Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генов поверхностных белков стрептококков группы А, связывающих протеины плазмы крови

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генов поверхностных белков стрептококков группы А, связывающих протеины плазмы крови"

РТ6 од

• 2 ЬВГ ^

на правах рукописи

Катеров Вячеслав Евгеньевич

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ А, СВЯЗЫВАЮЩИХ ПРОТЕИНЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.07 - Микробиология

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, академик

РАМН, профессор А.А. Того ляп

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор В.С. Гайцхоки

доктор медицинских наук, профессор Б. В. Тец

Ведущее учреждение:

Московский Научно-исследовательски институт эпидемиологии и микробиолс им. Гамалея Н.Ф.

Защита диссертации состоится "_"__1996 го;

_ часов на заседании диссертационного совета Д 001.23.02

защите диссертаций, представленных на соискание ученой степени док: наук при НИИ экспериментальной: медицины РАМН (193376, Caí Петербург, ул. акад. И.П. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института

Автореферат разослан (Ч " д-Дх_1996 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета П.Г. Назаров

доктор медицинских наук

ВВЕДЕНИЕ

В структуре инфекционных заболеваний бактериальной этиологии, болезням, вызываемым стрептококком фуппы А принадлежит одно из ведущих мест. Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А) является возбудителем ряда острых и хронических заболеваний человека, а также участвует в развитии тяжелых осложний, связанных с данной инфекцией. К болезням, вызываемым стрептококком данной группы, относятся: острый и хронический тонзиллиты, фарингиты, скарлатина, стрептодермии, гнойные процессы в тканях, коже, подкожной клетчатке, рожа, разные формы ревматизма, острый гломерулонефрит, аллергические васкулиты, инфекционно-аллсргические миокардит и полиартрит, некоторые формы пневмоний и ряд других заболеваний (отиты, менингиты, шоковые состояния, сенсии). Таким образом, один и тот же вид микроба способен вызывать широчайший спектр различных заболеваний. Вероятно это происходит за счет вовлечения в процесс множества факторов патогенности стрептококка, которые способны взаимодополнять действия друг друга. Так например, у некоторых SOF положительных серотипов стрептококка дня проявления устойчивости к фагоцитозу необходимо одновременное присутствие как Fe RA, так и EmmL белков, хотя по отдельности эти белки могут и не обладать достаточной антифагоцитарной активностью. Известно, что стрептококки группы А способны взаимодействовать с различными общими и специфическими защитными механизмами хозяина. Это взаимодействие происходит в процессе адгезии и колонизации тканей микробами, действия их протеолитических ферментов, цитолитичсских токсинов, суперантигенов, белков, реагирующих с системой коагулирования и белков, способных связывать плазменные белки и компоненты иммуппоп систсг^ы хозяина. Для того, чтобы понять процессы, стоящие за этим взаимодействием, необходимо детальное исследование всех потенциальных факторов патогенности стрептококка, и особенно, поверхностных белков микроба, так как они в первую очередь встречаются с белками млекопитающих, узнаются их иммунной системой и являются ответственными за успешную, либо неудачную адгезию и позже колонизацию организма хозяина микробами. Чтобы понять всю сложность действия стрептококковых поверхностных факторов патогенности, приходится проводить детальный анализ каждого подозреваемого в этом белкового продукта данного микроорганизма; более того, из-за большого различия в патогенных свойствах различных штаммов стрептококка группы А необходимо детальное сопоставление их характеристик. Из изложенного ясна необходимость дальнейшего изучения, накопления и анализа генетических и биологических характеристик бактериальных поверхностных факторов патогенности данного микроба, что подчеркивает актуальность поставленной в работе проблемы.

С другой стороны, отдельные стрептококковые поверхностные белки (Т, M и SOF, а в ряде случаев нейраминидаза и ДНКаза) являются важными эпидемиологическими маркерами и широко используются для типирования и субтипирования штаммов этой бактерии. Поэтому анализ последовательностей генов данных типоспецифических маркеров позволит получить новую информацию, которая может быть использована для создании молекулярно-диагностических методик.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы является детальная характеристика генов поверхностных факторов патогенности стрептококков группы А и кодируемых ими белков, а также генетический анализ взаимоотношений между одноименными и аналогичными генами различных ссротипов стрептококков. Для достижения поставленной цели запланированы следующие задачи:

1. Определить организацию vir регулона в штамме стрептококка группы A ML5 серотипа. Данный тип выбран для изучения, поскольку в предыдущих работах он был использован для изучения патогенности и выделения натквкого I3O рсиоггторкого белка.

2. Определить полную нуклеотидную последовательность генов, составляющих центральную часть vir регулона этого серотипа, а так же последовательность фланкирующих генов, входящих в состав регулона.

3. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей рада клонированных генов.

4. Экспрессировать рекомбинантные гены в E.coti.

5. Выделить рекомбинантные белки, кодируемые генами vir регулона и определить их связывающие свойства.

6. Клонировать в Е.соИ ген нового фибриноген связывающего белка (белка F) стрептококка группы А.

7. Определить нуклеотидную последовательность гена, кодирующего данный белок и провести ее анализ.

8. Экспрессировать ген этого белока в Е.соН.

9. Провести очистку белка F с последующим исследованием его свойств. Научная новизна работы состоит в том, что:

1. Впервые определена организация vir регулона в штамме М15 серотипа стрептококка группы А.

2. Впервые показано, что М15 серотип должен быть отнесен к SOF положительным типам.

3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генов, составляющих центральную часть vir регулона штамма M15 серотипа,

4. Впервые показано, что M-like (М-подобные) белки SOF положительных серотипов стрептококков группы А отличаются по своей организации, и возможно, по функции от настоящих M белков из SOF негативных штаммов.

5. Детально изучены связывающие свойства всех белкой, кодируемых генами vir регудона.

6. Впервые показано, что фибронектин-связывающий белок F также обладает аффинностью к фибриногену, хотя и с менее выраженной активностью.

7. Впервые показано, на примере гена белка F, что горизонтальный перенос генетического материала, по-видимому является одним из основных механизмов формирования изменчивости стрептококковых факторов патогенности.

Теоретическая ценность.

Данная работа носит теоретический характер. Полученные результаты позволяют ответить на вопрос о механизмах образования изменчивости генов стрептококковых факторов патогенности. • Анализ свойств различных поверхностных белков стрептококка в сопоставлении с вызываемыми ими заболеваниями должен помочь в установлении реальных путей, по которым бактерия атакует организм хозяина, а также вычленить наиболее важное звено в патогенезе стрептококковых инфекций. В дополнение к сказанному следует отметить, что полное понимание "образа действия" стрептококка позволит определять группы людей наиболее подверженных этой инфекции (или отдельным её формам) и, тем самым, значительно снизить риск развития заболевания.

Практическая ценность.

С практической точки зрения, исследование основного фактора адгезии стрептококка, фибронектин/фибриноген связывающего белка F, как возможного кандидата на создание вакцины, предотвращающей адгезию стрептококка к клеткам хозяина может оказаться ключевым моментом в предотвращении рягнчития стрептококковах заболеваний. Информация, полученная при анализе последовательности гена M-likel5 белка может оказаться полезной при тонировании клинических изолятов стрептококков методом ДНК-ДНК гибридизации.

Положения, выносимые на защиту:

1. MIS ссротип стрептококков группы А принадлежит к SOF положительному типу, что согласуется с организацией vir регулона в этом серотипе и с последовательностью С-терминальной части EmmLL5 белка.

2, Связывание иммуноглобулинов является характерным свойством белков, кодируемых в vir регулоне SOF положительных типов стрептококков группы А.

3, Фибронектин связывающий белок F обладает способностью связывать фибриноген, что может подтверждать важность связывания фибриногена стрептококком, как одного из основных механизмов, обуславдивующем патогегшость стрептококков группы А.

4. Точечные мутации и горизонтальный генетический перенос играют основную роль в формировании изменчивости генов факторов

иатогенности стрептококка, как показано на примере анализа последовательностей гена белка F из различных серогипоп.

Достоверность полученных результатов подтверждается следующим:

1. Высокой специфичностью использованных молекулярных методов ( нолимеразная цепная реакция, секвенирование, ДНК-ДНК гибридизация, иммунологические методы анализа и т.д.), которые в совокупности позволяют однозначно трактовать полученные данные.

2. Применением наиболее современных способов компьютерного анализа данных секвенирования ДНК с привлечением таких банков данных как GenBank, EMBL и SwissProt.

Апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в четырех научных статьях, и доложены на "XII Лансфильдовском Международном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковым заболеваниям", С-Петербург, 1993 г. и на Международной научной встрече "Лунд-Мальмё-Копенгаген" в 1995 году. Материалы работы докладывались на заседании Отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ РАМН (1993, 1994 гг.) и па конференции Отдела микробиологии Университета Луида (Швеция) (1994, 1995 гг.). Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 123 страницах машинописного текста и включают: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, пять глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 16 рисунками. Указатель литературы содержит 85 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Streptococcus pyogenes. штамм EF1949, М15 серотипа бьш использован как источник хромосомной ДНК для клонирования генов vir регулона и гена белка F. Escherichia coli штамм JM109 использовался, как хозяин для векторных и рекомбшгантных плазмид, E.coli NM539 использовали для выращивания рекомбинантных бактериофагов. E.coli штамм НВ101 использовали как реципиент для высокоэффективной трансформации. E.coli штамм BL21(DE3) (Novagen, UK) применялся как хозяин для экспрессионнош плазмидного вектора рЕТ21а(+) и рекомбинантных плазмид на его основе. Следующие стрептококковые референс штаммы, полученные из соответствующих лабораторий, были использованы для сравнения нуклеотидных последовательностей части prtF генов: M4(281C;Colindale), M4/243(Umee), M4/118(Prague), M12/103(Prague), M12<195/2110; Prague), M 12( 100085; Colindale), M15/106(Prague), M18/104(Prague), M18(SS-36;CDC), T27(SF40;Colindale), M48(B4C3/48/l; St.Petersburg), M49(245/2110; Prague).

S.pyogenes выращивали на TH бульоне (Difco, UK) или на 1% ТН агаре с добавлением 2% лошадиной кропи. E.coli культивировали на L бульоне (Difco, UK) или на L агаре, при необходимости в среду добавляли ампициллин (Ар) (Sigma, USA) до конечной концентрации 100 мкг/мл.

В работе применялись следующие векторы для клонирования: фаговый вектор для геномного клонирования XGEM11 (Promega, USA), плазмидный вектор pGEM7Zf(+) (Promega, USA), экспрессионный вектор рЕТ21а(+) (Novagen,UK).

Хромосомную ДНК стрептококка приготааляли как описано Haanes и Cleary (19S9). ДНК бактериофагов лямбда выделяли по протоколу описанному Маниатис и соавт.(1982). Плазмидную ДНК выделяли и очищали в соответствии с Маниатис (1982) или при помощи Qiagen piasmid kit (Qiagen, Germany).

Рекомбинантную вставку плазмиды pDH56, содержащую большую часть fcrA76 гена, метили дипжеигешшом и использовали как зонд на А повторы. Меченная вставка из плазмиды рРС124, содержащая С концевую часть етт12 гена, использо!шлась для определения С повторов. Все гибридизационные эксперименты проводили на нитроцеллюлозных мембранах (BioRad, USA) по протоколу к DIG DNA. Labeling and Detection kit (Boehringer, Mannheim, Germany).

Геномная библиотека стрептококкового штамма EF1949 в фаге '/.GEM 11 (Promega) была получена по Маниатис (1982). Packagene in vitro packaging system (Promega) использовали для упаковки лигированной ДНК в бактериофаговые частицы. Приготовление E.coli JM109 или HB 101 компетентных клеток и трансформацию делали по протоколу фирмы Promega. Манипуляции с фагами, рестрикция ДНК, лигарование, Southern гибридизация и электрофорез в агарозных гелях проводили в соответствии со стандартными протоколами (Маниатис, 1982).

ДНК секвенировали по методу Сангер (1977). Перекрывающиеся двухцепочечные образцы для секвенирования приготавливали при помощи Erase-a-Base system (Promega). Реакции для определения нуклеотидной последовательности проводили с Sequenase Version 2.0 kit (USB, Cleveland, Ohio, USA) с использованием стандартного -40 M13/pUC праймера (Мессинг 1983) и праймеров к ТЗ и Т7 промоторам. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности анализировали при помощи GCG программного пакета Университета Лунда (Швеция).

Для получения амплификата, PCR проводили в соответствии со стандартной методикой (Saiki и соавторы 1988).

Очистку фибриноген связывающего белка F проводили из вскрытой кипячением E.coli BL21(DE 3), содержащей экспрессионную плазмиду pFNB3, фракционированием сульфатом аммония. Фракцию, содержащую 30 % сульфата аммония, наносили на колонку с Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) и уравновешенную с 15 мМ PBS рН=7.2 и 10 мМ бензамидин гидрохлоридом. Собранные фракции проверяли на способность связывать

7

фибриноген. Положительные фракции бьши объединены и нанесены на колонку с фибриноген-Сефарозой в том же буфере, который использовался для гель-фильтрации. После отмывки, связавшийся белок был эллюирован буфером, содержащим 0.1М глицин-HCl рН=2.8 и 10 мМ бензамидин гидрохлорид. После диализа, белок F был анализирован в СДС-ПАГЭ и Western блоте для проверки степени его очистки.

йммуноглобулиновые фракции сывороток против фибриногена и фибронектина (Dacopatts a/s, Denmark) бьши проверены в Western блоте на наличие перекрестных реакций с фибронектином и фибриногеном, соответственно.

Для определения фибриноген связывающих белков, фибриноген был помечен N-гидроксисукцинимидным эфиром дигоксигенин-З-О-метилкарбонил-е-аминокапроновой кислоты и дигоксигенин-З-О-сукцинил-[2-(Ы-малеимидо)]-этиламидом, а затем проявлялся в соответствии с описанием фирмы (Boehringer, Mannheim, FRG). Для определения IgG связывающих белков использовали кроличью ПАП систему производства Dakopatts (Glostrup, Denmark), в соответствии с прилагаемой инструкцией. Моноклональный человеческий сывороточный IgAl ( получен от проф. A. Grubb, Лунд) и иногда фибриноген (KABI-

Pharmacia) метили

125,

в реакции с Iodo-Beads (Pierce, Rockford, Illinois,

USA).

СДС-ПАГЭ белков проводился в соответствии с Laemmli (1970). Электроперенос белков из полиакриламидного геля на НЦ мембраны делали по стандартной методике Andersen (1984).

Константы связывания (Ка) белка F с фибриногеном и фибронектином определяли в соответствии с принципами, описанными Friguct с сотр. (1985).

Активность фактора оппалесценции определяли в бактериальных СДС экстрактах (Halbs and Widdowson, 1982) методом агаровых слайдов, описанным Maxted (1973).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Организация vir регулона S.pyogenes М15 серотипа.

Для выяснения структуры vir регулона стрептококка M15 серотипа было проведено детальное картирование хромосомной ДНК из штамма EF1949 при помощи ДНК зондов, представляющих гены, входящие в vir регулон как SOF негативных, так и SOF позитивных серотипов. Этими ДНК зондами бьши: fcrA76 ген, представляющий vir регулон SOF позитивных серотипов и имеющий т.н. А повторы, и С-концевая часть етт12 гена, включающая в себя С повторы, характерные для генов M белков SOF негативных серотипов и генов M-like и Епп белков SOF позитивных серотипов стрептококков. Выявленный гибридизационный

паттерн соответствал трем примыкающим друг к другу генам, один с А повторами и два с С повторами. Такая организация очень похожа на архитектуру vir регулона общую для SOF позитивных, а не для- SOF негативных типов S.pyogenes, как было предложено в 1992 году Haanes с соавторами (1992).

Для дальнейшего изучения структуры vir ре!улона штамма М15 серотипа была предпринята попытка клонирования входящих в него генов. В результате двойного отбора с вышеупомянутыми ДНК зондами, был найден один фаговый клон (ph 12/76), к тому же, были сохранены по одному клону, реагирующему только с зондом на С повторы (phl2), и только на А повторы (ph76). Физическая рестрикционная карта рекомбинантных вставок в фагах phl2/76, phl2 и ph76 была построена как показано на рисунке 1.

ph 12/76-

ВН SX В BBS

.1 „4 -f-i^-p-

XX X

— ph76

!.0kb E BU

pM1576 pM!512 pM151.S pENNIS oEMML 15

pli 12

X

virRli fer Al 5

> С

emmLl j

ennl5

I> С

scpAlS

1.0 kb

Рисунок l.

Рестрикционная карта области M15 хромосомной ДНК, содержащей vir регулон и представление секвенированных частей (толстая линия) с локализацией генов. Также указаны положения рекомбинантных фаговых и плазмидных вставок, упоминавшихся в тексте. (B-BglII, E-EcoRI, S-Sacl, X-Xbal).

Участок рекомбинантной вставки фага phl2/76, содержащий гены с А и С повторами, был разбит на три фрагмента, которые были клонированы в

плазмидном векторе. Полученные рекомбинантные плазмиды получили названия рМ1512, рМ151.5 и рМ1576.

Для выяснения тонкой структуры vir регулона стрептококка группы А штамма EF1949, было проведено определение нуклеотидной последовательности вставок в плазмидах рМ1576, рМ1512 и рМ151.5. В пределах исследованной области были найдены последовательности, кодирующие пять полииептидов. Первый из них, от позиции 3 до позиции 707, кодирует 235 аминокислот гомологичных С-концевой части транерегуляторного белка Мгу. Вторая открытая рамка считывания (ОРС), протягивающаяся от позиции 894 до 2058, кодирует 388 аминокислотную последовательность практически идентичную белку Мгр4. Третья открытая рамка считывания, со стартовым кодоном ATG в позиции 2265 и стоп кодоном ТАА в позиции 3396 кодирует 377 аминокислотный пептид с интенсивной гомологией с белками М49, Emml2.1, Агр4, также как и с белком Н. Транслированный с этой последовательности белок, был назван ЕшшЫ5. 212 Ьр ниже emmllS гена была найдена четвертая ОРС, начинающаяся с позиции 3608 и заканчивающаяся на позиции 4709. Полипептид, длинной 367 аминокислотных остатков, транслированный с этой последовательности, обладая высоким уровнем идентичности с EmmL2.2 и ЕппХ белками и был назван Епп15. 335 Ьр ниже стоп кодона епп 15 гена были определены первые S5 кодонов, предполагаемого ScpA15 белка (с позиции 5043 до позиции 5297), имеющего 95.3 % идентичности с ранее описанным ScpA12. 2. FcRAlS

Ген FcRA15 белка является первым геном в vir регулоне после гена транерегуляторного белка (virR/mry). Ген fcrAlS кодирует белок, насчитывающий 388 аминокислотных остатков, и экспрессируется с собственного промотора в E.coli. Чтобы выяснить степень гомологии между FcRA15 белком и уже описанными FcRA белками из М4 и М76 серотииов, был проведен компьютерный анализ аминокислотных последовательностей этих белков. Как показал этот анализ, FcRA15 белок обладал всеми характерными структурными элементами, описанными для белков, входящих в v/грегулон. Так все три сравненных белка (FcRA15, FcRA76 и Мгр4) имели практически идентичные сигнальные последовательности, А повторы, домены, отвечающие за пронизывание клеточной стенки, якорные домены и заряженные С концевые домены. В то же время для N-концевого, суперизменчивого (как считалось ранее) домена диапазон степени гомологии значительно отличался в зависимости от белка, с которым проводилось сравнение. Так для пары FcRA15-FcRA76 идея о вариабельном N-конце вполне подтвердилась, так как эти два белка не имели никакой гомологии в рассматриваемых областях. Однако для пары FcRA15-FcRA4(Mrp4) ситуация была прямо противоположной, эти два белка отличались друг от друга в своих N-концевых доменах только по шести аминокислотным остаткам. Возникает вопрос, достаточно ли замены 10

шести аминокислотных остатков для обеспечения изменчивости типовой специфичности FcRA белков?

Основываясь на аналогии с M белками SOF негативных серотипов и распределении аминокислотных замен в пределах N-концевой области FcRA белков, можно сделать вывод, что столь незначительная разница между FcRA15 и FcRA4 белками не может обуславливать серьезные типовые отличия Ml5 и М4 серотипов, хотя полностью ответить на этот вопрос удасться только при помощи экспериментов с использованием моноклональных антител к соответствующим доменам FcRA белков. Таким образом удалось выяснить, что FcRA белки SOF позитивных серотипов не являются прямыми функциональными аналогами M белков SOF негативных серотипов, а играют, по-видимому, несколько другую роль в реализации патогснности стрептококков, хотя возможно, что они и обладают антифагоцитарной активностью (Podbielski с соавт. (1996)). Чтобы выяснить какие именно функции выполняет FcRA15 белок, была проведена его частичная очистка и определен спектр связывания различных белков плазмы крови человека. Связывающая способность FcRA 15 белка проверялась со следующими белками крови человека-альбумин, моноклональные IgG всех подклассов, сывороточный IgA, IgM, IgD, коллаген I, фибриноген, фибронектин, ламинин и вшронектин. Было найдено, что белок способен связывать фибриноген и иммуноглобулины G первого, второго и четвертого подклассов. Эти результаты полностью согласуются с данными, ранее описанными в литературе о биологической активности FcRA белков стрептококков группы А. 3. EmmL15

Ген EmmL15 белка находится на втором, после fcrAlS, месте в центральной части \'ir регулона Обычно EmmL белки связывают человеческий иммуноглобулин G третьего подкласса и целый спектр иммуноглобулинов G 1, 2 и 4 подклассов в различных комбинациях, иммуноглобулин А, а также некоторые другие белки плазмы крови. Для выяснения степени родства между M/EmtnL белками из других SOF позитивных стрептококковых серотипов и белком Н, SO F негативного Ml серотипа, способного связывать все четыре подкласса IgG человека, был проведен компьютерный анализ аминокислотных последовательностей. Сравнение аминокислотной последовательности EmmL15 белка с другими упомянутыми выше белками в отдельности, не обнаружило какой либо значительной гомологии в их N-концевых областях, однако, одновременное сравнение множества последовательностей и определение консенсуса показало аминокислотную общность в последовательностях N-терминальных частей зрелых белков. Более того, белок H из штамма SOF негативного Ml серотипа обладал соответствии с M-like белками из SOF положительных типов. Все пять сравниваемых белков (EmmL15, Агр4, EmmL2.1, Emm49 и белок H) имели схожую длину N-концевых изменчивых доменов, которые отличалась от вариабельных доменов M

белков из SOF негативных серотипов. Последние намного длиннее и более изменчивы по последовательности. Надо отметить, что гены все трех исследованных M-like белков, белка H и М49 белка распологаются на втором месте в vir регулоне, после гена, кодирующего IgG рецептор IIa типа. Это говорит в пользу версии о том, что M-like белки, включая белок H и М49, имеют некую общую биологическую функцию и, по-видимому, общее эволюционное происхождение.

После определения полной нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего emmL15 ген, он был выделен переклонированием в плазмидный вектор pGEM7Z(+). Рекомбинантная плазмида, несущая только полноразмерный emmLlS ген, получила название pEMML15 (рис. 1). Создание этой плазмиды позволило экспрессировать EmmL15 белок и исследовать его биологические свойства без наложения иммуноглобулин связывающих активностей других белков из vir регулона. Возможность реагирования EmmLlS белка с одинадцатью белками плазмы крови человека (моноклональные IgGl, IgG2, IgG3, lgG4, IgA, IgM, IgD, фибриноген, коллаген типа I, альбумин и фибронектин) была проверена посредством Dot blot техники. Было найдено, что, меченный йодом-125, EmmL15 белок взаимодействует с человеческими IgGl и IgG3, и ни с одним из других использованных белков.

Таким образом, спскгр связывания для EmmLlS белка оказался уникальным и не описанным ранее для иммуноглобулин связывающих стрептококковых белков. 4. Епп15,

Ген, кодирующий linn белок, встречается в основном в SOF положительных серотипах стрептококков группы А, и в vir регулоне Ml5 ссротипа этот ген находится на третьей позиции после leaa M-likel5 белка. Долгое время биологическая активность Епп белков оставалась не выясненной,, так как за редким исключением гены этих белков не экспрессируются в кишечной палочке с собственного промотора и, таким образом, напрямую определить связывающие активности этого белка в отношении белков крови не представлялось возможным. В случае с М15 серотипом ген Епп15 белка также не экспрессировался с собственного промотора в E.coli. Однако сопоставление иммуноглобулин связывающих активностей взятого для работы стрептококкового штамма и экспрессируемых в кишечной палочке рскомбинаптных белков показало, что должен существовать ещё один белок с IgA связыванием, так как исходный стрептококковый штамм обладал IgA связыванием, в то время как ни один из до этого описанных рекомбинантных белков не выявил такой активности. Для экспрессии епп15 гена в кишечной палочке была предпринята попытка субкяонирования этого гена в экспрессионном векторе рЕТ21а(+). Полученная плазмида была названа pETENN15.

Штамм кишечной палочки, содержащий рекомбинаитную плазмиду pETENN15 и несущий хромосомную копию гена Т7 РНК 12

полимеразы, после индукции Т7 промотора экспрессировал слитый Епи15 белок с выраженной IgA связывающей активностью. 5. Белок F.

Впервые белок F был описан почти три года тому назад, как поверхностный белок стрептококхов группы А, связывающий один из основных белков внешнеклеточного матрикса, фибронектин. Ген, кодирующий белок F был отклонирован и изучен. Было показано, что присутствие этого белка на поверхности стрептококка играет важную роль в адгезии микроба на поверхности клеток хозяина.

Работа началась с того, что исследуемый стрептококковый штамм M15 серотипа обладал непропорционально высоким уровнем связывания фибриногена по сравнению с уровнем связывания IgG. В то же время считалось, что связывание IgG и фибриногена в SOF позитивных серотипах определяется преимущественно уровнем экспрессии одного белка (FcRA), связывающего как IgG, так и фибриноген. Для ответа на возникающий при этом вопрос была сделана попытка клонирования и идентификации гена, ответственного за экспрессию . фибриноген связывающего белка, отличного от Fe RAI 5. Геномная библиотека стрептококка группы А М15 серотипа анализировалась на наличие клонов, способных связывать фибриноген. Несколько найденных рекомбинантных фаговых клонов, способных связывать фибриноген, проверяли на гомологию с fcrA76 ДНК зондом, для того, чтобы отобрать клоны, связывающие фибриноген и отличные в то же время от последовательности fcrA генов. В результате такого двойного скрининга были найдены пять независимых фаговых клонов и для них были построены рестрикционные карты (рис. 2).

phFBl

phFB2+

phFB7+

phFBlf

phFB21+

Xbal Xbal

_L----^-----

Sac! xbal

Xbal

Xbal Xbal

Saf! Xbal

__I__l___

Xbal

Xbal

_!_

Xbal _J-

Xbal _1_

Xbal

_

1.0 kb

Xhol

Sacl Xbal

Xbal Sacl*

RS 1,1-5

UFBD

RS2.I-4

ADHD

Рисунок 2.

Рестрикционная карта рекомбинантных фаговых (ph) и плазмидных (р) клонов и структура фибронектин/ фибриноген связывающего белка F15. +: клоны, экспрессируюшие связывание фибриногена; -: клоны без связывающей активности; Sac*: рестрикциопиый сайт из ÂG ЕМ 11 клонирующего вектора; SS: сигнальный полипептид; RSl,l-5: пять повторов первого типа с неизвестной функцией; UFBD: верхний фибронектин связывающий домен; RS2,l-4: четыре повтора второго типа с фибронектин связывающей активностью; AD: мембранный якорь; HD: гидрофобный домен.

Суммарно последовательность в 2801 нуклеотидные пары, по обе стороны от Sphl рестрикционного сайта, была определены в плазмидах pFSXl и pFSKl (рис. 2). В определенной последовательности была найдена одна длинная открытая рамка считывания. Эта открытая рамка считывания кодировала белок, насчитывающий 645 аминокислотных остатков и имеющий интенсивную гомологию с ранее описанным фибронектин связывающим белком F.

Белок F15 обладал всеми типичными особенностями, которые были описаны для Spb или белка F из других серотипов.

Нуклеотидные последовательности приблизительно в 300 bp со стороны N терминального конца от места отщепления сигнальной последовательности для 12 дополнительных штаммов были определены для того, чтобы провести анализ степени изменчивости последовательностей на вариабельном участке. Сравнение этого участка гена белка F из настоящего штамма S. pyogenes M15 серотипа, других 12 штаммов и ранее описанной последовательности гена белка F показаны на Рис. ЗА.

А

Рисунок 3.

А: Сравнение начальных последовательностей в 273 нуклеотида из генов белка Р (ргг!), стартовая позиция соответствует первому аминокислотному кодону зрелого белка Б S.pyogenes. Использованные штаммы перечислены в Материалах и методах.

В: Схематичное представление паттернов изменчивости последовательностей, показанных в А. Вертикальные линии обозначают места нуклеотидного полиморфизма. Шесть различных паттернов

обозначении латинскими цифрами ([-VI). Позиции нуклеотидов, не включенных в консенсус, не показаны.

Несколько паттернов изменчивости нуклеотидной последовательности могут быть легко определены даже при визуальной инспекции. Различия между паттернами последовательностей указывают на множество внутригенных рекомбинаций, имеющих место в эволюции spf генов. Также следует отмстить мозаичность структуры изменчивого участка, которая особенно очевидна на примере последовательностей из штаммов М4(281С), M4(Umee), M18(SS-36), М12(195/2110) и М12(100085), где последовательность имеет общий паттерн до позиции 59, а затем разделяется на различные варианты. Так, в пределах позиций с 60 до 270, приблизительно шесть паттернов могуг быть определены (рисунок ЗВ).

Для того, чтобы получить рекомбинантный белок в количестве достаточном для очистки и определения его характеристик, фрагмент prîF гена был амплифицирован с помощью PCR и клонирован через ВатШ. и Sad рестрикционные сайты, введенные в последовательность гена с праймерами для PCR, в экспрессиошшй вектор рЕТ-21а(+). Полученная таким образом плазмида была способна экспрессировать большие количества белка F в штамме хозяине E.coli BL21(DE3) после индукции с IPTG.

Укороченный вариант белка F15, лишенный С терминальной части, был получен при экспрессии в Я coli рекомбинантной плазмиды pEFNB31, содержащей фрагмент prtF¡5 гена, полученный при помощи PCR (см. Материалы и Методы и Рис. 2) Этот белок не выявил никакой связывающей активности ни для фибриногена, ни для фибронектина. Характеристика белка F15.

Белок Fl5 был выделен из теплового экстракта рекомбинантного штамма Е.соН, несущего илачмиду pFNB3. Пик, элюированный с фибриноген-сефарозы, выявил единственную полоску при окраске Coomassie после SDS-PAGE, реагирующую с фибриногеном и с фибронектином.

Наблюдаемый MW белка F15 составил приблизительно 100 kDa. Была проверена способность белка F связывать другие белки плазмы и внешнеклеточного матрикса. Для этого были использованы следующие белки: фибриноген, фибронектин, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, ламинин, витронсктин, Clq фракция комплемента, коллаген и сывороточный альбумин. Белок F выявил значительное связывание только с фибронектином и фибриногеном.

Связывание фибриногена с белком F в растворе ингибировалось фибронектином концентранионно зависимым образом. Константы связывания белка F с фибронектином и фибриногеном были определены при помощи ELISA. Эксперименты показали, что белок F связывал фибронектин с более высокой константой (Ка= 1.8x108 mol"1), чем 16

фибриноген (Ка= ],25х107 mol-1)-ВЫВОДЫ

1. vir регулон, штамма EF1949, стрептококка [руппы A M15 серотипа, содержит пять генов, такие как: vir 15, fcrA15, emmL15, епп15 и scpA¡5, что согласуется с организацией vir регулона из SOF позитивных серотипов стрептококков.

2. Нуклеотидная последовательность emmL15 гена однозначно указывает на принадлежность М15 серотипа к SOF позитивному типу стрептококков ¡руппы А, а так же на функциональное отличие, кодируемого этим геном белка, от типичных M белков SOF отрицательных серотипов.

3. Последовательности fcrAlS и епп15 генов полностью согласуются со структурными особенностями ранее описанных соответствующих генов из других серотипов.

4. Все три гена центральной области vir регулона были экспрессированы в Е.соН и связывающие активности кодируеммых белков определены, как указано: FcRA15 белок связывает человеческий IgGl, IgG2, IgG4 и фибриноген; EimnLlS связывает человеческий IgGl и lgG3; Епп15

С ВЯЗ ЬГВ£1СГ IICJTOBCMCCîvîiÎ* ÍqAI

5. Новый фибриноген связывающий компонент стрептококка группы А был определен, как ранее описанный фибронектин связывающий белок F, и его ген клонирован и экспрессирован в Е.соН.

6. Рекомбинантный белок F был очищен и дана его детальная характеристика, которая показала, что идентичные, либо близко расположенные участки этого белка вовлечены в связывание как фибриногена, так и фибронектина, а так же, что константа связывания для фибриногена примерно на порядок ниже, чем для фибронектина (KaFg= 1,25х107 mol-1 nKaFn= 1.8xlOs mol"1, соответственно).

7. Была определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок F, и проведены ее анализ и сравнение с рядом соответствующих последовательностей из других стрептококковых пггамммов различных серотипов. На основании этого анализа удалось показать, что механизм горизонтального генетического обмена, наряду с точечными мутациями, может играть основную роль в формировании изменчивости факторов патогенности стрептококков группы А.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. V. Golubkov, L. Nesterchuk, A. Dukliin, V. Katerov, A. Totolian. Cloning of immunoglobulin G Fc receptor protein of Streptococcus pyogenes type M48. In Genetics and molecular biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci. Eds.: J.M. Dunny, P. Cleary, L. McKey. ASM, Washington, D.C. 1991, p.228-229.

2. V.Katerov, C. Schalen, A. Totolian. Vir regulon of Streptococcus pyogenes type M15. In: Pathogenic Streptococci: Present and future. Ed.: A.A. Totolian. Lancer Publications, St.Petersburg, Russia. 1994. p.244-245.

3. V. Katerov, C. Schalen, A. Totolian. M-like, immunoglobulin-binding protein of Streptococcus pyogenes type M15. 1994. Current Microbiology, v.29., pp.3136.

4. V. Katerov, C. Schalen, A. Totolian. Sequencing of genes within the vir regulon of Streptococcus pyogenes type M15-an opacity factor positive serotype with low opacity factor expression. 1994. Mol Gen Genet v.235. pp. 78-85.