Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка препаратов и методов диагностики гепатита А

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка препаратов и методов диагностики гепатита А"

РГБ ид

Мини^р&тво' "здравоохранения и медицинской

промышленности Российской Федерации Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "ВЕКТОР" Научно-исследовательский институт молекулярной биологии

|1а 1 ¿¿-"а 13.-1 Л

Майданюк Александр Григорьевич

РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ

АПАТИТА А

У''1 - ^ "

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

Кольцово - 1995

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственно го научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" Минздрав медлрома РФ.

Научные руководители:

академик РАН Л. С.Сандахчиев

доктор биологических наук С.В.Нетесов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.П.Мертвецов

кандидат медицинских наук Г,Н.Игнатьев

Ведущая организация: Институт эпидемиологии к микробиологи: ум, Н.Ф.Гамалеи, г. Москва

Защита состоится "22,"Орг^Х10^1995 г. на заседании специализированного совета К.098.08.01 во ВНИИ молекулярной. биологии ГКЦЗБ "Вектор" по адресу: 533153 Кольцове Новосибирской области, АБК, конференц-зал

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ГНЦВ5"Бектор' Автореферат разослан ,!1%цбс1р а 1395 г.

Ученый.секретарь специализированного совета кандидат химических наук ////', Л) Т.Н.Шубина-

Актуальность проблемы. Вирусный гепатит А - ото из самых распространенных вирусных заболеваний человека как в СНГ так и в некоторых зарубежных странах. Заболеваемость Еирусныш гепатитами з СНГ в последние годы регистрируется на уровне около 1 млн с.т:, -чаев а год. причем основной вклад в заболеваемость вносит вирусный гепатит А /до 80-9035/. До последнего времени профилактика гепатита А базировалась в основном на мероприятиях санитарно-гигиенического характера, а также пассивной иммунизации с использоваки- •

Длительное время трудности с разрасатхик методов диагги/ч и изучения вируса гепатита А - этиологического агента этого заболевания были связаны с отсутствием, адекватных экспериментальных моделей репродукции вируса в культуре клеток. В 19?э году появились первые публикации, описывающие размножение ВГА In vitro и с тех пор началось изучение вируса, з том числе адаптация изолятов ВГА к размножению в культурах клеток, создание систем репродукции вируса, изучение его свойств и разработка диагностических препаратов на основе культурального БГА.

К моменту качала наших исследований -''1587 г. / з стране отсутствовали конкурентноспоссбные с зарубежными аналогами диагностические тест-системы выявления маркеров БГА. В России не было известно о быстрорастущих цитопатогенкых атаммах ВГА. не бале в наличии методов определения нейтрализующих свойств анти-ЕГА иммунных сывороток.

Цель и задачи исследования...... ....... - -------

Основная цель исследований - разработка яаучних основ изготовления современных препаратов для диагностики гепатита д.

Для выполнения' поставленной цели'необходимо'было-реиить еле- -дующие задачи:

1. Разработать технологию получения антигена ВГА с количествах. достаточных для последующего масштабного производства:

2. Получить высокотитражные специфические поли- или мовекле-яальные сыворотки.

3. Выделить атаммы ВГА от больных, адаптировать их к рам клеток и провести скрининг их биологических свойств.

4. Изучить биологические и генетические характеристики высс-корепродуктивных штаммов ВГА.

5. Разработать метод определения нейтрализующих свойств спе-цийических сывороток.

6. Разработать' и апробировать, иммуноферментные тест-системы для диагностики гепатита А. ■ '

Научная, новизна. Впервые выделен отечественный штамм ВГА. обладавший высокой .репродуктивной' активностью и цитопатическим /бляшкообразующм/ действием ь культуре клеток. .Подробно изучены его биологические характеристики и ростовые свойства, на основании чего он рекомендован в качестве эффективного производственного штамма при разработке и выпуске препаратов для диагностики гепатита А. Впервые в отечественной практике разработан метод опрр-деления титра нейтрализующих.антител енти -ВГА иммуных сывороток с использованием цитопатических свойств штамма МБ-7 ВГА.

Практическая значимость и внедрение результатов исследований в практику. Разработанные на основе культурального антигена иммуноферментные тест-системы для выявления маркеров инфекции'гепатита А нашли широкое распространение не только в лабораторных исследованиях. но и в практическом здравоохранении. Комплекты' для определения анти-ВГА иммуноглобулинов класса М и анти-ВГА антител освоены в условиях промышленного производства и исгГользуются на практике! Разработана методика, основанная на. использовании .прямой реакции нейтрализации в культуре клеток для изучения 1 нейтрализующих свойртв сывороток после'вакцинации и введения иммуноглобулинов. Внедрение вышеназванных препаратов в практику'здравоохранения повлекло за собой более- эффективную диагностику гепатита А::, следовательно, своевременную изоляцию., а также более правильную тактику лечения больных.'

Разработаны и утверждены следующие нормативно-технические документы:

1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ РЕГЛАМЕНТ. 373-92 -Тест-система , иммуноферментная для выявления . иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А /Вектогеп А-ХяМ/. .

2. ВРЕМЕННАЯ ФАГ'АКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ- ВФС 42-331ВС-92. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к ■вярусу гепатита А /Вектогеп А 1вМ/.

3. ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы . иммуноферментной . для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита.А /Вектогеп А-1вМ/

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ РЕГЛАМЕНТ -. Тест-систо-ма иммуноферментная для выявления антител к вирусу гепатита а /Вектогеп А-антитела/.

5. ВРЕМЕННАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ-БФС 42- ' Тест-спс-тема иммуноферментная для выявления антител к вирусу гепатита г. /Вектогеп А-антитела/, . ■

с. ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы иммуноферчентнсй для выявления антител к вирусу гепатита А.

В коллекции Государственного института стандартизации 'и

севича депонирован под' íl 2:3 птаим МБ-7 еируса гепатита А. ленный от больного гепатитом А человека и адаптированный к размножению в перевиваемых культурах клеток почек обезьяны.

Получен патент-РОССИИ "Штамм Virus hepatitis A iiomlnis для "приготовления вакцинных и диагностических препаратов"..

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференциях и совещаниях, в.том числе на i отраслевой конференда!-конкурсё ..молодых ' 'ученых/Колыювс: 1988г/. республиканской научно-практической конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузиокных препаратов",-Новосибирск. 1S88 г/.',отраслевом совеаании "Биотехнология вакцин и лечебно-профилактических препаратов'7Новосибирск. 198Э г/, всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов"/Москва. Í9S0 г. /, межведомственной конференции "Изучение и профилактика особо опасных висусных инфекций "/Кольцово, 1993 г. '/." " '' ~ ...................... ' --------

структура работы. Диссертация " состоит-из' Бвед-пкя. círcn литературы, экспериментальной части и обсуждения. заклэт'-ни:3. выводов и сгглска литературы. Работа изложена на __ страницах-маши-кописного текста, включая 14-рисунков и Н таблиц. •Основные результаты, изложенные в диссертации, .получены в соавторстве с сотрудниками НПО "Вектор": Бондаренко Е.П. Т:оннлко?ым ::ым ¡C.E. КснаксЕсй В. 5. Kcsk Н Л}., Яуятяков'.а 'Л. А, Гирюг'.з,-л "-■.*-.гиковым В. Е. Мамаевой Н. А. .чммооовьм A.L Гтмансьым 5., Н.

С. В. Сандахчиевым Л. С. и сотрудника:«! ГИС:'а нм.Л. .'■.. '¿саоегн'!'-.. Калашниковой Т.В и Карпович Л. Г.

Разработка препаратов .и методов диагностики гепатита.

Известно, что основными серологическими маркерами инфекции. гепатита А. являются специфические иммуноглобулины класса М и суммарные анти-ВГА антитела. Помимо этого . применяется также, обнаружение антигена БГА в экстрактах Фекалий больных. К моменту начала наших исследований в мире и в стране были описаны иммуно-Ферментные тест-системы" для выявления перечисленных выае трех маркеров инфекции, однако разработанные в России тест-системы не выдергивали конкуренции с зарубежными аналогами по основным пара-неграм- стабильности, длительности анализа, чувствительности и другим потребительским свойствам.

Иммуноферментная тест-система для выявления иммуноглобулинов иласса к к вирусу гепатита А в сыворотке (плазме) крови человека используется с целью дифференциальной диагностики гепатита А в клинических и эпидемиологических исследованиях.

Иммуноферментная тест-система для выявления общих антител к вирусу гепатита А в образцах плазмы, сыворотках крови и иммуноглобулинах как человека, так и животных, используется при контроле эффективности вакцинации у людей и экспериментальных животных, при оценке иммунного статуса людей к вирусному гепатиту А. а также при производстве.МИБП для диагностики и профилактики гепатита >1.

Иммуноферментная тест-система для выявления антигена вируса гепатита А используется для контроля при производстве диагностических и вакцинных препаратов.' а также для анализа источников питьевой воды.

Для тоге, чтобы вновь созданные тест-системы удовлетворяли Международным стандартам необходимо было выполнить следующую последовательность работ:

а) Разработать методы культивирования ВГА на культуре клеток

4647;

б) разработать методы концентрирования и очистки вируса;

в) разработать методы ::нактивавди и проверки безвредности препаратов ВГА;

г) разработать методы иммунизации морских свинок и очистки антител из сыворотки морских свинок:

д) получить конъюгаты анти-ВГА с пероксидазой хрена.

Эти стадии являются необходимыми для разработки всех вышеу-

помянутых тест-систем.

Определение оптимальных параметров культивирования тгамма HAS-15.

Изначальным и наиболее важным моментом в указаниях разра.бот-хах является стадия получения антигена ВГА. Работы по получению хультурзльного,антигена были начата-нами со штаммом НАЗ-15. адаптированным к клеточной культуре 4647. Уровень накопления антигена ВГА на культуре клеток сначала был совершенно недостаточен для серийного выпуска диагностических препаратов. Поэтому нани была

iiMMüviWbiiQ. иаии Гл ПО HNniiTU ni-rroyem-XTTLTV — ПУ.ТОТПОП^ООООО.,-О.

штамма r.ko-iö £ГА на клет::г-: 4647 з роллерном варианте.

Лля изучения оптимальных условия культивирования штамма HAS-15 вируса гепатита А на культуре клеток 4647 в различных сочетаниях испытывались следующие параметры: множественность заражения от Ю"1 до Ю"3 ТШ 50/клетку; длительность культивирования - 1.2,3.4 недели с момента заражения; процент содержания сыворотки в поддерживающей среде - 1%, 5% и 10%; возраст монослоя к моменту заражения -1.2.3.4.6 суток. Постоянными оставались температура культивирования ;3"° С) и зремя адсорбции ча-т-.

Анализ серии экспериментов по роллернсмч' культкчпр<,2анга :.п-руса гепатита А, основанный на обработке данных более опопе-риментальных точек, позволил выделить <\>?дуввде основные тенденции процесса культивирования зтсго зируоа.

Основными Факторами. гдсдвдйми на е'-ли "hvv нкутриклеточнсго антигена, при услсзик ота-.'ялиюст- г..-.--¿ст.-. : характеристик сред и культур клеток, в порядке степени влияния оказалась следующие фактора: длительность гуль т::о;(:"..:;■■■. вен» концентрации сыворотки и е ченьаеа отепо.ч;: :с..л : - •-;• \. заражения. Как показали результаты экспериментов, влияние rooooo-та монослоя по существу сводится к одному необходимому условию, которое заключается в том, чтобы возоаст монослоя hp пплчгрн w-ть менее 2 суток. 3 пооглвном случае, огл'отт не^чое^о ,;--;-, т. :т;. заражения происходит' разрушение мснсслсд.

Пр;: изменении зречен»: ку.гсглвите!'.-..-;::? о: ; дс . г .. кгноу первой недели наблюдается дозолькэ кпокш! прирез" рации внутриклеточного антигена'(табл. ), затем содержание его значительно увеличивается к концу зторой недели и на протяжении третьей, а к концу четвертой недели начинает снижаться.

- е -

Таблица

Средний титр внутриклеточного вируса при различной множественности заражения.

Концентрация Множествен- Длительно сть культивиро! гания

сыворотки ность иед

% заражения

1 ! 2 ! 3 ! 4 !

1% 1 10 1:4 1:4 1:32 1:32

5% 1 10 1:8 1:16 >1:128 1:32

10S 1 10 - 1:32 >1:126 -

IX- 1 100 1:2 1:8 1:32 1:32

5% 1 100 1:8 1:20 >1:128 1:32

т. 4 100 - 1:32 1: е-4 1:32

1% 1 1000 1:2 1:16 1:16 1:32'

5» . ' 1 1000 1:16 1:32 1:64 1:32

10% 1 1000 - 1:32 1:64 1:32

При роллерном .культивироБании концентрация внутриклеточного антигена к концу второй недели б среднем в 4-8 раз вьые по сравнению с 1 концом 'первой недели. Б конце четвертой недели выход внутриклеточного антигена'падает примерно в 2 раза по сравнению с концом третьей недели, что можно объяснить, отчасти, значительным выходом вируса в этот период в культуральную жидкость.

В результате анализа экспериментальных данных услоеия оптимального роллерного культивирования вируса гепатита А стало возможным сформулировать следующим образом:

а) длительность культивирования 3 недели,

б) возраст монослоя не менее 2 суток.

в) интервал допустимых концентраций сыворотки в культураль-ной жидкости от 5Я до ЮК.

г) интервал допустимого значения множественности 1 заражения от 10"1 до - Ю-2.

При соблюдении этих условий можно стабильно получать препараты внутриклеточного антигена с титром в среднем не менее 1:128. а в отдельных экспериментах он достигает величины 1:256 и более.

Проведение работ по выбору оптимальных параметров культивирования етамна НА5-15/-1647 дало возможность '/сличить выход т.'.ти-гена 5ГА з среднем в 10 раз. ггс сравнений с таковым на начало работ,

Создание эффективноЯ и достаточно хорошо воспроизводимой системы культивирования ВГА позволило приступить к разработке ме-т:д'.п и гпзетратов для диагностики ин'*екгаи гепатита А. Для соз-лг-::;л &исскос-^гективных иммуно.те[мент;-шх тест-систем, конкурентных с зарубежными аналогами, необходимо было на следующем этапе

ситоритзк. для '{-¿го требуется получение Гасокс-очищекного антигена БГА.

Концентрирование и очистка БГА.

Ссисзызачсь на описанных в литературе методах очистки куль-турального ВГА мы получили концентрированные гомогенные-препараты

Получение высскотитрагных специфических сывороток к ЗГА.

Для п:лучения спе^;;;'.чкых сывороток, к ЕГА выбрали морских сзпн/.к. которые применяется в качестве модельных животных при к:нтр"з кммуногенности инзктигирсзанной вакцины против гепатита

При иммунизации различными количествами очищенного ВГА морских свинок получили высокотитрзгные специфические ишж-лги •мвс--стск . которые в дальнейшем после выделения специфичных ймкукгг-лобулинод б использовали для нанесения на подложку в системах на выявление антигена ВГА и суммарных антител, а также для получения специфического кснызгзта в тест-системах для выявления всех трех маркеров инфекции ВГА.

Инактивация и проверка специфической безвредности пвепаса-

7=3 ЕГА.

Поскольку вирус гепатита А является высокоинфекционным пре-

паратом, для использования в коммерческих тест-системах необходимо было найти условия его инактивации и проверки безвредности препаратов, применяемых при компановке тест-систем.

' Литературная проработка показала, что для инактивации ВГА обычно используется формальдегид в концентрациях 0.001-0.1%.

Для отработки методов инактивации был взят район концентраций формальдегида ' от 0. 001Д' до 0.5%. Проверку в данном опыте проводили однократным культивированием ВГА на клетках 4647.

Концентрации формальдегида 0.5. 0.1 и 0.01% инактивируют вирус в полном объеме при данном способе проверки препаратов на специфическую безвредность.

В соответствии с тем, что высокие концентрации формальдегида неблагоприятно действуют на стабильность и антигенные свойства антигенов вируса гепатита А. а также и на клетки 4647, используемые при проверке специфической безвредности, нами была выбрана . наименьшая концентрация формальдегида. ■ обеспечивающая полную инактивацию вируса, а именно 0.01% формальдегида в течение 5 суток при 37° С.

Обычно при проверках на специфическую безвредность из-за . крайне незначительного количества оставшегося инфекционного вируса е препаратах используют несколько пассажей вируса на чувствительной клеточной.культуре , поэтому мы также осуществляли такую проверку с использованием 3 пассажей. _ .

'.'Три пассажа препаратов ВГА. инактивированны формальдегидом в концентрации 0.01% в течение 5"суток при 37° С при перемешивании, по; азали, . что после 3-го пассажа наблюдается прирост антигена ВГА. что говорит о недостаточной инактивации вируса при данном режиме. Ужесточить режим можно было двумя путями, а именно: увеличив концентрацию формальдегида или увеличив время инактивации ■ при заданной концентрации 0.01%. В соответствии с вышесказанным, а именно из-за неблагоприятного действия высоких концентраций формальдегида как на антиген ВГА, так и на клетки, решено было увеличить время выдержи?-щия. препаратов с 0.01%' формальдегидом до 15 суток при 37° С.

Препараты, полученные при данном способе инактивации, показали полную специфическую безвредность при очень жестких условиях проверки, удовлетворяющих всем необходимым требованиям Минздрава России и рекомендациями ВОЗ.

Выделение и характеристика штамма МЕ-7 ВГА

Так как наработка антигена БГА ка основе штамма НА5-1: тр.: серийном . производстве диагностических препаратов затрудш'т^лнг из-за долгого срока культивирования вируса - 3.5-4 недели, нам;: ; !9£? году были начата раоста по выделению и адаптации к кул: ^у^ы-клеток диких штаммов БГА. выделенных от больных.

хи1й мммгтУгртййя И п 'ппи | /-!11 и и йлштЮп ГНМ П. П.-.'! Г" 1 [ППЛИ лппгшп----

использовали положительное на наличие ЬГЛ а гЛ'А экстракты Ф^.-.а-'п-.и больных гепатитом А. Фекалии собирали от больных во время вспышки гепатита А в Новосибирске в 1988 г. Диагноз гепатита А у больных был подтвержден клиническими данными, биохимическими анализами и выявлением анти-ВГА ^М методом ИФА. Продукция антигена ВГА была . обнаружена методом ИФА у каждого из адаптированных 8-ми штаммов ВГА на 2-м пассаже в культуре клеток. Количество антигена ВГА в клетках ГРЖ-4. зараженных этими штаммами, возрастало с каждым пассажем, и к 8-му пассажу титры их составляли 1:4-1:16.

У одного из штаммов, получившего название МБ-7, наблюдалась интересная особенность, а именно на 10-12 (в зависимости от множественности заражения) день культивирозания после заражения кле ток ГРМ-4 наблюдалось отслоение и в последующем разрушение монослоя клеток.

Для подтверждения цитопатического эффекта клетки ГКоК-4. зараженные штаммом МБ-7, покрывали агаром и окрашивали кристаллвио-летом начиная с 10-го дня культивирования. Бляшки на клвточн™ монослое наблюдали на 12-14-й день культивирования, размер их бы г разнородный.

При последующем трехкратном клонировании методом предельных разведений была выделена чистая линия штамма МБ-7, который на 10-12-й день культивирования образовывал однородные бляшки диаметром до 3 мм.

Принадлежность штамма МБ-7 к ВГА определяли в трех разновидностях реакции нейтрализации:

- 1) нейтрализация - антигена ВГА штамма. МБ-7 в конкурентном ИФА, "блок-вариант";

2) нейтрализация репродукции штамма МБ-7 в культуре клеток на основании выявления антигена ВГА методом ИФА;

3) нейтрализация бляикообразовання атаима ИБ-7 в культуре

клеток Р!М-4.

0С0 {отраслевой стандартный образец) анти-БГА антител и МСО (мекдународный стандартный образец) анти-БГА антител более чем в 16 раз подавляли антигенную активность зтамма МЕ-7.

Репродукция аггамма МБ-7. обработанного специфическими сыворотками анти-ЗГА. на 3-4 сутк»? бшта й! 50« кике относительно по-лсзктельнсго контроля.

ОСО анти-ЗГА и МСО анти-ВГА. подавляют блясксобразовзние лттча МБ-7 по сравнению с контролем более чем на 80'.

На основании зтих исследований установлено, что ОСО .акта-ЕГА и МСО анти-5ГА существенно нейтрализовали штамм ИБ-7 в конкурентном -ИФА, репродукцию и бляшкообразовзние его в культуре -клеток гНПК-4. что подтверждает идентичность .¡¡гамма Ш-7 -вирусу гепатита А.

Проведено клонирование фрагментов генома ВГА штамма МБ-7 для изучения нуклеотидной последовательности гена белка '/Р-1. принимающего участие в формировании иммунодоминантного эпитопа вируса. При сравнительном анализе последовательностей выяснено, что штамм МБ-7 по своей нуклеотидной последовательности наиболее близок штаммам НАЗ-15/дикий тип/ и С1СС-1.- Наиболее^ существенными, отличиями штамма МБ-7 являются отсутствие делеции 18 нуклеотидов в начале гена белка УР1 и изменение 5 нуклеотидных оснований, которые приводят к изменениям аминокислотной последовательности белка УР1. Различия на нуклеотидном уровне с изолятами из других регионов мира значительно больше: 23 нуклеотида с МВБ. 28 нуклеотидов с НМ-175, 22 нуклеотида с 01*326, 16 нуклеотидов с МБ-!. Таким образом, полученные данные указывают на родство штамма МБ-7 со штаммами, циркулирующими в Китае и США, которые относятся по генотипу к группе 1(подгруппа 1а).

Накопление антигена ВГА штаммов НАБ-15 и МБ-7 при культивировании на культурах клеток.

Сравнение кривых' размножения штамма НАЗ-15 ЗГА на клетках 4347 и штамма МБ-7 В ГА на клетках ШН-4 показало.- что максимальный уровень продукции антигена ВГА при культивировании штамма НА5-15 достигается на 21-22 день, тогда как для штамма. МБ-7 мак-

-

сичзльный- уровень продукции антигена ВГА достигается на 8-9 лень.

Гг. еле адаптации стакка Кг-7 к клеткам 40-П. при культавнроег-нии • роллерном варианте были получены титры антигена ВГА 1:\2Ъ. ».¿¿С

и ч~с- и- менее, а порей и с-олее уровня ньк&шгенш! акти: г':.':

Р."; •„•:И-'-:'

: 7-е": -. .гтгкы ;:имунп'".'рк<\чти'.й для пыяг-лг••VI'

н'-глсхулимое класс: К к вирусу гепатита А' (ВЕКТОГЕП А-!«:!•!■.

у.-«'.** Пу« Тр г Тг'.Т-Ск-.Тг«^ Н»ЧУЧ*1«у|>Л5ПТ«»А ¿«л

выявления иммуноглобулинов класса Н к вирусу гепатита А взяли классическую схему. применяемую' практически во всех зарубежных аналогах. Иселеду?кую сыворотку еносят в лунку планшета для иммунологических реакций с нанесенными4 антителами к иммуноглобулинам класса М человека. В результате реакции иммуноглобулины Н из раствора связываются с антителами нз планшете. После отмывки планшета :т и кеезязавпклея компонентов сыворотки.в лужу

планаета кч-с?т -гт-шд.егтный раствор антигена, который связывается со п«мугсг.-:сулпнами класса М к вирусу гепатита А.

Затек г юьдуг. л .-игу ькг,сят раствор конъегата антит---. ь

вирусу гепатита А с г.ергкендазой хрена. В результате реакш'/ конг-с~хсванны>: С-срмент связывается с планшеток. После отмыт; плак1-та от несвязаьиегося конъегата наличие иммуноглобулине:; класса М к вирусу гепатит". А устанавливают измерением активности связанного- с антигеном на планшете ¡¡^рмеьта при доьаБле.кии суоь-трата - пел вмйгта г. к. п.

Оценку диагностической г-^-егливнссти ьяовь раграбс-танг^г тест-системы "Вектсгеп -А ПЛ.'", а также коммерческой тест-системы "ДИАГНАГЕП" (производство ИПЗЭ г.Москва). предназначенных для выявления &НТИ-ВГА ИГК проводили путем сопоставления полученных результатов с данными референтной тес/;-системы "Анти- ВГА ИГК ИФА ЛйАплвс"(СП Россия-Швейцария).

Результаты Государственных испытаний тест-системы "Вектогеп - А ИГМ". предназначенной для ранней диагностики ВГА показали, что диагностическая эффективность вновь разработанного препарата сопоставима с данными референтной тест-системы, и существенно превосходит первую отечественную коммерческую тест-систему "ДИАГНАГЕП" (ИПВЭ г.Москва) при более.удобной и быстрой схеме поста-

новки анализа.

Общий показатель совпадения результатов с системой сравнения составил 98,1%.

Аналогичный показатель для тест-системы "Диагнагеп" составил 83,3%. .

Таким образом, на основании проведенных исследований тест-система "Вектогеп А ИГМ" была рекомендована для внедрения в практику здравоохранения и на нее была утверждена НТД (ВФС --2-331БС-32).

Разработка тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу гепатита А.

Выявление антител к ВГА основано на конкурентном варианте, твердофазного иммуноферментного анализа. Разведения исследуемой сыворотки вносят в лунку планшета для иммунологических реакций с нанесенными антителами к ВГА. Сразу же в эти лунки вносят стандартный раствор антигена ВГА. В результате реакции анализируемой сыворотки со стандартным антигеном ВГА анти-ВГА антитела блокируют антиген и не дают ему связаться с анти-ВГА антителами н^ план-' шете. После отмывки планшета от пробы, антигена и несвязавшихся компонентов сыворотки в лунку планшета вносят раствор конъюгата антител к ВГА с ■ пероксидазой. В результате реакции, коньюгирован-ный фермент связывается с материалом лунки. После отмывки планшета от несвязавшегося конъюгата наличие антител к ВГА.устанавливают измерением активности связанного с антигеном на планшете фермента при добавлении субстрата - ОФД вместе с Нг02.

Государственные испытания тест-системы иммуноферментной для выявления антител к ВГА "Вектогеп-А-антитела" были проведены в 1994 году в ГИСКе им. Л.А.Тарасевича. В качестве референтной тест-системы сравнения использовалась отечественная коммерческая иммуноферментная тест-система для вачвления анти-ВГА "ИФА-ан-ти-ВГА"(НПО"Диагностические системы" г. Нижний Новгород). Зарубежные аналогичные тест-системы на госиспытаниях, к сожалению, не' оы;;л представлены.

В процессе государственных испытаний сотрудниками ГИСКа им. Л.А. Тарасевича была определена чувствительность и диагностическая эффективность тест-систем "Вектогеп-А-антитела".

В результате проведенных титрований стандартных образце-,, чувствительность испытуемой тест-системы "Вектогеп а-антитела' составила. 9.8+_1.2 мМЕ/мл. а чувствительность референтн.-.-г тест-системы "И1'А анти-БГА - 11.8»_1.6 мМЕ/мл. Отсутствие сушгот-венкых различий между двумя указанными показателям!! свидетельствует о том. что чувствительность тест-системы "Вектогеп /—антитела" не отличается от референтной и, по данным литературы, прагт; чески соответствует зарубежным аналогичным- стандартам С: С-

и№Г/ил\

Оп ЛАНЛПА ПЛПАА«пТ111АГтЯ ПЛЧ^ИП далипП) О Т Т ОЛЧЦ1ПТП1П Т1Л Т. ХГГУГТТХ —

V w.. V 1, V X ^ ¡.'V ! - АЛ V- ^ 1 I . ' 1 1. I ---I. . 1 V . . . -----

чественного определения уровня анти-БГА в исследуемых образцах Зыли рассчитаны отдельные показатели диагностической эффективности тест-системы "Вектогеп-А-антитела", которые составили: чувствительность - 99%. специфичность - 81,8%, вероятность установления положительного диагноза - 95.6%, вероятность установления отрицательного диагноза - 97,2%. общий прказатель совпадения результатов составил 95,9%. • . -

В связи с тем. что на госиспытания не были представлены аналогичные зарубежные тест-системы, показатели специфичности ,вероятности установления положительного и отрицательного диагноза нуждаются в значительном уточнении.

Тест-система "Вектогеп-А-антитела" внедрена в практику здравоохранения и на нее. утверждена НТД (ВФС 42.. . . Разработка методики. определения титра нейтрализующих,антител

В процессе разработки вакцин протиЕ гепатита А возникает необходимость.. в. оценке.иммунного.ответа после.проведения.вакцинации. Одной из важне,.жх характеристик иммунного ответа является появление специфических антител в крови. Специфические антитела могут быть выявлены иммуноферментным или радиоиммунным методами, чувствительности которых ограничена определенными параметрами.

В связи с тем, что иммунный ответ на однократное введение вакцины в первоначальный момент достаточно слабый в отличие от естественной инфекции, антитела часто не выявляются существующими иммуноферментными или радиоиммунными методами. В то асе время показано, что нейтрализующая активность антител даже после однократ-

ной иммунизации имеет место, что обеспечивает хорошую защиту- от инфекции. •

- Стандартная коммерческая тест-система RIA( HAVAB, Abbot Laboratories') выявляет только те сыворотки титр нейтрализующих антител которых составляет больше'чем 1:160 .

Наиболее удобным методом определения нейтрализующих антител является метод подавления оляшкообразозания с применением штопа-тогенного штамма вируса гепатита А. Этот метод получил в послед-лее время большое распространение. Свойства выделенного нами ци-топатогенного штамма МБ-7 вируса гепатита А позволили нам разработать методику определения титра нейтрализующих свойств специфичных сывороток .- -

За основу при разработке этой методики нами была взята реакция бляшкообразования штамма МБ-7. ВГА с культуре клеток FRHK-4: Наиболее четкие бляшки образовывались на 12-13 день выдерживания под агаром.

При титровании вируса методом бляшкообразования наш было показано,. что существует пропорциональная зависимость количества бляшек, образуемых цитопатическим штаммом ВГА на культуре клеток •FRhK-4 (см. рис.)от разведения вируса. Впоследствии в реакции .нейтрализации использовали примерно' 200 - 500 инфекционных вирус-' ных частиц. Количество бляшек 200Н ■ 180| 16СН 140-f ISO-} .100-1 ЙГЯ '

1UI

v.o-i

■Ij"5 10"6' Ш"7' разведения вируса'

Зависимость количества бляаек ст разведения штамма МБ-7.

Данным методом и штаммом воспользовались при испытании различных специфических сывороток, полученных при раьоаОотке- оеком-бинантной вакцины против гепатита А • в • НПО-Вектор". ' Гуморальные антитела в сыворотках крови различных животных не выявлялись ле" введения различных .рекомоинантных конструкций, поэтому мы привели скрининг большего количества образцов сывороток с испол-сованием .'цитопатогенного. штамма МБ-7 .в. реакции подавления оляшкреб-разующего действия в культуре меток FRhK-4. В дополнении к от-■ сутстЕий-*ciitiiritwitcCiuix' ¿пт;;7с.~.""к^гг.-.—-ИФА. показано также отсутствие нейтрализующих ЕГА антител в исследуемых сыворотках.

. ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований и анализа экспериментальных, данных выбраны оптимальные параметры роллерного культивирования штамма HAS-15/4647 ВГА, обеспечившие увеличение накопления антигена ВГА в 8-10 раз.

2. Впервые выделен отечественный штамм МБ-7, обладающие ци-топатическими свойствами в культуре клеток и высокой репродуктивной активностью.

3. По результатам анализа нуклеотидной последпнательности фрагмента генома белка VP-1 птамм MBL7 может быть отнесен г более распространенному в мире генотипу группы 1 'пгдгруп-с

что явилось решающим для его применения в производстве диагностических и, в перспег-иве, вакцинных препаратов. * ............

4. Разработана методика определения титра нейтрализующих антител анти-ВГА иммунных.сывороток в культуре клеток с использова-

. нием цитопатических свойств штамма МБ-7.

5. Разработаны и внедрены в практику здравоохранения иммуно-ферментные тест-системы для диагностики гепатита А:

- Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А "Вектогеп-А Ig М"

- Тест-система, иммуноферментная для выявления антител к . ви-

русу гепатита А "Вектогеп А - антитела"

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Бондаренко Е.П.. Бондаренко К. В.. Майданвк А. Г.. Тюнников

Г.И., Немцов е.В., Конакова В.Б. Выбор оптимальных параметров куль-таярсаания вируса "гепатита А. //Ред. ж. Вопросы вирусологии. М-lSSl-iíc. Библиограф. 14. назв. Рус. Деп. ВИНИТИ 07.02.91

2. Ма'Лданюк А. Г, Тюнников Г.И. Конакова В.Б. Бондаренко Е.П. Немцов Ю. В. Карпович Л.Г; Калашникова Т.Е. Мамаева Н.В. Сосновцев

■:.Б. Чижиков В. Е. Выделение и изучение характеристик цитопатичес-хсго штамма вируса гепатита А. //Вопросы вирусологии 1993, N3 стр. 101-104.

3. МаЯданюк А.Г.. Бондаренко Е.П.. Немцов Ю.В.. Тюнников

Г.Я.. Конакова В.Б., Мамаева Н.В.. Чижиксв В.Е. "Штамм Virus hepatitis A hominis для приготовления вакцинных и диагностических препаратов" //Патент СССР N 1806190 выдан 30.03.1993 г.

4. Майдангк А.Г.. Немцов D.B.. Тюнников Г.И., Мунтянова

М.А.. Крюк Н.И.. Бондарчук В. Б. Разработка препаратов и методов ди- . агностики гепатита А. //Инфекционной службе г. Новосибирска-90 лет. Сборник материалов научно-практической конференции. (5-7 октября 1994 г.) г." Новосибирск •

5. Тюнников Г.'И.. Майданюк А. Г., Бондаренко Е.П.. Конакова В. Б. Иммуноферментная тест-система для выявления, общих антител к вирусу гепатита А. //Изучение и профилактика особо опасных вирусных инфекций. Сборник материалов межведомственной конференции. 7-3 апреля 1993 пгт.Кольцово.