Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионов переходных металлов и водорастворимых полимеров на прикрепление дрожжевых клеток к твердым поверхностям

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионов переходных металлов и водорастворимых полимеров на прикрепление дрожжевых клеток к твердым поверхностям"

579.66,

543.544:577.11(047)

На правах рукописи

" ' Г> 1

• • - о и

Днгель Илья Эдгаровнч

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ПЕРЕХОДНЫХ МЕТАЛЛОВ И ЗОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИМЕРОВ НА ПРИКРЕПЛЕНИЕ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК К ТВЕРДЫМ ПОВЕРХНОСТЯМ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Республика Казахстан Алматы 1998

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казахского Государ! венногр Национального Университета им. аль-Фараби

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

академик АСХН РК доктор биологических наук, профессор Жубанова А.А. доктор биологических наук, профессор Саубенова М.Г. кандидат биологических наук, старш. науч. сотр. Джусупова Д Казахский НИИ пищевой промышленности МН-АН РК

Защита состоится " 27 " ноября 1998 г. в 14 часов на заседай! диссертационного совета Д. 53.24.01 при Институте микробиологии и в русологии МН-АН РК по адресу: 480100, г. Алматы, ул. Богенбай батыр 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии МН-АН РК

Автореферат разослан " 27 " октября 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ✓ /

кандидат биологических наук -^''"у ' Айткельдиева С./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛоОТЫ

Актуальность теуы

Иммобилизованные клсгкн микроорганизмов обладают целым рядом полезных свойств, имеющих большую значимость при их использовании на практике (Birnbaum, 1994, Hinfray, 1995). Это связано со значительным снижением потерь биомассы из рабочей зоны реактора с током жидкости, что, в свсю очередь, предотвращает загрязнение продукта и окружающей среды микробными клетками, позволяет достичь большей концентрации работающих клеток, и, в конечном счете, приводит к увеличению производительности и продуктивности (Синнцын и др., 1994).

Несмотря на то, что первые установки по производству уксуса с использованием иммобилизованных микробных клеток появились еще в 1823 году, во времена Пастера, наибольшее распространение и развитие иммобилизация клеток получила в 80-е годы нашего века. Подъем интереса к иммобилизованным биокатализаторам именно в эте? время был вызван комплексом объективных факторов, связанных с переходом биотехнологии на качественно новый уровень. Такими факторами, на наш взгляд, явились:

- переход к промышленному многотоннажному производству биотехнологических препаратов (аминокислот, витаминов, и др.);

- переход, во многих случаях, к непрерывному культивированию, позволяющему повысить эффективность производства;

- повышение требований к качеству биотехнологнческой продукции, к экологической чистоте производства.

Среди разнообразных способов иммобилизации, прикрепительные методы, основанные на образовании связей между поверхностями клеток и носителя, отличаются от остальных (включение в матрицу геля, инкапсулирование и др.) своей технической и методической простотой, дешевизной, отсутствием нежелательных воздействий на биокатализатор и уменьшением диффузионных ограничений (Birnbaum; 1994). Однако следует заметить, что прикрепительные методы иммобилизации, зачастую, не могут обеспечить достаточно прочного и необратимого закрепления клеток на поверхности, в отличие от методов инкапсулирования н включения в гель, где иммобилизованность клеток обеспечивается жестким ограничением их подвижности внутри гелевого матрикса или мембраны (Birnbaum, 1994). Это связано с тем, что воздействиям, вызывающим отрыв клеток от поверхности (ток жидкости, перемешивание, другие энтропийные тенден; ции), противостоит лишь небольшая (хотя и многоточечная) область кон-

такта поверхностей клетки и носителя (Яскович Г.А. 1996). Еще одним недостатком прикрепительной иммобилизации является недостаточная ёмкость поверхности носителя в отношении клеток, что связано с ограниченным количеством сорбционно-активных сайтов.

Указанные обстоятельегиа в значительной мере препятствуют реализации всего производственного потенциала закрепленных клеток и существенно ограничивают сферу их промышленного использования (Силиции, 1994). Это свидетельствует об актуальности поиска новых способов увеличении эффективности прикрепительной иммобилизации клетей, что позволило бы значительно расширить круг производств с иммобилизованными клетками и, таким образом, повысить эффективность многих биотехноло-гнческих процессов. Проведение подобных исследований ь Казахстане имеет особое значение ввиду остро стоящих проблем рационального использования отходов молочной промышленности, эффективной микробиологической переработки сельскохозяйственной продукции, бытовых и промышленных сточных вод и т.д.

Цель и задачи исследования

. Цель данной работы - разработка способов увеличения прикрепления дрожжевых клеток к твердым поверхностям путем модификации поверхностей ионами переходных металлов, действием водорастворимых полимеров различного происхождения, изучение закономерностей и механизмов действия указанных факторов на прикрепление клеток промышленных штаммов дрожжей. Для достижения поставленной цели в процессе исследования решались следующие задачи:

1. Подбор наиболее подходящих носителей для иммобилизации дрожжевых клеток. Изучение основных кинетических характеристик адсорбции дрожжевых клеток на поверхность носителей различной

• химической природы, в зависимости от физико-химических параметров адсорбционной системы, а также от условий культивирования клеток.

2. Изучение физико-химических свойств поверхности клеток дрожжей и ее компонентов, изучение их роли в процессах неспецифического прикрепления клеток к твердым поверхностям.

3. Разработка способов модификации поверхностей полимерами различного химического строения, исследование основных характеристик адсорбционного процесса при модификации.

4. Имплантация в поверхность носителей ионов переходных металлов И изучение механизмов изменения степени адсорбции клеток, на ос-

новгнип кгмстнческнх и термодинамических характеристик адсорбционного процесса.

5. Создание высокоактивных биокатачизаторов с живыми иммобилизованными клетками на основе моднфициропаниых носителей, изучение стабильности и эффективности их функционирования.

Научная навизча

Впервые изучены основные закономерности закрепления клеток промышленных штаммов дрожжей на твердых поверхностях, модифицированных ионами переходных металлов и водорастворимыми полимерами. Разработаны способы модификации поверхностей водорастворимыми полимерами, определен круг наиболее перспективных модификаторов. Впервые исследованы механизмы влияния водорастворимых полимеров различной химической природы на адсорбцию дрожжевых клеток на твердых поверхностях в модельных опытах.

Для максимально адекватной оценки сорбционных свойств носителей и клеток впервые предложен интегральный показатель эффективности прикрепления (ПЭП). Получены новые данные о ведущей роли поверхностных биополимеров дрожжей в неспецифической адгезии клеток к твердым поверхностям.

Впервые описано явление инверсии температурной зависимости адсорбции клеток, имеющей место при модификации кремнеземных поверхностей ионами переходных металлов. На основании термодинамических расчетов, а также кинетических закономерностей процесса, сделаны выводы о смене при модификации электростатических и др. адсорбционных взаимодействий более прочными координационными связями.

Анализ обширного экспериментального материала позволил сформулировать качественно новую концепцию о существенно различных механизмах, лежащих в основе увеличения адсорбции клеток микроорганизмов водорастворимыми полимерами и ионами переходных металлов.

Практическая ценность диссертации

Результаты исследований рекомендуются для применения п биотехнологии. Использование разработанных способов модификации носителей для повышения адсорбции дрожжевых клеток позволяет достичь большей концентрации активных клеток в рабочей зоне биореакторов, объемных'

фильтрах очистных сооружений и других систем с иммобилизованными клетками, а также увеличить стабильность их функционирования, чго способствует увеличению производительности и нридуктишюсти биотехнологических процессов.

Достигаемое модификацией поверхностей значительное снижение потерь биомассы из рабочей зоны реактора с токо i жидкости предотвращает загрязнение продукта и окружающей среды микробными клетками.

В работе обсуждены вопросы выбора наиболее адекватных с то'.^н зрения практического использования носителей и способов модификации адсорбционных свойств поверхности в зависимое! и от природы и структуры носителя. Обнаруженные в работе общие закономерности неспецифического взаимодействия микробных клеток с твердыми поверхностями представляют интерес для решения проблем биообрастаний, медицинской трансплантологии, при исследовании почвенных экосистем.

Положения, выносимые на защиту

1. Предлагаемые способы модификации поверхности носителей ионами переходных металлов и водорастворимыми полимерами приводят к увеличению количества иммобилизованных дрожжевых клеток и позволяют повысить эффективность работы биокатализаторов с иммобилизованными клетками.

2. Стимулирующее действие ионов переходных металлов и водорастворимых полимеров обусловлено существенно различными механизмами. Увеличение прикрепления клеток под действием полимеров обусловлено уменьшением электростатического отталкивания поверхностей и увеличением сорбционно-активных сайтов поверхности, i: то время как имплантация в поверхность носителей ионов переходных металлов приводит к возникновению качественно новых адсорбцион-

" ных взаимодействий координационного характера.

Личный вклад автора

Все разделы представляемой работы выполнены лично автором.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых и студентов КазГУ им. аль-Фараби 1995г, 1997г, на международной научно-практической конференции (г. Степногорск, 1995), на конференции, посвященной 25-летию кафедры микробиологии КазГУ им аль-

Фзраби (декабрь 199 г), на р зспублчканской научной конференции молодых ученых » сгуд'-нточ (A.r-aru, 23-23 ш.релч 1997 г.), на 1 съезда микробиолога;! Узбекистана (Ташкент, 6-9 октября 1997г.), на научной конференции "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии" (пгг. Гвардейский, 21-22 мал I99S г), на международном мнкросг.мпозиумс "Colloids and surfaces". Almaty, 29 Aug.- 3 Sept. 1998, на республиканской паучко-нрактичсскои конференции "Состояние, проблемы и перегхктнпн развития пищевых технологий в условиях реформировшш.ч экономик" Казахстана" (Алматы, 15-16 октября 1998 г.), на конференции молодых ученых биотехнолопл Республики Молдова (Кишинев, 24-27 октября 199S г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ. Получены положительные решения на выдачу патентов по двум заявкам.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста, иллюстрированы 45 рисунками и 10 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 разделов собственных исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы, включающего 396 па-именований, из которых 201 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, методы и материалы исследования

В работе использовали производственные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae (штаммы 717, Я, UI7, 4-1), лакгозосбраживзгощне дрожжи Torulopsis (Candida) kefir var. kumis штамм T17, каротиненнтези-рующие дрожжи Rhodoíorula glutinis var. gluiinis. Для культивирования микроорганизмов применялись творожная сыворотка, неохмеленное ппв-ное сусло 6°Б и синтетическая среда Рндер.

В качестве носителей для иммобилизации клеток использовали следующие материалы: силикагель КСМ-7, стеклянные шарики, алыинат кальция ("Serva"), акриловые полоски, пенополиуретан эластичный на основе полиэфира П-2200, полиэтиленовое волокно, нити капроновых вий, яитроцеллюлозные мембраны "Synpor" (Чехия), "Millipore" (США), 'Владниор" (Россия).

Сорбцпонную способность носичелзй и клеток определили методом Нлкобской (Никовская, 1986). Для оценки с.-пени сорСцпи и десорбции клеток использовали прямой визуальный подсчет клеток в кам ;ре Горлсиа, адгезионную пробу по Samaran?./аке (1980), а также измерение i онцентра-Ц1Ш кд;то1. в растворе путем детекции оптической плотности суспензии на фотоколориметре КФК-2МП и сис.ггрофогомегре СФ-46 и стандартных кюветах с длиной оптического пути 1см при длине ьо.ты Ó70 им (Гвоздик, 1990).

Гидрофобность дрожжевых клеток определяли способом Розенберга в модификации Никовскон (1986). Дзета-потеццкал иоверхносш клеток оп-ргаеляли по электрофоретической подвижности клеток на основании уравнения Гельмгольца - Смолуховского.

Модификацию носителя ионами переходных металлов проводили ко методу (Woodword, 1988).

В качестве модифицирующих полимеров использовали декстран, 40 кДа, ("Sigma", США), бычий сывороточный альбумин, 68 кДа, ("Serva", Германия), полиэтнленгликоль, 6000 Да, ("Реахим", Венгрия), полиэгиле-нимин, 10 кДа, полученный в Институте нефтехимического синтеза им. AJÍ. Топчиева РАН, поверхностные биополимеры дрожжей, полученные экстракцией. При исследовании влияния различных полимеров на адсорбционный процесс растворы полимеров, носитель (пенополиуретан) и клетки приводили в контакт друг с другом в различной последовательности, с 10-минутным интервалом.

Бездеструктивную экстракцию поверхностных биополимеров дрожжей. проводили по следующим методикам:

а) получение флокулирующих биополимеров дрожжей по Долобовской (1990) осуществляли экстракцией 2% раствором этилендиаминтетраацета-та (ЭДТА, "Serva") в течение 4 часов при 4° С, рН 7.8.

б) получение поверхностных антигенов по Парфеновой в модификации M.S. Manocha et al, (1997) осуществляли экстракцией ЗМ раствором бикарбоната натрия при 4 С, рН 9.7, в течение 2 часов.

Кроме того, поверхностные биополимеры экстрагировали:

в) 6М раствором мочевины в течение 3 часов при 25° С (Sand T.T.,et al., 1993).

г) 0.5% раствором додецилсульфата натрия (ДСН) ("Serva") в течение 3 часов при 25° С (Витовская и др., 1989),

д) 20 мМ раствором 2-меркаптоэтанола ("Serva") в течение 3 часов при 25" С

Содержание Сел::а в полненных экстрактах определяли по метод)' Bradlord (1976). Индикацию углеводов осуществляли в реакции Молиша с а-нпфтолом.

Фракционный анализ клеточных полимеров п определение их молекулярной массы проводили с помощью электрофореза в пластинах полиак-риламндного геля в присутствии додецилсульфата натрия (Остермая, 1981) и методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200 (Остерман, 1985).

Содержание этанола в среде культивирования определяли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе Chrom-4 с пламенно-ионизационным детектором, содержание редуцирующих веществ определяли по методу Бертрана.

В работе использованы методы статистической обработки, разработанные для случая нормального распределения (ГОСТ 11.004-74 , ИСО 260273). Оценку однородности дисперсии проводили по критерию Кохрена. Для полученных результатов вычислялось среднеквадратичное отклонение ст. В таблицах приведены значения средних арифметических с указанием* средней ошибки среднего арифметического. Калибровочные кривые приводили к формульному виду взвешенным решением метода наименьших квадратов (Веичиков н др., 1976). Вычисление достоверности отличия no-указателей в разных группах опыта проводилось с привлечением коэффициента Стыодента, используемого для рядов с малым числом вариант. При' проведении статистических расчетов использовали табличные процессоры' Excel 7.0 (Microsoft® Corporation) и Lotus 1-2-3 (Lotus® Development European Corporation).

Результаты исслсдопаний и обсуждение

Закономерности адсорбции дрожжевых клеток на поверхностях носителей различной структуры и химического состава.

На начальном этапе экспериментов были исследованы некоторые культурально-биохимическис особенности дрожжей, построены градунро-вочиые кривые, получены кинетические кривые и изотермы адсорбции дрожжевых клеток на носители различной природы и химического состава.

Наиболее подходящими носителями для иммобилизации дрожжевых клеток являются пенополиуретан и силикаголь, клеточная загрузка которых достигает 200 и 160 мг/г носителя, соответственно. Вычисленное значение константы скорости формирования адгезионных связей клеток

дрожжей с поверхностью пенотлнуретана равнялось 0.054 ч*1. Удельная скорость адсорбции для начального отрезка кривой составляет от 0,7x106 до 1.5x106 клеток на 1 г носителя за 1 минуту.

В ходе экспериментов было установлено, что сорбция клеток к твердой поверхности удовлетворительно описываегся уравнением Лэлгмыра, что соответствует представлениям об однослойной сорбции с участием ограниченного числа сорбционно-активных сайтов поверхности:

Необходимо отметить, что прикрепительная способность поверхности носителя является комплексной характеристикой, складывающейся из адсорбционной емкости (определяемой числом сорбционно-активных сайтов поверхности) и прочности связывания клеток с поверхностью (определяемой числом и силой ьзаимодействий между контактирующими поверхностями). Для более адекватной оценки прикрепления клето.с нами предложен интегральный показатель эффективности прикрепления (ПЭП), равный отношению процента десорбировавшихся клеток к проценту адсорбировавшихся клеток. При отнесении ПЭП к аналогичному показателю для контрольного варианта, принято.-лу за 100%, вычисляется относительный ПЭП. Показатель эффективности прикрепления использовался нами в последующих опытах.

Влнянне условий культивирования на адгезивную способность клеток

Результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что способность дрожжей к адсорбции во многом определяется свойствами самих клеток, точнее их поверхностных структур, которые, в свою очередь, могут зависеть от таких параметров, как возраст культуры, состав и свойства питательной среды, уровень аэрации, температура культивирования и т. п. Так, аэрация увеличивала последующую сорбцию клеток на 16-20 %. Действие аэрации на адгезивную способность клеток, вероятно, обусловлено большей физиологической активностью растущих клеток, что приводит к интенсивному синтезу адгезивных компонентов. Дрожжевые клетки, выращенные нами на твердой питательной среде, обладают более высокой адгезивной способностью, чем при использовании жидкой среды.

Одна из важнейших характеристик клеточной поверхности - гидро-фобнос!ь клеток - является достаточно лабильным показателем, который можно изменять, например, вариацией соотношения углерода и азота с среде культивирования (Э^аш, 1978). В рамках изучения влияния гидро-фобности клеток на процесс их адсорбции на гидроксилсодержащие носи-

тел и нами проводилось измерение гидрофобности клеток Т. ке/уг при различных условиях их культивирования, а именно, в зависимости от соотношения азота и углерода в среде культивирования. Это соотношение регулировалось нами путем изменения содержания глюкозы.

Коэффициенты гидрофобности поверхности клеток дрожжей при их культивировании в питательных средах с различным содержанием углерода показаны на рисунке 1.

Коэффициент гидрофобности клеток дрожжей, культивируемых на синтетической среде Ридер с различным содержанием глюкозы (в процентах)

О БассЬ. сегеуЫае □ Т. кеГуг ЕШ1е1иИшз

ст

4

Рисунок I.

Видно, что гидрофобность клеток постепенно возрастает при увеличении отношения углерода к азоту в питательной среде. Обращают на себя внимание резко выраженные штаммоспецнфические различия в гидрофобности клеток. Отсутствие четкой зависимости гидрофобности клеток от возраста культуры, полученное в ходе другой серии опытов, объясняется сложной динамикой фосфолипидного состава дрожжевых клеток на протяжении жизненного цикла (Оис1ат, 1978).

В таблице 1 представлены данные по адгезионной способности дрожжевых клеток, выросших на питательной среде Ридер с различными источниками углерода.

Таблица 1

Адсорбция на ППУ клеток дрожжей, выросших, да различных источниках углерода (приведен процент прикрешшшихся клеток)

Источник углерода Т. кеГуг Шт. :ч1к Ь^с. Ь. сепг-ушае 4-1

Этанол 16.9 - 22,5

Лактоза 18,0

Глюкоза 32,1 30,2 24.7

Сахароза 25,3 27,6 11.5

Мальтоза 28,0 23.2

Галактоза 32.9 32,5 22.9

Дульцит 15,0

Манноза 23,0 32,0 18.74

Примечания

1. данные пересчитаны на относительные величины

2. * - рост отсутствовал

Как видно из таблицы 1, эквимолярная концентрация различных Сахаров в среде (глюкоза, сахароза, галактоза, фруктоза, мальтоза и др.) способствует адгезии в различной степени. Наиболее активно прикреплялись клетки ЯИ. glutinis, выращенные на среде с глюкозой, маннозой и галактозой. Слабая адгезивная способность зарегистрирована у клеток, выращенных на среде с этанолом в качестве единственного источника углерода. Для клеток Т. ке]уг наиболее благоприятной в отношении адгезии является среда Ридер с галактозой и глюкозой, а этанол, в сравнении с углеводами, в наименьшей степени способствует адгезии,

вычисленное значение коэффициента корреляции (по Пирсону) между составом питательной среды и способностью к адгезии составило 0.9868 для Шюс1о1оги!а и 0.7147 для Тоги1орв13, что свидетельствует о выраженном влиянии среды культивирования на интенсивность адгезии.

Можно предположить, что адгезия клеток повышается за счет образования компонента, синтезируемого в ответ на высокое содержание сахара в среде, что согласуется с данными литературы, полученными для других культур (Витковская, 1989). Известно, что дрожжи, выросшие на среде с сахарозой и пептоном, прикрепляются лучше, чем выросшие только на пептоне, что связывают с синтезом экстрацеллюлярных полимеров в ответ на ввеЬение сахарозы (БсИектап, 1989).

Изучение роли поверхностных биополимеров в процессах адгезии

К настоящему времени явно доминирующее положение приобрела концепция, связывающая адгезионный процесс с химической структурой поверхностных слоев клеточных оболочек (вгише! М., 1997). Познание молекулярных механизмов взаимодействия и контакта клеток с твердыми поверхностями требует изучения роли в прикреплении компонентов клеточной поверхности.

Поверхностные структуры дрожжей были экстрагированы нами различными способами и исследованы электрофоретическими и хроматогра-фическими методами. Кроме того, исследовалась адгезивность клеток дрожжей, лишенных поверхностных полимеров (таблица 2).

Таблица 2

Относительный показатель эффективности прикрепления клеток дрожжей со "снятыми" поверхностными слоями к пенополиуретану (а процентах по отношению к контролю (интактные клетки))

Экстрагент БассК сеге\<1$ше 717 КИ. %1и(Ыз Т. кс/уг Т17

Контроль 100 100 100

Мочевина 84,18±5,85 83,50+3,39 78,75±6,44

дсн 94,13±3,27 88,26+6,86 99,21+2,12

Щелочь 59,77±5,48 69,48+6,27 61,82+3,89

ЭДТА 62,11±4,49 48,95±5,99 63,32±4,73

Можно предположить, что уменьшение адсорбции при обработке экстракторами связано с штктнвацией клеток, однако, как показано нашими исследованиями, мертвые клетки прикрепляются так же, как живые. Это означает, что поверхностный слой дрожжевых клеток не является индифферентным по отношению к клеточной адгезии, а принимает активное участие в прикреплении.

В следующей серии опытов изучалась адгезия клеток дрожжей в присутствии экстрактов клеточных стенок. Было показано, что присутствие поверхностных дрожжевых полимеров компенсирует негативный эффект предварительного "снятия" поверхностных молекул в отношении адгезии

u

обработанных клеток. Данные по влиянию полученных фракции ля процесс адгезии интактных клеток дрожжей к пенополиуретан) отражены на рисунке 2.

Влияние поверхностных дрожжевых полимеров на адгезию интактных дрожжевых клеток к пенополиуретану

Sacch.cerevisiae 717

Rh. gludnis

T.kefyrT17

□ Контроль

□ ЭДТА ИДСН

□ Щелочь 19 МОЧСЙИНЗ

Примечание - данные приведены в процентах но отношению к контролю.

Рисунок 2.

Как можно видеть из рисунка, добавление биополимеров, особенно экстрагированных ЭДТА и щелочью, U систему с ингактными клетками существенно стимулирует их. сорбцию. Таким образом, количество и состав поверхностных макромолекул играет решающую роль в прикреплении клеток. Поскольку взаимодействие дрожжевых клеток с искусственными носителями является неспецифнческим, вероятно, усиление клеточной адгезии не будет являться прерогативой только дрожжевых полимеров. Можно ожидать, что искусственные полимеры с соответствующими характеристиками, также, будут усиливать прикрепление клеток.

Влияние водорастворимых полимеров различной природы на адсорбцию дрожжевых клеток

Известно, что искусственные полимеры, взаимодействуя с поверхностями, могут оказывать модулирующее влияние на процессы, протекающие на поверхности раздела фаз (van Alstine J.M. et al., 1997). В контексте с

;,ашшмн, полученными ранее при исследовании влияния поверхностных полимеров дрожжей на адсорбцию, представляло интерес изучение влияния растворов полимеров на характеристики адсорбционного процесса в люделыюй системе. Для этого нами использовались полимеры разнообразной химической природы - белки, полисахариды, полиэтиленимин, полн-этиленгликоль.

Н) рисунке 3 приведены кинетические кривые адсорбции клеток дрожжей на пенополиуретан в 0,1% растворах полимеров.

Прикрепление (в %) клеток Т. кфг к поверхности пенополиуретана в 0,1% растворах водорастворимых полимеров

Контроль

ИЭИ

Декстраи

15 30 45 во 75 М 105 120

Рисунок 3.

Как следует из рисунка, введение в адсорбционную систему полимерного компонента приводит к увеличению как скорости адсорбции (характеризуемой наклоном кинетических кривых), так и количества прикрепившихся клеток. Наиболее выраженное увеличение числа прикрепившихся клеток при добавлении полиэтиленимина, можно объяснить большим положительным зарядом полимера вследствие протонирования ими-ногрупп в растворе. Это приводит к многоточечному связыванию полимера с отрицательно заряженными поверхностями клеток и носителя, что

нейтрализует их взаимное отталкивание. Кроме того, полимеры могут иг рать роль своего рода мостиков между реагирующими поверхностями увеличивая площадь их контакта.

Переходные металлы как модификаторы адсорбционных свойст! поверхностей

Стимулирующее действие полимеров на адсорбционный процесс явля ется, по существу, следствием элиминирования электростатического от талкивання поверхностей, благодаря нейтрализации заряда и увеличении числа адсорбционно-активных сайтов. Качественных изменений во взан модействии поверхностей клеток и носителей при этом не происходит. I этой связи, представляется привлекательным введение в систему бола сильных адсорбционных взаимодействий, приближающихся по прочносп к ковалентной связи. Перспективными модификаторами в данном контск сте являются представители переходных металлов - так называемые ё- и Г элементы, способные к образованию координационных соединений с де локализацией электронов за счет добавочных валентностей.

Следует отметить, что в связи со стернчсскнми затруднениями невоз можно заместить псе лягалды комгщекса металла гидрокенльными ил] другими группами носителя и поэтому оставшиеся группы будут обладат] потенциалом для последующих реакций координационного прикрепленш молекул (Ямсков и др., 1985). При использовании переходных металлов ! качестве модификаторов ключевым является тот факт, что гидроксильньк группы поверхностей клеток являются более предпочтительными лиган дами но сравнению с молекулами воды, окружающими ион металла в рас творе. Вследствие этого, замещение молекул воды лщроксильиыми труп памн носителя протекает довольно легко. Почти столь же эффективно про текает комплексообразование с карбоксильными и аммониевыми группа; ми. ' к

Результаты изучения прикрепления и последующей десорбции клето! (в виде относительного показателя эффективности прикрепления) при ис пользовании нативных и активированных ионами переходных металло! носителей приведены в таблице 3.

ьблшп 3

Огносител!Щ.1Й показатель эффективности прикрепления (ОПЭП) кле-ок Т. kefir, иммобилизованных на нативные и модифицированные ионами металлов поверхности

Вариант Силикагель Стекло Пенополиуретан Альгинат Са

Контроль 100.0±0.00 100.0±0.00 100.0±0.00 I00.0i0.00

СаЬ 101.2il.38 101.6il.74 102.3i3.98 124.li4.85

Fe" 140.6±2.11 129.0±1.06 194.4i6.07

Сиг+ 108.1 ± 1.08 104.2*1.32 96.2i2.44 131.3i6.14.

Mn2t 118.6il.94 109.5il.07 177.8i2.61

108.7il.55 102.2il.01 lll.9i4.99

Со2+ 111.8±2.26 104.3il.03 103.2il.54

Примечание -* - Модификация привела к разрушению носителя.

Полученные данные можно оценивать с точки зрения поиска наилуч-иего носителя и наиболее эффективного модификатора. Согласно провеянным исследованиям, наиболее активным модификатором являются ио-ш трехвалентного железа. В целом, увеличения прикрепления удается юстичь практически во всех случаях, однако наиболее эффективно модифицируемым носителем оказался гранулированный силикагель. При мо-шфикации ППУ в ряде случаев происходило разрушение носителя, что, юзможно, указывает на взаимосвязь эффективности модификатора с его (агрессивностью» по отношению к поверхности.

Можно предложить несколько объяснений полученным экспериментальным данным о стимулирующем действии солей металлов на процесс адсорбции:

Во-первых, в случае использования многовалентных ионов возможно селатообразование с гидроксильными группами с образованием сшивок лежду клетками и носителем через ионы металла, что было показано для жсидов циркония и титана (Ямсков и др., 1985).

Во-вторых, ионы металлов способны изменять величину, а иногда даже так заряда поверхности, что, возможно, обеспечивает большее электро-гтатическое притяжение между клетками и поверхностью.

В-третьих, ионы металлов способны влиять на термодинамику адсорбции, изменяя величину поверхностной энергии носителя, увеличивая не-

и

равновесность системы. Скорее всего, механизм активации носителя имел1 комплексный характер, складываясь из нескольких процессов.

Клетки дрожжей Т. ке/уг, иммобилизованные на сшшкагеле, модифицированном ионами Ре3+, были использованы для получения этанола на основе молочной сыворотки. Опыт проводился в условиях периодического культивирования. По окончании очередного цикла культивирования образцы биокатализатора отмывались и заново использовались. В таблице 4 показано сравнительное содержание этанола и культуральной жидкости при использовании нативного и модифицированного Ре + силикагеля в качестве подложки.

Таблица 4

Содержание этанола (в процентах) при периодическом культивировании иммобилизованных на активированном Ре^силикагеле клеток Т. ке/уг .

Цикл культивирования 1 2 3 4 5

Обработанный силика-гель 2,6±0,2 3,3±0,1 3,0±0,2 2,9±0,1 3,1±0,3

Нативный силикагель 2.1 ±0,3 2.4±0,2 2.5±0,1 2.5±0,1 2.2±0,1

Примечание - каждый цикл культивирования продолжался 48 часов

Полученные данные говорят о том, что возможна эффективная работе модифицированного биокатализатора с прикрепленными клетками на протяжении, по крайней мере, пяти 48-часовых циклов при культивировании на молочной сыворотке. При этом не наблюдается подавления бродильной активности клеток по сравнению с контролем.

Анализ кривых сорбции клеток на интактиые и модифицированные поверхности (рисунок 4) свидетельствует об увеличении прочности связывания с поверхностью при модификации, что, в свою очередь, изменяет кош станту равновесия адсорбционного процесса. Сдвиг равновесия реакций выражается в более "высоком расположении кривых адсорбции для активи-рованцого носителя.

Кннешческне кривые адсорбции дрожжевых клеток на силикагель, моднфшшров'ЛнныЛ ионами переходных металлов

И О 15 30 45 «0 75 М 103 120 135 150 из

_мин .

—»— ЯассЬ. сегеу!51ае (пативи.) —Т. ке(уг (нативн.)

Иг glutiшs (нативн.) —БассЬ. сетеушае (модиф.)

-«►-Т.ке^т (модчф.) —Л— ИЬ. ¡^ийтв (модиф.)

Рисунок 4.

Обращает на себя внимание идентичность углов наклона начальных 'частков всех кинетических кривпх. Согласно классическому математиче-:кому анализу, тангенс угла наклона кинетической кривой к оси абсцисс характеризует скорость процесса. Если бы обработка металлами приводила с увеличению числа адсорбционно-активных сайтов на поверхности, след-;тви.\м модификации было бы к изменению скорости реакции, согласно 1акону действующих масс. Таким образом, можно предположить, что механизм стимулирующего влияния ионов металлов состоит в увеличении фочности связи в индивидуальных точечных контактах, при сохранении юстоянного числа адсорбционно-активных сайтов.

Это предположение доказывается результатами наших опытов по влиянию рН и ионной силы раствора на адсорбцию и десорбцию дрожжевых клеток на пативных и модифицированных кремнеземных поверхно-л'ях. Так, система с клетками, иммобилизованными на модифицированные поверхности, характеризуется иной реакцией на изменение химических свойств жидкой фазы.

Влияние температуры на адсорбцию дрожг;епых клеток на иатчв ных и модифицированных ионами металлов поверхностях

Известно, что характер взаимодействия поверхностей напрямую связан с температурными параметрами процесса. Это означает, что температура, как один из фундаментальных макроскопических параметров может служить инструментом для изучения механизмов и характера взаимодействия микробных клеток и носителя в процессе иммобилизации.

Для изучения термодинамических закономерностей прикрепления клеток адсорбционный процесс проводили при различных температурах, измеряя скорость адсорбции и количество прикрепившихся клеток. Результаты опытов представлены на рисунке 5.

Эффективность прикрепления клеток Т. ке$г к нативному и модифицированному силикагелю при различных температурах

о Е к Е § 2

н К « &

гас

Модификация Контроль

Рисунок 5.

В опытах с температурными вариациями установлено, что при повышении температуры прикрепление клеток к модифицированному ионами металлов носителю возрастает, а к необработанному - уменьшается (рисунок 5), то есть, проведенная нами модификация носителя приводит к возникновению эффекта инверсии температурной зависимости адсорбции.

Обнаруженный нами эффект свидетельствует, на наш взгляд, о сущест- • ешюм изменении характера химических связей между поверхностями легок и носителя при модификации. На основании известных уравнений ермодинамики можно показать, что константа связывания клетск с по-ерхьостью зависит от температуры следующим образом (Лопаткин и др., 995):

ЛаХ = Л/Г Л ЯТ1

Одним из следствий данного уравнения является то, что для сильно эк-«термических взаимодействий (то есть связанных с большими отрица-ельными ДМ, например, образование водородной или полярной связи) фочность связи будет уменьшаться с повышением температуры. Это озна-1ает, что максимальное связывание может быть достигнуто на холоде. В ;лучае иных вовлеченных взаимодействий, большое значение приобретает »нтропийный член ТДБ, а изменение энтальпии для них несущественно. В •том сл'-чае, изменение температуры влияет на сродство к поверхности не-шачительно и зависимость может носить совершенно иной характер.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов подтверждают :ложившееся представление об адгезии клеток к твердым поверхностям гак о комплексном процессе, основанном на взаимодействии физико-химических и физиологических факторов. Глубокая сопряженность и взаимозависимость свойств клеточной поверхности, метаболической активности и способности дрожжей к прикреплешпо к твердым поверхно-:тям требуют учета множества факторов при попытках управления какой-либо из сторон функционирования биокатализатора.

Компоненты поверхности дрожжевых клеток (преимущественно гли-копротеиды), синтез которых определяется особенностями условий культивирования, оказывают большое влияние на адгезивную способность клеток, в силу особенностей своей структуры и, вероятно, пространственной ориентации. Особенностями функционирования этого звена адгезионного процесса являются его многофакторность, гибкость и сложная прогнозн-руемость.

Тем не менее, использование достаточно простых абстрактных моделей поверхности носителя, базирующихся на данных физической и коллоидной химии, позволяет однозначно сдвигать равновесие адсорбционного процесса в ту или иную сторону. Так, показана возможность блокирования электростатического отталкивания поверхностей, что приводит к увеличе-

пню прикрепления клеток. Введение в структуру носителя атомов и групп, способных формировать новые, более прочные типы сг.язсй по типу координационного взаимодействия приводит к увеличению адсорбции клеток. В этом случае кинетика процесса приобретает совершенно особые черты и закономерности, свидетельствующие, о глубоком нзмснелш; вовлеченных с адсорбцию взаимодействий.

Достигаемое тем или иным способом увеличение концентрации функционирующих клеток в зоне бнореактора влечёт зп собой повышение производительности установок с иммобилизованными клетками при отсутствии каких либо структурных трансформаций биореактора на макроуровне. Показанная высокая эффективность, стабильность и безвредность модифицированных поверхностей в составе биокатализаторов, осуществляющих реакции превращения углеводов в этанол, может быть легко экстраполируема на другие биотехнологические процессы.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что из широкого круга гранулированных и волокнистых материалов наиболее подходящими носителями для иммобилизации дрожжевых клеток являются пенополиуретан и силикагель, клеточная загрузка которых достигает 220 и 180 мг/г носителя, соответственно. Для максимально адекватной оценки сорбциониых свойств носителей и клеток предложен интегральный показатель эффективности прикрепления (ПЭП), равный отношению процента десорбнровавшихся клеток к проценту адсорбировавшихся клеток.

2. Закрепление дрожжевых клеток на поверхности гидроксилсодержа-щих носителей увеличивается при модификации поверхностей ионами переходных металлов. Показано, что наиболее активным модификатором являются ионы Fe3+, при использовании которых закрепление клеток увеличивается на 41 -80% по сравнению с контролем. е

3. Установлено, что основным механизмом стимулирующего действия имплантированных в носитель ионов на адсорбцию дрожжевых клеток является появление координационных взаимодействий между поверхностями носителя и клеток. Об этом свидетельствует впервые обнаруженный эффект инверсии температурной зависимости адсорбции, заключающийся в том, что если при повышении температуры адсорбционной системы прикрепление клеток к необработанному носителю уменьшается, то к носителю, модифицированному ионами переходных металлов, возрастает.

4. Показано, что клетки дрожжей Т. kefyr, иммобилизованные на сили-<агель, модифицированный ионами Fe3+, после культивирования их на творожной сыворотке в течение 48 ч. образуют, по сравнению с клетками, иммобилизованными на натнвном силикагеле, на 27% больше этанола.

5. На основании данных об отрицательном (в целом) заряде поверхностей клеток и носителей, показана возможность блокирования электростатического отталкивания поверхностей водорастворимыми полимерами, которое приводит к увеличению прикрепления дрожжевых клеток. Показано, что наибольшее увеличение адсорбции клеток (140% по отношению к контролю) достигается при использовании раствора полиэтиленимина, что объясняется высокой плотностью его заряда.

6. Установлено, что предобработка поверхности пенополиуретана 1 М раствором полиэтиленимина при периодическом культивировании дрожжей Т. kefyr на творожной сыворотке в течение 48 ч. позволяет увеличить ' выход этанола на 17%.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Основные результаты диссертации опубликованы в 15 научных статьях и тезисах:

1. Н.Э. Дигель, A.A. Жубанова. Модификация адсорбционных свойств пенополиуретана обработкой солями металлов и убитыми дрожжевыми клетками. - Алматы. (Деп. в КазГосИНТИ, 08.11.94, № 5473-Ка94).

2. И.Э. Дигель. Увеличение степени адсорбции клеток дрожжей при обработке гндрокснлсодержащих носителей ионами переходных металлов // Тезисы докладов международной конф., Степногорск, 1995. - С. 132.

3. A.A. Жубанова, И.Э. Дигель. Эффект температурной инверсии при прикреплении дрожжевых клеток Torulopsis kefyr var. kumis к нативному и модифицированному силикагелю // Вестник КазГУ, сер. биол. - 1996. -№3,-С. 31-34.

4. Жубанова A.A., Дигель И.Э. Разработка способов повышения эффективности сорбции клеток микроорганизмов на твердые носители // Новости науки Казахстана. - 1996. -№4. - С. 71-74.

5. А.П. Богоявленский, И.Э. Дигель, В.Э. Березин. Особенности адсорбции вирусных антигенов на ннтроцеллюлозные мембраны в твердофазном ИФА // Известия МН-АН PK, Сер. биол. - 1996. - №4. - С. 18-21.

6. И.Э. Дигель, A.A. Жубанова. Использование кремнеземных носителей, модифицированных переходными металлами, для иммобилизации дрожжевых клеток // Тезисы докладов 1 съезда микробиологов Узбекистана, Ташкент, 1997. - С. 127.

7. Дигель И.Э. Взаимосвязь состава среды культниироватыя и адгезионны: свойств дрожжевых клеток // Тезисы докладов 1 съезда микробиолога: Узбекистана, Ташкент, 1997. - С. 28. В.'Днгель И.Э., Жубанова А.А. Прикрепительная иммобилизация клето] микроорганизмов // Биотехнология: теория и практика.- 1997. - № 4. - С 3-9.

9. Жубанова А.А., Дигель И.Э. Влияние экстрактов поверхностных бнопо лимеров дрожжей на их адгезию к твердым поверхностям // Биотехноло гая: теория и практика. - 1998. - №1-2. - С. 43-45.

10. Дигель И.Э. Продукция этанола дрожжевыми клетками, нммобшшзо ванными с использованием раствора полиэтиленнмина (11ЭИ) // Биотсх пологая: теория и практика. - 1998. - №1-2. - С. 122.

11. Дигель И.Э., Жубанова А.А. Влияние водорастворимых полимеров 1« адгезию клеток к твердым поверхностям // Биотехнология: теория i практика. - 1998. - №1-2. - С. 122-123.

12. Digel I.E., Zhubanova А.А. Modification of hydrohyl-containing surface! adsorption properties by transition metal ions // International Microsymposiun "Colloids and surfaces". Abstracts. - Almaty, 1998. - P. 64.

13. Digcl I.E., Zhubanova A.A., Tazhibaeva S.M. The presence of watcr-solubli polymers increases adhesion of microbial cells onto solid surfaces // Interna tional Microsymposium "Colloids and surfaces". Abstracts. - Almaty, 1998. - P 63.

14. Digel I.E., Tajibaeva S.M., Musabekov K.B., ct al. Immobilization of yeas cells on silica gel U International Microsymposium "Colloids and surfaces". Ab streets. - Almaty, 1998. - P. 27.

15. Тажибасва C.M., Оразымбетова А.Б., Мусабсков К.Б., Дигель И.Э., Жубанова А.А., Каирманова Г.К., Ахмсткалиева Г.Т. Иммобилизация дрожжевых клеток на твердых носителях и возможность использования их дл? получения этилового спирта // Тезисы докладов республиканской научно-практической конференции "Состояние, проблемы и перспективы развит® пищевых технологий в условиях реформирования экономики Казахстана", АлматЫ, 15-16 октября 1998. - С. 155-156.