Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фенотипические и генотипические особенности клеток линии мышиной гепатомы XXIIа на разных уровнях устойчивости к колхицину

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горностаев, Вадим Сергеевич

Глава I. ВВЕДЕНИЕ.

Глава 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР . II

2.1. Устойчивые к антиметаболитам мутанты культивируемых клеток в решении проблем генетики соматических клеток . II

2.1.1. Актуальность проблемы. II

2.1.2. Мутанты, устойчивые к ядам . II

2.2. Множественно-измененный фенотип клеток с мембранно-обусловленной устойчивостью.

2.2.1. Мембранные мутанты

2.2.2. Изменение состава белков устойчивых клеток.

2.2.3. Коллатеральная чувствительность и холодочувствительность клеток с множественной устойчивостью.

2.2.4. Признаки трансформированного фенотипа в клетках с множественной устойчивостью

2.2.5. Характер наследования признака множественной устойчивости *

2.3. Высокий уровень устойчивости к антиметаболитам и амплификация генов.

2.3.1. Амплификация генов у эукариот

2.3.2. Устойчивость, амплификация генов и цитологическая картина явления

2.3.3. Множественная устойчивость к ядам и амплификация генов.

2.3.4. Стабильная и нестабильная амплификация

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Клеточные линии и клоны. Условия культивирования

3.2. Селекция устойчивых к колхицину клонов

3.3. Индукция мутагеном повышенной частоты появления устойчивых вариантов

3.4. Изучение стабильности сохранения признака

3.5. Повышающая селекция

3.6. Особенности размножения клеток: скорость роста, насыщающая плотность и зависимость от сыворотки.

3.7. Определение перекрестной устойчивости

3.8. Потенциирование мембранной проницаемости твином 80.

3.9. Накопление клетками ^-колхицина.

3.10. Определение чувствительности клеток к вирусу везикулярного стоматита (ВВС)

3.11. Онкогенность клеток

3.12. Гистологическое исследование опухолей

3.13. Гибридизация.

3.14. Определение уровня устойчивости к колхицину в гибридных клонах.

3.15. Трансформация чувствительных к колхицину клеток с помощью ДНК устойчивых клеток

3.16. Кариологический анализ.

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Селекция устойчивых к колхицину клонов

4.1.1. Селекция устойчивых клонов и повышение частоты их появления мутагеном

4.1.2. Различная степень стабильности устойчивых к колхицину клонов первого шага селекции

4.1.3. Повышающая селекция.

4.2. Характеристика фенотипических особенностей устойчивых к колхицину клеток.

4.2.1. Особенности размножения.

4.2.2. Перекрестная устойчивость резистентных клеток

4.2.3. Дотенциирование чувствительности к колхицину твином 80.

4.2.4. Накопление 3Н-колхицина клетками

4.2.5. Чувствительность к вирусу везикулярного стоматита.

4.2.6. Онкогенность клеток МГХХПа и колхицин-устойчивых клонов.

4.2.7. Морфология опухолей.

4.3. Стабильное и кодоминантное наследование признака устойчивости

4.3.1. Стабильное наследование устойчивости к колхицину в высокорезистентных клонах

Г-101, Г-401 и Г

4.3.2. Кодоминантность наследования резистентности в гибридах.

4.3.3. Перенос признака устойчивости к колхицину из устойчивых клеток в чувствительные с помощью ДНК.

4.4. Цитогенетическая характеристика.

Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Генетическая прщюда и различная степень стабильности признака устойчивости в изученных клонах.

5.2. Фенотипические особенности устойчивых к колхицину клонов.

5.2.1. Измененная проницаемость мембраны как механизм устойчивости к колхицину

5.2.2. Особенности трансформированного фенотипа устойчивых клеток

5.2.3. Сниженная чувствительность к вирусу

5.3. Стабильное и кодоминантное наследование признака устойчивости в высокорезистентных клонах.

5.3.1. Стабильность устойчивости высокорезистентных клонов.

5.3.2. Кодоминантное наследование признака устойчивости

5.4. Патогенетическая характеристика устойчивых клонов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипические и генотипические особенности клеток линии мышиной гепатомы XXIIа на разных уровнях устойчивости к колхицину"

2.1.1. Актуальность проблемы

В последние 10-15 лет стало очевидным, что анализ функционирования биологических систем, биотехнологические задачи во многом определяются наличием всевозможных вариантов культивируемых клеток. Исследования процессов дифференцировки, опухолевой трансформации, вирус-клеточного взаимодействия, продукции биологически активных веществ в настоящее время уже немыслимы без использования клеток, культивируемых вне организма и имеющих измененный фенотип. Ставшая самостоятельной областью биологической науки генетика соматических клеток основывается на получении и изучении различных клеточных вариантов.

2.1.2. Мутанты,устойчивые к ядам

Многие вещества, проникая в клетку или действуя на нее через мембрану, препятствуют нормальному метаболизму клетки и приводят ее к гибели. 5-бровдезоксиуридин (БДУ), 8-азагуанин (АГ), 6-тиогуанин (ТГ) и другие токсичные аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований включаются в ДНК и вызывают гибель клетки (Szibalski, Smith, 1959; Kit et al., 1963; Littlefield, 1965; Sharp et al., 1973). Среди возможных механизмов устойчивости к ядам можно выделить 4 основных:

1) утрата или снижение активности фермента, метаболизирующего токсичный агент;

2) изменение сродства белка-мишени к антиметаболиту;

3) избыточное производство белка-мишени;

4) изменение транспорта яда через плазматическую мембрану клетки.

Пример почти полной утраты фермента тимидин киназы (ТК) в клетках линии ъ, устойчивых к БДУ, описан в работе Кита с соавт. (Kit et ai., 19бз). Отсутствие фермента ТК позволяет клеткам расти в присутствии токсичной концентрации БДУ (30 мкг/мл), который не включается в ДНК и не приводит к гибели. Другие исследователи получили варианты клеток линии ОНО (клетки яичника китайского хомячка), в которых обнаружено пятикратное снижение сродства фермента дигидрофолатредуктазы (ДШР) к метотрексату (МТ), который ингибирует этот фермент и тем самым препятствует синтезу нуклеиновых кислот (Flintoff et ai.,1976а). Снижение сродства cL- и ft-тубулинов к колцемиду (КМ), колхицину (КХ), гризеофульвину (ГФ), таксолу (ТС), вызы-вызывающим деполимеризацию тубулинов микротрубочек и останавливающим деление клетки, показано в клетках китайского хомячка (Ling et al., 1979; Cabral et al., 1980; Keates et al., 1981; Cabral et al., 1981).

Механизм устойчивости, основанный на суперпррдукции нормального или измененного фермента ДШР, обнаружен в МТ-устойчи-ВЫХ клетках китайского хомячка (Flintoff et al., 1976а; Gupta et al., 1977), МЫШИ (Schimke et al., 1978), человека (Bertino et al., 1982), КРЫСЫ (Pougere-Deschatrette et al., 1982). В большинстве случаев устойчивость к КХ связана с изменением мембраны, в результате которого снижается поступление яда в клетку (Ling, 1975; Juliano, Ling, 1976; Juliano et al.,1976). Для таких клеток характерна устойчивость не только к селективному агенту, но и к целому ряду веществ, отличающихся как по структуре, так и по механизмам действия: пуромицину (ПМ), дау-номицину (ДЦ), эметину (ЭТ), грамицидину D (ГЦ), бромистому этщщю (БЭ) (Bech-Hansen et al., 1976; Сальников, 1979; Плес-кач, 1980; Kartner et al., 1983; Ефимова И др., 1984).

Клеточные варианты, устойчивые к ядам, представляют наиболее многочисленный и изученный класс мутантов культивируемых клеток. Они имеют ряд общих свойств. Большая часть представителей этого класса наследует признак рецессивно: БДУ-устойчи-ВОСТЬ (Chan et al., 1975), ТГ-УСТОЙЧИВОСТЬ (Ullraan et al., 1979; Hoffee, 1979), АГ-устойчивость (Littlefild, 1963; Gil-lin et al., 1972), MT-УСТОЙЧИВОСТЬ (Flintoff et al., 1976Ъ).

Это позволяет использовать такие варианты в качестве реципиентов в опытах по переносу генов.

Для отбора устойчивых к ядам клеток применяют прямую селекцию мутантов на среде с селективным агентом. В некоторых случаях возможна обратная селекция чувствительных ревертантных клонов, что говорит об участии структурных генных мутаций в возникновении измененного фенотипа и может служить удобной моделью ДЛЯ исследования мутагенеза (Ray, Siminovitch, 1982).

Несмотря на то, что селекция часто направлена на определенную внутриклеточную мишень, возможно получение разных фенотипов при отборе мутантов на одном селективном агенте. Так, селекция на устойчивость к МТ может дать клетки трех разных фенотипов: сниженное поступление МТ в клетку, измененное сродство ДШР к яду и суперпродукция измененного фермента при повышении концентрации Ш (Flintoff et al., 1976а). И наоборот, возможно получение одного фенотипа при селекции на разных селективных агентах. Получение устойчивых клеток к КХ, актиномицину Д (АД), винбластину (ВБ) и другим ядам нередко приводит к выделению мутантов с измененной мембраной, которые перекрестно устойчивы К этим веществам (Ling, 1975; Bech-Hansen et al., 1976; Воробьева и др., 1983; Ефимова и др., 1984).

Заключение Диссертация по теме "Цитология", Горностаев, Вадим Сергеевич

ВЫВОДЫ

Результаты генетического анализа КХ-устойчивых клеток мышиной гепатомы XXIIa и сравнение кариотипических и фенотипических особенностей чувствительных и устойчивых клеток на разных этапах селекции позволили сделать следующие выводы:

1. Селекция устойчивых к КХ клеток из высокодифферен-цированной линии мышиной гепатомы XXIIa позволила получить клоны и сублинии, характеризующиеся разными уровнями устойчивости к КХ.

2. Обнаружение устойчивых к 0.05 мкг/мл КХ клеток линии МГХХПа с частотой (3.7-5.1)х10~5, 5-6-кратное повышение частоты в результате предварительной обработки клеток мутагеном МННГ и стабильное сохранение признака устойчивости в двух полученных клонах первого шага селекции позволяют рассматривать изменения, происходящие в клетках стабильно устойчивых клонов Г-I и Г-4 , как результат генетически обусловленных событий.

3. Межвидовые гибридные клоны, полученные слиянием устойчивых к КХ мышиных клеток сублинии Г-101 с чувствительными клетками китайского хомячка линии Е-36, характеризовались величинами ЛДК50КХ, промежуточными между ЛД^КХ устойчивого и чувствительного партнёров гибридизации, что говорит о кодоминантном типе наследования устойчивости к КХ.

4. Возможность переноса признака устойчивости к КХ в чувствительные клетки с помощью ДНК из клеток высокорезистентной сублинии подтверждает вывод б кодоминантном типе наследования признака, а также свидетельствует в пользу предположения о наличии множества копий гена(ов), обуславливающих повышенный уровень резистентности"к КХ в клетках сублиний клона Г-1.

5. Перекрёстная устойчивость изученных клонов к КХ, а

АД, БЭ и ВВС, сниженное накопление Н-КХ и потен-циирование проницаемости мембраны для КХ с помощью твина 80 позволяют считать механизмом устойчивости снижение проницаемости мембраны для КХ. •» *

6. Изучение особенностей размножения клеток по мере повыжения уровня их устойчивости к КХ показало снижение насыщающей плотности культур и снижение зависимости роста клеток от сыворотки.

7. С повышением уровня резистентности к КХ обнаружены снижение онкогенности клеток, а также значительное увеличение экстраклеточного материала в опухолях, образованных при введении устойчивых клеток мышам линии СЗНА.

8. Обнаружение ДОО(ГОО) в В2-районе хромосомы 8 в сублиниях Г-110.и Г-120 соответствует, по-видимому, амплификации гена(ов), обуславливающего(их) высокий уровень устойчивости к КХ.

9. Нестабильность прицентромерного района хромосомы'2, появление ДОО(ГОО) в В2-районе хромосомы 8 в наиболее высокорезистентных сублиниях и увеличение процента полиплоидных клеток в популяции с повышением устойчивости к КХ указывают на неслучайные изменения кариотипа клеток в процессе формирования высокоустойчивого фенотипа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Суммируя результаты работы, можно заключить, что развитие устойчивости к КХ в клетках линии МГХХПа - сложный и многоступенчатый процесс.

Селекция устойчивых к низким концентрациям КХ клеток показала, что устойчивые к 0.05 мкг/мл КХ клоны обнаруживаются с с частотой (3.7-5.1)хЮ . Частота обнаружения устойчивых клонов может быть повышена в 5-6 раз обработкой чувствительных клеток мутагеном МННГ. Из 6 выделенных без обработки мутагеном устойчивых клонов 2клона наследовали признак стабильно в неселективных условиях, тогда как 4 клона теряли устойчивость. Проведенная генетическая характеристика полученных клонов позволяет рассматривать изменения, происходящие в клетках стабильно устойчивых клонов, как результат генетически обусловленных событий.

Многошаговой селекцией из клонов Г-1 и Г-4 получен ряд высокоустойчивых сублиний, наследующих признак устойчивости относительно стабильно. Успешная селекция высокорезистентных сублиний, возможность переноса устойчивости в чувствительные клетки с помощью ДНК высокорезистентных клеток и обнаружение ДОО(ГОО) в В2-районе хромосомы 8 позволяют высказать предположение о наличии множества копий гена(ов), обеспечивающего(их) высокий уровень устойчивости в сублиниях клона Г-1.

Изучение межвидовых гибридов, образованных устойчивыми и чувствительными клетками, привело к заключению о кодоминантном типе наследования признака устойчивости в сублинии Г-101. Этот вывод подтверждается успешным переносом устойчивости в чувствительные клетки с помощью ДНК высокоустойчивой сублинии Г-104. Следовательно, генетический анализ клеток клона Г-1 и его сублиний показал возможность использования признака устойчивости к КХ в качестве доминантного селективного маркера в решении проблем генетики соматических клеток.

Исследование фенотипических особенностей устойчивых клеток позволило связать механизм устойчивости в этих клетках с изменением клеточной поверхности, приводящем к сниженному поступлению КХ в клетки. Об этом свидетельствуют перекрестная устойчивость к АД, БЭ и ВВС, сниженное накопление Н-КХ в устойчивых клетках и потенциирование твином 80 проницаемости мембраны для КХ. Изучение особенностей размножения резистентных клеток выявило снижение насыщающей плотности клеток в высокоустойчивых клонах и снижение зависимости размножения клеток от сыворотки. Кроме того, устойчивые клетки имеют сниженную онкогенность, а в опухолях мышей, которым вводили устойчивые клетки, обнаружено увеличение экстраклеточного материала. Все это говорит об изменении клеточной поверхности устойчивых клеток.

Следует отметить, что с повышением уровня устойчивости наблюдалось прогрессируещее изменение ряда своств клеток: увеличение уровней перекрестной устойчивости к КХ, АД и БЭ, уменьшение зависимости роста от сыворотки, снижение онкогенности.

Анализ хромосомных перестроек в сублиниях клона Г-I показал на третьем этапе селекции изменение хромосомы 2; на последующих этапах, наряду с изменением хромосомы 2, отмечено появление ДОО(ГОО) в В2-районе хромосомы 8' и перестроек с участием, в основном, 2-, 8- и 15-й хромосом.

Таким образом, генетическая и цитогенетическая характеристика, наряду с изучением фенотипических свойств КХ-устойчивых клеток, свдетельствуют о сложной, многоступенчатой эволюции высокого уровня устойчивости к КХ в клетках линии МГХХПа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горностаев, Вадим Сергеевич, Ленинград

1. Алексанян Ю.Т. Синтез U -фетопротеина, альбумина и транс-феррина в длительно культивируемых клетках мышиной гепа-томы. Бюлл. экспер. биол. мед., 1979, т. 85, № 7, с. 76-78.~

2. Алексанян Ю.Т., Басмаджан М.Е., Мовсеян К.С., Манукян Л.А.,

3. Геворкян С.К. Линии перевиваемых клеток, полученные из перевиваемой мышиной гепатомы. Бюлл. экспер. биол. мед., 1972, т. 74, J& 9, с. 94-95.

4. Воробьева О .А., Игнатова Т.Н., Арцыбашева И.В. Внутриклональная фенотипическая гетерогенность клеток китайского хомячка линии ют, устойчивых к бромистому этидию. -Цитология, 1983, т. 25, В 9, с. 1080.

5. Гелыптейн В.И. Прогрессия перевиваемых мышиных гепатом.

6. Цитология, 1971, т. 13, № I, с. 3-14.

7. Гринчук Т.М. Особенности кариотипа клеток мышиной гепатомы

8. ХХПа. В кн.: 1У съезд Всес. об-ва генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. Кишинев, 1982, часть 4, с. 186.

9. Ефимова Е.В. Фенотипические особенности клеток китайскогохомячка с наследственно измененной устойчивостью к колхицину, актиномицину Д и бромистому этидию. В кн.: Матер. П Всес. совещ. по генетике сомат. клеток в культуре. М., Наука, 1980, с. 14-15.

10. Игнатова Т.Н. Цутанты и гибриды в изучении генотипическойизменчивости трансформированных клеток в культуре. -Автореферат докт. дисс., Л., 1983, 40 с.

11. Какпакова Е.С., Массино Ю.С., Малахова Е.М. Резистентные кактиномицину Д и 6-меркаптопурину линии клеток джунгар-ского хомячка: кариотип, морфология, злокачественность.-Генетика, 1981, т. 17, J6 3, с. 460-468.

12. Какпакова Е.С. Проявление признаков трансформации в опухолевых клетках, резистентных к колхицину. Бюлл. экспер. биол. мед., 1983, т. 89, № 7, с. 89-91.

13. Копнин Б.П., Ставровская А.А. Генетический анализ резистентности соматических клеток мыши к колхицину. Генетика, 1978, т. 14, В 9, с. 1625-1633;

14. Копнин Б.П., Гудков А.В., Кадырова Е.Л. Хромосомная и внехромосомная локализация амплифицированных генов в резистентных к колхицину клетках. Докл. АН СССР, 1982, т. 262, № 4, с. 993-997.

15. Копнин Б.П. Генетическое изучение стабильно наследуемойустойчивости клеток к колхицину. Хромосомный и гибридиза-ционный анализ. Генетика, 1982а, т. 18, № 10, с. 16931702.

16. Копнин Б.П., Гудков А.В. Амплификация участков генома всоматических клетках млекопитающих, устойчивых к колхицину. Сообщение Ш. Локализация амплифицированных генов в мелких хроматиновых образованиях. Генетика, 1982а, т. 18, J& 10, с. 1683-1692.

17. Копнин Б.П. Амплификация генов как механизм изменчивостисоматических клеток млекопитающих. Автореферат докт. дисс., М., 1983.

18. Массино Ю.С., Какпакова Е.С., Копнин Б.П., Погосянц Е.Е.

19. Связь резистентности клеток млекопитающих к актиномици-ну Д с изменением кариотипа и уменьшением проницаемости цитоплазматической мембраны. Генетика, 1981, т. 17, JS 7, с. 1253-1258.

20. Массино Ю.С., Копнин Б.П. Изменения генотипа и фенотипа,определяющие устойчивость соматических клеток джунгарского хомяка к адриаблаетину. -Билл. экспер. биол. мед., 1983, т. 89, № 9, с. 92-95.

21. Оленов Ю.М. Проблемы молекулярной генетики. Клетка. Онтогенез. Рак. Эволюция. Л., Наука, 1977 , 207 с.

22. Плескач В.А. Регуляция размножения и структурно-функциональные особенности поверхности клеток линии ь. Автореферат канд. дисс., Л., 1980.

23. Плескач В.А., Игнатова Т.Н. Контроль размножения клетокin vitro. I. Зависимость размножения от факторов сыворотки крови. Цитология, 1980, т. 22, № 3, с. 332-337.

24. Полоцкая А.В., Гудков А.В., Копнин Б.П. Гиперпродукцияспецифического белка в клетках, резистентных к колхицину и адриабластину. Бюлл. экспер. биол. мед., 1983, т. 95, № 5, с. 93-96.

25. Розенблат В.А., Серпинская А.С., Ставровская А.А. 0 механизмах резистентности к колхицину сублинии мышиных клеток Ъ. Докл. АН СССР, 1973, т. 211, № 6, с. 1460-1462.

26. Сальников К.В. Получение и характеристика клеток линии ъ,резистентной к бромистому этидию. Автореферат канд. дисс., Л., 1979.

27. Серпинская А.С. Исследование проницаемости мембраны опухолевых клеток для антимитотических препаратов (колхамина и колхицина). Автореферат канд. дисс., М., 1980.

28. Balaban-Malenbaum G., Gilbert P. Double-minite chromosomesand homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science, 1977» vol.198, p. 739-742.

29. Barker P.E., Hsu T.C. Double minites in human carcinomacell lines, with special reference to breast tumors. -J. Natl. Cancer Inst., 1979, vol. 62, n. 2, p. 257-262.

30. Bech-Hansen N.T., Till J.E., Ling V. Pleiotropic phenotypeof colchicine-resistant CHO cells: cross-resistance and collateral sensitivity. J. Cell Physiol., 1976, vol. 38, p. 23-32.

31. Belehradek J.J., Biedler J.L., Thonier M. Actinimycin Dresistant in vitro mouse cell line derived from a methyl-cholanth.rene-indu.ced sarcoma: Decrease of malignancy and antigenic characteristics. Int. J. Cancer, 1974, vol. 14, p. 779-788.

32. Bertino J.R., Srimatkandada S., Bngel D., Medina W.D.,

33. Scheer D.I., Moroson B.A., Dube S. Gene amplification in a methotrexate-resistant human leukemia line K-562.-In: Gene Amplification, R.Schimke, ed. (Cold Spring Harbor, Hew York: Cold Spring Harbor Laboratory), 1982, p. 23-27.

34. Biedler J.L., Riehm H. Cellular resistance to actinomycin

35. D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic and cytogenetic studies. Cancer Res., 1970, vol. 30, p. 1174-1184.

36. Biedler J.L., Riehm H., Peterson R.H.F., Spengler B.A.

37. Membrane-mediated drug resistance and phenotypic reversion to normal growth behavior of Chinese hamster cells. J. Hatl. Cancer Inst., 1975, vol. 55, n. 3, p. 671677.

38. Cabral F., Abraham I., Gottesmann M.M. Isolation of ataxol-resistant Chinese hamster ovary cell mutant that has an alteration in oC -tubulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, n. 7, p. 4388-4391.

39. Carlsen S.A., Till J.E., Ling V. Modulation of membranedrug permeability in Chinese hamster ovary cells. -Biochim. Biophys. Acta, 1976, vol. 455, p. 900-912.

40. Chan T-S., Long C., Green H. A human-mouse somatic hybridline selected for human deoxycytidine deaminase. -Somat. Cell Genet., 1975, vol. 1, p. 81-90.

41. Chu E.H., Mailing H.V. Mammalian cell genetics. II. Chemical induction of specific locus mutation in Chinesehamster cells in vitro. Proc. Hatl. Acad. Sci. USA, 1968, vol. 61, p. 1306-1312.

42. Chu E.H.Y. Induction and analysis of gene mutation in cultured mammalian somatic cells. Genetics, 1974, vol.78, p. 115-132.

43. DeMars R. Resistance of cultured human fibroblasts andother cells to purine and pyrimidine analogies in relation mutagenesis detection. Mutat. Res., 1974, vol. 24, p. 335-364.

44. Dolnick В., Berenson R., Bertino J., Kaufman R., lunberg

45. J., Schimke R. Correlation of dihydrofolate reductase elevation with gene amplification in a homogeneously staining chromosomal region in LS1784 cells. J. Cell. Biol., 1979, vol. 83, p. 394-402.

46. Flintoff W.F., Davidson S.V., Siminovitch L. Isolationand partial characterization of three methotrexate-resistant phenotypes from Chinese hamster ovary cells. -Somat. Cell Genet., 1976a, vol. 2, p. 245-261.

47. Flintoff W.R., Spindler S.M., Siminovitch L. Genetic characterization of methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cells. In Vitro, 1976b, vol. 12, p. 749*757.

48. Fougere-Deschatrette C., Schimke R.T., Weil D.,Weiss M.C.

49. Amplification of dihydrofolate reductase gene in rat hepatoma cells and their dedifferentiated variants. -In: Gene Amplification, R.Schimke, ed. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory), 1982, p. 29-31.

50. Gillin F.D., Roufa D.J., Blandet A.L., Caskey C.T. 8-Azaguanine resistance in mammalian cells. I. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Genetics, 1972, vol. 72, p. 239-252.

51. Gupta R.S., Flintoff W.F., Siminovitch L. Purificationand properties of dihydrofolate reductase from metho-trexate-sensitive and resistant Chinese hamster ovary cells. Canad. J. Biochem., 1977, vol. 55, p. 445-452.

52. Heinz E. Coupling and energy transfer in active aminoacid transport. In: Current Topics in Membranes and Transport, P.Bronner & A.Kleinzeller, eds., Acad.Press, Inc., Hew York, 1974, vol. 5, p. 137.

53. Hoffee P. A method for the isolation of purine nucleosidephosphorylase-deficient variants of mammalian cell lines. Somat. Cell Genet., 1979, vol. 5, p. 319-328.

54. Kartner П., Riordan J.R, Ling V. Cell surface P-glycoprotein associated with multidrug resistance in mammalian cell lines. Science, 1983, vol. 221, n. 4617, p. 12851288.

55. Keates R.A.B., Sarangi 3?., Ling V. Structural and functionalalteration in microtubule protein from Chinese hamster ovary cell mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, n. 9, p. 5638-5642.

56. Kessel D., Botterill V,, Wodinsky I. Uptake and retentionof daunomycin by mouse leukemic cells as factors in drug response. Cancer Res., 1968, vol. 28, p. 938-941.

57. Kit S., Dubbe D.R., Piekarski L.H., Hsu Т.О. Deletion ofthymidine kinase activity from L cells resistant to bromdeoxyuridine. Exper. Cell Res., 1963, vol. 31, p. 297-312.

58. Kuo Т., Pathak S., Ramagli L., Rodriguez L., Hsu T.C.

59. Vincristine-resistant Chinese hamster ovary cells. -In: Gene Amplification, R.Schimke, ed. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory), 1982, p. 53-57.

60. Langelier Y., Simard R., Brailovsky C. Mechanism of actinomycin resistance in SV40-transformed hamster cells. -Differentiation, 1974, vol. 2, p. 261-267.

61. Levan G., Mandahl N., Bengtsson B.O., Levan A. Experimentalelimination and recovery of double minute chromosomes in malignant cell populations. Hereditas, 1977, vol. 86, • p. 75-90.

62. Li E., Kornfeld S. Effects of wheat germ agglutinin onmembrane transport. Biochim. Biophys. Acta, 1977, vol. 469, p. 202-210.

63. Ling V. Drug resistance and membrane alteration in mutantsof mammalian cells. Can. J. Genet. Cytol., 1975, vol. 17, p. 503-515.

64. Ling V., Thompson L.H. Reduced permeability in CHO cellsas a mechanism of resistance to colchicine. J. Cell Physiol., 1974, vol. 83, p. 103-116.

65. Ling V. A membrane-altered mutant cold-sensitive forgrowth. J. Cell Physiol., 1977, vol. 91, p. 209-224.

66. Ling V., Baker R.M. Dominance of colchicine resistance inhybrid CHO cells. Somat. Cell. Genet., 1978, vol. 4, 11. 2, p. 193-200.

67. Ling V., Aubin J.E., Chase A., Sarangi P. Mutants of Chinese hamster ovary (CHO) cells with altered colcemid-binding affinity. Cell, 1979, vol. 18, p. 423-430.

68. Littlefield J.W. The inosinic acid pyrophosphorylase activity of mouse fibroblasts partially resistant to 8-aza-guanine. Proc. Hatl. Acad. Sci. USA, 1963, vol. 50, p. 568-576.

69. Littlefield J.W. Studies on thymidine kinase in culturedmouse fibroblasts. Biochim. Biophys. Acta, 1965, vol. 95, p. 14-22.

70. Moehring T.J., Moehring J.M. Selection and characterization of cells resistant to diphtheria toxin and pseudo-monas exotoxin A: Presumptive translational mutants. -Cell, 1977, vol. 11, p. 447-454.

71. Hunberg J., Kaufman R., Schimke R., Urlaub G., Chasin L.

72. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc. JSTatl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, n. 11, p. 5553-5556.

73. Olmstead J.В., Borisy G.G. Microtubules. Ann. Rev.

74. Biochem., 1973, vol. 42, p. 507-540.

75. Papahadjopoulos D., Jacobsen K., Poste G., Shepherd G.

76. Effects of local anesthetics on membrane properties. I. Changes in the fluidity of phospholipid bilayers. -Biochim. Biophys. Acta, 1975, vol. 394, p. 504-519.

77. Paterson A.R.P., Kim S.C., Bernard 0., Cass C.E. Transport of nucleosides. Ann. IT.Y. Acad. Sci., 1975, vol. 255, p. 402.

78. Peterson R.H.F., Biedler J.L. Plasma membrane glycoproteins from Chinese hamster cells sensitive and resistant to actionomycin D. J. Supramol. Struct., 1978, vol. 9, p. 289-298.

79. Plagemann P.G.W., Richey D.P. Transport of nucleosides,nucleic acid bases, choline, and glucose by animal cells in culture. Biochim. Biophys. Acta, 1974, vol. 334, p. 263-305.

80. Poste G., Papahadjopoulos D., Jacobson K., Vail W.J.1.cal anesthetics increase suspectibility of untransformed cells to agglutination by concanavalin A. -Nature, 1975, vol. 253, p. 552-554,

81. Ray P.N., Siminovitch L. Genetic variants of culturedanimals cells. In: Somatic Cell Genetics, C.J.Caskey & D.C.Robbins, eds., Plenum Press, N.-Y.-Lond., 1982, p. 127-167.

82. Reed L.I., Muench H. Simple method of estimating 50 percent end points. Am. J. Hyg., 1938, vol. 27, p. 493497.

83. Schimke R.T., Alt F.W., Kellems R.E., Kaufman R., Bertino J.R. Amplification of dihydrofolate reductase genes in methotrexate-resistant cultured mouse cells. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. XLII, 1978, p. 649657.

84. Schimke R.T., Browm P.C., Kaufman R.J., McGrogan M., Slate D.L. Chromosomal and extrachromosomal localization of amplified dihydrofolate reductase genes in cultured mammalian cells. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. XLV, 1981, p. 785-797.

85. Schimke R.T., Haber D.A. Gene amplification and methotrexate resistance in cultured animal cells. In: Somatic Cell Genetics, C.J.Caskey & D.C.Robbins, eds., Plenum Press, N.-Y.-Lond., 1982, p. 97-109.

86. Schimke R.T. Studies on gene duplications and amplifications an historical perspective. In: Gene Amplification, R.Schimke, ed. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory), 1982, p. 1-6.

87. Spradling A.C. Chorion gene amplification during the development of Drosophila follicle cells. In: Gene Amplification, R.Schimke, ed. (Cold Spring Harbor, lev/ York: Cold Spring Harbor Laboratory), 1982, p.121-127.

88. Szybalski V/., Smith M.J. Genetics of human cell lines. I.8.azaguanine resistance, a selective "single-step" marker. Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 1959, vol. 101,p. 662-666.

89. Taber R., Alexander V., Wald N. The selection of virusresistant Chinese hamster ovary cells. Cell, 1976, vol. 8, p. 529-533.

90. Taub LI., Englesberg E. Isolation and characterization of5.fluorotryptophan-resistant mutants with altered L-tryptophan transport. Somat. Cell Genet., 1976, vol. 2, n. 5, p. 441-452.

91. Thompson L. Mutant isolation. Methods Enzymol., 1979,vol. 58, p. 308-322.

92. Till J.E., Baker R.M., Brunette D.M., Ling V., Thompson

93. H., Wright J.A. Genetic regulation of membrane function in mammalian cells in culture. Peder. Proc., 1973, vol. 32, p. 29-33.

94. Todaro G.J., Green H. Quantitative studies on the growthof mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J. Cell. Biol., 1963, vol. 17, n. 2, p. 299-313.

95. Wahl G., Padgett R., Stark G. Gene amplification causesoverproduction of the first three enzymes of UMP synthesis in N-(phosphoroacetyl)-L-aspartate resistant hamster cells. J. Biol. Chem., 1979, vol. 254, p. 8679-8689.

96. Wigler I.I., Pellicer A., Silverstein S., Axel R., Urlaub G.

97. Chasin L. DNA-mediated transfer of the adenine phospho-ribosyltransferase locus into mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, n. 3, p. 13731376.

98. Wigler M., Perucho M., Kurtz D., Dana S., Pellicer A.,

99. Axel R., Silverstein S. Transformation of mammalian cells with an amplifiable dominant-acting gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, n. 6, p. 35673570.

100. Wilson L., Bamburg J.R., Mizel S.B., Grisham L.M., Creswell K.M. Interaction of drugs with microtubule proteins. Fed. Proc., 1974, vol. 33, p. 158-166.

101. Wright J.A., Lev/is W.H., Parfett C.L.J. Somatic cell genetics: a review of drug resistance, lectin resistance and gene transfer in mammalian cells in culture. Ca-nad. J. Genet. Cytol., 1980, vol. 22, p. 443-496.

102. Zimmer W.E., Jr. & R.J.Schwartz Amplification of chickenactin genes during myogenesis. In: Gene Amplification, R.Schimke, ed. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory), 1982, p. 137-146.