Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Низкомолекулярный белок клеточной стенки стрептококка группы А, не обладающей типовой специфичностью: выделение, иммунологические свойства, использование в иммунодиагностике

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Низкомолекулярный белок клеточной стенки стрептококка группы А, не обладающей типовой специфичностью: выделение, иммунологические свойства, использование в иммунодиагностике"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УД К 616.157:576.8.077.3:621.928.1 МОЛЧАНОВА Татьяна Олеговна

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ БЕЛОК КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ А, НЕ ОБЛАДАЮЩИЙ ТИПОВОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ИММУНОДИАГНОСТИКЕ

Специальность 03.00.04 — Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1991

Работа выполнена в Московской медицинской академии им.И.¡Л.Сеченова

Научный руководитель - доктор медицинских наук

Ряшс Л.А.

Официальные оппоненты: акадешк АШ СССР, АШ РС4СР,

Горина Л.Г.

Ведущая организация - П-й Московский государственный медицинский институт им.Н.П.Дирогова

Д. 1)74.05.10 при ША им. И.:,¡.Сеченова (119881, Москва, Г-435, Ь.Пироговская ул., 2-6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ША ш. 11.1,1. С бульвар,37/1

доктор медицинских и биологических • наук,профессор Доыарадский И.В.; доктор биологических наук

Защита диссертации состоится часов на заседании Специализированного совета

в

Учений секретарь специализированного совета Д.074,05.10 кандидат медицинских наук, доцент

¡¿фонов А.Ю.

Актуальность темы. Стрептококковая, инфекция, этиологическим агентом которой является стрептококк группы А, представляет собой одну из наиболее распространенных бактериальных инфекций и включает разнообразные по своей клинической картине заболевания, объединяемые в группу стрептококкозов. К стрэптококкозам относят скарлатину, острые и хронические стрептококковые поражения ЛОР-органов и кожи, а также негнойные посгстрептококковые заболевания ( вторичные формы стрептококковой инфекции): ревматизм, рожу,пост-

стрептококковый гломерулонефрит, некоторые формы васкулитов.

Многообразие клинических проявлений стрептококкозов при общности этиологии закономерно1 выдвигает в разряд первоочередных задачу поиска антигенов стрептококка группы А, на основе которых можно было бы создать единую систему иммунологической диагностики стрептококковой инфекции.

Одной из отличительных черт структуры клеточной стенки стрептококка группы А является наличие в её составе большого количества белков ( до 60 мольных процентов). В настоящее время большинство исследований белков клеточной стенки стрептококка группы А посвящено типоспецифическим М белкам, так как они могут являться базой для разработки стрептококковой вакцины ( вваеЬеу е.н. вt а1., 1987, 1388,Р18с11ет \r.et ¿11988). Однако использование типоспеци-фических белков в серодиагностике затруднено из-за отсутствия четкой связи определенных серотилов стрептококка группы А с теми' или иными клиническими формами стрептококковой инфекции. Одним из направлений изучения белков, пригодных для целей серодиагностики, является поиск белков клеточной стенки, не обладающих типовой специфичностью.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выделение и очистка белка, не обладавшего типовой специфичностью, изучение его биохимических и иммунологических свойств, а также возможной ишунодаагностической ценности.

«Л^тлЯ ЧМ\КАП«1 ЯТЧЧ . ..ЧДТ I

щллтин рииут шл/иышыэ.

- разработка мягкого метода экстракции поверхностных белков клеточных стенок стрептококка группы А;

- создание системы скрининга выделяемого белка на основе того, что он не должен обладать типовой специфичностью;

- разработка последовательных стадий очистки и выделения белка, не обладающего типовой специфичностью, из тритоновых экстрактов клеточных стенок стрептококка группы А;

- изучение биохимических и иммунохигаческих свойств выделенного белка;

- оценка ишунодаагностической ценности определения антител к выделенному белку при иммунизации мышей клеточными стенками стрептококка группы А;.

- оценка ишунодаагностической ценности определения антител -к выделенному белку в клинической серодиагностике стрептококковых инфекций.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований разработана схема выделения нового, ранее не изученного белка, не обладающего типовой специфичностью, из состава клеточных стенок стрептококка группы А. Изучены биохимические и ишунохиш-ческие свойства белка, а также возможность использования его при дифференциальной диагностике различных форм стрептококковой инфекции.

Практическая ценность. Дисоертация выполнена в соответствии с плзчом научных исследований Проблемной научно-исследовательской

лаборатории по изучению стрептококковых инфекций при кафедра эпидемиологии ША им. И.М.Сеченова по теме "Изучение взаимодействия стрептококка группы А о организмом человека и совершенствование диагностики и профилактики стрептококковой инфекции" (номер государственной регистрации 01860048890) в рамках Отраслевой научно-технической программы в области медицины на 1986-1990 гг. С14 "Изучение научных и организационных аспектов дальнейшего снижения заболеваемости населения инфекционными болезнями и ликвидации управляемых инфекций (шифр задания 02.01.06.Н1).

Результаты настоящей работы могут служить основой для разработки новых способов иммунодиагностики на основе определения антител к белкам, не обладающим типовой специфичностью.

Обнаружено наличие у выделенного низкомолекулярного белка и 1д<32человека общих антигенных детерминант, что может помочь в понимании механизма постстрептококковых осложнений с перспективой на возможное их преодоление.

Цубликашщ. По теме диссертации опубликовано две статьи, а также тезисы докладов на Первом Всесоюзном иммунологическом съезде,

Апробатоя работы. Диссертация апробирована на конференции кафедры эпидемиологии ША им. И.М.Сеченова.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописи и состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, отдельного раздела, посвященного основным положениям диссертационной работы, выносимым на защиту, списка литературы.

Первая глава поовящена обзору литературы по белкам клеточной стенки отрептококка группы А: их характеристике и использо-

ванию в иммунодиагностике. Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в работе. В третьей, четвертой, пятой и шестой главах изложены результаты собственных исследований. Заключение посвящено обсуждению полученных результатов. В списке цитируемой литературы приведены 127 лоточников отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована II таблицами и 25 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе были использованы matt -формы штаммов стрептококка группы А, типов 29М (М+штадм, Д23/П, Je 62/59, Пражская коллекция), I AI и 12 М (^штаммы соответствующих типов бшш любезно предоставлены старшим научным сотрудником Института ревматологии А<.Я СССР Лабинской A.C.), выращенные на бульоне Todd-Hewitt (Difco ,СИА). Клеточные стенки выделяли отдельно из клеток каадого типа, разрушением их в замороженном состоянии на окструзионном прессе Эдебо

( ькв f Швеция) с последу нцим дифференциальным центрифугированием.

Для получения поверхностных белков в нативном состоянии из состава клеточных стенок использовали неионный детергент тритон Х-100, приготоатенный на дистиллированной воде (I% раствор), в котором суспендировали 16-18 часов предварительно отмытые и обработанные РНК-азой А (10 мг на 100 мл буфера) клеточные стенки. Сулернатаыг отделяли центрифугированием.

Ионообменную хроматографию тригоновых экстрактов клеточных стенок I, 12 и 29М типов проводили на колонке, содержащей ДЭАЭ-трисакрил Ц, с элюцией сорбировавшихся компонентов ступенчатым градиентом концентрации наС1 • Гель-фильтрацию белковых фракций осуществляли в два этапа: на широкой, а затем на узкой колонке. В обоих случаях применяли смолу Sephadez G -50, Superfine .

Аминокислотный анализ выделенного белка, гидролизованного

6н соляной кислотой ( при Ю9°С, в течение 24 часов в атмосфере азота), был выполнен на амш окислом ом анализаторе ьс 5000 ( Biotronik t фрг) ПрИ любезном содействии сотрудницы лаборатория Битко С.А.

Кроличьи антисыворотки к целым клеткам стрептококка группы А типов SM, I2M ж I9M были любезно предоставлены др.О.йонемундом ( Институт микробиологии и экспериментальной терапии АН ГДР). Антисыворотки к целым клеткам стрептококка группы А типов Ш, I2M, 29М; к цельным тритоновым экстрактам 29М типа, а также к ряду фракций, отобранных при ионообменной хроматографии, получали гиперишунизавдей кроликов соответствующими препаратами. Мышиные сыворотки к клеточным стенкам стрептококка группы А 29М типа были получены от самцов и самок мышей линии ВА L В/С, иммунизированных вяутрябршшнно, через I, 3, 6 и 8 недель. Кавдому интервалу времени и контрольной группе соответствовало 10 животных. Сыворотки больных ревматизмом в активной и неактивной фазе ( соответственно в числе 31 и 30), рожей ( в числе 33) и сероне-гативным ревматоидным артритом ( в числе 33), а также 44 сыворотки здоровых доноров бшш любезно предоставлены сотрудниками центра по иммунодиагностике стрептококковых инфекций при Первой городской клинической больнице - Нежяукченко М.Ю. и Феоктистовой О.Б.

Двойную иммунодиффузию по Ухтерлони проводили на предметных стеклах в 1,3$ агаре Нобля, содержащем 1% полиэтиленгликоля -600Q на 0,05М барбитоновом буфере. Ilt.if.iy но электрофоре з проводили на стеклах от фотопластин размером 9x12 см в 1,5 мм слое 1% ага-розы на 0,0IK барбитоновом буфере, рН 8,6 при напряжении I50B и силе тока 5 мА на гтекло в течение I часа.

Мммунофер-ментный анализ (ИФА) проводили на 96-луиочных полистироловых плашках ( Dynatech , Швейцария) в рамках стан-

дартной системы непрямой модификации №iA. Для оценки нетипоспеци-фичности в качестве первичных антител использовали антисыворотки к целым клеткам стрептококка 11,1, ЗЫ, I2M, I9M и 29М типов. Fo - рецепторную активность изучали до связыванию сорбированного на плашки белка с нормальной кроличьей сывороткой. Содержание А-полисахарида в различных препаратах определяли с помощью коммерческой кроличьей антисыворотки к А-полисахариду в качестве первичных антител, ¡¡ля оценки чувствительности антигенных детерминант выделенного белка, распознаваемых антителами, к ряду про-теаз, а также к НаЮ^ проводили предварительную обработку сорбированного белка указанными реагента!,¡и. Б качестве вторичных антител использовали в зависимости от примененного варианта №М коммерческие антисыворотки к кроличьему иммуноглобулину j6g , к мшш.ыы иммуноглобулинам igji , igG , igA. к человеческим .иммуноглобулинам1^ , IgG , IgA , lg ( М+ G + А), а также коммерческие ыыпшше igG моноклональные антитела к человеческий иммуноглобулинам: igGl , igG2 , Ig03 , IgG4 .

Концентрацию белка в цельных tjjütohobux экстрактах, а такке во фракциях, полученных на всех стадиях очистки, определяли по Лоури в ьикромодофнеации, а также спектрофотомотрически. Концентрацию углеводов - па основе определения раынозы с помощью антро-ноеого реактива. Содержание неорганического фосфора в различных белковых препаратах измеряли микрометодом P.S.Chen и др. Наличие примеси нуклеиновых кислот в тритоноЕЫХ экстрактах проверяли преципитацией их 1% раствором проташн сульфата.

доя статистической обработки результатов изучения сывороток шшей и люден применяли критерий Стьвдента ( нормальные или близкие к портальным распределения), нелараметрически« критерий »i0ji.'.i0r0p0Ba-C.\;;ipfi0Ba, а такке критерии Пирсона для оценки досто-

верности различий по уровню превышения значений в контрольной группе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛ&ОВАКИЙ И ОЬСКдДЗНЬЕ.

Выделение и очистка низкомолекулярного белка неточной стенки. не обладающего типовой специфичностью.

Одной из первоочередных задач представленной работы являлось выделение и очистка белка клеточной стенки стрептококка группы А, не обладающего типовой специфичностью.

С целью выделения белка била использована экстракция клеточных стенок стрептокошса группы А неионниы детергентом тритоном Х-100 на дистиллированной воде. üi6op указанного метода экстракции определялся следующим! причинами:

I) использование неионного детергента вместо применения относительно жестких методов экстракции ( экстракция соляной кислотой, гидроксиламином, экстракция ферментами) позволяет выделять белки, связанные с клеточной стенкой гидрофобными связями, без нарушений структур, связанных ковалептными связями; 2) использование для экстракции растворов низкой ионной силы ( в данном конкретном случае дистиллированной воды) позволяет снизить вероятность разрушения экстрагируемых белков конституционными протеаза-ми клеточной стенки стрептокошса ( однако, экстракция одной лишь дистиллированной водой без детергентов приводит к низкому выходу экстрагируемых белков M.Lyampert et.ai. . IS77). Предэкстракцион-ная обработка клеточных стенок ЕК-азой А позволяла снизить последующее загрязнение тритоновых экстрактов Н1К, ассоциированной с клеточной стенкой.

Первичный скрининг тритоновых экстрактов на наличие белков, не обладающих типовой специфичностью, проводили мзтодаш двойной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза с использованием алтисыворот-

ки к тритоновому экстракту типа !<129 и тритоновых экстрактов I, 12 и 29М типов. Еьшо показано, что антиоыворотка к одному из трех тритоновых экстрактов образовывала несколько идентичных полос преципитации с трнтоновылш экстрактами грех указанных типов. Учитывая, что: I) антисыворотка к тритоновому экстракту не образовывала полос преципитации с А-полисахаридом; 2) полосы лреци-питации не исчезали ери отмывке геля 1% раствором ц&с1 ; 3) нор-г.шъпал кроличья сыворотка не образовывала полос преципитации с тритоновыми экстрактами всех трех типов, - было сделано заключение

0 том, что антисыворотка к тритоновому экстракту типа Ы2£ образовывала полосы преципитации с белками, не обладавдими типовой специфичностью.

В экстракте 29И типа было определено содержание белка, ■'. . • • углеводов и нуклеиновых кислот. Концентрация белка составила

1 мг/мл, :-углеводов,; - 0,082 ыг/мл; нуклеиновые кислоты не выявлялись.

С целью разделения-тритоновых экстрактов I, 12 и 29М типов на дискретные фракции была использована аниояо-обменная хроматография на ДЭА&- трисакриле М с элвдией сорбированных компонентов ступенчатым градиентом концентрации иаС1 . Как видно на рис Л, разделение тритоновых экстрактов I, 12 и 29Ы типа на ДЭАЭ - трисакриле Ц выявило наличие белковых пиков, элшрованннх идентич-ншш концентрациями НаС1 . Значимая часть белков тритоновых экстрактов трех типов не сорбировалась на анионо-обмешшке и элшровалась буфером без КаС1 . Представленные графики элюции белков позволял!! ориентировочно оценить содержание белков в собираемых фракциях.

Фракции тритонового экстракта типа И29, обозначенные на рис. 12 ¡ю.мераш 2, 3, 4,бшп использованы дю ишунизацил кроликов. Яолученные алтисавохюткз попользовали в реакции двойной

а - нанесение препарата б,в,г,д -г смена буфера по ступенчатым увеличением концентрации ИаСх(и,1; 0,15; 0,<¡5 А соотвег-сгвенно). По оси абсцисс отложено время элюции, по оси ординат оптическая плотность при ¿80 нм.

преципитации ни с одной из антисывороток к гетерологичным Ы типам { при регистрировании связывания в ИФА), а также с антисыворотками к тритоновому экстракту типа.М29 и антисыворотка!,ш к фракции 2 тритонового экстракта типа МЗЗ. К сожалению, анализ балка методом электрофореза в ПААГ о ДОТа не позволил выявить какие-либо полосы, вероятно, вследствие молекулярной массы выделенного белка меньше нижней границы разрешения примененного метода.

Исследование биохимических и иммунобиологических свойств низкомолекулярного белка, не обладающего типовой специфичностью.

Ультрафиолетовый спектр белка тлел два максимума в области 220 и 275 нм. Первый максимум поглощения был характерен для пептидных связей, второй - для ароматических аминокислот.

Молекулярная масса выделенного белка, определенная с помощью аналитической гель-фильтрации на колонке 0,6 х 100 см, наполненной сефадексоы с -50, Superfine , составляла около 4000 Д.

Анализ аминокислотного состава выявил чрезвычайно высокое содержание в выделенном белке глицина - 42,5 ыол.$, ароматические аминокислоты составляли 3,7 а содержание гидрофильных и гидрофобных аминокислот было 34,9 мол.$ и 22,8 тл.% соответственно ( табл.1). Высокое содержание глицина в составе низкомолекулярного белка, не обладающего типовой специфичностью, несвойственное известным ранее белкам клеточной стенки стрептококка группы А, вероятно, может определять конформацнопную структуру указанного белка в виде складчатого слоя: взаимное отталкивание r -групп при р -конформациа минимально, так как глицин имеет в качестве заместителей атомы водорода. Преобладание гидрофильных адэтокислот над гидрофобными определяет хорошую раствори-

ТАБЛИЦА I. Аминокислотный состав выделенного низкомолекулярного белка.

Аминокислота Содержание, в молярных %

Аспарагин +

аспара-тиновая кислота 9,7

Треонин 0

Серин 7,2

Глутамин +

глутаминовая кислота 8,6

Пролин 3,8

Глицин 42,5

Алании 6,5

Валин 2,0

Кетионин 2,4

Лейцин 5,7

Тирозин 1,3

йенилаланин 2,4

Гистидая 1,8

Лизин 3,9

Аргинин 2,4

ли уровня IgA. антител в указанной точке достоверно не отличались- от контроля. У самок средние показатели уровня igA антител на 3-й, 6-й и 8-й неделе эксперимента достоверно превышали контрольные значения ( р < 0,05, р < 0,01 и р < 0,01 соответственно) .

Выявлены такке половые особенности ответа мышей лиши ВА ьВ/С на выделенный белок. В контрольных группах уровень igU , igG и igA антител был выше у самцов, чем у самок, при атом половые различия в исходном уровне igA антител были статистически достоверны ( р < 0,05). Оценка амплитуды изменения уровня антител выявила, что у самок амплитуда изменения и igA антител была в два раза выше, чем у самцов, тогда как половые различия в амплитуде изменения igG антител бшш незначительны. Исследование половых различий уровня , igG и igA антител на разных сроках эксперимента выявило■достоверные различия уровня igji и IgG антител у иммунизированных животных на 3-й неделе ( р < 0,02 и р < ,0,01 соответственно).

Интересно отметить, что ранее были описаны половые различия в индукции экспериментального артрита после системной инъекции клеточных стенок стрептококка группы А ( R.L.Wilder et.al.,1982). Данные представленных экспериментов в совокупности с опубликованными в литературе позволяют предположить наличие определенной корреляционной связи между половыми особенностями ответа на выделенный белок и половыми различиями в индукции постстрептококковой патологии.

Исблеловаиие диагностической ценности определения антител к низкомолекулярному белку, не обладающему типовой специфичностью. в клинике стрептококковой ингоекци: . •

С целью установления да-агностической значимости определения

показателей гуморального иммунного ответа больных стрептококковой инфекцией к низкомолекулярному белку клеточной стенки, не обладавшему типовой специфичностью, а также с целью получения данных о роли указанного белка в патогенезе стрептококковой инфекции человека, было проведено сравнительное исследование уровня

( > 1еА и сумг.1арных ( М + о + А) антител к выделенному белку в сыворотках здоровых доноров, а также больных рожей, ревматизмом в активной и неактивной фазах ( заболевания, при которых этиологическая роль стрептококка группы А строго установлена) и больных серонегативннм ревматоидным артритом (заболевание, при котором этиологическая роль стрептококка группы А не установлена). Дополнительно, в отдельных группах была исследована корреляционная овязь уровня суммарных антител к выделенному бету о уровнем суммарных антител к А-полисахариду, а 'также распределение антител по оубклассам1^1 . ^з

и 1504 •

а) Определение уровня х&и антител в сыворотках больных и доноров.

Максимальный средний показатель уровня антител был выявлен в группе больных серонегативным ревматоидным артритом, он достоверно превышал аналогичный показатель группы'здоровых доноров ( р < 0,01). Высокий средний показатель*^ антител, достоверно превышающий показатель группы здоровых доноров (р < 0,05), также был обнаружен в группе больных первичной рожей. Статистическая обработка данных о помощью критерия Колмогорова-Смирнова выявила, в отличие от результатов, получеш:ых с помощью критерия Стъюдента, достоверные различия группы больных ревматизмом в активной (¡азе и контрольной группы (р < 0,01). Исследование различий в уровне х^ антител ыехсду rpynnaj.ni боль-

- IB -

ных выявило, что средний показатель уровня lg!«! антител в группе больных серонегативным ревматоидным артритом достоверно превышал аналогичный показатель группы больных ревматизмом в неактивной Лазе ( р < 0,01),

Применение критерия Пирсона для статистической обработки результатов позволило выявить достоверные различия с контрольной группой только в группе больных серонегативным ревматоидным артритом ( р < 0,01). |

б) Определение уровня igG антител в сыворотках больных и доноров.

Распределение антител по субклассам igGi , igG2 tigG3 и igG4 в сыворотках больных и доноров. Во всех группах больных, за исключением группы больных первичной рожей, средние показатели уровня igG антител достоверно превышали соответствующий показатель группы здоровых доноров с максимальным средним показателем уровня igG антител в группе больных ревматизмом в неактивной фазе (р < 0,01). Исследование различий между группами больных выявило, что средние показатели уровня igG антител в группах больных ревматизмом в активной и неактивной фазах, а также в группе больных серонегативным ревматоидным артритом, были достоверно выше ш'галогичного показателя группы больных первичной рокей ( во всех случаях р < 0,01).

Результаты, идентичные вышеуказанным, были также получены при статистической обработке данных с помощью критерия Пирсона.

Дополнительно в отдельных сыворотках ( в 10 сыворотках здоровых доноров, в II сыворотках больных первичной рожей и в 22 сыворотках больных ревматизмом в активной и неактивной фазах) било исследовано распределение igG антител к выделенному белку по субклассам IgGi ,.Igö2 , igG3 и iga4 . Учитывая наличие

общих антигенных детерминант у выделенного белка rilgG2 человека, были подобраны условия проведения ¡©А, позволяющие избежать перекрестные реакции. Было показано, что использование низких разведений сывороток (1:5) позволяло практически полностью устранить взаимодействие моноклональных антител KIeQ2 человека о сорбированным белком.

Сравнение средних показателей уровня антител каждого из субклассов в сыворотках больных ревматизмом, ролей и доноров выявило значимые различия только по уровню IgG1 антител в сыворотках больных рожей и доноров ( р < 0,01).

Во всех изученных сыворотках доминировали либо антитела, либо xgG3 , либо оба субкласса одновременно. В группе доноров отмечалось одинаковое количество сывороток с доминированием каждого из субклассов igG2 иi6G3 (5/5). В группе больных ревматизмом выявили доминирование igG2 антител ( р < 0,05, согласно критерию Пирсона). В группе больных рожей также наблюдали более выраженный ответ по по сравнению с igQ3 антителами. Однако, достоверных различий получено не было.

в) Определение уровня igA антител в сыворотках больных и доноров.

Средние показатели уровня igA антител во всех группах больных достоверно превышали средни;! показатель уровня igA. антител группы здоровых доноров ( во всех случаях р < 0,01), при этом максимальный средний показатель уровня ^ антител был выявлен в группе больных ревматизмом в неактивной фазе. Следует отметить, что средний показатель урогня антител группы больных ревма-

тизмом в неактивной фазе достоверно превышал аналогичный показатель группы больных ревматизмом в активной фазе ( р < С,01).

Применение критерия Пирсона также выявило достоверность различий уровня igA антител всех груш больных, по сравнению с ' группой здоровых доноров ( во всех случаях р < 0,01).

г)Определение уровня ig (М+ а +А) антител в сыворотках больных и доноров. Изучение корреляционной зависимости уровня суммарных антител к выделенному белку от уровня суммарных антител, определяемых к А-полисахариду, в сыворотках больных ревматизмом в активной и неактивной фазах. 1

Средние показатели уровня суммарных антител всех групп больных достоверно превышали этот показатель группы здоровых доноров. Максимальный средний показатель уровня суммарных антител определялся в группе больных серонегативным ревматоидным артритом. Различия в средних показателях уровня суммарных антител между группами больных были недостоверны.

Аналогичные результаты были получены при обработке данных с

использованием критерия Пирсона.

/

Дополнительно в группах больных ревматизмом в активной и неактивной фазах была исследована корреляционная связь уровня суммарных антител к низкомолекулярному белку, не обладающему типовой

< .

специфичностью, с уровнем суммарных антител к группоспецифическо-му А-полисахариду, Было установлено, что'в обеих группах определяется положительная корреляционная связь иммунного ответа на оба используемых антигена, при этом в группе больных ревматизмом в активной фазе коэффициент корреляции составлял 0,413, а в группе больных ревматизмом в неактивной фазе - 0,717. Полученные результаты указывали на более сильную корреляционную связь иммунного ответа на выделенный белок и А-полисахарид у больных ревматизмом в неактивной фазе, по сравнению с больными в активной фазе.

Таким образом, было установлено, что определение антител к низкомолекулярному белку, не обладающему типовой специфичностью,

представляет несомненный клинико-диагностический интерес и песет важную информативную функцию. Анализ ответа на белок по пзо-типам антител выявил следующие закономерности: I) максимальные

показатели суммарных (М + о +А) антител определялись в сыворотках больных серонегативным ревматоидным артритом; 2) максимальные показатели уровня антител определялись в сыворотках больных серонегативным ревматоидным артритом и первичной рожей, что свидетельствовало о выраженности первичного иммунного ответа на использованный антиген в данных группах больных; 3) максимальный уровень ж 1еА антигел определялся в сыворотках больных ревматизмом в неактивной фазе; 4) для больных ревматизмом была установлена положительная корреляционная связь мея-ду ответом на белок и грушюспецифический А-полисахарид, наиболее выраженная для больных в неактивной фазе. Два последних пункта указывали на I) выраженность вторичного иммунного■ответа у Сольных ревматизмом в неактивной фазе, 2) длительную персистенцию компонентов клеточной стенки, приводящую к высокой корреляционной связи иммунного ответа на дискретные антигены клеточной стен-га.

Следует отметить, что обнаруженные, статистически достоверные различия в уровне 1вА антител между больными ревматизмом в активной и неактивной фазах могут служить основой для разработки перспективных тестсистем определения активности ревматизма.

Выводы?

1. Обработка клеточных стенок стрептококка группы А 1% раствором тритона Х-100 на дистиллированной воде позволяла экстрагировать белки, не обладающие типовой специфичностью.

2. Разработана схема очистки низкомолекулярного балка, не

- & -

обладающего типовой специфичностью, включающая ионообменную хроматографию на трисакриле М и двухэталную гель-фильтрацию на сефадексе ® -50,Зирег:Ппе . Очищенная белковая фракция не

ЛЛ ТГГ '.*"■» ЧП *ГТЧЯЛПП1ГЛТ| Т»

3. Низкоыолекулярный белок, не обладающий типовой специфичностью, имел следунцие свойства:

а) молекулярная масса - 4000 Л, '

б) максимум поглощения в УФ области при ?20 и 275 ни,

в) доминирование в аминокислотном составе |глицина (42,5$),

г) чувствительность антигенных детерминант, распознаваемых антителами, к трипсину при резистентности к пепсину, папаину, проназе и N»10,

д) наличие общих антигенных детерминант с 1вС2 человека.

4. Однократное введение мышам линии БД ЬВ/С клеточных стенок отрептококка группы к приводило к динамике 1ем , ^к3 и антител к выделенному белку. Выявлены половые различия в ответе мышей на использованный белок.

5. В клинике первичной рожи, ревматизма в активной и неактивной фазах и оеронегативного ревматоидного артрита показана диагностическая ценнооть определения суммарных антител и отдель-них изогмов (Ы, о , А) антител к низкомолекулярному белку, не обладающему типовой специфичностью. Показано преобладание среди субклассов - 1ваг и л^з.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Молчанова Т.О., Шихман А.Р. Перспективы иммунодиагностики стрептококковой инфекции на основе белков клеточной стеши стрептококка группы А, лишенных типовой специфичности// Первый Всесоюзный иммунологический съезд. - Москва, 1989. - Т.1. - С. 235.

2. Молчанова Т.О., Шихман А.Р., Брико Н.И. Изучение уровня

, , 10А - антител и суммарных антител н низкомолекулярному белку клеточной стенки отрэптококков груши А, лишенному типовой специфичности, в сыворотка больных стрептококковой инфекцией// ЯМЭИ. - 1990. - № II. - С.21-26.

3. Молчанова Т.О., Шихман А.Р., Дынча Л.О. Ниакомолекулярянй белок клеточной стенки стрептококков группы А, лишённый типовой серологической специфичности// ИСТ. - 1991. - № 2. -С. 16-20.