Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индикация и идентификация флавивирусов методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Индикация и идентификация флавивирусов методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот"

РГ6

М^П/СТДРСТЗО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ТОМСКИМ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК

На правах рукописи

ДРОКИН

Дмитрий Анатольевич

ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЛАВИВИРУСОВ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ кислот

03.00.0fi — вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТОМСК 1993

Работа выполнена в Шоком научно-исследовательском ин-

ститута приоодяоочаговых инфекций Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора ГО.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник В.И.Злобин

Официальные оппонент«: доктор биологических наук, старший научный сотрудник ¡1.П.Мертвецов кандидат медицинских наук, старший научвдй сотрудник А.И.2анков

Ведущее учреждение: Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

Завита состоится ¿¿¿уь^пи- 1993 г. в часов на заседании специализированного совета К.098.11.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических паук оря Томском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин и сыворот.ок (634050, Томск, др. Ленина, 32).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского научно-исследовательского института вакшм и сывороток.

Автореферат разослан ^¿¿^иъЛЛ 1993 г.

'Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Л.Н.Полещух

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, В семейства флавивирусов, насчитывающем более 60 представителей, переносимых комарами и клещами, имеется немало возбудителей серьезных заболеваний, таких как лихорадки, энцефалиты, геморрагические лихорадки. Многие деоятки тысяч людей ежегодно болеют флавивируонымя инфекциями (:'on-.;ti;, 1986), Наиболее важными среди них являются: клещевой энцефалит (КЗ), широко распространенный б умеренной поясе Евразии, желтая лихорадка (ЮГ) - в экваториальном и субэкваториальном поясах планеты, лихорадка Денге -в тропиках, японский энцефалит ^ЯЗ) - в Восточной, Юго-Восточной и Южной Азии, лихорадка Западного Нила Í3H) - в Северной Африке, Юкной Европе, на Ближнем Востоке и в Средней Азии, энцефалит Сен-Луи (ЭОЛ) - в Северной Америке, энцефалит долины Муррвя (ЭДМ) - в Австралии.

Надежный метод индикации флавивярусов необходим для проведения ранней диагностики флававярусних заболеваний, определения вируоофорнооти переносчиков фмивирусов, исследовании диких животных. Среди существующих методов индикация флавивируоов вое большее распространение получает иммунофер-ментный анализ ШМ). Альтернативой ему мог би стать мвтсд молекулярной гибридизации нуклеиновых киолот ШИК), не уступающий Шк по чувствительности и скорости получения результатов и детектирующий непосредственно вирусный генетический материал в исследуемых образцах.

Большую проблему представляет идентификация вируоов. Большинство флавивярусоз входит в состав нескольких антигенных групп, внутри которых вирусы трудно дифференцировать благодаря наличию существенных антигенных перекрестов между ними. Многие серологические тесты не различают близкородственные ВИДЫ флавлвирусов (Calisber et si., 1989; Stephenson al., 1989), Самым надежным тестом, как а десятки лат назад, остается реакция нейтрализации (РН), требующая: боль-лих затрат времени и труда. Метод ШЕ очень специфичен, особенно при использовании олигонуклеотадных зондов, способна* выявлять тонкие различия в геномах иИаманин и др., TS9I; ríallaee et al., 1979), вследствие чего он представляется перспективным

для быстрой и надежной идентификации флавявирусов.

Ранее метод '.ИНК с использованием плазмидных зондов был применен для индакаши вируса КЭ в клэаах и клинических образцах: (Плетнев и др., 1985} Ницанко и др., 1989; Буковская и др., 1990), вирусов грушщ Денге в культуре клеток (кьап, \7rieirt, 1987), а используя олигонуклеотидные зонды, изучали пггаымовые различия вирусов КЭ и Дэягн 2 (Шаманил и др., 1991 { Пехаоапег сь о1.,К86). Квтори отмечали высокую специфичность МГНК, но не использовали этот метод для идентификация штаммов флавявирусов.

Цель и задачи исследования. Целью работы било создание видо- и группосаецифичных зондов, исследование возможности их применения в ИНК для индикации к идентификации флавнви-руоов.

Б задачи исследования вхопело!

1. Проведение сравнительного анализа Структур гэномов флавявирусов, выбор учаотков геномов, специфичных для определенные видов и групп флавивируоов, получение синтетических оли-гонуклеотидных зондов, комплементарных этим участкам.

2. Изучение специфичности получекгш* олигонуклеотядных зондов, формирование иавора зондов гуш идентификаций 9 видов флавивируоов, относящихся к 4 основным антигенным группам (.группам КЭ, ЯЗ. М и Денге).

3. Оптимизация метода МГНК для индикации и идентификации флавивируоов.

А. Апробация ЖГНК дая иядикагда флавивирусов в различных пробах (клещах, комарах, млекопитающих, крови больных) к идентификации штаммов фяавивиру.соз, а также сравнение вффак-тивнооти применения МШК пля этих целей с эффективностью наиболее широко используемых для этих целей серологических методов.

Натчная новизна работы. Впервые получены синтетические олкгонуклеотиднне зонды к больному числу флавявирусов не оо-нове анализа отруктур их геномов; впервые о целью индикации и идентификации флавивирусов получен и Применен набор синтетических виде- я грушзоспецафичгаоЕ олигоиуклеотмщнх зондов; впервые разработан метод идентификации флавивирусов на основе МГЕК; впервые для индикации.вируса КЭ применен нерадлоак-

тивномач9нны& зонд; впервые проведена индикация флавивирусов методом МГНК в пробах от позвоночных животных из природных очагов флавиэируснкх инфекций и вируса йгекой геморрагической лихорадки ЮГЛ) в крови болышх.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработаны и адаптированы для практического применения методы индикации и идентификация флавивирусов, оо-нованныэ на .',ПЖ; получен набор зондов, позволяющий идентифицировать штаммы основных представителей флавивирусов; произведена апрбация шгазмидных и олигонуклеотидных зондов для индикации флавивкрусов в различных источниках: клещах, комарах, млекопитающих, клиническом материале я идентификации штаммов флавивирусов, выделенных из различных источников.

Практическая реализация работы. На основе данных, полу-ченннх в ходе исследований, была подана заявка на изобретение "№бор для идентификации флавивирусов", положительное решение № 48923S8/I3 - I202I8 от 7 января 1992 г.

По итогам работы было подготовлено информационное пиоь-мо "Индикация и идентификация флавивирусов методом молекулярной: гибридизации нуклеиновых кислот о синтетическими оли-гонуклеотиднша зондами", утвержденное ре-аанием ПНЦ № 3 от 20 апреля 1992 г.

В Государственно! коллекции вирусов были депонированы 9 щтаммов флавивирусов.

Апробация.таботы. Результаты исследования доложены на:

- Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемиологии, диагностика и профилактики клещевого энцефалита"

U\ Иркутск, IS90 г.);

- Всесоюзной ошпоэиунв "Арбовирусы и арбовируснне инфекции" tnoc. Лыткино Московской обл., 1991 г.);

- Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклео-тиды: проблема и перспективы практического применения"

(г. Москва, 1991 г.).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 9 печатных работах.

lía защиту выносятся следующие положения: I. Олигонуклеотидныа зонды обладают высокой специфичностью, позволяющей дифференцировать близкородственные виды флавивирусов. На основа анализа структур геномов можно получать

синтетические олигонуклеотицние зонды о разной специфичностью: видо- и группоспещфичше,

2. Сформирован и апробирован набор олигонуклеотидннх зондов, полученных к 9 видам флавивирусов, для идентификации штаммов флавивирусов.

3. Чувствительность и специфичность ЬТГНК с использованием плазмидных зондов к вирусу КЭ позволяет проводить индикацию вирусов комплекса КЭ в полевом и клиническом материале о одновременной идентификацией штаммов до антигенной группы» Более высокая специфичность ЫШК с олигонуклеотидными зондами позволяет проводить идентификацию флавивирусов до вида, но при индикации требуется предварительное биологическое накопление вируса.•

Объем и отруктурэ диссертации.. Диссертационная работа ■. состоит из введения, обзора литературы, четырех глав .собственник исследований, обсуждения, выводов. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста й иллюстрирована 15 таблицами и 4 рисунками. Библиографический указатель (.на 26 страницах) содержит 213 источников, из которых 61 отечественный и 152 зарубежше.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и матом. Б работе использованы тташы флава-, тога- и аренавируоов. Флавивйрусы: КЭ (Со$ьин, Удб-17, Е-21, АЭна/Г448, 4072, Абоетгароа, Лесойарк-ТТ, Тенис-1, Иугул-1, Бузуучук, Преголя-8), Негиоя. (прототмпнаЗ, В-Ш), шотландского энцефаломиелита овец ШШ)ч(И-40), КиаеанурскоЗ лесной болезни ИЛЕ), ОГЛ (Боголюбовка), Лангет 1ТР-21, Скалкца), По-вассан (3£21), ЖЛ (Дакар), ЯЭ (Ддагар 01, АТ-31, Сагара, Ха-ч сан-19, СП-69, Я-47, ДВК-4, Какаямй НИХ, Лекин-1, 46-2, м-мутант Мукаи), ЗН (прототипнай, Е 101, НР-94, Йг-2266, 1640, Нентерия, Ливидуа), Карта, Эй, ЭСЛ, Денге I Ш) (Лэвайи), Денге 2 (12) Шью Гвинея Б), Денге 3 (ДЗ) Ш-87), Денге 4 (Д4) (Камбоджа 62-С6), Тогавируоы: Синдбис (УРМ-ЗЭ), лихорадки леоов Сеылнки (Смятбурн;, восточного энцефаломиелита ло-надеИ. Аренавирус: лсглфоцнтарного хориошнингита ШЧ-Г>22). " ¡»гпт.*.« вируса ЯЭ были лябезно предоставлены нам В.В.Погодиной

{Институт полиомиелита и вируоных энцефалитов), птаммы вируса КЭ Лооопарк-П, Тенис-1, Нугущ-1, Бузуучук, Преголя-8 выделены нами и депонированы в Государственной коллекции вирусов, остальные штаммы получены из Государственной коллекции вирусов. Кроме того, при исследовании полевого и :<лшическо-го материала нами били выделены и идентифицированы еще 31 штамма флавивярусов: КЭ (1910, 2002, 2053, 2082, 2145, Нен-терия 86, Флавееценс-22, <5лазесценс-41, *лавесиенс-70, Рябчик, 20А, 51А, 641, 760, 786, 4628, Í638, Д-ов), ОГЛ (Ориба-теи-83, ¡I-I5, П-31, M-I5, I.Í-3I. К-ан, К-ев, К-ий, С-оз, Т-ко, У~ов), ЗН (Шал, Бентерия, Ливицуо, 932), ЯЭ (Нарван).

йсоледовано 1680 особен иксодовых клещой, 48300 особей кровососущих комаров, 53 пробы мозга грызунов и насекомоядных, 25 проб крови больных о подозрением на флавивирусные инфекции. Для выделения РНК попользовали метод горячей феноль-ной экстракции t'Jherrer, 1969). Нанесение образцов PIK на нитроцеллюлозные фильтры, цредгибридизацию и гибридизацию, экспонирование с рентгеновской пленкой и оценку результатов проводили по (!.1аниатио и др., 1984; ГСаманин и др., 1990).

Б работе использовали 4 пяазмидных зонда, содержащих участки генома вируса КЭ: р51.1 - 5'-область, гена С и преМ (о (около 1000 пар нуклеотидов), р? - ген Е (около 1500 пар пук-леотидов), рНЗ-IICS - ген пзя (около I30G пар нуклеотидов), р3.20 - конец гена Г35 и 3'-область (около 500 пар нуклеотидов). Использовали также 19 синтетических олигонуклеотидных зондов, характеристики которых приведены в таблице I. Плаз-шщы р51 Л, р7, рИЗ-ИСВ и рЗ.20, а таете олигонуклеотиды Ш, 1113, 1115, Л26, .'331, ÍI33-ÍI35 были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории рациохимш Новосибирского института биоорганической химии. Олигонуклеотиды 126 а ФТ-НО получены нами. Плазмидиие зонды метили нсполы^я методику ник-трансляции изотопом ^Р (Г.'.ашатио и др., 1984) или биотипом Clerfcstj'iteens, 1985). Онигонуклеотидные зонды метили 32Р о помошья полинуклеотидкиназы Т4 (Маннатис и др., IP84) или де-зоксптуклеотицилтраноферази lía, colon, 1980).

Изоляцию ашеивпрусов из полевого и клинического материала, пассирование шташов 'Ггавнвирусов проводили на новорожденных белых г,;шшх. Для доведения FH по метолу !-';mJeX

Таблица I

Структуры синтетических олигонуклеотидкнх зондов

Зонд Последовательность Вирус Локализация в генома

Ш ЩТ1ШЦ1Ш7ГТЦЦГ1111ЦЩ кэ преМ, 639-658

:пз ТЦ;иГА:ЩЦАТ,1ЦЦГЦААЦГ КЗ преМ, 837-856

Ш5 на! ¡аатгцтг1щттт1шааатаатцц кэ Е, 1282-1303

1126 ГГГТЦТЦетцГАА'лцгцгаг ЕЛ 3"-область, 1070910728

ГОТ ГЦМЦТТЦ.Г^иГЦАШ1А кэ 1Т81, 3498-3515

ПЗЗ гцаацттцтгцагг1дц!1а зн Г31, 3388-3405

П34 гцагцтщсгцааа1й1щ эда ГЗ-1, 340&-3420

П35 ацагцт1 шзтща11аш1а эсл И31, 3396-3413

Л26 гццщаг. 1т11гтгтгцт щ дт ко 5'-область, 108127

цтаггаг птатгтггатат нэ 3'-область, 1090710926

Ф2 а№ 1гцтагащщщгцгш кл 3'-область, 1069910718 ■

ФЗ атшот;штптлггтат Л1 С, 242-261

Ф4 ' АТАГСШТГШЩЩАЦГ Д2 Е, 2281-2300

Ф5 тт;тгАГАГ11Тгцг1ггц Д4 5'-область, 81-100

Ф6 шц^шттгттгагацат ада 5'-область, 94-113

Ф7 ТЦАГАГАТЦТПШтДТА Д2 5'-область, 80-97

Ф8 цтацтаагтттгт 1щл1гца зн 5'-область, 17-36

Ф9 Т1ШАгтггттгг1Щ,ц эяд Е, 1075-1091

Ф10 ггаттцццггцгааааалцг эся 5'-область, 76-95

Обозначения: * - указан ген шг гегрансляруемая область и позиции яуклеотияов от 5'-гонца генома

(1978) использовали 6—8 г белнх мы'лей, Постановку реакции связывания комплемента (РСК) проводили в мккроиодифгасяции По общепринятой методике (Методические рекомендации по лабораторным и полевым исследованиям арбовирусов, IS75), :й>А в прямом варианте для выявления антигена вируса КЗ проводили по (Voller et al., Г979). Прямо!! метод флюоресцирующих антител (¡Ш) с Дшннесцируюшей си коротко;!, полученной к штам\?у Софьин вируса КЭ, осуществляли о использованием клеток СПЭВ, выращенных на покровных стеклах и инкубированных в течение 58-72 ч посла инокуляции суспензиями клешей.

Для Приготовления антигенов (АГ) использовали метод са-харозо-ацетоновоЯ экстракции (Clarke, Casals, 1957). Растворимые AT готовили из еахарозо-ацетоновнх по методике, они-саниоЛ Лавровой и Обуховой (I078j. (Ь.мушшо асцшшо жидкости (1!АД) получали на 20 г белых мышах по методу üronovsky, Benda 11981 J.

Дяя статистичоскоЯ обработки результатов попользовали биометрические методы (Урбах, Т964; Терзптьев, Ростова, 1977). При компьютерном анализе структур геномов флавивиру-СОВ использовал» программы "ИесЪзап microbenie", "Becknaa ßoftviare. Version 4-'.

Результаты и обсуждение

Получение синтетических олигонуклеотидкых зондов и изучение специфичности олигонуклеотидшх и ллазвидннх зондов

Па основании компьютерного анализа первичных структур геномов 48 штаммов II видов флавивирусов нами были выбраны короткие участки геномов, специфичные для различных видов и групп флавивярусов. К таким участка;,; .били получены синтетические олягенуклеотидные зонды, ¡.'.и исследовали 19 олигонук-леотидных зондов, комплементарных различным учаспсам геномов 9 видов флавивирусов. Специфичность олигонуклеотидных зонпов изучали в ЩЖ с коллекцией гатаглмов, гмючающеЯ 20 гатаммов 17 видов флавивирусов и 4 штамма 4 вирусов других групп. Результаты ШЖ, предстагмонгшо в таблице 2, в целом подтвердили праеильноеть выборя нами участков геномов фла-

ыширусов для получения 13ицо- и группоспеци.фичных зондов« Группосдетфическимя свойствами обладали 4 олигонуклеоткдннх зонда. Зонд Г!5 гпбрлдизовался с И К 4 вирусов комплекса КЗ: КЭ, Реггааи, Г'ОО, КЛБ; зонд Я2С, проявивший наиболее широкую специфичность, - с вирусами ИЛ и групп ЯЭ и Деиге? зонд <>6 -с вирусами гсуппы ЯЭ} зонд Ф7 - с вирусами группы Денге. Кроме того, межвидовая гибридизация была отмечена для зондов 1!Э1 и Л26, которые гибрвдизошлись с вирусом 1?егнта, и дня зонда ПЗЗ, гибрлдизоЕятогооя о РЖ вируса Карм. Вое остальные олигонуклеотидкие зонды проявила видоспецифичность, то есть гибридизовались только с ИШ гомологит»;х им вирусов! СТ и П;3 - с РЯК вируса КЭ, <Л - ЯЭ, '12 - ¿1, ФЗ - Д1, 04 -Д2, Ф5 - Д4, 08 - ЗН, 1Ш и ч<9 - ЗШ, ¡135 и ФЮ - ЗОЛ. !!и один из олигоиуклеотидныг. зондов иэ гибридизовался о Р51К тога- или аренавпрусов. Специфичность плазмицкых зондов р51.Т, р7, рПЗ-ПСЕ, р3.20 изучали с тем же набором штаммов Флави-вирусов, при этом для всех 4 зондов наблюдали примерно одинаковую картину гибридизация. МаксимальныЛ уровень гибридизации отмечали с РНК вируса КЭ, е тазшв вирусов 1|,ЭО и Неги-ши. С РНК вирусов ОГЛ, КЛБ и Лангат уровень гибридизации был примерно на порядок ниже,. а Р1К других флапивирусов не гибридизовались с плазмидными зондами к вирусу КЭ.

Сялгонуклеотидные зонды, полученные к вирусам,' характеризующимся наибольшим генетическим многообразием - КЭ, ЯЭ ' к ЗН - были изучены с наборами штаммов этих вирусов. |!!таммы относились к различным антигенным вариантам, были выделены в различных регионах, в газика годи и из различных источников. Группоепещфгеше зонды 1126 и <Т6 гибридизовались с Р:1К всех штаммов вирусов ЯЭ и ЗН, а зонды, ранее проявившие себя как видоспецяТшчяне, - только со тааммами гомологичного вида. При атом зочд >Л гибридизовался с РНК 10 штаммов вируса ЯЭ из II изученных, зонд Ф8 - с Р1К всех В изученных штаммов вируса ЗН, а зонд ЯЗЗ - только с РНК 4 штаилов вируса ЗН. С РНК всех 10 исследованных штаммов вируса КЭ гибридизовались только зонды Ш5 и Л26, с РИС 9 штаммов - зонд ,!!3, о РЖ 8 штаммов - зонд 1131. При гибридизации РНК штаммов вирусов КЭ, ЯЭ и 311 с различными олигонуклеогидными зондами была отмечена пчутрпвадовая генетическая гетерогенность птаммов этих

Таблица 2.

ГвЬрцдвзадаа спнтеютесзпа: одпгонуклеотццшгх зондов с НЖ Лгаштцрусов

йпт» (ЕташГ101! ДВ }• ps |Ш1}дге{-дг j se j ai \im\ & )дз4| jmsjsioj аз} S4 j as'

кэ (Goíbssa) ++++++- - — — - — - - - - - - - _

КМДбсетаарсш) ++++++-- - - - - - - - - - - -

Негзшя — -н- + — • — — — — — - — —

ОШ - - - - - - - - - - -- ___

К2Б + - - - - - - - - - ___

¿антат — — — — — — — — — — — — — — — — —

Повассан — - - - - — - — - — - - - - - - -

21 - - __ __ ___ ___

ЯЭ (Даатар 01) - - ++- +++*-- - - - - - - - - -

ЯЭ (Накажа НИХ) - - - -м- - ++ ++ - - - - - - - - -

® ЗН (Е 101) - - - ++- ++-++++_ ___ ___

ЗН {lie 22SS) - - - ++_ ++• - ++ ++ - - - - - - -

Карев - - ++ - + — + - - - - - - - -

щд - - ++- — — -++*+-- - - -

зшЁ - - ++ - ++- - - - _++++-_-

лх ++++_-

р, - - ++- - - - - - - -- -Н---Н.-.

д| - II £ I I I _ II III £ I , I

Обозначагшя! ++■ - внеокпй уровень твбрздизацш, + — низкий уровень гкбрздазагцш, -ase гибридизации

- OTCyTCÍ-

вирусов, проявлявшаяся в наличии или отсутствия, а также в степени гибридизации их с разлитыми зондами.

По результата:,: ;;селе,',лва'-ш специфичности различных зондов нами diu с йо широка 11 набор в;що- и группоспецифичных зондов, предназначении;! дня идентификаций яргажов флавивирусов. Б набоо во-ш: в качестве группоспоцифичных: плазиидные зонды к виоусу КЭ как группоспецифичные для комплекса КЭ, блиГо-нуклеотидш! зонд !\'5, специфичный для вирусов КЭ, Негида, Г1Э0 и КЛБ, зонд Л26, специфичный дня вируобв ЕЛ и групп ЯЭ . и Денго, зонд '.6, специфичный дня вирусов группы ЯЭ, зонд <57, специфичны;! для вирусов группы Денге. В качестве видосйеод-фичнкх в набор вогалн сленуотие олигонуклеоглдше зонда: 03 -к вирусу КЗ, 42 - к вирусу ХД, '-Л - к вирусу ЯЭ, Ф8 - к вирусу 31!, 09 - к вирусу эда, WO - к вирусу ЭСЛ, ФЗ - к вару-, су Д1, Ф4 - к вирусу Д2 и Ф5 - к вирусу Д4.

Определение чувствительности молекулярной гибридизации с илаалвдпшй и олигонуклеотиднши зондами

Нами била проведена сравнительная оценка чувсгвйтельнос-ти ШЖ с плазмицнимя зондами, мечеными радиоактивйоЯ й нерадиоактивной «летками, и олигонуклеотиднкми зондами о »дннкчю5 и множественно.t радиоактивными метками.

Чувствительность 1ДЖ с плазмидннми зондами р51,1, р7 и р3.20, мечен иши 32Р, составила I пг вирусспецифичвской кДНК или виоусной РИ;, выделенной из вирионов вируса КЭ, очищенных ультра центр*/Фуг ипованием. Биотин-мечетшИ зонд р51.1 Позволял выявить в тех же образцах 10 пг вируссйеайфическоА нуклеиновой кислогн. При индикация вируса КЭ а мозговой ткана инфицированных белых мыло чувствительность !ДЖ о рчдиоактивноме-ченяыми зоилами составила 10 пг, а с биотикмёченчш - 100 пг вирусной РНК.

Олигонуклеотигсша зонды Ш5, ii, ПЗЗ, 1134, Ш5 и Ф4, содержащие -единичную метку ЖР, использовали для индикации го-мологнчннх га флавивирусов (КО, ЛЭ, ЗН, ЭЛЛ, ЭСЛ и Д2 соответствию) в мозговой ткани инфицированных белых мняэй. Чув-ствчтольчость .ИГШ; с зондами 45 и <Л составила 100 пг, с зондами '131 я И - 2fi0 пг, с зондами 1133 и П35 - 500 пг вирусной РНК. Ивпкоапе в зонды Г'5 и множественной концевой метки

Ю

позволяло повысить чувствительность ГИбрПДИЗПЦШ! до 50 пг вирусной РНК.

Оптимизация условий проведения молекулярной гибридизации

Важнейшим фактопок, влияющим ня уровень и специфичность 1.Ш, является температура, пли которой происходит процесс гибридизации (Еударков и др., IS90). Оптимальную т.ег.тесату-ру гибридизации с олигонуклеютидннми зондами рассчитывают по формуле, учитывающей размер н нуклеотидны! состав олигонук-леотида O'einbotu, v/ahl, 1981). Оптимальные значения температуры гибридизации ин определили экспериментально для всех используемых ия«я олкгоиуклеотпдннх зондов. Экспериментально установленное и теоретически рассчитанное значения совпали только дяя зонда 07, для всех остальных зондов формула расс-чета давала значения заввчешшэ на 3-12°С по сравнению с экспериментально установленными * йы установили также, что в диапазоне ± 5°С от экспериментально установленных значочи'!. оптимально.! температуры гибридизации уровни специфической гибридизации и фона остаются практически неизменными, поэтому ГШ1К можно проводить в этом диапазоне без снижения специфичности г:е?ода.

Кроме Того, нами были определены оптимальные условия послвгибрпдиэащюпноЯ отмывки фильтров, выделения я хранения РНК.

Индикация флавиг.крусов в полевом и клиническом материале

В ходе эксперимента до сравнению эффективности трех экспресс-методов индикации вггоуса КЗ в клешах - методов !ДГНК, Ж'А и ЖА - исследовали 1480 особе!* иксодовнх клешеi, ■ собранных тз Калининградской, Новгородской, ПермскоЯ, Новосибирской, Сахалинской областях и Хабаровском крае. Б Калининградской области были собраны клещи D. reticuiatus, а в остальных регионах - I. persuloatus, Из собранных клеше't сформировали 148 пулов. Все пулн исследовали в ШЖ с шизмидчим зондом p5t.I, '.ГА а биопробе па новорожденных белых мчэах, в МЛА исследовали 134 пула. Положительными в биопробе были 62 пробы (4Т,0!б от числа исследованных), в ПГНК - GS (14,Гу7),

в И-:-А - 37 (25,0;;), в ПОА - 26 119,4::*;. Гйекду данными, полученными всеми методами, наблюдали достоверную корпеляцию, которая била наивысшей между биопробоЗ и ЛЖ, между биопробо.5 и :К'А. Сравнительны.! анализ эф Активности индикация вируса КЗ в клешах, собранных б различных частях нозоареала КЭ, показал, что на эффективность серологических методов UffiA и .АI могут оказывать слияние антигенные вариации штаммов, циркулирующих на различных территориях, Так, эфьективность !'К>Л, коньюгат для которого был получен на основе уральского ■штамма 4072, била максимальной при индикации вируса КЭ в клещах, собранных на Урале и в Западной Сибири, л значительно меньшая при исследовании клещей, собранных в Европейской части России и на Дальнем Востоке. В то же время э|>ректив-иость iffilK была одинаково высокой при исследовании ыатеоча-ла, независимо ст района сбора.

Параллельно в биопробе на ионорочцепних белых мымах и в МГНК с плазмидннм зондом р? и олигонуклеотядными зондами ШЗ, L15 и !I2fi исследовали суспензии НО индивидуальных клещей I. perauicnUas из Олеко,i области, 58300 комаров 4 видов рода Aedest объединенных в 2S2 пула, собранных в Or.icKo.i, Новосибирской областях л Алтайском крае, а также 40 образцов мозга мелких млекопитающих (32 - от грызунов и 8 - от насекомоядных), собранных в СмскоД области. Было показано, что чувствительность МЯК с олигонуклеотицшш зондами недостаточна для непосредственной индикации влруса КЭ в иссчедоваи-ных пробах, но после первичного заражения белых мычаЗ оли-гонуклеотиднне зондн позволяют детектировать вирус во всех образцах положительных в блопробе, из которых были изолированы штаммы вируса КЭ. э^йектипность .не использования плаз-мидных зондов для индикации шруса КЭ в ^тешах и «елкнх мдекотгга.-ляих находилась на одном уровне с эффективностью биопробп. 1!и в оцно^ из проб комаров вирус КЭ не был детектирован метопом .ИГНК непосредствен'ю, но в трех изолятах, полученных после парвлчного заражения белых мндей, вирусная PILK обнаруживалась как с полотью плазмидных, так и с помошыи олигоиуклеотичдах зондов Ш и Гб. В биопробе изолировали 9 штаммов р.уc-'i КУ от кленюЛ, 3 ита-лма от комаров, 3 штамма от грпзуноп и 1 :irav,i от наоетлоятчих.

Образцы крови 25 больных с подозрением на КО и ОГЛ из Олек о Л и ПоЕосибг.рсг.оЛ области исследовали в ШК с шгазмнд-ным зондом р7, оллгонуклеотидным зондом ',г5 и в №"А с тест-систегло ! для индикации ЛГ вируса КЭ. Образцы крови бальных с подозрением на ОГЛ кроме того исследовали в биопробе. Шестнадцать проб крови были Положиельни одновременно в '.¡ГШС и 1!>А, очна проба была положительна только в МГНК. При исслодог вании в бяопробе 13 образцов крови больных с подозрением на ОГЛ из 6 образцов выделили вирус. Бсо они были положительны в МЖ с плазшщннм зондом и !КЛ, нп из одного образца отрицательного в 1.1ГПК и Л>'К вирус изолировать не удалось. Олиго-нуклеотидны.} зонд К5 позволил детектировать вирусную РНК в 3 пробах от большие с подозрением на КЭ, причем в этих случаях в ЖЖ о плазмпдннм яондом было показано высокое содержание виру свой РЖ в образцах.

Обращает на себя икиание рапная эффективность применения !ЛЖ с плазмидньи.ги зоппами л биопробн при ипдзжашто вирусов КЭ и ОГЛ в полевом и клиническом матопиале, в то воемя как в модельном эксперименте на лабораторных минах Ш1К уступает биопробе но чувствительности на 5-6 порядков. Ряней феномен одинаково! эффективности ЮТ и биопробы при индикации вируса КЭ в клешах и кпови большое такие бнл отмечен, его объясняли пеоптяпальными условиями репликации вируса' КЭ в организмах некоторых хозяев, прп котооых значительная часть вирусной РНК'не входит в состав инфекционных вирионов, что объясняет повышение эф активности .'.ДНК как метода индикация вируса КЭ Шансуров я тп., 1989;.

В дальнейшем птам-ш, выделенные из проб, положительных в ¡ДНК при исследовании полового материала были идвитиГжии-рованы как чггаикм вируса КЭ, а дамки, внцвдешша от больных с подозрением на ОГЛ - как тгяммн вируса ОГЛ.

Идентификация стгаммов флавивирусов

Для идентификации отобрали 4Г изолят, гнделппнн! из разнообразных источников в различных региона*. Српди исследуемых были: [9 иаолятоп от членистоногих - от пастбищных глете<1, У - от клеши! убэтишно-поротго комплекса, 4 - от

клешей, сочетающих пастбищные и убежшдно-норовые элементы, 3 - от комаров), 14 изолятов от позвоночных животных (2 - от птиц, 9 - от грызунов, I - от насекомоядных, 2 - от рукокрылых), В изолятов от больных людей. Выделены они были в Калининградской, Поркской, ТюмакскоЗ, СыскоЗ, Новосибирской, Иркутской областях, Алтайском и Приморском краях, Башкирии, Киргизии и ¡Шдии. ' . -

£ качестве методов идентификации использовали ¡ЛГНК с набором видо- и группоспеци5>ичных зондов, P1I на белых мышах, РСК с сахарозо-ацетоновыми и растворимыми AT, t№A.

Бее изоляты били идентифицированы в ШШ (таблица 3), 23 из них по данным гибридизации были отнесены к вирусу КЭ, все они гибридизовались с плазмидиыми зондами и олигонуклео-тидным зондом Ш5, а также хотя бы с одним из зондов Ш1 и Г13. Среди них были изоляты от адещей (Тенис-1, Нугуш-I, Бузуучук, 2145, 1910, 2002, 2053, 2082, Нрегоя-8, Нентерия 86), от комаров 1Флавосцонс-22, '¡лаиесце]1с-41, 0лавесценс-70;, птицы (Рябчик), грызунов (2"?А, 5IA, РЛА, 7S0, 786), рукокрылых (4628, 4638) и от больного (Д-ов). Для двух изолятор наблюдали высокий уровень гибридизации с зондами, специфичными для комплекса КЗ (р51Д, р3.20 и 1К5), такоЗ характер гибридизации ранее отмечали для рирусов Негдащ, С;Э0. Одиннадцать изолятов от болышх (К-ан, К-ев, К-ил, С-ов, Т-ко, У-ое), ондатр (11-15, '.¡-Г5, П-31, 1,!-31) и убежищных клешоЛ ^Орибатеи 83) гибридизовались на более низком уровне с плазшщныш зондами и не гибридизовались ни с одним олигонуклеотиднш зондом. Аналогичны Л характер гибридизации наблюдается для вирусов ОГЛ н Лангат. Пять изолятов гибридизовались с груп-аоспециЬичными зондами 1126 u -'G, на основании чего их можно отнести к группе ЯЭ. Четыре из них (Ливидус, Нентерия, Ямал и 932) гибридизовались такие с зондом '-'б, то есть являлись Штаммами вируса 3.4, а одни (Нарван) - с зондом И, что указывает на принадлежность его к вирусу ЯЭ.

В РН идентифицировали II штаммов. При втом принадлежность штаммов Лишдус, ¡'вптерия, Янал и 932 к вирусу 311, a также штага,юв Флавесцзнс-ЙЙ, ^лавеспенс-Ц и '1 лавесценс-70 к вирусу кЭ была подтверндена. Мтада /ieconapic-II, по данным МГНК oTHoceHHUil к наиболее близким к вирусу КЭ вирусам Неги-ти шш 1 30, по результатам РН мы отнесли к вирусу КЭ, хотя

Таблица 3

Идентификация штаммов флавивирусов методом молекулярной . гибридизации нунлеяновнх кислот

Зонда

1м8ммн p5l.ljp3.20 ш1 } шз И5 ¡1126 Ф6 01 { Ф8

I 2 { 3 5 б Ь 8 •9

Тенис-1 ++ 44 4 4 ++ _ _

Нугуи-1 4+ 44 4 ++ ++ - - -

Бузуучук 44 44 4-+ + ++ - -

1осопарк-П 44 44 - - ++ . - - - -

2145 44 44 4 + + - ■ - - ■ -

1910 44 44 - + + - - -

2002 44 44 4 ++ 44 - - -

2053 ++ 44 4 - 44 - - - -

2082 44 44 4 44 +4 - -

Лив иду с - - - - - 44 . 44 - ' 44

Преголя-8 44 44 4 + 44 - - - -

'!ентерия - - - - - 44 44 - 44

Нентерия 86 +4 44 4 + +4 - - • ~

Ямал - - - - - 44 44 . - • 44

Орибатеи 83 - 4 - - - - -

В-Ш +4 44 - - 44- - - - -

Флавесцонс-22 44 4-4 - + + - -

Славесценс-И ++■ 4- + + + 44 тЬ - -

'•лаввсценс-70 44 44 + - 44 - - - -

932 - - - - - 44 4 - 44

Рябчик 4 + 4! 4-4 + 44- - - - -

:.!-Т5 4 1-

4 f

II-Г 5 4 4

[-31 4 4

'¿7А + f 1-4 - 4 44 - - - -

П1А 44 44 -4 ♦ 4 44 - - „ -

¡>4А 4 4 ~ )-4 - - - -

700 * 1- 44 4 4 1 4 4 4 - - -

76 Г> 1 4 ■1 ) . » '

Продолжение таблицыЗ

Г ¡2 Г, ! t J i ¡4 I ! 5 i 6 h 1 8 ! о ! f 9 1 110

2 OA ++ + _ _ _

4628 ++ ++ - - - - -

4G3S ++ ++ ++ - - - -

К-ан - - - - - - -

К-ев -1- +

к-иа ■t- +

С-ов + +

Т-ко +

У-ов + +

Д-ов ++ ++ + +4- - - - -

Парная — - — — — ++ —

Обозначения: ++ - высоки.í уровень гиДридизяшм, + - нпзкиЗ уровень гибридизации, — отсутствие гибридизации

•л наблюдали суиеотвениое отличие его от штампа Софьин. Разница индексов нейтрализации штамма Ласопарк-TI гомологичной НАЛ и iiA£ к оттешу Сорьин составила 2 ir; bbgQ, а такод гложет бить разница между наиболее близкородственными флавиви-русами (Caliaher et al.,I9C9J. Три штамма от ондатр Ul-31, 1Л-Т5, M-3I) идентифицировали как штаммы Еируса ОГ'Л.

Яо результатам идентификации в РСК 15 штаммов получили следутиа дашгае: штаммы Тенис-1, 1!угуш-Т, Лесопарк-IT., Бу-чуучух, Г1роголя-8, Славосценс-il и ,лапесцанс-70 били отнесены к вирусу КЗ, шташш Срлбатеа £3, ¡.¡-15, ,.i-3T, 1Mb и 11—31 - к вирусу ОГЛ, а штампы Лнвицус, Поптерия и Лмад - к вирусу 31. Специфичность с-харозо-ацегоповых АГ не всегда была достаточной для четко! дифференциации близкородственных вирусов, в то время, как растворимые АГ позволяли однозначно идентифицировать uto.imu.

С .тест-системой для определения АГ в:шусм КЗ последовали 21 штамм, лва из них U:ffi¡tir>'c и !кштерия> ня основании данных и I'll огкесешие к i-upvcy ЗН *>«•: orp:inrt-тельние результаты. Остальные ке ; шумлю»' ймн полочп— тельны, п;)Л ого.! не инЛ^цдои ра.тчнЛ л---у .«•«•¡:¡4<.<:.\ri

представителями комплекса КЭ. В число этих 19 изолятов входили: Тенис-1, Нугуп-1, Лесодарк-П, Бузуучук, Пряголя-8, 2115, 1910, 2002 , 2053, 20Й2, Д-ов, ранаэ отнесенные к вирусу КЭ, К-ан, К-ев, К-я.1, С-ов, Т-ко, 7-ов, Орибатаи 63, отнесенные к вирусу ОГЛ, а также В-Ш, отнесенный к вирусу Неппи.

Данные по идентификации $лавивируоннх изолятов методом ГЯЖ с одно;! стороны и серологическими метопами с друге 1 ни в одном случае не противоречили друг другу. Изоляты, идентифицированные в МГНК как гатяммы вирусов КЭ или 311, в серологических тестах идентифицировали аналогично. К сожалению, наличие зондов только к одному про дета в ;гт элю комплекса КЭ -вирусу КЭ - не позволяло установить точную видовую принадлежность ряда изолятов, хотя по характеру гибридизации их о разными зондами удалось сузить число предполагаемых видов до двух (ОГЛ или Лангат для штаммов от ондатр, больных о подозрением на ОГЛ, Орибатея 83, а такта Негши, !"Э0 для штамма В-Ю. ¡1дентификация этих штаммов в серологических тестах позволяла уточнить данные ЮТ. Для штаммов В-Ш и Нарван имелись предварительные серологические данные, на основании которых они были опроделенш^й^йтамгш вирусов Легши и ЯЭ соответственно. X V

Таким образом, в результате пар&ллелыю!! идентификации разнообразных изолятов (Тлавивирусов различными методами ми получили убедительное совпаденяа данных 'МГКК с одно^Я стороны и серологических тестов с другой.

Следует отметить, что данные, полученные в ходе опитов по индикация Лягзв'.гаирусов, били подтверждены щ5и идентификации изолятов из полового и клинического материала. Из всех чроб, ггтбридпзоппихся при ш!дикашиЗ£?пидос1теци$1ГЧ11ым зондом 5113. были выявлены только чтгшми вируса КЭ, а яз проб, гибрчлизовагпихся с зондами групггоепвгеифлчнвмя для комплек- • ся КЭ '1ыли пиелены птам*ш вирусов комплекса КЭ - КЭ а ОГЛ.

в ь в о л и

I. Прорятсч ч'иляз структур геномов 'Мавивирусоз, на основе кэтоплго гчбраин участки гексмов с последовательностями, унш'пть'шмч для различных вилоп т» групп Флавя^ярусо?.

Т7

2. Изучение специфичности полученных олигонуклеотидных зондов подтвердило правильность выбора участков геномов; получены видоспэцифичные зонды к 9 флавивирусам; вирусам КЗ, ЖД, ЯЭ, ЗН, ОД,!, ЭС1, ДГ, Д2, Д4, а также группоопецифичные зонды, один из которых гибридизуется о вирусами 3£Л и групп ЯЭ в Денгэ, второй - с вирусами группы ЯЭ, третий - с вирусами группы Денгв и четвертый - с Л вирусами комплекса КЭ (ШЭО, Нагиши, КЯБ и КЗ). Из видо- и группоспецифичных зондов сформирован набор, позволяющий идентифицировать штаммы флавивиру-оов, результаты подтверждены классическими методами.

3. Оптимизированы условия проведения ИГНК, позволяющие повысить чувствительность и специфичность метода.

4. Олигонуклеотищгав зонды обладают высокой специфичностью, что обеспечивает выявление тонких различий в геномах и позволяет дифференцировать близкородственные виды вирусов;

по специфичности МГНК аревооходит ША и РСК с сахарозо-аца-тоновшии антигенами, на уступая РН и РСК с растворимыми антигенами.

5. Радиоактивномечвнныа шшзмидные зонды, содержащие участки генша вируса КЭ, позволяют проводить экспресс-индикацию г идентификацию вирусов комплекса КЭ в МГНК в полевом и клиническом, материала, по вффективности индикации не уступая биопробе и ИФА и превосходя МФА. При использовании олиго-нуклеотидных зондов для индикации флавивирусов в крови больных или переносчиках в больяинстве случаев необходим предварительный пассах исследуемого материала на белых мышах; дополнительные затраты времени в этом случае компенсируются возможностью одновременной индикации и идентификации флави-вирусов.

6. На основании результатов МГНК с олигонуклеотпдными зондами, полученными к различным участкам геномов вирусов КЭ, ЯЭ и ЗН, подтверждены данные о внутривидовой генетической гетерогенности этих вирусов.

Список работ, опубликованных по тема диссертации:

I. Дрокин ПЛ., Злобин З.М., Каманин В.А. Применение молекулярной гибридизации для идентификации штаммов Еируса клещевого энцефалита II Прироцноочаговые болезни человека. -

Омск, 1990. - С.33-35.

2. Злобин В.II., Квегковя Э.А., Наволокин О.В., Мансурог П.Г., Дрокин Д.Пицепко Н.Д., Добракова Е.П., Р'амашш

Б.А., Лтетпев А.Г., Вертинский Б.Б., Закревская A.B., Свешникова ¡.'.О., Гигакипа Г .В., Верета I.A., Нуховская U.M. Сравнение трех экспресс-методов индикации вируса клещевого энцефалита // Бодр, вируоол. - 1990. - '¡¡Т. - С.57-59.

3. Р'аманин В.А., Плетнев А.Г., Дрокин Д.А., Злобин В. if. Применение молекулярной гибридизации с синтетическими дезок-сиолигонуклеотидамп для дифференциация штаммов вируса клетевого энцефалита // Современ. проблемы эпидемяол., диагностики и профилактики клешевого энцефалита. Гез. докл. Всесоюз. С!эдп. - Иркутск, 1990. - С.Г5-16.

4. Дрокин Д.Л., Злобин В.П., ¡'"аманин D.A., Плотнев Л.Г, Использование синтетических олигонуклеотидов в качестве зондов для идентификации фгавивирусов // Современ. лроблемн эпидемиол., диагностики я профилактики клешзвого энцефалита. Тез. докл. Зсесопз. сшш. - Иркутск, 1990. - С.97-98.

5. Дрокин Д.А., Злобпп В.П., ртаоднин В.А. Выбор оптимальных олигонук.таогадпыг зондов для идентификации Флавшзи-русов // Итоги науки и техники. Вирусология, т.24. Арбовиру-сы и арбавирусные инфекции. - !,!., Í99I. - С.5Р-60.

G. Калмин О.Б., Якименко В.3., Дрокин Д.А., Богданов И.й., Бусыгин О.О. Изоляция вирусов комплекса клещевого энцефалита из кровососущих комаров i:а юге Западно:-! Сибири // Природноочэго^ые. болезни-человека. - Омск, 1991. - С.91-95.

7. Дрокин Д.А., Злобин В.Я. Набор для идентификации-Флавиьярусов, Положительное решение по заявка 4892388/13/ I2Ü2I8. от 07.01.92.

8. 7,lobj71 V.l., SJinronin V,A., Urokin D.A., Plfitnav A.3. ITs ir. 7 Of ths synthetic olisonucleobiile рг-оЪез for iti-V3stiär.ti;n of tict-born? encophalitis virus genetic vari-abiXJty // Wwicli Acids $упго~згип Serien, Z4-, - Oxford, 1991. - Г.г»,

9. ¡siovit» V.l., taokir. Ö.A., V.A. Synthetic

r'iBoxyo] ironucleolridn /ч'оЪез Гот idl^ntifitsatiOTi cf flyvii'i-runes // ''uel-sic 'iVoiiln ¡Jynpoai un Oeries, 24. ~ OxforO,

i?n

;c