Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение природных популяций вируса клещевого энцефалита методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение природных популяций вируса клещевого энцефалита методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот"

российская академия медицинских наук

Научно-исследовательский институт вирусологий имени Д.И.Ивановского

«Тв он

На прапзх рукописи ...г УДК 578.883.26:67.083.2

ПЛОВСКАЯ Наталия Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МЕТОДОМ МОЛШЛЯРНОИ ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание учейой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Хабаровском научно-исследовательском института эпидемиологии и микробиологии Государственного комитета санитарно-эпидемиологического надзора Российской федерации. ;

Научные руководители: заслуженный деятель науки России,

профессор, доктор медицинских наук

|Л7ДТВорёта

доктор химических наук А.Г.Плетнев

0фи1|иалыше оппонэитны: заслуженный деятель науки России,

почотшй академик РАЕН, профессор, доктор медицинских наук С.Я.Гайдаморич кандидат биологических наук О.Е.Еуйшцкая

Ведущая организация: Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича Государственного комитета сатиарно-опидемиологичбскагс надзора Российской Федерации.

Защита состоится " ^" 1994 г. на заседаню

Специализированного Совета Л 001.20.02 при научно-исслвдователь ском институте вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН по адресу;

123098, Москва, ул.Гамалеи, 16.

»

Автореферат разослан _"_ 1994 г.

С диссертацией мозщо ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь

Специализировашого Совета

кандидат медицинских наук А.М.Жуковский

п

<и

_Актуальность_прдблеки. Клещевой энцефалит (КЗ) занимает наиболее важное место среди заболеваний, вызываемых арбовирусами на территории России, На Дальнем Востоке его природам очаги занимают обширную территорию. Среди циркулирующих штаммов вируса выявлены высокспатогенные варианта, способные вызывать тяжелые формы заболевания. Развито молекулярно-биологичеасих методов, е частности метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот ГТЛГНЕ), позволяет проводить исследования' на принципиально новой основе - изучения и выявления РНК вируса клещевого энцефалита (Плетнев А.Г. и соэвт., 1985). При апробации метода МГНК для индикации .необходимо оценить полноту ■ выявления различных вариантов вируса и степень сходство РНК свежевыделенных штаммов •вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и эталонного штамма -Софыш, на основе которого создана Тест-система для постановки МГНК. С другой стороны, результаты сравнения нуклеотидных последовательностей РНК штаммов ВКЭ с .помощью 'гибридизация отражают молекулярные основы географической изменчивости и гетерогенности природных популяций вируса, что представляет несомненный теоретический и практический интерес. Возможности . метода МПШ по индикации и определению количества вирусной РНК в клещах-переносчиках открывают новые перспективы более детальной характеристики вирусных популяций непосредственно в природных очагах, оценки потенциальной эпидемической опасности изучаемой территории.

Цель настоящей работы состояла в изучении методом молекулярной гибридизация нуклеиновых кислот генетических вариантов вируса клещевого энцефалита, циркулирующих в дальневосточном регионе, и определении параметров вирусофорности индивидуальных таежных клещей в природных очагах Приамурья и о.Сахалин. В соответствии с цельи были определены следующие задачи: .1. Изучение методами молекулярной гибридизации генетических вариантов ВКЭ, циркулирующих з дальневосточном регионе. 2. Определение параметров вирусофорности методом МГНК в сравнении с традиционными вирусологически! способами.

3. Изучение ■ трансовариальной передачи ВКЭ иксодовыми клещами с помощью метода МГНК.

Впервые с

помощью метода МГНК проведено сравнение РНК свежовыделенных штаммов ВКЭ, циркулирующих в дальневосточных природных очагах, и эталонного штамма Софыт, изолированного в 1937 г. также на Дальнем Востоке. Показана возможность применения рекомбинантных. плазмид с ДНК-вставками, комплементарными участкам генома шт. Софьин, для индикации ВКЭ (вирусной РНК). Проведено сравнение МГНК с методами биопробы и ИФМ при Еыявлегаи ВКЭ в таэжних клещах.

Гибридизация с синтетическим! дезоксиолигонуклаотщцшми зондами выявила отличил нуклаотидных пасладовательностой РНК дальневосточных штаммов от аналогичных структур шт.Софьин. Вместе с тем, для дальневосточных природных популяций ВКЭ отмечена .большая степень сходства РНК различных по биологическим свойствам штаммов с РЖ шт.Софьин, чем для сибирских и приморских вариантов вируса. РНК дальневосточных штаммов ВКЭ гибриди-зовалась с дезоксиолигонуклеотидными зондами, комплементарными участкам РНК, соответствующим как консервативным, так и вариабельным среди фпапивирусов аминокислотным последовательностям.

Впервые получены данные о вирусофорности индивидуальных клещей в очагах КЗ Прйамурья и о.Сахалин и количестве содержащейся в них вирусной РНК, изучено пространственное распредела-ше таенных клещей и вируса КЭ по територии природных очагов.

Разработана модификация МГНК для детекции РНК вируса. КЗ в напитавшихся самках икродид и полученных с^т них яйцекладках. • Изучена динамика трансовариальной передачи ВКЭ. '. На основе результатов работы составлено и подано три заявки на., изобретения, получены приоритетные справки. По двум заявкам есть положительные решения о выдаче патентов - по "Способу отбора производственных штаммов вируса клещевого энцефалита", заявка £ 4853821/13(062883), и "Способу консервации клещей переносчиков арбовирусов", заявка & 4884567/13(113423).

Материалы работы нашли свое отражение в гс'.формационно-методическом письмо "Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот как метод быстрой диагностки клещевого энцефалита" (Омск, 19Э2). Представлено шесть информационных писем для Хабаровской крайСЭС, Сахал1шской облСЭС и Хабаровского крайздравотдела. В информационных письмах изложены результаты апробации метода МГНК на Дальнем Востоке, представлены данные о вирусофорности ' таежных . клещей при исследовании единичных особей и особешюстях пространственного распределения таежных клещей и ВКЭ в различных растительных группировках природных очагов КЭ Приамурья и о.Сахалин.

По результатам выполненных исследований на защиту выносятся еледающие положения диссертации:

1. Показана высокая чувствительность и специфичность метода МГНК с использованием рекомбинантных шюзмид при изучении генетических вариантов ВКЭ, циркулирующих в природных очагах Дальнего Востока.

2. Результаты гибридизации с дезоксиолигонуклеотидными зондаж подтверждают положение о генетической* неоднородности природных популяций вируса, установленное ранее с 'помощью вирусологических методов. . :

3. Впервые для дальневосточных природных очагов определены параметры вирусофорности при изучении индивидуальных таэзашх клещей и йзучоно пространственное распределение клещей й'ВКЭ по территории природных очагов Приамурья и о.Сахалин, ■ выделены наиболее потенциально опасные по КЭ участки территории. '

4. С помощью метода МГНК изучена трансовариальная передача ВКЭ иксодовыш клещами. Получены данные, • свидетельствующие .об Увеличении количества вирусной РНК у самок ■' при татании на теплокровных животных и о передаче РНК ВКЭ только, части яиц в кладке. - . • ' .

Публикация^ апробация работы. По . материалам диссертации опубликовано 8 статей. Основные результаты исследований доложены на Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Биология кле-

б

щового энцефалита" (Новосибирск, май 1987 г.). на научно-практической конференции "Клещевой энцефалит" (Новосибирск, апрель'1989 г.), на восьмой Всесоюзной конференции по медицинской географии "Реализализация и пути повышения эффективности медико-гаографичоских исследований" (Ленинград, октябрь 1991 г.).

. Диссертация изложена на 139 страшат, ислючаицих 24 таблицы, 8 рисунков к список литературы (122 ccujiiai). Работа состоит из сведения, трех глав, обсуждения результатов и выводов. Глава I состоит из двух частей - "Opraim-низация генома флавивирусов" и "Гетерогенность природных популяций флавивирусов" (обзор литературы). В главе П представлены использованные материалы' и методы, в главе Ш - собственные исследования.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

^т§риалы_и_мето5ы. Половые наблюдения и сбор клещей для вирусологических исследований проводили в трех пунктах стацио парного наблюдения в Хабаровском крао и Сахалинской области Пункты стационарного наблюдения в Хабаровском крае расположены на юге (п. Кия, район ¡»¡.Лазо) и севере ( п.Кондон, Солнечного района) зоны хвойно-широколиственных лесов. На о.Сахалин клещей собирали в окрестностях п.Калшпшо Холмского района (юга западное побережье острова ). Согласно схеме геоботашиескогс районирования (Толмачев А.И., 1955) данная территория относитсг к подзоне южной тайги. Для очагов КЭ юга зоны ХЕойно-широкс лиственных лесов Приамурья характерна высокая епидемическа* активность, для севера зоны она ниже, а для очагов о.Сахалш свойственно малош!тенсивное эпидемическое проявление' (Борет: Л.А. и соавт., 1973; Коренберг Э.И.,1979).

За период I985-1990 гг. исследовано на зараженность В И 998 иксодовых клещей, в том числе 4 398 индивидуальных особ методом МГНК и 480 методом ИФА. Параллельно методами биопроб Ш1 и МГНК изучено 712 пулов клещей по 10 экз.

Для получения яйцекладок самок иксодовых клещей на разни

вазах. насыщения кровью собирали с домагагах животных в п.Кип района ш.Лазо Хабаровского края во П-Ш декаде кал 1386-1983 гг. Зсего било изучено 175 самок иксодид, от 62 из них получена 201 троба яйцекладок и 18 проб личинок.

Вирус КЭ изолировали из клещей путем заражения белых шагай кассой 6-8 г и последующего пассирования. Идентификацию выделенных нейротрошшх агентов проводили с помощью РБН, РТГА, КФМ и модификации МГКК. Титры вируса б 1В50 расчитывали по Риду и Менчу, статистическая обработка результатов проведена с использованием общепринятых методик. За время работы было изолировано и типировано 24 штамма из клещей I.parsulcatua и 2 штамма из мозга умерших от КЗ людей.

Постановку гибридизации осуществляли как описано Добриковой Е.Ю. и соавт. (.1986) я Шаманшшм В.А. (1990). Выделение нуклеиновых кислот проводили по Маниатис Т. и.соавт. (1984). Рекомби-нантные плазмиды pBR 322 ДНК ЕКЭ и дезоксиолигонуклеотидннв зонда получены от научного сотрудника лаборатории радиохимии Новосибирского . института биооргаЕлческоЙ химии СО АН СССР В.А.Шаманина,' кДНК-Фрагменты РНК ВКЭ - от сотрудников той же 'лаборатории Е.Ю.Добриковой и О.В.Морозовой. Тест-системы для выявления антигенов ВКЭ с использованием поликлонзльных и монокло-нальных антител в спот-варианте предоставлены,сотрудником той Ж8 лаборатории Л.З.Матвеевым, постановку Ш проведена в соответствии с методикой, описанной Матвеевым Л.Э.и соавт. (1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЩЕНИБ 1 '

Гибридизация РНК дальневосточных штаммов срекомбинантными плазмидами pBR 322 ДНК ВКЭ. Для оценки полноты выявления вариантов ВКЭ, циркулирующих в дальневосточных природных- очагах,■ проведена сравнение гибридизации плазмвд pBR 322 ДНК ВКЭ с РНК-штаммов*из коллекции отдела природно-очаговых инфекций ХНИЙЭМ и РНК эталонного штамма Софыта, на основе которого создана тест-система для постановки МГНК. Штаммы, использованные для гибридизации, относились к трем различным природным популяциям . (юга и ; севера зоны хвойно-широколиственных лесов Приамурья и подзоны

южной тайги о.Сахалин) и прешли, с основном, незначительное число пассажей (2-4). Том не менее, ¿ик 16 из 18 штаммов гибридизо-валась с плаомидами'рБН 322 ДКК БКЭ аналогично шт.Софьин - в точке, соответствующей 20 нг суммарной мозговой РНК (пик развития клинических явлений), определено 10 пг РНК БКЭ (рис. I). Исключение составили- только два спзжовдол^нгшх штамма на уровне I и 3 пасежой, уровень гибридизации которых на порядок гоже . Штаммц природной популяции о.Сахалин по показателям гтатогенно-сти, размеру -близок и ряду других гонотичоских маркеров отличны от циркулирующих на моторике, по тем по менее РНК отих штаммов хорошо гибридизовалась с ре«№'инаптга.'1.'и плззмнлами.

■ Расчет количества ЬП^, соогвотствуадго 10 пг вирусной РЖ, показал некоторый разброс показать от 4,7 до 8,5 Ы)Кд, который определялся различными значениями показателей па-тогеююсти .при внутримозговом способе зараташя. Для большинства изученных штаммов, как и для шт.Софьин, 10 пг вирусной РНК соответствовало 5,0-6,5

Полученные результаты свидетельствует о возможности применения диагностических препаратов на основе «локироваших в бактериальных плазмидах ДНК-копий РЖ БКЭ для кндикащги вируса

20 нг

2' НГ

и;«а т т т • <, «

и

I

^■¿у: г, У'=л Г.4" : ^ %

Софыга 205 209 228 241 139 129 1с 815с

Рис. I. Радиоавтограммы проб РНК, выделенных. из мозга мышей, зараженных различными штаммами ВКЭ. Пробы нанесены в соответствии с ' содержанием суммарной мозговой. РНК : (20 нг, 200 нг, 2 мкг). •

(вирусной РНК) в материалах из природах очагов. РНК дальневосточных штаммов ВКЗ, выделенных из различных источников (клощи I.persulcatus, мозг умерших людей) и различии по сбоим биологическим свойствам, гибридоовалась с рекомбинантными плазмидами аналогично FHK шт.Софьин, на .основе которого была сконструирована тест-система для индикации вируса методом ГОЖ.

Д§29ксио^гднуклеотидных_зондо . Дезоксиолигонуклеотидные зонды были синтезированы в соответствии с куклеотидноЯ последовательностью эталонного шт.Софьин, определенной Плетневым А.Г. .и со-авт. (1Э39): Первичная структура РНК дальневосточных штаммов ВКЗ изучена в сравнении с эталонным штаммом Софыш с помощью набора дезоксиолигонуклеотидних зондов, комплементарных участкам генома, соответствующим структурным и неструктурным белкам (С, ргМ, М, Е, HS 1, IJS 2Б, HS 4В). Некоторые зонды (Ш4, В5, П2 и П31) соответствуют аминокислотной последовательности, консервативной для других флавивирусов - И, денге 2, ЯЭ, а зонда Ш1, Ш2, ГО, П5, ПЮ, IHSГ - вариабельным участкам' (Шамагога В.А., 1990). Зонд ПЮ2 является аналогом зонда Ш4 с единичной нуклеогадной заменой. Оценку уровня гибридизации проводив как визуально (рис.2), так и с помощью подсчета радиоактивности - на фильтрах. Гибридизацию с РНК шт.Софьин принимали за I0QZ, для прочих, штаммов уровень гибридизации рассчитывали, в процентах по отношению

ГО .

ПТ31-

-. 'Софьин ' 205 7 ' . 209* - К. '241 129 .* 134* ' 1с 315с v 815о

Рис. 2. Результаты гибридизации с синтетическими дезоксиолиго-нуклеотидными зондами проб РНК различных шташов ВКЗ и схема., их расположения (К - проба РНК,- выделенная из 'мозга, незаряженных мышей).. \ ' ' ' ''

ш

к шт.Софыш с учетом контролей. Сроди изученных 12 штаммов с РНК четырех гибридизовались вро дезоксиолигонуклеотидные зонды, пяти - не гибридизовался одшг зонд, РНК одного штамма не гибридизовалась с. двумя зондами, двух штаммов - с тремя из К зондов (табл. I). .Если сравнить дальневосточные штаммы I зависимости от принадлежности к той или иной природной вирусшй популяции, то 'наиболее близкой к шт.Софыш группой являют^ штаммы, изолированные на юге зоны хвойно-широколиствеинш

Таблица I ■ Гибридизация дозоксиолигонуклаотидпых зондов с РНК различных штаммов ВКЭ

дозоксиолигонуклеотидц

Ш1ШШ П2 П5 пю П31 ГП02 П131 Ш1 1112 ШЗ Ш4 Ш5 а

Софыш ++ 44 ++ ++ 44 44 44 44 44 44 -14 И/И

205 44 44 ++ - - 44 4^ 44 44 н.и. 44 а/ю

2 ■++ 44 ++ : ++ н.и. 44 44 44 4 + 44 44 10/10

7 44 4 +1 - 44 4 4 т н,к. 44 9/10

39 44 44 ++ 44 н.и. •н 4ь 4 44 44 44 10/10

51 44 ++. 44 н.и. 44 4 44 44' 44 44 ю/ю.

209 . ' ++ 4 '+4 4 4 44 . 44 44 44 н.и. 44 ю/ю

241 44 4 44 4 - 44 4 44 4-1 н.и. 44 9/10

129,. 44 - 44 - - ++ 44 4 .44 н.и. 44 ' 7/10

134 - 4 , ++ 4 4 . 4+ 4 44 44 н.и. 44 9/10

1с 44 ++ - 4 44 44 44 44 н.и. 4 9/10

315с 44 44 - - 44 44 44 44 н.и. +4. • 7/10

$5с • 44 •н .++ 4 44 4 44 44 н.и. 44. 9/10

Примечания: соответствует уровню-гибридизации по отношению шт.Софьин 0-5,0$,"+" - от 5,1 до 20,0%, "44" 20,1-100,ОХ, "н.и." - не исследовано. N - число ГИбрИДИЗуЮЦИХСЯ зондов"по рТНОШеНИЮ к числу исп0л1 зованных 'дэзоксиолигонуклоотидоб.

лесов, т.е. там же, где был выделен шт.Софьин. Только в этой группе определены варианты вируса, которые гибридизовались со всеми использованныгш зондами. Штаммы, изолированные из клещей, собранных на севере зоны хвойда-широколиственных лесов Приамурья или подзоне южной тайги о.Сахалин, отличались от шт. Софьин в несколько большей степени. Изученные сахалинские штаммы ВКЗ были отличны от шт.Софьин по области генома, соответствующей зонду П31 (участку белка N51)- только один из трех шгагжов имел уровень гибридизации несколько выше 5,Ой. Гибридизация дезоксиолигонуклеотидных зондов с РНН ВКЗ других географических регионов выявила заметные отличия этих вариантов вируса от шт.Софькн (Шаманин.В.А,, 1990; Злобин В.И. и соавт. 1992). Некоторые из этих штаммов реагировали только с двумя или тремя зондами, в то же время штамм Хабаровск-17 был' неотличим от шт. Софьин.

• Таким образом, гибридизация РНК дальневосточных штаммов ВКЭ с синтетическими дезоксиолигонуклеотидными зондами, комплементарными определенным участкам генома шт.Софьин, выявила отличия нуклеотидных последовательностей РНК ряда штаммов- от аналогичных структур шт.Софьин. Эти'результаты подтверждают ранее порученные• с помощью вирусологических методов данные о гетерогенности природных популяций ВКЭ на Дальнем Востоке (Верата Л.А., Воробьева . М.С., 1990). с тем, для дальневосточных природных популя-

ций ВКЗ отмечена большая степень сходства нуклеотидных последовательностей геномной РНК различных штаммов с РНК шт.Софьин, чем для вариантов вируса иного географического происховдения.' РНК дальневосточных штаммов ВКЭ ' гибрвдизовалась ' с: дезоксиолигонуклеотидными зондами, комплементарными участкам РНК, соответствующим как консервативным, так и вариабельным среди флавиЕирусов аминокислотным последовательностям.-

Изучение вирусофорности клещей 1.рег8ц1са^ _метддрм_ШД в сравнении с методом биопробы и И1. Пробедено сравнение метода МГНК, И и биопробы.при изучении вирусофорности клещей 1.рег-зи1са1.из, собранных в природных очагах Приамурья и о.Сахалин.

Метод МГНК, в отлично от катода биопроби, позволяет выявлять вирусную РНК непосредственно в исследуемом материале, не требует наличия жизнеспособного возбудителя и ого накопления в организме лабораторного животного. В процессе анализа не происходит отбора, как при культивировании на культуре тканей или при пассировании на животных. При этом детектируется вирусная РНК, как в составе вирионов, так и в составе рвпликативного'комплекса и дефектных интерферирующих частиц. Достоверно определяется 10 пг РЖ ЕКЭ, результат, соответствующий ■ 1-10 пг считают С0Ы1ШТ0ЛЫШМ (Добрикова Е.Ю. и соавт., 1936). Сравношю зпачошгй вирусофорности (доли клещевых пулов, в которых выявлен вирус или вирусная РНК), полученных при внутримозговом заражении мышей и с помощью МГНК, показывает, что РНК ВКЗ выявляется чаще, чем удается изолировать вирус. Наличие вирусной РНК в клещевых пулах отмочено и в те годы, когда но удавалось выделить штаммы ВКЗ. Для природных очагов юга' и севера зоны хвойно-щироколиствешшх лесов близкие значения вирусофорности получеш как при изучошш методом биопробы,, так и при детекции вирусной РЖ. Средние значения-за период изучения составили для ига 5,Ш,2Х методом бпопробн и -14,2+1,9Х методом ЮТ (1985-1930 гг.) и 3,4+1,4 и 14,4+2,7% соответственно для севера зош (1935, 1937-1989 гг.). Для юга зош хвойно-широколиствешшх лэсов Приамурья отмечены колебания значений вирусофорности при определении методом .биопробы, раное описанные Л.А.Берета (1975). Максимальные значения вирусофорности соответствовали • росту показателей заболеваемости на изученной территории. В то же время, в клещевых пулах РНК ВКЗ' выявляли примерно на одном уровне, возможно, что в годы высоких значений вирусофорности (при определении методом биопробы) в природной популяции ВКЭ возрастает доля вирулентных штаммов, что является одним, из факторов, обуславливающих эпидемически неблагоприятную ситуацию. Кроме этого, для года подъема заболеваемости определено увеличение численности клещей и продолжительности периода их активности, следствием чего является увеличение числа лиц,

подвергшихся нападению клещей.

Для природного очага КЗ Сахалинской области (за период I985-1988 гг.) отмечены несколько более высокие значения виру-софорности при выявлении вирусной РНК (18,4+2,7%), чем для очагов Приамурья. В то же время, только в 1987 г. удалось выделить вирус КЗ. Трудности изоляции ВКЭ в сахалинских природных очагах, скорее всего, связаны с особенностями .циркулирующих здесь вариантов вируса, для которых ранее'отмечены низкие значения вирулентности.

При. параллельной постановке биопробы, МГНК и трех систем для постановки Ш.1 (двух экспериментальных серий ШТБХ СО РАН спот-варианта с использованием поликлональных и моноклональных антител 2НЗ в качестве подлого; и коммерческого набора института вирусологии ш.Д.II.Ивановского РАМН) в клещевых пулах, из которых выделен вирус, детектирована й РНК, и антигены ВКЭ, причем при использовании всех трех тест-систем. В части проб определено наличие вирусной РНК' и антигенов ВКЭ при отрицательной биопробе, а в отдельных пробах - только РНК ЕКЭ или его антигенов. В целом, можно' отметить, что значительная часть проб, в которых была детектирована РНК ВКЭ, была положительна . и при использовании тест-систем для постановки ИФМ, хотя количество выявленных положительных проб заметно отличалось при использовании различных иммуноферментных тест-систем.

Возможным свидетельством в пользу селективной роли'"клёток мозга по отношению к различным вариантам ВКЭ являются результаты детекции вируса и вирусной'РНК при внутримозговом пассировании вируса. Только для части клещевых пулов, в .которых выявлена вирусная РНК, отмечено ее накопление в- мозгу мышей - для GG,7+IO,3S пулов, в которых выявлена РНК ЕКЭ в количестве 10 пг и более, и для 46,2+13,8% пулов в которых детектировано 1-10 пг вирусной РНК. Аналогичные данные получены и для проб, в которых выявлены антигены ВКЭ - в 52,9+8,6% проб при достоверных и в 68,8+11,6% при слабоположительных результатах. Часть природных вариантов ВКЭ не закрепилась при внутримозговом заражении, е

ряде случаев РНК или антигены ВКЭ обнаружены только в селезенке. Штаммы ВКЭ были изолированы из пулов, для которых при заражении мышей отмечено наличие РНК или антигенов ВКЭ или в мозгу и селезенке, или только в мозгу.

При сравнении доли клещевых пулов и мозговых суспензий для постановки порвого слепого пассажа, в которых выявлена РНК ВКЭ, наблюдается та же тенденция. Вирусная РНК выявляется чаще в клещевых пулах , по сравнению с суспензиями для первого пассажа -14,2+1,9 против 9,1+1,(р<0,005) для юга, 14,1+2,7 против 5,9+2,32 (р<0,025) для севера зоны хвойно-широколиственных лесов Приамурья и 18,4+2,7 против 12,7+2,7% (р<0,2) для сахалинского природного очага. В то же время, для вариантов ВКЭ, способных закрепиться при внутримозговом заражении мышей и дальнейшем пассировании отмечено увеличение количества РНК при проведении пассажей (рис. 3). Если в клещеых суспензиях, в большинстве 'случаев детектируется 10-пг РНК ВКЭ, то через 6-8 дней в мозгу инфицированных мышей - 100 пг и более, а на следующем пассаже - около ! нг .вирусной РНК (объем исходной суспензии - 0,2 мл). Аналогичные результаты получены при параллельной постановке №Ш., Для части кандидатов в . штаммы было отмечало наличие РНК ВКЭ и в оещбЕых,. и в мозговых суспензиях, но количество РНК при пассировании не возрастало. Такие изоляты не закрепились' в пассатах. Увеличение детектируемого количества РНК ВКЭ при •проведении пассажей, на наш взгляд, позволяет типировать изоляты как штаммы ВКЭ. Все кандидаты в штаммы, для которых отмечено увеличение количества вирусной РНК , были котированы как штаммы ВКЭ с помощью РБН, РТГА и Ш.

» . Более детальная характеристика природных очагов КЭ получена ' при изучении 1шдивидуальных таежных клещей (табл. 2). Метод МГНХ позволяет учитывать как долю инфицированных клещей, так и количество вирусной РНК в отдельных' особях. Значения вирусофзрности таежных клещей во всех изученных природных очагах находились примерно на одном уровне в каждом из очагов в течение периода наблюдения, так же.как и при изучении клещевых пулов. Средние

2 35 4?

•I -П 'I -п 'П

53 107 114

! *п /п -ш -п

i 119 122 127 I -I -Ш -I -п -Ш 129

•I 'П '1р "кл.с.

129 138 •Пр *1

• 10 "I -п

II

•I -п 'Ш

18 23

■I -I -п *Ш

25

"п

Рис. 3. Радиоавтографа и схема расположения проб РНК, выделе-ланшх из мозговых суспензий кандидатов в штаммы. Арабски,и; цифрам! обозначен номер кандидата в штаммы, греческими - пассаж, "р" - реизоляция, "кл.с." - клещевая суспензия, "сл.п." - слепой пассаж. Кандидаты в штагом 35, 129, 10, И, 23, 204 были типированы как штаммы ВКЗ при последующем изучении.

•показатели зараженности клещей, собранных на юге и севере зоны хвойно-широколиственных лесов достаточно близки - 10,0+1,0 для юга и 12,2+1,2$ для' севера зоны. РНК ВКЭ достоверно чаще (р<0,005) детектирована в клещах, собранных на о.Сахалин, по сравнению с югом зоны хвойно-широколиственных лесов Приамурья. Несколько больше и доля клещей с содержанием РНК ВКЗ 100 пг и более - 13,9+2,3 среди инфицированных клещей, собранных на о.Сахалин, против 8,0+2,6 на юге (р<0,2) и 6,7+2,756 на севере (р<0,05) зош хвойно-широколиственных лесов. Вероятно, что более высокий уровень инфицированное™ (по данным fffHK) таежных клещей и в то же время крайне низкие значения вирусофорности при' выделении вируса на мышах отражают особенности природных

Таблица 2

Значения вирусофорности таежных клещей в пориод массовой активности при определении методом МГНК

год самки самцы общее количество

юг зоны хвойно широколиственных лесоп Приамурья "

1985 7,1 + 2,6 ' 10,0 + 3,0 8,6 ^ 2,0

1986 14,3 + 9,4 9,8 + 4,2 10,8 1 3,9

1937 ' 10,0 + 3,2 7,8 + 2,8 8,9 + 2,1

1988 . 11,3 1 3,5. . 13,4 1 3,8 12,5 + 2,6

1989 12,2 + 3,4 6,7 I 2,6 9,4 1 2,2

1990 13,3 + 5,1 . ' 9,1 1 4,3 11,2 + 3,3

1985-1990 10,6 + 1,5 9,5 +. 1,4 10, .0 + 1,0

север зоны хвойио-широколиствепных лесов Приамурья

1985 24,0 + 8,5 16,6 + 7,3 20,0 + 5,7

1987 13,3 1 2,9 10,6 1. 2,6 11,9 1 2,0

1988 11,9 + 2,9 ^ 2,8 11,6 + 2,0

1989 • 15,0 4 4,0 7,7 1. 3,0 • 11,4 + 2,5

1985, 1987-1! Э89 13,9 + 2,0 10,5 + 1,6 12,2 + 1,2

подзона кшной тайги о.Сахалин

1986 . 16,2 + 2,6 ' 12,4 3,4 15,0 + 2,1

1987 13,1 + 2,0 13,2 + 1,9 13,2 + 1,4

1988 12,5 + 2,8 • 13,9 1: 2,9. ; . 13,2 | 2,0

1989 11,0 + 2,2 1 17,0 + 2,Г 13,9 + 1,8

1986-1989 13,2 + 1,2 14,2 +1,3 * * 13,7 1 0,9

популяций возбудителя КЗ на о.Сахалин. Во всех изучопных природных очагах КЗ самки .и самцы таежного клоща были инфицированы в равной степени. Содержание вирусной РНК в клещах, в основном, составляло 10 пг. В каждом из изученных природных очагах встречались особи, содержащие около 100 пг

вирусной ВНЙ, Максимальное количество РНК ВКЭ в клощо, I нг и 10 нг, выявлено лишь у нескольких экземпляров.

Специфичность гибридизации РНК,' выделенных из единичных клещей, с рекомбинантними плазмидаш pBR 322 ДНК ВКЗ подтверздо-на гибридизацией с ДНК-фрагментами, комшюмонтариши РЖ ВКЭ. Совпадение результатов, полученных при двух вариантах гибридизации, отмечено з 96,9+1,1% случаев. Значения вирусофор-иости индивидуальных клещей при определении методом MFHK близки аналогичным величинам, полученным с помощью ИФМ 10,9+1,5 и 8,1+1,2% соответственно (юг зоны хвойло-широколиствошшх лесов Приамурья, 1983-19Э0 гг.).

Выявление РНК различных вариантов, циркулирующих в природных очагах, данные о вирусофорности шдивидульшх клеще* и содержании РНК ВКЭ d клещах расширяют наш знания о .природных популяциях вируса. Метод МГНК, с помощью которого можно\ проводить массовое исследование индивидуальных клещей, является,' на наш взгляд, перспективным для выявления природных очагов КЗ, их детального обследования в сочетании с воолого-параоитологи-чоскими методами.

Пр^странстБеипоа ^аспре2влешв_ВКЭ_в_пр^з^_очаг§х.

На юге зоны хвойно-широколиственных лесов ( п.Кия 'и п.Сукпай, предгорья западного Сихотэ-Алиня) в однотипных хвойно-листвешшх лесах клещи I.porsulcatua распределены относительно равномерно, -существенной раз1шцы в их численности в пойлах рек и на склонах ссг.и nq отмечено. Вирусная РНК обнаружена у 10,0+1,0% имаго I.persulcatua, 13,3+5,1% H.concinna и 10,045,5% D.silvarum. Таекные клещи, собранные на однотипных участках хвойно-лиственного леса, отстоящих друг от друга на расстоянии 4-5 км, не отличались по степени зараженности ВКЭ.

У северной границы зоны хвойно-широколиственных лесов (п.Кондон, Зворон-Чукчагирская низменность) лесная растительность представлена массивами' смешанных лиственных группировок п поймах рек, на склонах сопок *и водораздельшх хребтов господствуют лиственично-березовые багульниковые и темнохвойные леса.

В гассодона селении абсолютно преобладает 1.регзи1са1;из. Основна масса клещей сосредоточена в пой,¡энных местообитаниях, вирус К (вирусная РНК) также распределен неравномерно. Еолео высоки показатели вирусофорности, как и численности, отмечены в поймен ных лесах - 14,3+1,8 против 5,3+1,6% у клещей, собранных п склону сопки ,(1987-1989 гг.). Только в пойменных группировка выявлена особи с содержанием РНК ВКЗ 100 пг и более, штаммы ВК были выделены из собранных здесь клещей.

Таким образом, для лесов юга зоны хвойно-широколмственны лесов Приамурья характерно достаточно равномерное распределен!! клещей (в первую очередь Г.регзиХсайш) и вируса КЗ (вируснс РНК) по территории очага. Пойменные смешанные леса на север зоны в целом занимают незначительную площадь, но именно они силу ежегодно высокой численности и вирусофорности 1.регби1саи определяют - потенциальную валентность очага КЗ, их мои рассматривать как наиболее активную часть (ядро) оча! (Коренберг Э.И., 1979). На юге зоны наиболее активную чаи очага оконтурить трудно, потенциально вся территория лесов юз зоны хвойно-широколиственных лесов Приамурья является зож повышенной опасности по КЗ.

Результаты, полученные при изучении индивидуальных таеш клещей, собранных в природном очаге КЗ .на юго-западном побереи о.Сахалин (подзона южной тайги), показали широкую диссеминац) ВКЗ по территории природного очага. Местность характеризуем сильно - пересеченным рельефом, разнообразием растителья группировок и различными значениями численности 1.регаи1саШз них. Вирусная РНК обнаружена.в клещах, собранных во всех.раст: тельных группировках, кроме тешохвойного леса.. Наиболее высок показатели численности • таежных клещей и ' вирусофорности ( данным МГНК) в течение трех лет изучения (1987 - 1989 гг отмечены среди клещей, собранных на просеке в хвойно- лиственн лесу на склоне северной"экспозиции . Вирусная РНК обнаружена 17,7+3,9 - 20,3+.4,5% исследованных особей, среди них ча выявляли имаго, .у которых определено 100 пг РНК ВКЗ и боле

Единственный за время изучения штамм ЕКЭ был изолирован из пула клещей 1.регаи1са1;из, собранных с растительности на просеке. Среди прочих растительных группировок аналогичные параметры заметно ниже. Наименьшие значения зараженности БЕЗ, а также их изменение по годам в 2-3 раза отмечены у клещей, отловленных в лиственичнике и речных долинах, 'удаленных от от массива хвойно-листвекного леса. Таим образом, для сахалинского природного очага также можно выделить наиболее активную и потенциально опасную часть наряду с широкой диссертацией ЕКЭ по территории очага.

Использование метода МГНК для определения зараженности ВКЭ индивидуальных клещей в сочетании с зоолого-пзразитологическиш методами значительно расширяет возможности изучения структуры природных очагов. Возможно проведение дифференциальной оценки различных очагов, а также отдельных растительных .группировок природного очага с целью определения их потенциальной опасности по КЗ. Полученные наш результаты демонстрируют особенности структура природных очагов КЗ юга и севера зоны хвойно-широко-лиственных лесов Примурья и подзоны южной тайги о.Сахалин, определяющие различную степень их эпидемической опасности%

УЗУ^з^З^ТР^ЗЗнеЕУЗЛЬНоЯ^пврадачи__ЕКЗ_иксодовшж__клощами

м§то£ом_МГКК. Изучение вопросов трансовариальной передачи ВКЭ иксодовыми клещами, закономерностей воспроизведения популяции, возбудителя является одним из ключевых моментов познания сущности сложных процессов циркуляции ВКЭ в природных очагах. В клещах'по ходу метаморфоза отмечено существование наряду,.с вирулентной формой скрытой формы ВКЭ. Возможным объяснением этого феномена является предположение С.Я.Гайдамович (1977). об-образовании в яйцах клещей провирусов. т.е. ДНК-транскриггов вирусной РНК. Метод МГНК позволяет проводить как • индикацию РНК ВКЭ в яйцекладках и' напитавшихся самках (РНК-вариант), так и поиск ДНК-транскриптов вирусной РНК (ДНК-вариант). Для индикации ВКЭ в пробах яйцекладок была разработана модификация варианта МГНК, с помощью которой возможно определение РНК и поиск

ДНК-трэнскриптов РЖ ВКЗ в пробе, состоящей из-75-100 яиц. Этот вариант метода позволяет исследовать пробы яйцекладок, полученных от одной сажи, т.е. проследить динамику трансовари-альной передачи ВКЗ (рис. 4).

. Значения вирусофорности напитавшихся на домашних животных самок (при учете самок, в яйцекладках которых была детектирована РНК ВКЭ, и самок не давших кладки) выше, чем голодных имаго, собранных с растительности. Вирусная РНК определена у 32,7+4,53 исследованных особей 1,регзи1саШБ, за тот же период изучения среднее значение вирусофорности голодных самок этого вида достоверно (р<0,00Г) ниже и составило 11,3+1,9%. Среди самок Н.сопс1ппа РНК ВКЭ определена у 48,3+3,6% напитавшихся в 13,9+4,1% голодных (р<0,001), а у Б.зШагит - соответствен®: у 25,0+10,8 И 10,0+5,5% особей.

I.p.

I.D.

•3' 42 чал -2 *5 40 М9 -47л

■5 '10 '14 .'24 '47л •I.D.

•г "5 '10 -14 I.p.

. '24 -3 '9 49

Н.с. Н.с.

' 4.9 '27 Ч "27 Н.с.

• -3 ' '7 42 '25 ,Ч0л Н.с.

•3 *7 42 '25 ЧОл Н.с. I.p.

•3 '7 42) ЧОл "25

I.p. : •34л '3 '7.' 42 . ЧОл.

Рис. А'. Радиоввтограммы.и схемы расположения проб РНК, получен шх из яйцекладок самок яксодовдх клещей."I.p." - I.peraulcatus "Н.с."- - H.concirma, "D.s." - D.silvarum. Цифрой обозначены дн взятия пробя от начала яйцекладки, "л" - личинки. .

Основная масса проб яйцекладок таежшх клещей била получена в первую (46,4%) и вторую (25,9%) недели от начала яйцеклада, ^ответственно и большинство проб яиц, содержащих РНК ВКЗ, приходилось на первые две недели кладки. Так, в яйцекладках I.per-sulcatua РЖ вируса в первую неделю выявлена в 50,0% случаев и 39,1% - ео вторую, В дальнейшем выявление РНК ВКЗ значительно шже, от 8,22 б третью неделю до единичных положительных проб, юлучошшх па 4-8 подале от начала яйцекладки. Аналогичные дан-ио получены и для H.concinna - на-первые две недели приходится 15,9 и 29,4% собранных проб яйцекладок. РНК ВКЗ, в основном, де-гектирована б пробах первой (44,82) и Еторой (34,5%) от начала 1йцекладки, на третью недолю приходится 8,3%, на четвертую и мтую - по 4,22 положительных проб. Исследованы также пробы 1йцвкладок, полученные от 6 самок D.silvarum. РНК ВКЗ определена ' одной сашш в пробах 4, 8 и 18 дня от начала яйекладки. В делом, РНК ВКЭ детектирована в 24,7+4,4% проб I.persulcatus, ¡4,1+5,1% H.concinna и 17,6+9,2% проб яйцекладок D.silvarum. ¡роди проб яйцекладок от самок, в которых посла яйцеклада! или и) в кладках которых детектирована РНК ВКЗ, вирусная РНК обнажена в 26,4+5,9% проб, .полученных от I.persulcatus, и в ■I,8+6,7% проб от H.concinna.

Различно "и детектируемое количество РНК ВКЭ - в пробах йцекладок (75-100 яиц) определено от 10 пг до 10 нг вирусной ЯК. Специфичность гибридизации проб яйцекладок с pBR 322 ДНК КЗ подтверждав" гибридизацией с кДНК-фрагшнтами в 84,3+4^3* лучзов.

Достоверных данных о наличии ДНК-копий вирусной РНК не олучено. Часть проб ДНК яйцекладок (11,4+3,8%) гибридизовалась рекомбинантными плазмидами pBR 322 ДНК ВКЗ и с кДНК-фрагмпнта-и, что, скорее всего, обусловлено неспецифическим связыванием зндов при данных условиях проведения гибридизации.

вывода

1. Метод МГНК для индикации ВКЗ (вирусной РНК) апробирован в дальневосточном регионе. Показана его специфичность и высокая чувствительность при выявлений вариантов вируса, циркулирующих в природных популяциях ВКЗ Дальиого Востока.

2. Гибридизация синтетических дезоксиолигонуклеотидных зондов с РНК различных дальневосточных штаммов подтвердила ранее полученные с помощью вирусологических методов результаты, свидетельствующие о гетерогенности природных популяций вируса. Для' большинства изученных штатов характерна высокая степень сход-' ства с ¡эталонным штаммом Софыш, выделенном но Дальнем Востоке в 1937 году.

3. Получены данные о зараженности ВКЭ таежных клещей 1.регои1са-1из при исследований индивидуальных особей: в очагах юга зоны хвойно-шфоколиственных лесов Хабаровского края средние значения вирусофорности составили 10,0+1,0%, на севере зоны - 12>2+1,2%, в очаге КЗ. юго-западного побережья о.Сахалин (подзона южной тайги) в среднем у 13,7+0,9% исследованных имаго клещей обнаружена РНК- ВКЭ.

4. Изучено пространственное распределение таежных клещей и ВКЗ по территории пр}фодных очагов Приамурья и о.Сахалин. Показано равномерное распределение .клещей и ВКЭ для очагов юга зоны хвойно-широколиственных лесов Приамурья, выделены наиболее, потенциально опасные по КЗ участки территории в пределах изученных очагов на севере зоны хвойно-широколиственных лесов Приамурья и в подзоне южной тайги о.Сахалин.

5. Разработана методика детекции РНК ВКЭ » пробах яйцекладок от одной самки. Получены результаты, свидетельствующие об увеличении количества вирусной РНК у самок при. штанин на теплокровных животных и о передаче вирусной РНК только части яиц в кладке.

Основные результаты опубликованы в следующих работах;

1. Берета Л.А., Островская О.В., Николаева С.П., Пуховская Н.М. Выявление естественной неоднородности природных популяций вируса клещевого энцефалита и группировка штаммов •// Вопр.вирусол.-1983. - N 6.- 0.706-709.

2. Островская О.В., Верета Л.А., Пуховская Н.М. Влияние детергентов на гемагглютинирующую активность различных штаммов вируса клещевого энцефалита // Вопр.вирусол. - 1985. - Ы 4. - С.437-440.

3. Пуховская Н.М., Верета Л.А., Островская О.В., Шаманин В.А., Плетнев А.Г. Индикация вируса клещевого энцефалита методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в клещах Ixodes persul-catus // Мед. паразитол. - 1989. -(Н 3. C.II-I4. , . ; . . ,

4. Берета Л.А., Островская О.В., Волков В.Й., Пуховская. Н.М., Николаева С.П., Щукин A.B., Долгих A.M., Александров ' В.И., вельская Т.В., Воронкова Г.М., Захарычева Т.А., Скулкина А.И.// Клещевой энцефалит на севере зоны хвойно-широколиственных лесов очагового региона Приамурья // ЖМЗИ. - 1989. - N 7. - С.38-43. Б. Злобин В.И., Кветкова Э.А., Наволокин O.A., Мансуров П.Г., Дрокин Д.А., Пиценко Н.Д., Добрикова Е.Ю., Шаманин В.А., Плетнев А.Г., Вертинский В.В., Закревская A.B., Свешникова M.oi, Шишкина Г.В., Верета Л.А., Духовская Н.М. Сравнение трех вкспресс-мато-дов индикации вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол.' -1990. -HI.- С.57-59. , • '

• V ' <

6. Пуховская Н.М., Долгих A.M., Берета Л.А., Плетнев; А.Г. Природные очаги 'клещввого энцефалита на юго-западном побережье Сахалина // Мед. паразитол. - 1991- - H 2. - С:48гБ0.:9. .* Д ;

7. Пуховская Н.М., Долгих A.M., Щукин A.B.,..Верета Л.Ai,^Плетнев -, А.Г. Половая структура популяции и вирусофорность 'самцов и самок" таежного клеща в очаге клещевого энцефалита на юга Приамурья ({ Инфекционные болезни Дальнего востока . ~ Хабаровск.''; - • 1990.'', - " С.24-30. .' . ' ,;-.;'

8. .Пуховская Н.М., Верета Л.А., Шаманин В.А., Плетнев А.Г.:

Диагностические возможности метода молекулярной гибридизацш нуклеиновых кислот для индикации вируса клещевого энцефалита /,■ Вопр. вирусол. - 1991. - N 3. - С.250-253.

9. Кветкова З.А., Пиценко Н.Д., Конев В.П., Рачков A.A., Полищу; Т.Н., Шаманин В.А., Плетнев А. Г., Пуховская Н.М. Молекулярпа! гибридизация нуклеиновых кислот как метод быстрой диагностик! клещевого энцефалита, Информационно-методическое письмо. -Омск. - IS92. - 27с.

10.Берета Л.А., Воробьева М.С., Островская О.В., Воробьева Р,Н., Ладыженская H.H., Разгуляова A.B., Расщэгасгаа М.П., Ншшлаева С.П., Пуховская Н.М. Способ отбора производственных штаммов вируса клещевого энцефалита. Заявка JS 4853821/13 (062883), положительное решение от 20.12.91 г.

11.Н.М.Пуховская, А.М.Долгих. Способ консервации клеще! переносчиков арбовирусов. Заявка & 4884567/13 (II3423) положительное решение от 1.09.93 г.