образца ДНК взят образец, выделенный фенольной экстракцией из штамма М. hominis № 23114 полученной из АТСС (США). Впервые нами была выполнена работа по созданию отечественного набора реагентов для определения Mycoplasma genitalium в клиническом материале методом ПЦР, которая после клинической апробации была завершена регистрацией в МЗ РФ в 1998 г. (НПФ "ГЕНТЕХ", ТУ 9398-404-29032954-2003). В качестве положительного контрольного образеца была взята ДНК М. genitalium, выделенная фенольной экстракцией из штамма № 33530 полученной из АТСС (США). Выбранные праймеры фланкировали участок ДНК, специфичный для фрагмента гена белка адгезии MgPa М. genitalium. Сложность в решении указанной задачи состояла в том, что на момент начала разработки не существовало других клинико-диагностических подходов и коммерческих наборов для выявления данного условно-патогенного возбудителя, а следовательно, возможности провести сравнительный анализ с другими методами. Поэтому совместно с группой автоматического секвинирования ДНК Института молекулярной биологии им. В.А. Энгелыгардта РАН был проведен сиквенс ПЦР-продуктов реакции с выбранными праймерами для 5 образцов эпителиальных соскобов. Секвинирования ПЦР-продуктов показало полное соответствие последовательностей амплифицированных
ДНК клинических образцов гену белка адгезии MgPa М. genitalium. Единичные замены внутри гена (процент гомологии от 96 до 99%) обусловлены различиями между штаммами возбудителя.
На основе МАГ Ureaplasma urealiticum было установлено, что наиболее перспективной мишенью для амплификации является ген уреазы. После выбора праймеров нами был создан набор реагентов для определения U. urealiticum в клиническом материале методом ПЦР, проведена клиническая апробация и регистрация в МЗ РФ ( ТУ 9398-40456751480-2003, НПФ "ГЕНТЕХ"). В качестве положительного контрольного образца была взята ДНК U. urealiticum, выделенная фенольной экстракцией из штамма № 27618 полученного из АТСС (США). Известны различия в строении геномов представителей двух биоваров U. urealiticum Parvo и Т960, что дало возможность поднять их статус до видового - Ureaplasma parvum и Ureaplasma urealyticum и создать специфичные праймеры на каждый из них. Нами создана мультипраймерная диагностическая система ПЦР-анализа и на клиническом материале выявлена распространенность (83% Ureaplasma parvum и 17% Ureaplasma urealyticum ) указанных биоваров .
В связи с наличием в биологических образцах большого количество разнообразных возбудителей инфекционных заболеваний, необходимостью одновременного получения информации в группах, видах, штаммах микроорганизмов актуальной представляется разработка теоретических и практических подходов к множественному НГА и мультипраймерной ПЦР. Рассмотрены наиболее важные факторы, определяющие протекание мультипраймернойной ПЦР, в частности температура отжига и концентрация праймеров. Выбор структуры праймеров для мультипраймерной системы усложняется с увеличением количества пар праймеров, в частности в связи с необходимостью подбора размеров амплифицируемых фрагментов Наиболее важной проблемой при этом является несовместимость пар праймеров, которую можно избежать, если учитывать последовательность концевого триплета. Чрезвычайно важным при выборе праймеров является подбор нуклеотидов на 3' конце, причем, чем ближе нуклеотид к концу тем больше влияние он оказывает на специфичность. Необходимо избегать включение Г и Ц оснований на 3'-конец, что повышает вероятность неспецифического отжига праймеров из-за высокой прочности соответствующих водородных связей. На 5' конце нуклеотидные замены влияют не столько на специфичность праймера, сколько на температуру его отжига.
С использованием указанных теоретических подходов нами созданы мультипраймерные диагностические системы для определения от двух до пяти возбудителей урогенитальных инфекций (таблица 2).
Таблица 2
Мультипраймерные наборы для ПЦР-анализа._
№ п/п Количество пар праймеров в ПЦР Название возбудителей, размер амплифицируемого фрагмента генома (п.н.)
1 2 Хламидия трахоматис, 316 Уреаплазма уреалитикум, 466
2 2 Микоплазма гениталиум, 281 Микоплазма гоминис, 374
3 2 Трихомонас вагиналис, 320 Гонококк, 591
4 2 ВПГ 1 и 2, 220 ЦМВ, 340
5 2 Кандида апьбиканс, 372 Гарднерелла вагиналис, 820
6 2 ВПЧ 18, 300 ВПЧ 16, 538
7 3 ВПГ 1 и 2, 220 ЦМВ, 340 ЭБВ,610
8 3 хламидия трахоматис, 200 микоплазма гоминис, 374 уреаплазма уреалитикум, 466
9 4 хламидия трахоматис, 200 микоплазма гениталиум, 281 микоплазма гоминис, 374 уреаплазма уреалитикум, 466
10 5 хламидия трахоматис, 200 микоплазма гениталиум, 281 микоплазма гоминис, 374 уреаплазма уреалитикум, 466 уреаплазма Г 960, 666
С использованием мультипраймерных наборов реагентов для идентификации ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) 16 и 18 тииов (рис. Зв), а также ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска типов 16, 18, 31, 33, 35, 45, 56 (ПавАм, ТУ 9398-441-56751480-02, НПФ «ГЕНТЕХ») и ДНК ВПЧ низкого онкогенного риска типов 6, 11, 42, 43, 44 (ПанАм, ТУ 9398442-56751480-02, НПФ «ГЕНТЕХ») методом ПЦР в соскобах слизистой урогенитального тракта нами проведено исследование распространенности различных типов ВПЧ. Также нами разработаны наборы для идентификации ДНК еще 15 типов онкогенных папиллом, входящих в группу высокого риска.
Всего из 218 образцов урогенитальных соскобов пациентов ВПЧ высокого онкогенного риска был обнаружен в 60 образцах (27,5%), ВПЧ (16+18) - в 55 образцах (25,2%), а в 26 образцах (11,9%) найден ВПЧ низкого риска. Для 60 образцов, в которых был обнаружен ВПЧ высокого риска нами проведено типирование папиллом. Папиллому 16 типа детектировали в 35 образцах (58%), 18 типа — в 27 образцах (45%), 31 типа - в 12 образцах (20%), 51 типа - в 11 образцах (18,3%), 52 типа - в 8 образцах (13,3%), 33 типа - в 5 образцах (8,3%), 35 типа - в 5 образцах (8,3%), 39 типа - в 5 образцах (8,3%), 55 типа - в 5 образцах (8,3%), 45 типа - в 3 образцах (5%), 58 типа - в 2 образцах (3,3%). В данных образцах не было обнаружено ВПЧ 59,68,73,83 типов. На рис 3 представлены результаты электрофореза в агарозном геле для клинических образцов:
а) б)
ВПЧ н.р (типы 6,11,42,43,44) ВПЧ в.р. (типы 16,1831,33,35,45,56)
+ -1 2345678» + - I 23456789
Рис. 3. Электрофореграммы ПЦР - анализа клинических образцов (соскоб из цервикального канала) для выявления ДНК ВПЧ: а) низкого онкогенного риска; б) высокого онкогенного риска; в) высокого онкогенного риска (типы 16 и 18).
Таким образом, разработаны и апробированы новые подходы к подготовке проб биологического материала для клинического молекулярно-генстического анализа, оптимизированы условия проведения ПЦР реакции для ряда систем диагностики инфекционных агентов. Показаны преимущества и недостатки использования различных участков генома ряда возбудителей урогенитальных заболеваний для выбора олигонуклеотидных праймеров. На примере микоплазма гениталиум показана возможность быстрого создания наборов реактивов для детекции инфекционных агентов, не имеющих других диагностических методов. На основании теоретических и экспериментальных разработок созданы основы для практического использования методов мультипраймерной ПЦР. Созданы и испытаны на клиническом материале ряд молекулярно-генетических систем для диагностики до пяти инфекционных агентов одновременно в диагностике различных урогенитальных инфекций и их типов.
Сравнительное изучение метода ПЦР и других диагностически! подходов к анализу различных биологических образцов.
Настоящий раздел диссертационной работы посвящен выявлению места и роли молекулярно-генетических методов и их эффективности по сравнению с известными методами клинической лабораторной диагностики. Нами предложен метод ДНК-диагностики возбудителей инфекционных заболеваний в образцах клинического материала, основанный на детекции специфических нуклеотидных последовательностей в ДНК, выделенных из биологических образцов, методом НГА с одновременным контролем общего содержания ДНК в каждой пробе. Для такого контроля предлагается простой полуколичественный иммуноферментный тест с помощью антител к денатурированной ДНК. В качестве метки для зонда использовали диенП, а для детекции ДНК-гибридов - аффинные антитела к ДНК-диенП и антитела к кроличьему иммуноглобулину, коньюгированные с фосфатазой. Показано, что результаты НГА для хламидия трахоматис и уреплазма уреалитикум хорошо совпадают с данными ПЦР-диагностики. Предлагаемый метод прост в исполнении, экономичен, пригоден для массовых в том числе скриннинговых иследований.
Проведен сравнительный анализ эффективности быстрого культурального и ПЦР методов при исследовании цельной крови новорожденных детей на присутствие ВПГ 1 и 2 типов. Апробированы две системы ПЦР-детекции ВПГ на основе последовательностей ДНК гликопротеинов D и В, клинические испытания которых показали их высокую чувствительность. Однако при испытании тест-системы на основе гликопротеина D было выявлено образование неспецифических продуктов амплификации в отрицательных пробах (вероятно, за счет ГЦ-богатого состава праймеров). Клинические испытания системы, основанной на амплификации участка гена гликопротеина В, показали отсутствие неспецифической амплификации и достаточно высокую чувствительность. Сравнение быстрого культурального метода и ПЦР, проведенной в стандартных условиях и концентрировании ДНК на стадии пробоподготовки, показали хорошее совпадение результатов (76,5%) при выявлении ВПГ 1 и 2 типов. В целом, указанное исследование продемонстрировало эффективность использования двух и более методов лабораторной диагностики инфекции, вызванной ВПГ. Ранее указанный быстрый культуральный метод применен в сочетании с моноклональными антителами и ПЦР другими авторами для диагностики ЦМВ.
Нами разработан, апробирован и внедрен в клиническую практику набор реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей цитомегаловируса (Cytomegalovirus) (ЦМВАм) методом ПЦР в биологическом материале (в соскобах у мужчин из уретры, у женщин из
уретры и цервикального канала, у детей из зева или в моче) (ТУ 9398-00156751480-2003). В качестве положительного контрольного образца использовали ДНК ЦМВ. Клинические испытания набора ЦМВАм показали его высокую эффективность в диагностике, в частности в неонатологии (образцы слюны) и педиатрии. Сравнение результатов НГА с использованием биотинилированных зондов и ПЦР для 78 клинических образцов (моча детей и соскобы цервикального эпителия) на присутствие ЦМВ показал их близкую чувствительность: 7 и 9 положительных ответов соответственно. Показана возможность использования молекулярно-генетических методов в диагностике бактериального вагиноза и кандидоза: нами разработан и внедрен в практику набор реагентов ГарАм предназначенный для качественного определения ДНК гарднереллы вагиналис (G. vaginalis) в биологическом материале (соскобы у мужчин из уретры, у женщин из уретры, цервикального канала и заднего свода влагалища) методом ПЦР (ТУ 9398-433-29032954-02). Для клинических испытаний набора реагентов для выявления ДНК гарднерелла вагиналис (ГарАм) и кандида альбиканс (КанАм) методом ПЦР у 40 женщин были взяты соскобы слизистой вагинального тракта, которые были исследованы методами микроскопии и культивирования. По результатам микробиологических исследований из 40 соскобов слизистой было обнаружено 10 положительных и 30 отрицательных проб на гарднереллу вагиналис, что сравнимо с результатами при использованием метода ПЦР 13 положительных и 27 отрицательных проб.
Чрезвычайно важным для оценки микрофлоры влагалища является не только количественное содержание гарднереллы вагиналис, но и наличие лактобацилл и их соотношение. В результате проведения экспериментальных исследований создан первый мультипраймерный набор реагентов для определения ДНК лактобацилл (Lactobacillus spp.) и гарднереллы (Gardnerella vaginalis) методом ПЦР (ТУ 9398-013-567514802004, НПФ «ГЕНТЕХ») (ЛактАм), предназначенный для определения соотношения ДНК указанных микроорганизмов в отделяемом влагалища у женщин, и который может быть использован в клинической диагностике и оценке эффективности терапии бактериального вагиноза. Положительный контроль в данном наборе (ДНК рекомбинантной плазмиды pGEM с клонированным фрагментом лактобацилл или гарднереллы) соответствует 107 копий/мл для лактобацилл и 106 копий/мл для G vaginalis, что является нижней границей нормы для лактобацилл и верхней - для G vaginalis. Интенсивность ответов в клинических образцах сравнивается с интенсивностью свечения полосы контроля, соответствующей фрагменту генома Lactobacillus spp. (участка гена 16S рибосомальной РНК) размером 558 п.н. и с интенсивностью свечения контрольной полосы, соответствующей фрагменту генома G.vaginalis (гена белка теплового шока) размером 820 п.н.
На рис. 4 представлены результаты полученные на клиническом материале с использованием набора ЛактАм.
клинические образцы + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
G. vaginalis 10* копий/мл Lactobacillus spp. » 107 комийУмл^^Ш t
Рис 4. Диагностический мультипраймерный набор для определения нуклеотидных последовательностей Lactobacillus spp.(558 п.н.) и G. vaginalis (820 п.н.).+ - положительный контроль - верхняя полоса соответствует фрагменту G. vaginalis (размер 820 п.н.) в количестве 106 копий/мл; нижняя - фрагменту Lactobacillus spp. (размер 558 п.н.) в количестве 107 копий/мл., - - отрицательный контроль,1-19 - клинические образцы (отделяемое влагалища).
В пробах с 1-7, 10, 12, 18 - интенсивность свечения фрагмента Lactobacillus spp. в норме или выше нормы, при этом количество G. vaginalis в норме. Это значит, что состояние микрофлоры данных пациентов находится в пределах нормы. Ни у кого из них не было выявлено хламидии, микоплазмы гоминис и уреаплазмы. В образцах 8, 11, 13, 17 видна картина выраженного бактериального вагиноза: количество лактобацилл ниже нормы, количество G. vaginalis - выше нормы. В пробах 15 и 16 количество лактобацилл и G. vaginalis находится на грани нормы. В пробах 9, 14, 19 при нормальном количестве лактобацилл количество G. vaginalis значительно превышает норму. Все клинические образцы были исследованы бактериологическим методом, результаты которого полностью совпали с ПЦР анализом.
Для разработка набора реактивов для выявления ДНК трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis) проведен МАГ, показавший, что внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2) генов рДНК представляют собой удобную мишень для ДНК-диагностики, поскольку этот участок относится к повторяющимся последовательностям генома, что обеспечивает большую чувствительность системы. Проведенный в Центральном научно-исследовательском кожно-венерологическом институте анализ результатов различных методов диагностики Т. vaginalis, включая ПЦР, на разработанном нами наборе реагентов показал, что чаще всего возбудитель трихомониаза выявляется при бактериоскопии (микроскопии)-14%, а также одновременно при микроскопии и ПЦР-13%. При локализации трихомонас вагиналис в уретре и во влагалище, наиболее высокий процент положительных результатов получен при микроскопии и
ПЦР (20% и 16% соответственно), в цервикальном канале при микроскопии - 31%, а также микроскопии препаратов, включая темнопольную и ПЦР-анализ -16% наблюдений.
Учитывая актуальность одновременной детекции трихомонады и гонококка нами создан диагностический мультипраймерный набор для определения нуклеотидных последовательностей N. gonorrhoeae (591 п.н.) и Т. vaginalis (320 п.н.) методом ПЦР.
ПК OK 1 2
4 5
7 8 9 10
УВК-4 (805 п.н.)
N. gonorrhoeae(591 п.н/ Т. vaginalis (320 п.н.)
Рис. 5. Исследование клинических образцов с применением диагностического мультипраймерного набора: ПК - положительный контроль; ОК- отрицательный контроль; универсальный внутренний контроль УВК-4; 3 - положительный результат на Т. vaginalis (320 п.н.); 6, 9 - положительный результат на N. gonorrhoeae (591 п.н.); отрицательные результат для образцов 1, 2,4, 5, 7,8, 10.
На основе МАГ некоторых видов грибов разработаны наборы реагентов для выявления ДНК методом ПЦР. Проведено сравнение трех пар праймеров для детекции широкого спектра грибных патогенов и выбрана универсальная система, позволяющая выявлять ДНК более 78 штаммов 25 видов патогенных грибов. Проведенные нами клинические испытания указывают на эффективность использования этих систем для экспресс-диагностики системных микозов у новорожденных и перспективность их применения для детекции микозов у других групп иммунодефицитных больных, что хорошо подтверждается результатами культурального метода. Высокая чувствительность систем позволяет выявлять возбудителей микозов в количестве не менее 10—100 клеток возбудителя на 100 мкл исследуемого биологического материала.
Разработана эффективная видоспецифичная тест-система (КанАм) для выявления ДНК Candida albicans, которая занимает лидирующее место в списке возбудителей кандидоза. Результаты клинических испытаний видоспецифичной и универсальной ПЦР-систем хорошо подтверждаются культуральным методом и показывают эффективность их использования для диагностики урогенитального кандидоза и микозов в неонатологии и онкологии.
Выбор специфичных праймеров для детекции Т. rubrum был затруднен, так как на обычный для таких работ ген 16S рибосомальной РНК подобрать праймеры не удалось. Указанная последовательность
является высококонсервативной и любая пара праймеров подходит сразу для несколько видов дерматофитов. Удалось подобрать пару праймеров, на указанный фрагмент генома (ген топоизомеразы II) Т. rubrum длиной 925 п.н. Проведено обследование тремя диагностическими методами: микроскопией, бактериологическим анализом и ПЦР образцов (соскоб с ногтевых пластинок) 44 пациентов, из них 23 образца представляли собой соскобы с ногтевых пластинок пациентов с клинической картиной дерматофитии и 21 образец - соскоб с ногтевых пластинок здоровых людей. По результатам проведенного исследования, чувствительность применяемого варианта метода ПЦР-диагностики дерматофитного онихомикоза составила 94,4%, а специфичность-95,2%. Общая расчетная точность диагностической методики составила 94,8%, что существенно превышает отдельную и совокупную чувствительность микроскопии и культивирования.
Нами был создан мультипраймерный диагностический ПЦР набор «ТрифАм» для диагностики Т. rubrum и Т. interdigitale в одной пробе. Были исследованы более 200 клинических образцов соскобов ногтевых пластинок тремя методами: микроскопическим, культуральным и ПЦР с использованием набора «ТрифАм». Совпадение результатов, полученных на данном наборе, с результатами культуральных исследований составило более 98%.
ПК OK I 2 3 45 6 7 8 9 Т. rubrum -»- - -- м м т
Т.inttrdigiule —» TT тт ""в*
Рис 5. Электрофореграмма анализа клинические образцы - соскоб с пораженной ногтевой пластины. ПК - положительный контроль - верхняя полоса соответствует фрагменту Т. rubrum (размер 925п.н.) в количестве 103 копий/мл; нижняя - фрагменту Т. interdigitale (размер 392 п.н.) в количестве 103 копий/мл.; OK- отрицательный контроль; 1, 4, 6, 7, 8 -положительный результат на Т. rubrum а 5 - Т. interdigitale; 9 -положительный результат на Т. rubrum и Т. interdigitale одновременно; 2,3 - отрицательный результат.
Метод ПЦР при дерматофитии может, по нашему мнению, стать «золотым стандартом» диагностики данного заболевания. Таким образом, впервые разработан высокоспецифичный и высокочувствительный метод для определения ДНК главных возбудителей онихомикозов Т. rubrum, и Т. interdigitale.
В данном разделе работы на основе МАГ созданы наборы реактивов для выявления ДНК различных вирусов, бактерий, микроорганизмов, грибов и даны примеры их практического применения в лабораторной
диагностике. Показано значение чувствительности наборов в определении клинической значимости результатов анализов. На примере НГА и ПЦР анализов выявлено место молекулярно-генетических методов в клинической лабораторной диагностике. Сравнение преимуществ метода ПЦР с традиционными диагностическими приемами (микробиологическое исследование, иммуноферментный анализ, микроскопия) показывает перспективность разработанных подходов к МАГ.
Способ Формирования набора компонентов для молекулярного анализа генома н его применение.
В данном разделе диссертационной работы изложен способ унификации и стандартизации различных методов молекулярного анализа генома (МАГ) с целью формирования единообразного, объективизированного представления о морфофункциональном состоянии генома на основе интерпретации МАГ как информационной биотехнологии и построении биотехнологической структуры (БТС). При выборе способа формирования набора и метода МАГ необходимо выделение этапов для достижения цели анализа, в том числе на совокупность процессов (пробоподготовка, гибридизация, амплификация и др., детекция результатов), в зависимости от характера и объема информации, которую необходимо получить. В процессе реализации МАГ как информационной технологии осуществляются по крайней мере три этапа.
На первом этапе производится выбор нуклеотидной последовательности зонда или праймеров для генодиагностики микроорганизма из генетических баз данных и литературных источников. Первый этап реализуется с помощью человеко-машинных информационно-справочных систем. При этом необходимо адекватно поставленной задаче использовать характерные для молекулярно-генетических методов уникальные специфичность и чувствительность. В процессе выбора зонда или праймеров могут решаться две задачи: в одних случаях должны отсутствовать общие фрагменты с другими геномами, что и определяет специфичность методики, в других - для выявления всех представителей данного класса микроорганизмов необходимы общие фрагменты нуклеотидных последовательностей. Разработчик сталкивается зачастую с неполной (например, известны последовательности только части генома) или противоречивой информацией (результаты исследований разных авторов или последовательности различных клинических изолятов одного микроорганизма). В зависимости от необходимой чувствительности набора генодиагностика может реализовать либо обнаружение микроорганизма с максимальной чувствительностью (гонококк, вирус гепатита и т.д.), либо с клинически значимой (условно патогенные или не патогенные микроорганизмы).
Второй этап формирования набора для МАГ, как информационной технологии, реализуется единообразным подбором характеристик набора, как унифицированных элементов конструктора, для достижения поставленной разработчиком целей. Например, для множественного НГА или мультипраймерной ПЦР наборы должны целенаправленно формироваться по следующим принципам: группам микроорганизмов, вирусов (например, объединение герпесвирусов или ВПЧ), возможным градациям риска возникновения различных заболеваний (например, онкологических заболеваний: ВПЧ высокого или низкого риска), возможному или преимущественному способу передачи инфекции (например ИППП), по нозологиям (например, неспецифические пневмонии или оникомикозы, вызываемые трихофитон рубрум и трихофитон ментагрофитес), соотношению конкурирующих микроорганизмов (лак-тобациллы и гарднерелла, что актуально при бактериальном вагинозе ).
Третий уровень получения информации состоит в визуализации и документировании получаемых результатов. Данный этап обеспечивается с помощью человеко-машинных видеокомпьютерных и оптоэлектронных систем. Данные о молекулярном уровне реализуются с использованием видеосистемы для просмотра электрофореграммы в ультрафиолетовом свете, а в случае НГА с помощью видимого света с применением хромогенных субстратов или коллоидных частиц, либо в ультрафиолетовом свете с использованием флуоресцентных красителей или хемилюминесценции. На клеточном и тканевом уровне информация о пространственном распределении выявляемых генетических элементов получается с использованием технологий НГА (например FISH на хромосомах) и ПЦР in situ.
После первого и/или второго информационного этапа у разработчика в рамках выбранного метода анализа, формируется представление о способе создания набора для МАГ, исходя из которого, определяются элементы биотехнологической структуры (БТС). Для выполнения поставленных целей подготавливаются компоненты с определенными функциональными свойствами (специфичные праймеры, ферменты и т.д.), которые при соблюдении требуемых физико-химических параметров, и наличии искомой мишени (в данном случае матрицы НК), взаимодействуют между собой и, следовательно, формируют БТС, реконструируя часть генома. БТС обладает свойством самоорганизации, которая возникает в результате слияния реактивов и последующих физико-химических процессов, происходящих в реакционной смеси. Таким образом, БТС является результатом процесса самоорганизации компонентов набора для МАГ, реализуемого, по алгоритму морфологического преобразования с формированием канала передачи информации о структурно-функциональном состоянии генома на микро -и/или макроскопическом уровне организации генома.
С точки зрения теории информационных систем в БТС реализуется трехкаскадная схема преобразования (выделения) и получения сигнала: во-первых, в качестве селективного фильтра используются специфические праймеры или ДНК-зонды, во-вторых, усилительным каскадом является процесс амплификации мишени или сигнала (мишеней или сигналов) реализуемый либо циклически (ПЦР, лигазная цепная реакция, и т.д.), либо поэтапно (например для НГА) происходящим в векторно-морфологическом пространстве БТС и в-третьих, на макроуровне обеспечивается детектируемость и распознавание сигнала (сигналов) (например положение электрофоретической полосы), позволяющие идентифицировать исходный геном (геномы). Таким образом, сущность предлагаемого подхода заключается в создании новой информационной технологии в геномике, унифицирующей и обобщающей все имеющиеся молекулярно-генетические методы, а МАГ является распространением информационных технологий на молекулярно-генетический уровень.
МАГ и его реализация с помощью БТС является специализированной человеко-машинной интеллектуальной
информационной системой, предназначенной для объективизации оценки состояния генома, на базе фрагментарной ненадежной (неспецифические праймеры и гибридизация, ошибки синтеза полимеразой), возможно противоречивой информации.
Детектируемость является целевым свойством БТС, реализуемым путем конформационных и конфигурационных взаимодействий между компонентами набора для МАГ и формируемым в процессе морфологических преобразований, в виде амплификации мишени и/или усиления сигнала, обеспечивающим регистрацию сигнала на микро - и/или макроскопическом уровне организации БТС.
Нами предложен комплекс операций, входящих в формирование набора компонентов для МАГ, предусматривающий построение многоуровневой БТС в виде последовательного реконструирования структурно-функциональной части генома путем топологических, конформационных, конфигурационных и комплементарных взаимодействий, последующих морфологических преобразований, включающих амплификацию мишени и/или сигнала в виде его усиления, а также детектирование сигнала на макроскопическом и/или микроскопическом уровнях БТС с получением полной системы морфоденситометрических показателей морфофункционального состояния генома.
ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Созданы новые способы модификации ДНК дигидразидом янтарной кислоты и синтезирован новый биотинилирующий реагент -полифотобиотин для эффективного использования в нерадиоизотопном гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.
2. Впервые разработан новый, быстрый и простой в исполнении способ нерадиоизотопного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, основанный на применении флуоресцентных латексных частиц для детекции гибридизационного сигнала. Метод сопоставим по чувствительности с широко применяющимся методом гибридизационного анализа, использующим ферментные конъюгаты.
* 3. На основании теоретических и экспериментальных разработок
созданы основы для практического использования методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот и мультипраймерной ПЦР. Разработаны и клинически апробированы ряд молекулярно-генетических систем для диагностики нескольких микроорганизмов, грибов и вирусов одновременно.
4. На пример« нерадиоизотопного гибридизационного, ПЦР и других видов анализов показано место молекулярно-генетических методов в системе клинической лабораторной диагностики, проведено сравнение преимуществ, ограничений и перспективности разработанных подходов к анализу геномов микроорганизмов. Разработаны новые приемы подготовки проб биологического материала и на основе анализа геномов созданы наборы реактивов для выявления ДНК различных микроорганизмов, вирусов, грибов.
5. На основе анализа нуклеотидных последовательностей исследован оптимальный состав и реализован модульный принцип проектирования и создания наборов для молекулярного анализа геномов, как совокупности компонент конструктора, допускающих их относительно независимую разработку и унификацию.
6. Впервые разработана и внедрена новая информационная технология молекулярного анализа геномов на основе построения биотехнологической структуры, повышающая надежность и доказательность принимаемых решений о морфофункциональном
Л состоянии генома.
Основные научные работы, опубликованные по теме
диссертации:
1. Валькова Г.А., Щербо С.Н., Шигорин Д.Н., Моисеева 3.3., Бир Е.Ш. К систематике молекул по спектрально-люминесцентным свойствам. V. Линейный хинакридон и его производные//Журнал физической химии.-1979.- 53.-№3.-С. 566-569.
2. Турчинский М.Ф., Айнбиндер Е.И., Кнорре В.Д., Щербо С.Н. Модификация ДНК дигидразидом янтарной кислоты для получения гибридизационных зондов//Биоорганическая химия,- 1989.- 15,- № 10.- С. 1341-1344.
3. Лукин Ю.В., Венер Т.Н., Кнорре В.Д., Щербо С.Н., Зубов В.П., Коваленко В.А., Свердлов Е.Д., Туркин С.И, Турчинский М.Ф. Способ ' проведения гибридизационного анализа//Авторское свидетельство 4652161/30-13/026980/ положительное решение от 25.08.1989.
4. Венер Т.Н.,Турчинский М.Ф., Кнорре В.Д., Генералова А.И., Лукин Ю.В., Щербо C H., Туркин С.И., Зубов В.П. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с использованием окрашенных латексов// Биоорганическая химия.-1990,- 16,- № З.-С. 424-426.
5. Щербо С.Н., Лукин Ю.В., Южаков В.И., Зубов В.П. Спектрально-флуоресцентные свойства полиакреолиновых латексов, содержащих красители/ЛКурнал физической химии,-1990,- 64,- №6. С. 424-426.
6. Турчинский М.Ф., Щербо С.Н., Кнорре В.Д., Колесник Т.Б., Алейник Ю.В. Полифотобиотин - новый реагент для введения биотина в нуклеиновые кислотыУ/Биоорганическая химия.-1991.- 17.- № 6.- С. 813818.
7. Vener T.I., Turchinsky M.F., Knorre V.D., Lukin Yu.V., Shcherbo S.N., Zubov V.P., Sverdlov E.D. A Novel Approach to Nonradioactive Hybridization Assay of Nucleic Acid Using Stained Latex Particles//Analytical Biochemistry.-199l.-v. 198,- P. 308-311.
8. Щербо C H., Пацаева C.B., Южаков В.И., Турчинский М.Ф. Спектральные и фотохимические свойства некоторых фотобиотинов// Биофизика,-1992.- 37,- 1,- С. 34- 38.
9 Родионова О.Ю., Щербо С.Н., Южаков В.И. Концентрационная зависимость спектрально-люминесцентных свойств растворов пиразолиновых красителей/ЛВестник московского университета. Сер. 3. - s 1992.-33.- № 5.- С. 42-47.
10 Турчинский М.Ф, Колесник Т.Б., Щербо С.Н. Метод множественного нерадиоактивного гибридизационного анализа/ЛГезисы 2-
ой конференции "Геном человека" - Переяславль- Залесский. - 1992.- С. *
188.
11. Турчинский М.Ф., Колесник Т.Б., Куницина О.Л., Щербо С.Н., Киселева В.И., Поверенный A M Разработка методов нерадиоактивного мечения ДНК зондов для множественного гибридизационного анализа//
Тезисы 3-ой конференции "Геном человека".- Черноголовка. - 1993.-С. 155.
12. Turchinsky M.F., Kolesnik Т.В., Kunitsina O.L., Shcherbo S.N., Volik S.V., Kiseleva V.l., Poverenny A.M., Pavlova I.S., Sverdlov E.D. Multiple hybridization analysis. A simultaneous use of two or three nonradioactive labels for DNA-probes: biotin, digoxigenin and trans-diamminedichloplatinum (И)//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология,- 1993.- № 6.- С. 29-31.
13. Родионова О.Ю., Щербо С.Н., Южаков В.И. Спектроскопическое исследование агрегатов пиразолиновых красителей в бинарных растворителях//Оптика и спектроскопия,-1993.- 75.- № 6.- С. 1215-1221.
14. Родионова О.Ю., Щербо С.Н., Южаков В.И. Концентрационные эффекты в люминесцентных характеристиках растворов пиразолиновых красителей//Журнал физической химии.-1994.-68.- № 1.- С. 48-51.
15. Балева СЛ., Видута О.Д., Щербо С.Н. Макаров В.Б., Федюшкина H.A., Карахан Н.М., Соха Л.Г., Шайхаев Г.О., Земляная Н.Ю., Зайцева С.П., Гараев М.М.,Сафронова О.Н.. Маркеры риска развития полиорганной соматической патологии, ассоциированной с персистентной герпесвирусной и хламидийной инфекциями у детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС//Российский вестник перинатологии и педиатрии,-1994.-39.-№ 6.- С. 18-20.
16. Киселева В.И., Щербо С.Н., Зайцева С.П., Поверенный A.M. Детекция Chlamydia trachomatis и Ureaplasma urealiticum методами гибридизационного анализа с использованием ДНК-Pt ((dien) С!)С1-зондов и ПЦР-анализаУ/Биохимия. -1995,- 60,- 5.- С. 783-789.
17 Вельтищев Ю.Е., Балева Л.С., Видута О.Д., Федюшкина H.A., Земляная Н.Ю., Воронцова Н.И., Зайцева С.П., Макаров В.Б., Щербо С.Н. Диагностика хламидийной, микоплазменных и герпесвирусных инфекций методом цепной полимеразной реакции//Методические рекомендации № 95-106. Министерство здравоохранения и медицинской промышленности РФ.- 1995.
18. Щербо С.Н., Макаров В Б. Использование метода полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем//Тезисы докладов IV Российского съезда дерматологов и венерологов. Ч. III. Казань. -1996. - С. 171-172.
19. Щербо С.Н., Макаров В.Б. Использование метода полимеразной цепной реакции и гибридизационного анализа для выявления возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем//Материалы 1 Всероссийской научно-практической конференции "Применение полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний". Методы лечения.-Сочи. -1996 - С. 22.
20. Дубинина И.Г., Щербо С.Н., Макаров В.Б. Метод полимеразной цепной реакции в лабораторной практике//Клиническая лабораторная диагностика,-1997,- № 7 - С. 4-6.
21. Щербо С.Н., Макаров В.Б., Дубинина И.Г. Диагностика хламидийной и гонококковой инфекции методом полимеразной цепной реакции//Клиническая лабораторная диагностика.-1997.-№ 7.- С. 6-9.
22. Щербо С.Н. Роль метода полимеразной цепной реакции в диагностике инфекций//Материалы московской областной научно-практической конференции "Современные методы скрининга в нефрологии детского возраста".- Москва - Мытищи. -1997.-С. 113-124.
23. Щербо С.Н., Макаров В.Б. ПЦР диагностика заболеваний, передаваемых половым путем/ЛСлиническая лабораторная диагностика,-1998.-№2.-С. 21-24.
24. Щербо С.Н., Семина C.B., Макаров В.Б. Диагностика заболеваний, передаваемых половым путем в г. Москве методом полимеразной цепной реакции//Материалы И Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний".-Москва. -1998. - С. 24.
25. Федюшкина H.A., Видута О.Д., Заплатников А.Л., Щербо С.Н. Диагностика внутриутробных инфекций методом полимеразной цепной реакции/Материалы И Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний".- Москва. -1998,- С. 26-27.
26. Щербо С.Н., Макаров В Б. Наборы лабораторного оборудования и реактивов для диагностики инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции//Материалы II Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний".- Москва. -1998,- С. 145-146.
27. Филатов H.H., Щербо С.Н., Макаров В.Б. ПЦР-диагностика возбудителей заболеваний, передаваемых половым путем//Тезисы 1-й Всероссийской конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций".-Саратов,- 2000.- С. 100.
28. Филатов H.H., Щербо С.Н., Макаров В.Б. Эпидемиологическое исследование распространенности заболеваний, передаваемых половым путем среди населения г. Москвы с использованием метода полимеразной цепной реакции//Материалы III Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине".-Москва. -2000.-С. 50-51.
29. Иванова Н.В., Полтараус А.Б., Сидоренко C.B., Стехова Г.В., Бахтикян К К., Вылегжанина A.B., Васенова В.Ю., Бузина В., Щербо С.Н., Макаров В.Б. ПЦР-диагностика микозов//Материалы III Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине",- Москва.- 2000,- С. 58-60.
30. Щербо Д.С., Полтараус А.Б., Щербо С.Н. Генодиагностика в клинической микологии//Успехи медицинской микологии.-Москва.-2002.-1.-гл2.-С. 81-83.
31. Иванова Н.В., Полтараус А.Б., Щербо И.В., Щербо С.Н. Метод ПЦР в диагностике микозов//Материалы I Съезда микологов России,-Москва.-2002.- С. 358.
32. Литвинова М.М., Земляная Н.Ю., Щербо С.Н. Эпидемиологическое исследование распространенности урогенитальных и внутриутробных инфекций с использованием метода ПЦР//Тезисы конференции «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении». - Москва. -2002,- С. 187-189.
33. Иванова Н.В., Рахимова Г.М., Щербо С.Н., Стехова Г.В., Сидоренко С.В., Дегтярева М.В., Фадеева Г.Б., Полтараус А.Б. Разработка и апробация систем ПЦР-детекции для выявления инвазивных микозов// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-2003.-№ 2.- С. 3238.
34. Молочков В.А., Кириченко И.М., Кривошеин Ю.С., Хайтович
A.Б., Андроновская И.Б., Латыпова М.Ф., Несвижский Ю.В., Смирнов И.В., Щербо С.Н. Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии/Под ред. Воробьева А. А. - М. Медицинское информационное агенство.- 2004.-72 с.
35. Молочков В.А., Киселев В.И., Рудых И.В., Щербо С.Н., Папилломавирусная инфекция. Клиника, диагностика, лечение/Пособие для врачей.- М. «Русский врач».-2004.-44 с.
36 Сергеев Ю.В., Богуш П.Г., Земляная Н.Ю., Щербо С.Н., Лещенко
B.М., Жарикова Н.Е., Мокина Е.В. Первый опыт прямой ПЦР диагностики дерматофитии ногтей//Успехи медицинской микологии.-М.-2004.- т.З,- С. 19-20.
37. Щербо С.Н, Аксенова О.А., Литвинова Н.А., Молочков В.А. Оценка содержания Lactobacillus spp и у Gardnerella vaginalis женщин репродуктивного периода/ЛГезисы IV Научно-практическая конференция «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии».- М.-2004,- С. 240.
38 Хлебникова А.Н., Земляная Н.Ю., Козлова Е.С, Щербо С.Н. Определение вирусов папилломы человека в базальноклеточном раке кожи/ЛГезисы IV Научно-практическая конференция «Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии» -М - 2004,- С. 206.
39. Способ формирования набора для молекулярного анализа генома и его применение// 2004,- Приоритет от 17 июня 2004 г №2004118277
40. Сергеев А.Ю., Богуш П.Г., Земляная Н Ю., Щербо С.Н., Лещенко В.М., Жарикова Н.Е., Сергеев Ю.В., Мокина Е.В. Генодиагностика дерматофитии: новый подход к борьбе с массовыми грибковыми инфекциями человека//Тезисы 5-ой Всероссийской научно-практической
конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» - М - 2004.- т.1-С. 105-107.
41. Щербо С.Н., Земляная Н.Ю. Аксенова O.A. Литвинова H.A. Выявление соотношения Gardnerella vaginalis, Lactobacillus spp. и некоторых анаэробных бактерий у женщин репродуктивного периода// Всероссийская конференция дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики Hill 111 и дерматозов»: Тез. докл.- М.- 2004,- С. 84.
42. Сергеев А. Ю., Щербо С.Н., Богуш П.Г., Лещенко В.М., Сергеев Ю.В., Мокина Е.В. Российский опыт и перспективы генодиагностики главных форм дерматофитии//Успехи медицинской микологии.-М.- 2005.-Т.5.- С. 23-25.
43. Сергеев А. Ю., Богуш П.Г., Щербо С.Н., Литвинова H.A., Лещенко В.М., Сергеев Ю.В. Первый опыт прямой генодиагностики микроспории в клиническом материале//Успехи медицинской микологии.-М.-2005.- Т.5.-С. 25-26.
Список сокращений:
ГА - гибридизационный анализ;
БТС- биотехнологическая структура;
ВПГ - вирус простого герпеса;
ВПЧ- вирус папилломы человека
ЛГА - латексный гибридизацмонный анализ;
МАГ - молекулярный анализ генома;
НГА - нерадиоизотопных гибридизационный анализ;
НК - нуклеиновая кислота;
ПАЛ - полиакроелиновый латекс;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
СА - стрептавидин;
ФБ, (ПФБ) - фотобиотин (полимерный фотобиотин);
Bio-4-dUTP,Bio-1 l-dUTP-биотинилированные дезоксиуридинтрифосфаты.
Сергей Николаевич Щербо (Россия)
"Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов"
Созданы новые способы модификации ДНК и синтезирован новый биотинилирующий реагент - полифотобиотин для эффективного использования в нерадиоизотопном гибридизационном анализе нуклеиновых кислот. Впервые разработан новый, быстрый и простой в исполнении способ нерадиоизотопного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, основанный на применении флуоресцентных латексных частиц для детекции гибридизационного сигнала. Метод сопоставим по чувствительности с широко применяющимся методом гибридизационного анализа, использующим ферментные конъюгаты. Показано значение молекулярно-генетических методов в клинической лабораторной диагностике на примере нерадиоизотопного гибридизационного и ПЦР анализов. Разработаны наборы реагентов для генодиагностики. Созданы основы для клинического использования мультипраймерной ПЦР.
Sergey N. Shcherbo (Russia)
"The development and applications of hybridization and PCR technologies for molecular analysis of microorganisms' genome"
There were created new methods for DNA-modification and synthesized a new biotinilating reagent - polyphotobiotin for the effective usage in non-radioisotopic hybridizaton analysis of nucleic acids. For the first time there was developed a new, fast and simple way of non-radioisotopic hybridizaton analysis of nucleic acids, based on the fluorescent latex particles used for detection of the hybridization signal. The method's sensitivity is commensurable with widely used methods of hybridizaton analysis based on enzymatic conjugates. The value of molecular genetic methods in clinical laboratory diagnostics has been shown by the example non-radioisotopic hybridization and polymerase chain reaction analysis. The new kits for DNA detection has been created. A basis for a practical clinical usage of multiplex polymerase chain reaction has been provided.
Подписано в печать^ #С"формат 60x84/16. Тираж'^ экз. Усл. печ. л. Заказ
Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3
0 5-12103
РНБ Русский фонд
2006-4 5562
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Щербо, Сергей Николаевич
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Методы гибридизационного анализа нуклеиновых кислот.
1.2. Способы модификации ДНК различными гаптенами для проведения нерадиоизотопного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот.
1.2.1 ДНК-зонды меченные биотином и дигоксигенином.
1.2.2. Фотомодифицирующие реагенты в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.
1.2.3. Люминесцентные метки для введения в нуклеиновые кислоты.
1.3. Применение нерадиоиозтопного гибридизационного анализа для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов и вирусов.
1.4. Способы пробоподготовки и условия проведения ПЦР реакции.
1.4.1. Пробоподготовка.
1.4.2. Оптимизация условий проведения ПЦР-реакции.
1.4.3. Подбор праймеров.
1.4.4.Термостабильная полимераза, дезоксинуклеотидтрифосфаты, компоненты ПЦР буфера.
1.5. Разработка наборов реагентов для молекулярного анализа
Щ генома методом ПЦР.
1.5.1. Хламидия трахоматис.
1.5.2. Микоплазма гоминис и микоплазма гениталиум.
1.5.3. Уреаплазма уреалитикум.
1.5.4. Одновременное выявление некоторых микроорганизмов и вирусов методом ПЦР с использованием мультипраймерных наборов реагентов.
1.6. Возможности метода ПЦР и других диагностических подходов к анализу клиниических образцов.
1.6.1. Анализ герпесвирусов.
1.6.2. Гарднерелла вагиналис.
1.6.3 Трихомонада вагиналис.
1.6.4 Грибы рода кандида и трихофитон.
1.7. Разнообразие методов и актуальность унификации подходов молекулярного анализа геномов.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Методы нерадиоизотопного гибридизационного анализа
2.2. Метод полимеразной цепной реакции. 128 2.2.1. Пробоподготовка клинических образцов. 128 2.2.1.1. Лизис клинических образцов.
2.2.1.2. Ускореная пробоподготовка.
2.2.1.3. Муколитический реагент.
2.2.1.4. Культивирование и выделение грибов.
2.2.2. Получение положительных контрольных образцов для набора реагентов для выявления кандида альбиканс.
2.2.3. Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-проду-ктов, полученных на клинических образцах М. genitalium, Т. vaginalis.
2.2.4. Инструкция по применению набора реагентов для обнаружения ДНК микроорганизмов, вирусов и грибов методом ПНР. 140 2.3. Клинико-лабораторные методы обследования на присутствие
G. vaginalis и Lactobacillus spp.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Разработка и оптимизация способов модификации ДНК биотином, производными платины, красителями, для проведения множественного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот. 149 3.1.1 Модификация ДНК дигидразидом янтарной кислоты для получения гибридизационных зондов.
3.1.2. Получение полимерного фотобиотинилирующего реагента (фотобиотина) и его использование в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.
3.1.3. Модификация ДНК комплексными соединениями платины для получения гибридизационных зондов.
3.1.3.1 .ТДДП-новая метка для ДНК-зондов.
3.1.3.2,ЦДДП и диенП - новые гаптены в нерадиоизотопном гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.
3.1.4. Множественный гибридизационный анализ с одновременным использованием нескольких ДНК-зондов, несущих различные нерадиоизотопные метки.
3.1.5. Разработка эффективных и чувствительных методов детекции нерадиоизотопных гибридизационных ДНК-зондов с использованием коллоидных частиц и полимерных маркеров.
3.1.6. Оптимизация свойств полиакролеиновых латексов для гибридизационного анализа.
3.1.6.1. Получение окрашенных полиакролеиновых латексов для нерадиоизотопного гибридизационного анализа.
3.1.6.2. Оптимизация спектрально-люминесцентных характеристик окрашенных полиакролеиновых латексов.
3.1.6.3. Получение конъюгата полиакролеиновых латексов со стрептавидином.
3.1.6.4. Выбор биотинилированных полинуклеотидных зондов для латексного гибридизационного анализа.
3.1.7. Нерадиоизотопный гибридизационный анализ нуклеиновых кислот с использованием окрашенных латексов. 201 Выводы раздела 3.1. 210 3.2. Разработка и совершенствование способов пробоподготовки, условий проведения ПЦР и мультипраймерной ПЦР,
3.2.1. Пробоподготовка.
3.2.1.1. Лизис клинических образцов и ускоренная пробоподготовка.
3.2.1.2. Лиофилизованный набор для пробоподготовки.
3.2.1.3. Пробоподготовка при работе с мокротой
3.2.1.4. Разработка системы внутреннего контроля для оценки возможности ингибирования полимеразной цепной реакции.
3.2.2. Разработка на основе анализа геномов наборов реагентов для выявления возбудителей некоторых инфекций передаваемых половым путем.
3.2.2.1 .Хламидия трахоматис.
3.2.2.2. Микоплазма гоминис и микоплазма гениталиум.
3.2.2.3. Уреаплазма уреалитикум.
3.2.3. Особенности подбора оптимальных условий для мультипраймерной ПЦР.
3.2.4. Разработка на основе анализа геномов мультипраймерных наборов реагентов для анализа некоторых урогенитальных инфекций.
3.2.4.1. Типирование вируса папилломы человека.
3.2.4.2. Герпесвирусы.
3.2.4.3. Хламидия трахоматис,микоплазмы и уреаплазмы. 252 Выводы раздела 3.2.
3.3. Сравнительное изучение метода ПЦР и других диагностических подходов к анализу различных биологических образцов.
3.3.1. Оценка и сравнение эффективности методов гибридизационного и ПЦР-анализа для выявления в клинических образцах некоторых возбудителей ИППП.
3.3.2. Молекулярный анализ геномов некоторых герпесвирусов.
3.3.2.1. Вирус простого герпеса.
3.3.2.2.Цитомегаловирус.
3.3.3. Разработка оптимальных схем применения молекулярно-генетических методов в клинической лабораторной диагностике.
3.3.3.1. Гарднерелла вагиналис, лактобациллы.
3.3.3.2. Трихомонас вагиналис.
3.3.4. Разработка на основе анализа геномов наборов реагентов для анализа ДНК некоторых видов грибов методом ПЦР.
3.3.4.1. Кандида альбиканс.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов"
В ряду современных генетических технологий особое место занимают методы генодиагностики, среди которых выделяются гибридизационный анализ (ГА) нуклеиновых кислот (НК) и амплификационные методы, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1-13]. Фундаментальные принципы молекулярной биологии: существование комплементарных взаимодействий между молекулами НК создают основу для разработки гибридизационных и ПЦР-технологий (в том числе множественного ГА и мультипраймерной ПЦР) для молекулярного анализа геномов (МАГ). Выяснение закономерностей геномной организации микроорганизмов ф необходимо, как для понимания природы и течения инфекционных процессов, так и создания лекарств нового поколения, действия которых направлено на специфические, определяющие патогенность мишени. В мире отмечается не только рост урогенитальных [хламидиоза, мико- и уреаплазмозов, трихомониаза, вируса папилломы человека (ВПЧ)] и герпесвирусных инфекций, микозов, и других, но и возникновение новых, ранее не известных (например, атипичная пневмония), что требует совершенствования подходов для быстрой разработки наборов реактивов для МАГ, прямого выявления возбудителя и правильной постановки диагноза.
Широко применяемые в настоящее время диагностические системы основаны, как правило на антигенных свойствах инфекционных агентов. ф Вместе с тем имеются различные виды, серотипы, а также некультивируемые формы микроорганизмов, возбудителей инфекционных заболеваний челове-Ф ка, быстро и качественно разработать диагностические подходы для которых, основываясь на антигенных свойствах затруднительно или невозможно. Высокоэффективные современные генетические технологии, используя методы МАГ, позволяют решать указанные задачи. Так, безопасные в работе нерадиоизотопные молекулярно-генетические методы детекции вытесняют все в большем числе случаев в медицинской практике радиоизотопные. В различных модификациях генодиагностики, связанных с применением биочипов, используются нерадиоизотопномеченные ДНК-зонды.
В связи с развитием методов ГА и амплификации НК актуальным ^ является разработка и оптимизация способов модификации ДНК различными гаптенами (биотином, производными платины, красителями и др.), используя химические и фотохимические реакции и эффективных методов детекции ги-бридизационных ДНК-зондов, сравнимых по чувствительности с радиоизотопными, исследование спектрально-люминесцентных свойств и механизмов образования межмолекулярных ассоциатов коллоидных частиц красителей, с целью наиболее эффективного применения в нерадиоизотопном гибридизационном анализе (НГА) нуклеиновых кислот.
Для успешного применения и правильной интерпретации результатов молекулярно-генетических методов в клинической лабораторной диагностике решающее значение имеет разработка оптимальных схем анализа • клинического материала. В частности сравнительная оценка эффективности использования молекулярно-генетических (НГА, ПЦР) и традиционных ме-^ тодов анализа (бактериологического анализа - БА, иммуноферментного анализа - ИФА и др.), изучение наиболее рациональных подходов к пробопод-готовке для различных клинических образцов, содержащих разнообразные микроорганизмы и вирусы, а также разработка наборов реактивов имеющих клинически значимую чувствительность при высокой специфичности. Одним из перспективных подходов могут стать сухие (лиофилизированные) наборы реагентов для выделения, амплификации и детекции НК.
Данные об эффективности и области использования методов, возможностях получения с их помощью взаимодополняющей информации ^ для каждого микроорганизма весьма разноречивы. В связи с этим важной задачей является выяснение места и роли молекулярно-генетических технологий в общей системе клинической лабораторной диагностики. Чрезвычайно важно определить в каждом конкретном случае клинически значимый уровень чувствительности обнаружения того или иного микроорганизма: в одних случаях высокая чувствительность метода ПЦР крайне важна, а в других в ней нет необходимости (условно-патогенные микроорганизмы). Необходимо учитывать возможные диагностические ошибки связанные с ложноположительными и ложноотрицательными результатами, что можно избежать применением внутреннего и внешнего контроля.
Существенным преимуществом молекулярно-генетических методов # анализа является возможность одновременной и независимой детекции различных нерадиоизотопных гибридизационных меток или проведение мультипраймерной ПЦР, при которой используется одновременно несколько пар праймеров. В случае анализа образцов биологического материала содержащих несколько возбудителей инфекционных заболеваний человека или решения других задач, в частности, скрининга геномных банков, применение таких подходов позволило бы значительно ускорить получение результатов.
Большие возможности открывает применение в молекулярной клинической диагностике амплификационных методов и прежде всего различных модификаций ПЦР, которая поднимает генодиагностику на принципиально иной уровень - уровень высокочувствительного и высокоспецифичного определения ДНК или РНК, что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. Разнообразны применения метода в различных областях человеческой деятельности: в научных исследованиях [1, 2, 13], медицине [3-9], ветеринарии [10], контроле за качеством объектов окружающей среды [11] и продуктов питания (в частности генетически модифицированных продуктов) [12], криминалистике (идентификация личности и установление отцовства). Особенно эффективным оказалось применение метода в медицине и в частности клинической лабораторной диагностике, медико-генетических исследованиях, гинекологии, дерматовенерологии, микологии. [3-9].
Разнообразие амплификационных подходов в генодиагностике [6, 1318] делает актуальным задачу исследования оптимального состава компонентов наборов реагентов для МАГ микроорганизмов, условий проведения ПЦР реакции и разработки унифицированного подхода к способу формирования набора для МАГ с целью обеспечения возможности сопоставления различных молекулярно-генетических методов для повышения доказательности принятия решения о морфофункциональном состоянии генома, определения места получаемых данных во всей совокупности информации о клеточном, органном, организменном уровнях организации и принятия клиницистом адекватного решения по диагностике и терапии.
Перечисленные проблемы обуславливают цели и задачи настоящего исследования.
Целью исследования явилась разработка, создание, внедрение и повышение информативности методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.
1. Создание способов модификации ДНК различными гаптенами, используя химические и фотохимические реакции, исследование спектрально-люминесцентных и фотохимических свойств предложенных биотинилирующих агентов, с целью повышения чувствительности ДНК-зондов в нерадиоизотопном гибридизационном анализе.
2. Разработка эффективных нерадиоизотопных методов детекции гибридизационных ДНК-зондов не уступающих: : по чувствительности радиоизотопным, исследование механизмов образования межмолекулярных ассоциатов и коллоидных частиц красителей, с целью внедрения указанных подходов в диагностическую практику.
3. Создание новых теоретических и практических подходов в использовании методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа и мультипраймерной ПЦР для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.
4. Внедрение оптимальных схем применения молекулярно-генети-ческих методов на основе сравнительной оценки эффективности нерадиоизотопного гибридизационного анализа, ПЦР и других методов в клинической лабораторной диагностике. Разработка новых приемов пробоподготовки различных клинических образцов, содержащих грибы, микроорганизмы, бактерии, вирусы.
5. Исследование оптимального состава компонентов, унификация и стандартизация подхода к способу формирования наборов для оценки структурно-функционального состояния геномов микроорганизмов.
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Щербо, Сергей Николаевич
ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Созданы новые способы модификации ДНК дигидразидом янтарной кислоты и синтезирован новый биотинилирующий реагент - полифотобиотин для эффективного использования в нерадиоизотопном гибридизационном анализе нуклеиновых кислот.
2. Впервые разработан новый, быстрый и простой в исполнении способ нерадиоизотопного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, основанный на применении флуоресцентных латексных частиц для детекции гибридизационного сигнала. Метод сопоставим по чувствительности широко применяющимся методам гибридизационного анализа, использующим ферментные конъюгаты.
3. На основании теоретических и экспериментальных разработок созданы основы для практического использования методов множественного нерадиоизотопного гибридизационного анализа нуклеиновых кислот и мультипраймерной ПЦР. Разработаны и клинически апробированы ряд молекулярно-генетических систем для диагностики нескольких микроорганизмов, грибов и вирусов одновременно.
4. На примере нерадиоизотопного гибридизационного, ПЦР и других видов анализов показано место молекулярно-генетических методов в системе клинической лабораторной диагностики, проведено сравнение преимуществ, ограничений и перспективность разработанных подходов к анализу геномов микроорганизмов. Разработаны новые приемы подготовки проб биологического материала и на основе анализа геномов созданы наборы реактивов для выявления ДНК различных микроорганизмов, вирусов, грибов.
5. На основе анализа нуклеотидных последовательностей исследован оптимальный состав и реализован модульный принцип проектирования и создания наборов для молекулярного анализа геномов, как совокупности компонент конструктора, допускающих их относительно независимую разработку и унификацию.
6. Впервые разработана и внедрена новая информационная технология молекулярного анализа геномов на основе построения биотехнологической структуры, повышающая надежность и доказательность принимаемых решений о морфофункциональном состоянии генома.
342
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Щербо, Сергей Николаевич, Москва
1. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. В кн. Анализ генома. Методы. Под ред. К.Дейвис. М. Мир. 1990. 176-190.
2. Льюин Б. Гены. Под ред. Георгиева Г.П. 1987. М. Мир. 544 с.
3. Введение в молекулярную медицину. Под ред. Пальцева М.А. 2004. М, Медицина, 496 с.
4. Иткес А.В. Полимерзная цепная реакция. 1999. М. Альтекс. 22 с.
5. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. 1997, СПб., Специальная литература. 287 с.
6. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций, 2003. М., Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 336 с.
7. Адаскевич В.П. Заболевания, передаваемые половым путем. 1997. Витебск. Издательство витебского медицинского института, 310 с.
8. Lo А. С., Feldman S.R. Polymerase chain reaction: basic concepts and ф clinical applications in dermatology//J. Am. Acad. Dermatol.-1994.-30.-2.-l.p.250.260. Review.
9. Carnegie P. R. Quality control in the food industries with DNA ® technologies//Australas Biotechnol.-l994.-4.-3.-p.46-149. Review.
10. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы.т.1 Генная и белковая инженерия. Под ред. Мирошникова А.И.-2004.- М. Наука. 2004. 526 с.
11. De Vega М., Blanco L., Salas M. Processive proofreading and the spatial relationship between polymerase and exonuclease active sites of bacteriophage phi29 DNA polymerase// J. Mol. Biol.-1999.-292.-1.p. 39-51.
12. Little M.C., Andrews J., Moore R. et. al. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system, BDProbeTecET//Clin. Chem.-1999.-45.-6.-Pt.l, p. 777-784.
13. Dean F.B., Neison J.R., Giesier T.L., Lasken R.S. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiplyprimed rolling circle amplification//Genome Res.- 2001.-11.- 6.-p. 1095-1099.
14. Notomi Т., Okayama H., Masubuchi H. et. al. Loop-mediated isothemal amplification of DNA//Nucleic Acids Res.-2000.-28.-12.-e63-7p.
15. Малеев Г.А. Лигазная цепная реакция. Теория, практическое применение, перспективы//Вестник РАМН.-2005.-2.-С.40-44.
16. Kessler С. Non-radioactive analysis of biomolecules//J. Biotechnol. -1994.- 30.-35. 2-3.- p.165-189. Review.
17. Matthews J.A., Batki A., Hynds L., Kricka L. J. Enhanced chemiluminescent method for the detection of DNA dot-hybridization assay. //Anal. Biochem.-1985.- p.205-209.
18. Dahlen P. Detection of biotinylated DNA probes by using Eu 3+- labeled streptavidin and time-resolved fluorometry//Anal. Biochem.-1987.-164.-p. 78-83.
19. Syvanen A-C., Tchen P., Ranki M., Soderlund M. Time-resolved fluorimetry: a sensitive method to quantitation of DNA-hybrids//Nucl. Acids. Rrs.-1986.-14.-p.1017-1028.
20. Forster A. C., Mclnnes I. L., Scingle D. C., Symons R. H. Nonradioactive hybidization probe prepared by chemical labeling of DNA and RNA with a novel reagent, photobiotin//Nucl. Acids Res.-1985.-V. 13.-№ 2.-p. 745-761.
21. Золотарев Ф. H. Голубев Д.В., Петров H.A. Метод дот-гибридизации в вирусологии//Успехи биологии.-1989.-108.-с. 375-285.
22. Barron С. An assay for quantitative nucleic acid hybridization on membrane filtrs//Anal. Biochem.-1989.-182-p.280-283.
23. Gerhard D. S., Kawasaki E.S., Barncroft F.C., Szabo P. Localization of unique gene by direct hybridization in situ//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1981.-78.-6.-p. 3755-3759.
24. Musiani M., Zerbini M., Gibellini D., Venturoli S., Gentilomi G., Gallinella G., La Placa M. Viral diagnosis using hybridization assays with digoxigenin labeled probes//Clin. Chim. Acta.-1994.-226.- 2.- p. 237-245.
25. Hopman A. H. N., Wiegant J., Tesser G. I., Van Duijn P. A nonradioactive in situ hybridization method based on mercurated nucleic acid probes and sulfhydryl-haptenligands//Nucleic Acids Res.-1986.-14.-p. 6471 6488.
26. Landegent J.E., Jansen W. N., Baan R.A., Hoeijmakers J. H. J., Van der Plorg M. 2-Acetylaminofluorene-modified probes for the indirect hybridocytochemical detection of specific nucleic acid sequences//Exp. Cell Res.-1984.-153.-p.61-72.
27. Matthews J. A., Kricka L.J. Analytical strategies for the use of DNA probes//Anal. Biochem.-1988.-169.-p. 1-25.
28. Singer R. H., Lawrence J. В., Rashtchian R. In: In situ hybridization. Applications to neurobiology (ed. K.L. Valentino, J.H. Eberwine, J.D. Barchas) 1987.pp. 71-96, Oxford University Press, Oxford.
29. Rando R.F. Nucleic acid hybridization as a diagnostic tool for the detection of human papillomaviruses//Adv. Exp. Med. Biol.-1990.-V. 263.- p. 89-109.
30. Nakagami S., Matsunaga H., Miyoshy K., Yamane A. Nonradioactive detection of nucleic acid by the universal probe system//Analyt. Biochem.-1991.-v.192. p. 11-16.
31. Турчинский M. Ф., Айнбиндер E. И., Свердлов E. Д. Множественная гибридизация в анализе геномов. 1. Реакция диаминов и бисульфита с цитозином для введения в ДНК нерадиоактивных меток//Молекулярная биология.-1988.-т. 22.-№ б.-c.l545-1553.
32. Shapiro R., DiFate V., Welcher М. J. Deamination of cytosine derivatives by bisulfite, mechanism of reaction//.!. Amer. Chem. Soc.-1974.-v. 96.-№ 3.-p. 906-912.
33. Rothenberg J.M. Wilchek M. p-diazobenzoyl-biocitin: a new biotinilating reagent for DNA//Nucl. Acids Res.-1988.-v. 16.-№4.-p. 3450-3456.
34. Takahashi Т., Arakawa H. A new biotinilating system for DNA using biotin aminocaproyl hydraside and glutaraldehyde//Nucl. Acids Res.-1989.-v. 17.-№12.-p. 50-65.
35. Vincent Ch. Tehen P., Cochen-Solal M., Kourilsky Ph. Synthesis of 8-SS-4-dinitrophenyl-2-6-aminoadenosine 5 triphosphate: biological properties and potential uses// Nucl. Acids Res.-1982.-v. 177.-p. 392-395.
36. Fuchs A., Lefevre J.F., Pouyet J., Daune M.P. Comparative orientati-on of the fluoren residue in native DNA modified by N-acetoxy-N-2-acetylami-nofluorene and two halogenoderivatives//Biochem.-1976.-v.l5,-p. 3347-3351.
37. Урываев JI.B., Русавская E.A., Сигнатулина H.M., и др. Выявление РНК вируса гриппа А методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с использованием биотинилированных зондов// Вопросы вирусологии.-1990.-№6.-с. 454-465.
38. Вейко Н.Н., Карпухин А.В., Салимов А.Г., Немцова М.В., Спитковский Д.М. Биотинилирование ДНК с использованием фотоактивиру-емого реагента 1Ч-(4-азидо-2-нитробензоил)-1,7-диаминогептана //Биотехнология." 1989.-5.- 4.-С.414-419.
39. Dattagupta N., Rae Р.М.М., Huguenel Е. D., Carlson E., Lyga A., Shapiro J. A., Albarella J. P. Rapid identification of microorganisms by nucleic acid hybridization after labeling the test sample//Anal. Biochem.-1989.- 177.-p. 85-89.
40. Levenson C, Watson R, Sheldon E.L. Biotinylated psoralen derivative for labeling nucleic acid hybridization probes//Methods Enzymol.-1990.-184.-p.577' 583.
41. Weeks I., Campbell A.K., Woodhead J.S. Two-site immunochemilu-minometric assay for humanfetoerotein//Clin. Chem.-1983.-№ 29.- p. 1480-1483.
42. Tan Т.Н. A nonradioactive screening method for cloning genes encoding ^ sequence-specific DNA binding proteins//Analyt. Biochem.-1991.- 192.-p. 17-22.
43. Creasey A., Anigo L.D., Dunne T.S., Kissenger C. Application of novel chemiluminescence-based DNA detection method to single-vector and multiplex DNAsequencing//Biotechniques.-1991.-v.ll.-№ l.-p. 102-109.
44. Киселев М.Ф., Щербо C.H., Леонов O.H., Крюков Л.Н. Использование галоидопроизводных дикетонов в люминесцентном иммуноанализе с временным разрешением//Журнал прикладной спектроскопии.-1991.-т. 54.-№ 5.-е.784-787.
45. Hurskainen P., Dahlen P., Ylikoski J., Kwiatkowski М., Siitari Н., # Lovgren Т. Preparation of europium-labelled DNA probes and their properties//
46. Nucl. Acid. Res.-1991.-v. 19.-№ 5.-p. 1057-1061.
47. Балакин К. В. Новые флуоресцентные ДНК-зонды: синтез и использование для детекции гибридизации в растворе. 1998. Дисс. к.х.н. М.
48. Прудников Д. Ю. Химические методы флуоресцентного мечения ДНК и РНК. Гибридизация флуоресцентных проб на микроматрице. 1997. Дисс. k.x.h.JM.
49. Островерхова Н.В., Назаренко С.А., Черемных А.Д. Сравнительная геномная гибридизация как метод оценки геномного дисбалансаУ/Генетика.-2002.-Т. 38.-№ 2.-С.149-160.
50. Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D. at al. Comperative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors// Science.-1992.-v.258.-p. 818-821.
51. Thiry M., Thritu-Blaise L. In situ hybridization at the electron microscope level: an improved method for precise localization of ribosomal DNA and RNA//Eur. J. Cell. Biol.-1989.-v. 50.-p. 235-243.
52. Rosenthal A., Jones D.S.C. Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction//Nucl. Acids Res.-1990.-v. 78.-p. 1890-1893.
53. Syvanen A.-C., Bergstrom M., Tenhunen J., Soderlund H. Quantitation of polymerase chain reaction products by affinity-based hybrid collection//Nucl. Acids Res.-1988.-v. 16.-p. 1327-1338.
54. Jungell-Nortamo A., Syvanen A-C., Luoma P., Soderlund H. Nucleic acid sandwich hybridization: enhanced reaction rate with magnetic microparticles as carriers//Mol. Cell. Probes.-1988.-v. 2.-p.281-288.
55. Wolf S.F., Haines L., Fisch J., Kremsky J.N., Dogherty J.P., Jacobo K. Rapid hybridization kinetics of DNA attached to submicron latex particles// Nucl. Acids Res.-1987.-v. 15.-p. 2911-2926.
56. Лукин Ю.В., Трифонов В.Д., Туркин С.И., Зубов В.П. Полиакролеиновые латексы в качестве иммунореагентов//Труды МХТИ.-1985,-вып. 35.- с.88-92.
57. Туркин С.И., Марквичева Е.А., Лукин Ю.В., Зубов В.П.,
58. Подойницин С.Н. Магнитные носители в биотехнологии и медицине// Труды МХТИ.- 1985.- вып. 35.- с.41-51.
59. Kuhnert P., Boerlin P., Fray J. Target genes for virulence assessment of Escherichia coli isolates from water, food and the environment//FEMS Microbiol. Rev.-2000.-24.-p. 107-117.
60. Злобин В.И., Погодин B.B., Дрокин Д.А. и др., Специфическое определение флавивирусов методом молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолигонуклеотидными зондами//Вопросы вирусологии.-2003.-6.- с.23-27.
61. Орлова Т.Н. Создание нерадиоактивного высокочувствительного гибридизационного метода детекции вируса клещевого энцефалита. Дисс. к. хим. наук. Новосибирск, 1996.
62. Использование молекулярных (ДНК) зондов для диагностики гриппозной инфекции генотипирования вирусов гриппа. Методические рекомендации. Ленинградский институт вакцин и сывороток, ВНИИ гриппа. 1990.
63. Cuyck-Gandre H.V, Job A, Burckhart M.F., Girond S., Crance J.M. Use of digoxigenin-labeled RNA probe to test hepatitis A virus antiviral drugs// Pathol Biol (Paris).-1995.-43.-5.-p.411-415.
64. Chantratita W, Henchal E.A, Yoosook C. Rapid detection of herpes simplex virus DNA by in situ hybridization with photobiotin-labelled double-stranded DNA probes//Mol. Cell. Probes.-1989.-3.-4.-p.363-373.
65. Сигнатулина Н.М. Разработка диагностических тест-систем для выявления инфекционных агентов с использованием нарадиоактивных ДНК-зондов.-1992. Дисс. канд. хим. наук. М.
66. Souza I.E, Nicholson D, Matthey S, Alden B, Haugen Т.Н. Detection of human cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes by the polymerase chain reaction and a nonradioactive probe//Diagn. Microbiol. Infect. Dis.-1994.-20.-1.-p.13-19.
67. Levy R, Najioullah F, Thouvenot D, Bosshard S, Aymard M, Lina B. Evaluation and comparison of PCR and hybridization methods for rapid detection of cytomegalovirus in clinical samples//Virol. Methods.-1996.-62.-2.-p. 103-111.
68. Chen Y, Chen Y, Lii H, Lu Z. Chemiluminescence detection of epstein-barr virus DNA with an oligonucleotide probe//Clin. Chim. Acta.-2000.-298.l-2.-p. 45-53.
69. Forslund O, Hansson BG, Bjerre B. Typing of human papillomaviruses by consensus polymerase chain reaction and a non-radioactive reverse dot blot hybridization//.!. Virol. Methods.-1994.-49.-2.-p.l29-139.
70. Marrero M, Valdes O, Alvarez M, Penate G, Morales E, Roges G, Otero A, Cutie E. Detection of human papillomavirus by nonradioactive hybridization//Diagn. Microbiol. Infect. Dis.-1994.-18.-2.-p.95-100.
71. Astori G, Pipan C, Muffato G, Botta G.A. Detection of HPV-DNA in semen, urine and urethral samples by dot blot and PCR//New Microbiol.-1995.-18.-2.-p. 143-149.
72. Poonnaniti A, Bhattarakosol P. Improvement of PCR detection of HPV-DNA using enhanced chemiluminescence system and dot hybridization//Med. Assoc. Thai.-1996.-79.-1 .-p.96-103.
73. Cubie H.A, Grzybowski J, da Silva C, Duncan L, Brown T, Smith N.M. Synthetic oligonucleotide cocktails as probes for detection of human parvovirus B19//J. Virol. Methods.-1995.-53.-1 .-p.91 -102.
74. Hicks K.E., Beard S., Cohen B.J., Clewley J.P. A simple and sensitive DNA hybridization assay used for the routine diagnosis of human parvovirus B19 infection//J. Clin. Microbiol.-1995.-33.-9.-p.2473-2475.
75. Rotbart H.A. DNA probes for viral diagnosis//Adv. Exp. Med. Biol. -1992.-312.-p.201-209.
76. Маныкин A.A., Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Лисицын Ф.В. Выявление ДНК вируса папилломы человека в шейке матки и гортани методом гибридизации in situy/Российский онкологический журнал.-1999.-№5.-с.25-28.
77. Лисицын Ф.В. Индикация ДНК вируса папилломы человека при кондиломатозе гениталий, папилломатозе гортани и мочевого пузыря, а также в опухолях этих органов. 2002. Дисс. к. б. н., М.
78. Жданов А. В. Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции и оценка параметров иммунного и интерферонового статуса у пациентов с различными формами урогенитального хламидиоза. 1996. Дисс. к. б. н. М.
79. Rychlik W., Spencer W. J., Rhoads R. E. Optimization of the Ш annealingtemperature for DNA amplification in vitro//Nucleic Acids Research1990.-18.-21 .-p.6409-6412.
80. Innis M.A. Gelfand D.H. Optimization of PCRs. pp. 3-12 in: PCR Protocols. Eds. Innis, Gelfand, Sninsky and White. 1990. Academic Press. New York.
81. Кабоев O.K. Горячий старт ПЦР при помощи ДНК-геликаз// Биоорганическая химия.-1999.-№ 3.- том. 25.-С.398-400.
82. Kemp D.J., Smith D.B., Foote S.J., Samaras N., Peterson M.G. Colorimetric detection of specific DNA segments amplified by polymerase chain reactions//PNAS USA.-1989.- v. 86.-7.-p.2423-2427.
83. Winship P.R. An improved method for directly sequencing PCR amplified material using dimethyl sulphoxide//Nucleic Acids Res.-1989.-v.17.-3.-p.1266.
84. Sarkar G, Kapeiner S. and Sommer S.S. Formamide can drrastically increase the specificity of PCR//Nucleic Acids Research.-1990.-18.-24.-p.7465.
85. Henke W., Herdel K., Jung K., Schnorr D., Loening S.A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences//Nucleic Acids Research.-1997.- v.25.-9.-p.3957-3958.
86. Kwok S., Kellogg D.E., McKinney N., Spasic D., Goda L., Levenson C., Sninsky J.J., Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies//Nucleic Acids Res.-1990.-18.-4.-p.999 1005.
87. Ehlen Т., Dubeau L. Detection of RAS point mutations by polymerase chain reaction using mutation-specific, inosine-containing oligonucleotide primers//Biophys. Res. Commun.-l 989.-160.-p.441-447.
88. Manos M. M., Ting Y., Wright D.K., Lewis A.J., Broker T.R., Wolinsky S.M. Molecular Diagnostics of Human Cancer.- 1989.-7.-p. 209-214, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
89. Gelfand D.H. and White T.J. Thermostable DNA polymerases, pp. 129141 in: PCR Protocols. Eds. Innis, Gelfand, Sninsky and White. Academic Press. 1990. New York.
90. Чалов C.E., Ворошина О.П., Сергиенко O.B., Лунин В.Г. Термостабильная ДНК-полимераза из термофильного микроорганизма ARCHAEON Archaeoglobus fulgiclus VC16 и ее свойства//Биохимия.-2003.-т.68.-вып. 3.-с.366-374.
91. Глухов А.И. Использование термостабильных ДНК-полимераз для анализа возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции. 1998. Дисс. д.б.н. М.
92. Ishino Y., Takahashi-Fujii A., Uemori Т., Imamura М., Kato I., Doi H. The amino acid sequence required for 5 3 exonuclease activity of Bacilus caldotenax DNA polymerase//Protein Eng.-1995.- 8.- 11.- p. 1171-1175.
93. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR//Appl. Environ. Microbiol.-1998.-64.-p.3724-3730,
94. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Ferrie R. Newton C., Little S. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR// Nucleic Acids Res.-1997.-25.-p.3235-3241.
95. Петухова И.И. Возможности полимеразной цепной реакции в детекции бледной трепонемы у больных сифилисом. 2002. Дисс. к.м.н. М.
96. Вишневская Е. Б. Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий возбудителей заболеваний человека. 2000. М., Дисс. д. б. н.
97. Cole S. Т., Brosch R., Parkhill J., Gamier Т., Churcher С., D. at al. Deciphering tlic biology of Mycobuctcrium tuberculosis from the complete genome sequence//Nature.-1998.-393 (6685).-p.537-544.
98. Kalman. S., Mitchell. W., Marathe,R. at al. Comparative Genomes of C. pneumoniae and C. trachomatis, unpublished Program in Infectious Diseases, University of California, 235 Earl Warren Hall, Berkeley, CA 94720, USA.
99. Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., at al. The minimal gene complement of M. genitalium//Science.-1995.-270.-p.397-403.
100. Шаткин A.A., Мавров И.И. Урогенитальные хламидиозы. 1983. Киев. Здоровье. 200 с.
101. Брагина Е.Е., Орлова О.Е., Дмитриев Г.А. Некоторые особенности жизненного цикла хламидий. Атипичные формы существования//Инфекции, передаваемые половым путем.-1998.-№1.-с.2-9.
102. Ориел Дж. Д., Риджуэй Д.А. Хламидиоз/Пер. с англ. 1984. М. Мир.286 с.
103. Lovett М., Kuo С.-С., Holmes К., Falkow S. Plasmids of the genus Chlamydia. In book: Current chemotherapy and infectious disease. Ed. Nelson J.D., Grassi C. 1980. p. 1250-1252.
104. Comanducci M., Ricci S., Cevenini R., Ratti G. Diversity of the Chlamydia trachomatis common plasmid in biovars with different pathogenisity//Plasmid.-1990.-v. 23.-p. 149-154.
105. Palmer L., Falkow S. A common plasmid of Chlamydia trachomatis// Plasmid.-1986.- v. 16.- p. 51-61.
106. Comanducci M., Ricci S., Ratti G. The structure of plasmid of Chlamydia trachomatis belived to be required for growth within mammalian cells//Mol. Microbiol.-1988.- v. 2.- p. 531-538.
107. An Q., Olive D.M. Molecular cloning and nucleic acid sequencing of Chlamydia trachomatis 16S rRNA genes from patient samples lacking the cryptic plasmid//Mol. Cell Probes.-1994,-v. 8.- p. 429-435.
108. Зимин А.Л. Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр 2. 2003.Дисс. к.б.н., М.
109. Можеренков В.П., Прокофьева Г. Л. Хламидиоз глаз// Медицинская помощь.-1999.-1 .-с.17-19.
110. Морисенкова Н.В. Распространенность и клинико-иммунологиче-ские особенности инфекций, вызванных Chlamydia trachomatis и Mycoplasma hominis при герпесиндуцированных формах недостаточности иммунитета. 2003. М. Дисс. к.м.н.
111. Сидорович С.Ю. Культура клеток как инструмент для определения хламидийной инфекции//Вестн. дермат. и венер.-2001.-№6.-с. 20-25.
112. Mahony J. et al. Effect of swab type and storage temperature on the isolation of Chlamydia trachomatis from clinical specimens//J. Clin. Microbiol.-1985.-v. 22.-p.865-867.
113. Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), и заболеваний кожи. Протоколы ведения больных, лекарственные средства. 2003. Под ред. А.А. Кубановой. М. ГЭОТАР-МЕД. 448 с.
114. Киселев В.И., Латыпова М.Ф., Дмитриев Г.А., Бакалова Л.А., Бурцева О.А., Абудуев Н.К. ПЦР-анализ в качестве критерия излеченностиурогенитального хламидиоза//Вестник дерматологии и венерологии.-2001.-№4.-с.4-5.
115. Thomas D.L., Quinn Т.С. Serologic testing for sexually transmitted diseases//Inf. Dis. Clin. NA.-1993.-v.7.-p. 793-824.
116. Шалепо K.B. Валидация методов лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Chlamydia trachomatis. 2003. Дисс. к.б.н., С.-Петербург.
117. Шалепо К.В., Савичева A.M., Шипицина Е.В., Домейка М.М. Обнаружение Chlamydia trachomatis в различных клинических материалах урогенитального тракта//Журнал акушерства и женских болезней.-2002.-1.-51.-С.95-100.
118. Федина Е.Д. Комплексная лабораторная диагностика хламидиоза и ассоциированной с ним инфекций при эндоцервицитах. 2003. Дисс. к.м.н., М.
119. Бурова А.А. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики разных форм хламидийной инфекции. 2002. Дисс. к.м.н., М.
120. An Q., Liu J., О, Brien W. Comparision of characteristics of Q beta replicase-amplified assay with competitive PCR assay for Chlamydia trachomatis//!. Clin. Microbiol.-1995.- v. 33.-p. 58-63.
121. Krul K.G. Closing in on Chlamydia//CAP Today.-1995.-№9.-p.l-20.
122. Латыпова М.Ф. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитального хламидиоза. 2001. Дисс. к. б. н., М.
123. Stary A. European Guideline for management of chlamydial infection//Int. J. STD AIDS.-200l.-l2.-3.-p.31-33.
124. Мисюрина О.Ю. Молекулярно-генетические особенности клинических изолятов С. trachomatis, in vitro устойчивых к фторхинолонам или макролидам. 2002. Дисс. к.б.н. М.
125. Шипицына Е.В. Микробиологические аспекты устойчивости Chlamydia trachomatis к антибиотикам. 2003. С-Петербург. Дисс к.б.н.
126. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология. 1995. Медицина. М. 288 с.
127. Ladefoged S. A. ct al. A 135-Kilodalton Surface Antigen of Mycoplasma hominis Pg21 Contains Multiple Directly Repeated Sequences// Journal of Bacteriology.-1995 .-63 .-p.212-223.
128. Ladefoged S. A. ct al. Analysis of 0.5-Kilobase-Pair Repeats in the Mycoplasma hominis Lmp Gene System and Identification of Gene Products// Journal of Bacteriology.-1996.-178.-p.2775-2784.
129. Ladefoged S.A., Christiansen G. Mycoplasma hominis exspresses two variants of a sell-surface protain, one lipoprotain, and one not// Microbiology.-1998.-144.-p.761-770.
130. Olson L.D., Shane S.W., Kapras A.A. et al. Monoclonal antibodeies to Ф surface antigens of pathogenic Mycoplasma hominis strain/TInfect. Immun. -1991.59.-p. 1683-1689.
131. Момыналиев K.T., Говорун B.M. Механизмы генетической нестабильности молликут (микоплазм)//Генетика.-2001.-т.37.-9.-с.1173-1187.
132. Ladefoged, S. A., and G. Christiansen. Sequencing analysis reveals a unique gene organization in the gyrB region of Mycoplasma hominis// Bacteriol. -1994.-176.-p. 5835-5842.
133. Christiansen G., Mathiensen S.L., Nyvold C., Birkelund S. Analysis of a Mycoplasma hominis membrane protein, P 120//FEMS Microbiol. Lett.-1994.• 79.-p. 133-140.
134. Jensen L.T., ladefoged S., Birkelund S. Christiansen G. Selection of Mycoplasma hominis PG21 deletion mutants by cultivation in the presence of monoclonal antibody 552//Infect. Immun.-1995.- 63.-p. 3336-3347.
135. Kupsch E.M., Knepper В., Kuroki Т., Heuer I., Meyer T.F. Variable opacity (Opa) outer membrane protains account for the cell tropisms displayed by Neisseria gonorrhoeae for human leukocytes and epithelial cells//EMBO J. -1993.-12.-2.-p.641-650.
136. Boyle M.D., Hawlitzky J., Raeder R., Podbielsky A. Characterization of gene encoding two unique type Ila immunoglobulin G-binding proteins expressed by a single group A streptococcal isolate/Anfect. Immun.-1995.-62.-4.-p.1336-1347.
137. Razin S., Yogev DF., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas//Microb. Mol. Biol. Rew.-1998.-64.-p.l094-1156.
138. Roberts M.C., Kenny G.E. Conjugal transfer of transposon Tn916 from Streptococcus faecalis to Mycoplasma hominis//J. Bacteriol.-1987.-v. 169.-p.3836-3839.
139. Александрова H.M., Бевова M.P., Говорун B.M. Трансформация Mycoplasma hominis плазмидой рАМ120 с помощью электропорации //Генетика. -2000.-36.-3.-С.309-313.
140. Jansen J.S., Blom J. Lind К. Intracellular location of Mycoplasma genitalium in cultured Vero cells as demonstrated by eletron microscopy//Int. J. Exp. Pathl.-l 994.-75.-p.91-98.
141. Mushegian A. R., Koonin E.V. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes//Proc.Nat.Acad. Sci. USA.-1996,-v. 93.-p.l0268-10273.
142. Himmelreich R.H., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li D.-C., Herrmann R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium M. pneumoniae//Nucleic Acids Res.-1996.-24.-p.4420-4449.
143. Himmelreich R.H., Plagens H., Hilbert H., Reiner В., Herrmann R. Complete analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium//Nucleic Acids Res.-1997.-25.-p.701-712.
144. Раковская И.В., Горина Л.Г. Лабораторная диагностика микоплазмозов человека//Клиническая лабораторная диагностика.-2000.-8.-с. 50-53.
145. Зангирова Н.А. Персистенция патогенных микоплазм и ее молекулярно-генетические механизмы, 2001. Дисс. докт. биол. н. М.
146. Вонский М.С. Белки теплового шока микоплазм. 2001. Дисс. канд. биол. наук, С. Петербург.
147. Taylor-Robinson D. The history and role Mycoplasma genitalium in sexually transmitted diseases//Genitourin. Med.-1995.-71.-p. 1-8.
148. Белоусова E. В. Сравнительная оценка эффективности методов выявления возбудителей урогенитальных микоплазмозов//Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы,-1998.-т.2.-№2, с.41.
149. Taylor-Robinson D., Giroy C.B., Thomas B.J., Hay P.E. Mycoplasma genitalium in chronic non-gonococcal urethritis// Int. J. STD AIDS.-200415.-1.-p.21-25.
150. Bjornelius E., Jensen J.S., Lidbrink P. Conjunctivitis associated with Mycoplasma genitalium infection//Clin. Infect. Dis.-2004.-39.-7.-p.67-69.
151. Razin S., Yogev D.F., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas//Microb. Mol. Biol. Rew.-1998.-64.-p. 1094-1156.
152. Kong, F., James G., Ma Z., Gordon S., Wang В., Gilbert G. L. Phylo-genetic analysis of Ureaplasma urealyticum- support for the establishment of a new species, Ureaplasma parvum//Int. J. Syst. Bacteriol.-1999.-49.-4.- p.l879-1889.
153. Kong F., Ma Z., James G., Gordon S., Gilbert G.L. Species identification and subtyping of Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum using PCR-based assays//J. Clin. Microbiol.-2000.-38.-3.-p.l 175-1179.
154. Ruifu Y., Minli Z., Guo Z., Wang X. Biovar diversity is reflected by variations of genes encoding urease of Ureaplasma urealyticum//Microbiol Immunol.-1997.-41.-8.-p.625-627.
155. Harasawa R, Kanamoto Y. Differentiation of two biovars of Ureaplasma urealyticum based on the 16S-23S rRNA intergenic spacer region// J. Clin. Microbiol1999.-37.-12.-p.413 5-413 8.
156. Jacobs E., Vonski M., Stemke G.W., Robertson J.A. Identification of Ureaplasma urealiticum//Med. Microbiol. Lett.-1994.- 3.-p. 31-35.
157. Robertson J.A., Vekris A., Bebear C., Stemke G.W. Polymerase chain reaction using 16S rRNA gene sequences distinguishes the two biovars of Ureaplasma urealyticum//J. Clin. Microbiol.-1993.-31.-4.-p.824-830.
158. Ollikainen, J., T. Heiskanen-Kosma, M. Korppi, M. L. Katila, and K. Heinonen. Clinical relevance of Ureaplasma urealyticum colonization in preterm infants// Acta Pediatr.-1998.-87.-p. 1075-1078.
159. Zheng, X., H. L. Watson, К. B. Waites, and G. H. Cassell. Serotype diversity and antigen variation among invasive isolates of Ureaplasma urealyticum from neonates//Infect. Immun.-1992.-60.-p.3472-3474.
160. Безруков В. M., Назаренко Е. Г. и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний: Материалы 2-й Всероссийской практ. конф. 1998. - М. - с. 31-34.
161. Екимов А. Н., Загребина О. С., Кисина В. И., Говорун В. М. Метод генотипирования клинических изолятов Ureaplasma urealiticum биовара Раг-vo//Moлeкyляpнaя генетика, микробиология и вирусология.-2001.- 1.-е. 28-32.
162. Knox С. L., Timms P. Comparison of PCR, nested PCR, and Random amplified polymorphic DNA PCR for detection and typing of Ureaplasmaurealiticum in specimens from pregnant women//J. Clin. Microbiol.-1998.- vol. 36.-10.-p. 3032-3039.
163. Kong F. Zhu X., Wang W. et al. Comparative Analysis and Serovar-Specific Identification of Multiple-Banded Antigen Genes of Ureaplasma urealyticum Biovar 1//J. Clin. Microbiol.-1999.-37.-p. 538-543.
164. Wang E.E., Matlow A.G., Olilsson A, Nelson S.C. Ureaplasma urealyticum infections in the perinatal period//Clin. Perinatol.-1997.-24.-l.- p. 91-105.
165. Tully, J. G., and S. Razin (ed.). Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology, vol. II. Diagnostic procedures. 1996. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.
166. Минкина Г.Н., Манухин И.В., Франк Г.А. Предрак шейки матки. 2001. Аэрограф-медиа. М. 122 с.
167. Киселев В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. Димитрейд График Групп. 2004. М. 184 с.
168. Молочков В.А., Киселев В.И., Рудых И. В., Щербо С.Н. Папилломавирусная инфекеция. Клиника, диагностика, лечение. Пособие для врачей. 2004. М. Русский врач. 44 с.
169. Киселев Ф. JL, Мазуренко Н.Н., Волгарева Г.М., Киселева Н. П. Взаимодействие вирусных и клеточных генов в опухолях шейки матки//С)нкогенетика.-2004.-38.-2.- с. 224-232.
170. Nidi I., Greinke С., Zahm D.M., Stockfleth Е., Hoyer Н., Schneider А. Human papillomavirus distribution in cervical tissues of different morphology as determined by capture assay and PCR//Int. J. Gynecol. Pathol.- 1997.-16.- 3.-p. 197-204.
171. Подистов Ю.И., Лактионов К.П., Петровичев H.H. Современные диагностические возможности в определении предрака и рака шейки матки (обзор литературы)//Клиническая лабораторная диагностика.-2003.-3.-с.15-24.
172. Кузнецова Ю.Н. Латентная папилломавирусная инфекция уро-генитального тракта женщин, обусловленная ВПЧ 16-го и 18-го типов. Варианты течения, тактика ведения. 2003. Дисс. канд. мед. наук. Екатеринбург.
173. Orle К.A., Gales С.A., Martin D.H. et al. Simultaneous PCR Detection щ of Hamophilus ducrey, Treponema pallidum and Herpes Simplex Virus Types 1and 2 from Genital Ulcers//J. Clin. Microbiol.-1996.-V. 34.-p. 49-54.
174. Polz M.F., Cavanaugh C.M. Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR//Appl. Environ. Microbiol.-1998.-64.-p.3724-3730.
175. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Feme R., • Newton C., Little S. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR//
176. Nucleic Acids Res.-1997.-25.-p.3235-3241.
177. Henegariu O, Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol//BioTechniques.-1997.-23 .-p.504-511.
178. Гранитов B.M. Герпесвирусная инфекция. Москва. Медицинская книга. 2001. Н. Новгород. Издательство НГМА. 88 с.
179. Исаков В.А., Борисова В.В., Исаков Д.В. Герпес: патогенез и лабораторная диагностика. Руководство для врачей. 1999. С-Петербург. Издательство «Лань», 192 с.
180. Львов Н.Д. Вирусы герпеса человека 6,7 и 8 типов-новые патогены семейства Herpesviridae//Bonpocbi вирусологии.-1999.-3.-с. 105-109.
181. Власова М.А. Влияние бессимптомной генитальной герпетической инфекции на исход беременности и состояние здоровья новорожденного. 2000. Дисс. к.м.н. Владивосток.
182. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров А.А., Гребенюк В.Н. Герпес (этиология, диагностика, лечение). 1986. М. Медицина. 272 с.
183. Roizman В. Herpesviruses. In: The Molecular Biology of Tumor Viruses. Ed. By Tooze J. 1973. p.470-501.
184. Daiminger A., Schalasta G., Betzt D., Enders G. Detection of Human Cytomegalovirus in Urine Samples by Cell Culture, Early Antigen Assay and Polymerase Chain Reaction//Infection.-1994.-22.-l.-p.24-28.
185. Collandre H., Aubin J-Th., Agut H., Bechet J-M., Montagnier L. Detection of HHV-6 by the polymerase chain reaction//.!. Virol. Methods.- 1991.-31.-p. 171-180.
186. Букринская А.Г., Жданов B.M. Молекулярные основы патогенности вирусов. 1991. М., Медицина. 255 с.
187. Delius Н., Clements J.B. A partial denaturation map of herpes simplex virus type 1 DNA: Evidence for inversions of the unique DNA regions// J. Gen. Virol.-1976.-33 .-p. 125-133.
188. Sterz H., ludwig H., Rott R. Immunologic and genetic relationship between herpes simplex virus and bovine herpes mammilitis virus// Intervirology.-1974.-2.-p. 1-13.
189. Buchman T.G., Simpson Т., Nosal С., Roisman В,. Nahmias A.J. The ф structure of herpes simplex virus DNA and its application to molecularepidemiology//Ann. NY Acad. Sci.-1980.-354.-p.270-290.
190. Little S.P., Jofie J.T., Courtney R.J., Schaffer P.A. A vision associated glycoprotein essential for infectivity of herpes simplex virus type 1// Virology.-1981.-115.-p. 149-160.
191. Марченко JI.А. Генитальный герпес. Новые клинические аспекты. Проблемы репродукции.-1996.- 4.- с. 29-33.
192. Mindel A. Genital herpes "the forggotten epidemic"// J. Internat. Herpes Management Forum.-1994.-1 (2).-p.39-48.
193. Павлюк A.C. Методы лабораторной диагностики заболеваний,вызванных вирусом простого герпеса//Заболевания передаваемые половым путем.- 1994.-3.- с. 3-7.
194. Kudashov N.I., Ozerova О.Е., Voroshilova G.P., Lvov N.D., Ivanova N.V. The role of herpes simplex virus in the pathogenesis of cerebral lesions and visceral disorders in newborn infants//Akush. Ginekol.- 1990- 1.- p. 24-28.
195. Safrin S., Shaw H., Bolan G., Cuan J., Chiang C.S. Comparison of virus culture and the polymerase chain reaction for diagnosis of mucocutaneous herpes simplex virus infection//Sex. Transm. Dis. 1997.-24.-3.- p. 176-180.
196. Kudo E., Shiota H., Kinouchi Y., Mimura Y., Itakura M. Detection of herpes simplex virus DNA in tear fluid of stromal herpetic keratitis patients by nested polymerase chain reaction//Jpn. J. Ophthalmol. -1996.-40.-3 p. 390-396.
197. Коршунов B.M., Володин H.H., Ефимов Б.А., Саркисов С.Э. и др. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах. 1999.Учебное пособие. МЗ РФ. М.
198. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. 2001.С-Петербург. ООО «Нева-Люкс». 364 с.
199. Тэйлор-Робинсон Д., Хэй П. Патогенез бактериального вагиноза и возможные причины возникновения заболевания//Заболевания, передаваемые половым путем.-1998.-№3.- с.3-5.
200. Полищук Н.А. Клинико-лабораторная характеристика бактериального вагиноза в сочетании с другими инфекциями. 2001. Дисс., к.м.н., М.
201. Larsen В., Galask R.P. Vaginal microbial flora: composition and influences of host physiology//Anil. Iffteru. Med.- 1982.-96.- p. 926-930.
202. Giorgi A., Torriani S., Dellaglio F., Bog., Stola E., Bernuzzi L. Identification of vaginal lactobacilli from asymptomatic women// Microbiological Rev.-1987.-p.3 77-384.
203. Забирова T.M. Биологические свойства лактобацилл биотопов человека в норме и при дисбиозах, 2001. Дисс.к. м. н. Оренбург.
204. Цвелев Ю.В., Кочеровец В.И., Кира Е.Ф. Анаэробная инфекция в акушерско-гинекологической практике//Питер-пресс.-1995 .-С-Петербург. 320 с.
-
Щербо, Сергей Николаевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.15
- Разработка систем идентификации грибов - возбудителей экономически значимых болезней зерновых культур методом ПЦР
- Конструирование тест-систем для выявления ДНК возбудителей чумы, туляремии и сибирской язвы методом мультилокусной ПЦР
- Филогенетическая принадлежность штаммов Yersinia pestis основного подвида из природных очагов России и сопредельных государств
- Разработка и адаптация молекулярно-биологических технологий для диагностики дифтерийной инфекции и изучения штаммов Corynebacterium diphtheriae
- Совершенствование молекулярной диагностики холеры и сибирской язвы
