Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной активности белка множественной лекарственной устойчивости Р-170 с помощью флуоресцентных красителей

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональной активности белка множественной лекарственной устойчивости Р-170 с помощью флуоресцентных красителей"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

[' [" ^ 0 д Биологический факультет

1 П ДПР

На правах рукописи УДК 616-018-022:615.37

ФОЛОМЕШКИНА Светлана Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Р-170 С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

М-24

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте канцерогенеза Онкологического научного центра РАМН и на Биологическом факультете МГУ.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор А.А.Став-ровская; доктор биологических наук, профессор Л.Б.Марголис.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Ю.Поляков; кандидат биологических наук В.В.Андрушкевич.

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт химической физики им. Н.И.Семенова РАН.

Защита диссертации состоится " " _1995 г в

<45чаСов на заседании специализированного Совета Д 053.05.68 в Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

/¿Г»

^СС^уь^7^ 1995 г.

Ученый секретарь

специализированного Совета Д 053.05.68

Е.Н.Калнстратова

Актуальность темы. Трансмембранныи глпкопротснн Р-170 осуществляет защиту клетки от воздействия широкого круга токсических веществ. Р-170 работает как энергозавпспмый насос, выводящий т нпто-плазматпческого пространства инородные липофнльные вещества в весовом диапазоне от 500 до 1000 Дт, не сходные по структуре и механизмам действия. В круг этих веществ входят многие химпотеряпевтнческпе препараты природного происхождения: растительные алкалоиды (среди них впнбластни н колхицин), антрацнклниовыс антибиотики, эппподофилло-токснны и др., а также флуоресцентные красители. Гиперфункция Р-170 приводит к множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток. Феномен МЛУ часто встречается при лечении онкологических заболеваний.

Регуляция активности Р-170 и механизмов, обеспечивающих выброс токсинов из клетки изучены недостаточно. Исследование Р-170 как одной из основных защитных систем клетки представляет существенный интерес. Одной из важных проблем в изучении этого белка является разработка методов наблюдения за функциональной активностью Р-170. Одним из таких методов является оценка скорости выведения из клеток флуоресцентных красителей, являющихся субстратами Р-170. Сообщения о применении подобных методик для исследования активности Р-170 начали появляться перед началом нашей работы. Однако для широкого применения этого метода необходимо было оценить его чувствительность. Нужно было проверить также, можно лн использовать флуоресцентные красители для исследования природных популяций, которые характеризуются гетерогенностью и невысокой степенью функциональной активности Р-170.

Развитие МЛУ клеток создает серьезное препятствие для химиотерапии онкологических заболеваний. В связи с этим важной практической проблемой остается диагностика МЛУ. Методы молекулярной биологии

позволяют определить, присутствуют ли клетки, экспрессирующие Р-170, в опухолевой ткани. Однако экспрессия в клетках Р-170 еще не говорит о том, что белок находится в активном состоянии. Поэтому важно определить не только уровень экспрессии гена, но и проявление функциональной активности его продукта - белка Р-170. Развитие в клетках МЛУ - многоступенчатый процесс. Существуют противоречивые данные об участии Р-170 на ранних стадиях развития МЛУ. Поскольку в природе обычно клетки обладают низкими уровнями устойчивости, то определение степени активности Р-170 на начальных этапах развития МЛУ представляет особенный интерес.

Важной теоретической проблемой является изучение механизмов появления клеток с МЛУ. Индукция экспрессии Р-170 хнмпопрспаратами -одна из возможных причин возникновения резистентных вариантов. Однако механизм воздействия цитостатпков на клетки до спх пор подробно не изучен. Особенно неясным остается вопрос, как реагируют клетки с различным начальным уровнем устойчивости на воздействие цптостати-коо.

Количественная оценка связывания антрацнклнновых антибиотиков с ДНК - важный параметр эффективности действия лекарства. До спх пор не существует методов, позволяющих оценивать количество антибиотиков, связавшихся с мпшеныо действия.

Решение этих проблем актуально как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики.

Цель работы.

Отработка методов с использованием флуоресцентных зондов для: а) измерения функциональной активности Р-170 в клетках; б) для измерения количества связавшегося с мишенью препарата - субстрата Р-170. Применение отработанных методов для решения некоторых экспериментальных и практических задач.

Задачи исследования:

1. Отработать методику выявления клеток с функционально активным Р-170 с применением флуоресцентных красителей Родамина-123 и Хехста-33258, определить разрешающую способность метода.

2. Изучить возможность оценки количественного связывания с ДНК антрацнклнновых антибиотиков и оценить, как активность Р-170 влияет на связывание антрациклинов с ДНК.

3. Применить отработанную методику с использованием Родамнна-123 для оценки функциональной активности Р-170 в культивируемых клетках

>еловека п грызунов начальных этапов развития МЛУ.

4. Исследовать влияние цптостатпка (колхицина) на функциональную ктивность Р-170 в модельных системах - культивируемых клетках жн-ютных и человека с разной степенью экспрессии гепа МИШ.

5. Применить разработанную методику с использованием Родампна-123 1ля изучения возможности выявлеппя клеток с активным Р-170 в при-)одных клеточных популяциях - у больных хроническим мпелопдным гейкозом.

6. Определить, размножаются ли преимущественно у больных хро-шческим мпелопдным лейкозом клетки, экспрессируюшпе одновременно 1ва антигена - белок Р-170 п маркер стволовых клеток костного мозга 1еловека СИ34.

Научная новизна и практическая значимость работы

В результате проведенных исследовании впервые показано, что метода с использованием флуоресцентных зондов обладают высокой разрешающей способностью, позволяющей выявлять минимальные изменения активности Р-170 п малые фракции клеток с активным Р-170 в гетерогенных клеточных популяциях.

Впервые на экспериментальных моделях показано, что функциональная активность Р-170 проявляется в опухолевых клетках человека с минимальным (2-кратным) уровнем резистентпостп к селективному агенту, что свидетельствует о том, что не только в клетках грызунов, но и в клетках человека первые этапы МЛУ могут обеспечиваться повышением гктнвности Р-170. Выявлена активация работы Р-170 в клетках человека и крысы после кратковременного воздействия колхицина. Показано, что :тепень активации белка зависит от исходного уровня экспрессии гена УГОШ в клетках.

Исследование природных клеточных популяций - клеток периферической крови больных хроническим мпелопдным лейкозом - показало, что зысокому уровню экспрессии Р-170, выявляемому с помощью мопокло-гальных антител, не во всех случаях соответствует высокая функциональная активность белка. Эти данные свидетельствуют о необходпмо-:тн сочетапного применения нммуногпстохпмпческого определения Р-170 I исследования его функциональной активности при изучении клшшче-:кого материала. Обнаружено, что в ряде случаев хронического дшело-[дного лейкоза происходит преимущественная пролиферация стволовых :лсток системы кроветворения, несущих Р-170 п антиген С £>34. Эти дан-1ые позволяют надеяться, что в результате дальнейших исследований южно будет выделить подтип бластного криза хронического миелопд-

ного лейкоза, имеющего данную характеристику. Впервые показано, что использование ДНК - специфичного красптеля Хехст-33258 - позволяет оценивать количество антрацпклиновых антибиотиков, связавшихся с ДНК клеток. Впервые обнаружено, что сопоставление активности Р-170 в клетках различных линий с количеством антибиотика, дошедшего до ДНК этих клеток, позволяет выявить случаи, в которых фенотип МЛУ определяется не только функционированием Р-170, но и дополнительными механизмами.

Публикации

По теме диссертации опубликовано четыре статьи и шесть докладов. Две статьи приняты к печати.

Апробация результатов работы

Основные положения работы доложены на заседании Ученого совета НИИ канцерогенеза (21 января 1994 г.), на конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка, 22-24 ноября 1993), а также на Между нар одном симпозиуме "Использование приборов фирмы "Becton Dickinson" в научной п клинической практике". Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании кафедры цитологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Основные результаты диссертации изложены в 6 статьях и 6 тезисах докладов.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста п включает разделы: введение, обзор литературы, четыре главы собственных результатов' исследования, обсуждение полученных результатов и выводы. Список цитируемой литературы содержит более 150 источников. Работа иллюстрирована 2 таблицами н 28 рисунками.

ВВЕДЕНИЕ

Метод регистрации функциональной активности Р-170 основан на измерении скорости выведения из клеток флуоресцентных красителей, которые являются субстратами Р-170 (Neyfakh, 1988). Наиболее удобным и часто употребляемыми являются красители Родамин-123 и Хехст-33258. Родамин-123 при определенных внешних концентрациях практически одинаково накапливается клетками, устойчивыми к колхицину и клетками дикого типа. Скорость выведения красптеля из клеток зависит от уровня их устойчивости к селективному агенту. Время полного освобождения клеток от родамина при помещении их в среду без красптеля - от нескольких минут для высокоустойчпвых популяций, до нескольких суток

' для клеток исходных линий. В присутствии блокатора работы Р-170 ве-рапамила ускоренного выведения красителей резистентными клетками не происходит, что свидетельствует о том, что оно было вызвано работой Р-170.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клеточные линии. В работе использованы линии клеток: меланомы человека mS (Снмпсона), гепатокарщшомы человека НерС2, гепатомы крысы МсА /?Н 7777, мышиного эритролейкоза DS-19 и их сублишш, устойчивые к колхицину (СН) с уровнем устойчивости от 2 до 190 раз. Раисе было показано, что в клетках резистентных сублиннй меланомы повышено количество мРНК гена MDR1. Поэтому линии mS-0.02 и mS-0.5 (уровни устойчивости к СН - 2 и 130 раз) были выбраны для отработки .метода определения функциональной активности Р-170 с помощью Родамнна-123. Клетки выращивали в среде RPMI 16-10 с 10% эмбрнональ-ной сыворотки (фирма "Flow"1 или производства НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф.Гамалея) с добавлением гентампщша (50 мкг/мл).

I Клетки крови больных получали из Гематологического научного центра РАМН специально для диагностики МЛУ. Кровь бралась из локтепой пены в раствор гепарина (50 ЕД/мл). После отстаивания эритроцитов клетки плазмы осаждали центрнфунгнровапнем, затем трижды отмывали PBS и ресусиенднровалп в специальной среде. Выражаю искреннюю благодарность канд. мед. наук врачу А.Г.Туркннои за предоставленные образцы и помощь в проведении экспериментов с клетками больных.

Для разработки метода оценки количества связывания доксорубнцн-на с ДНК клеток использовали клетки тимуса мышеи липни С'Г>7В£6 2-месячного возраста разводки питомника "Столбовая". Жш-тиых дека-пптнровалп, выделяли тимус и помещали его п охлажденный до -1°С раствор Хенкса без фенолового красного. Для получения суспензии тимоцитоп разрезали строму тимуса и вымывали из неё клетки п среду инкубации. Полученную суспензию клеток дважды отмывали центрпфунгпрованием по 5 мин. при 1200 об/ншг., осадок ресуспензнропалн в растворе Хенкса до конечной концентрации 10®кл/мл. Эксперименты проводили при f 20°С.

В этих экспериментах использовались также ДНК эритроцитов цыплят ("/?еапаГ, Венгрия) и хроматографнчеекп чистый доксорубшпш (НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН).

Для изучения влияния колхицина на функциональную активность Р-170 колхицин (СН) ("Merck") добавляли к клеткам, растущим на суб-

страте, на третий день после рассева. Дозы цптостатнка н время инкубации указаны d тексте.

Окрашивание флуоресцентными красителями

Окраска клеток Родамином-123. На третьи сутки после рассева клетки снимали версеном п трипсином с твердого субстрата ц ресуспензпровалн в культуральиой среде. После инкубации клеток с Родамином-123 (Sigma, 5 мкг/мл) в течение 15 мин. при 37°С клетки дважды промывали фосфатным буфером и инкубировали 10-G0 мин. (в зависимости от условии опыта) в чистой среде без красителя. Для изучения влияния верапамнла в среду во время окрашивания и инкубации без красителя добавляли вера-пампл в концентрации 20 мкг/мл. Доза верапамнла ("ЯеапаГ, Венгрия) была подобрана экспериментально (см. разд.4.2.1.).

Окраска клеток Ххстом-33258. Для фотометрического анализа клетки гепатомы И меланомы человека высевали в количестве 100 тыс. на чашку Петры диаметром 35 мм, в которую были помещены покровные стекла. На третьи сутки культивирования стекла переносили в раствор Хенкса, добавляли краситель Хёхст-33258 ("Aldrich" США) (3;1оА\1) и инкубировали 30 мин. при 37°С. Аналогичные операции проводили в присутствии 10 мкг/мл верапамнла.

Иммуногиетохимическое окрашивание.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуорееценции.

Для идентификации клеток с Р-170 использовали специфические мышиные моноклональные антитела (МКА) к белку Р-170 - TJIC-2, пзотн-па IgG2a. Антитела любезно предоставлены Е.Б.Мечетнером (Department of Genetics, Univ. of Illinois, Chicago, USA). MKA MY-10 к дпфферен-цпровочному антигену С DM (пзотппа IgGl), меченные фнкоэритрнном (РЕ) коныогаты к IgG2a, а также меченные FITC коныогаты к IgGl были любезно предоставлены T.M.Tliischmann (Johns Hopkins Oncology Center, Pediatric Oncology, Baltimore, USA). Непрямую реакцию иммунофлуорееценции проводили следующим образом: 500 тыс. клеток инкубировали с 20 мкл сыворотки, содержащей МКА UIC-2 нлн MY-10, в течение 30 мин. при 4°С, после чего клетки дважды отмывали фосфатным буфером рН=7.4, инкубировали 30 мин. при 4°С с 100 мкл нзотип-спецнфической сыворотки, меченной РЕ или FITC, дважды отмывали буфером и ресуспензнровалп в 0.9%-ом растворе NaCl, содержащем 1% формалина. Если предполагалось после окраски МКА смотреть активность Р-170 с помощью Родампна-123, то в формалин клетки не помеща-

ли. Для проверки нсспецнфпческого связывания вторых антител с ними ставилось контрольное окрашивание.

Измерение пптс.псиопости флуоресценции окрашенных клеток:

а) па проточном цитофлуориметре

Интенсивность флуоресценции от 5000 тыс. клеток пациентов или 3000 тыс. культивируемых клеток после процедуры окраски Родамппом-123 и МКА измеряли на проточном цитофлуориметре FACScan (фирмы "Dectou Dickincon"). Гейт (окпо) популяции гранулоцитов и бластпых клеток пациентов устанавливали па основе комбинации светорассеяния и размера клеток (Фролова, 1992).

в) под микроскопом

Интенсивность флуоресценции клеток, растущих на субстрате, после процедуры окраски Хёхстом измеряли с помощью фотометрической насадки к микроскопу Люмам-ИЗ. Возбуждение флуоресценции осуществляли ксе-ноновон лампой через светофильтр с областью пропускания в диапазоне до 380 им. Флуоресценцию регистрировали с использованием интерференционного светофильтра с максимумом пропускания на длине волны 457 им. Величину среднего значения интенсивности флуоресценции популяции определяли, измеряя интенсивность свечения 75-ти клеток.

Флуоресцентные измерения для количественной оценки связывания доксорубицнна с ДНК клеток проводили на спектрофлуоримстрс "Hitachi—Л/850" (Япония). Спектральная ширина щелей составляла 5 им, Спектры поглощения Хёхста-33258 и доксорубицнна регистрировались на спектрофотометре "Hitachi—{/ 2000" (Япония).

Используемые сокращения: СП - колхицин; /?Д123 - Родамин-123; Р-170 - Р-гликопротепн; МЛУ - множественная лекарственная устойчивость.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Чувствительность метода определения функциональной активности Р-170 с помощью Родамина-123

Было проверено, можно ли регистрировать функциональную активность Р-170 в клетках с минимальным- уровнем устойчивости к колхицину п какую часть клеток с функционирующим Р-170 можно выявлять в гетерогенных популяциях. Это было сделано с помощью резистентных сублиппн клеточной линии меланомы человека mS с разными уровнями устойчивости к колхнцнну. Интенсивность флуоресценции 3000 клеток регистрировали на проточном цитофлуориметре FACScan. На рнс.1

представлены диаграммы значений интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных антителами к Р-170 ШС-2 и ЛЛ123. Каждая точка на диаграмме соответствует значению интенсивности флуоресценции отдельной клетки. Положение основного пула клеток по вертикальной оси свидетельствует о количестве антител, связавшихся с молекулами Р-170. При сравнении распределения значений интенсивности флуоресценции клеток разного уровня устойчивости (рпс.1 б,д,з) видно, что связывание антител к Р-170 коррелирует со степенью устойчивости клеток к колхицину. В диаграммах, помещенных в третьем столбце, представлен цптометрп-чеекпй анализ клеток после пх двойного окрашивания: перед реакцией преципитации с антителами ШС-2 клетки были окрашены ЛЛ123. После окрашивания красителем клетки СО мин. инкубировались в "чистой" среде. Расположение пула клеток по горизонтальной оси показывают величину интенсивности флуоресценции Лк\23 в клетках. Так как в присутствии верапампла сдвиг влево енгпала от клеток отсутствует (рпс.1к), то можно заключить, что уменьшение интенсивности флуоресценции Л/1123 в клетках вызвано работой Р-170. Верапамнл - известный блокатор Р-170. Степень уменьшения интенсивности флуоресценции красителя в резистентных клетках относительно клеток дикого типа свидетельствует об уменьшении в них количества Лк123. При сравнении диаграмм (в) и (е) видно, что изменение интенсивности флуоресцепцнн /?/г 123 наблюдается уже у клеток начального уровня устойчивости к колхицину (in.S-0.02) (при сравненн с клетками дикого типа). Интенсивность флуоресценции Лк 123 коррелирует с уровнем связывания антител к Р-170 (положение клеток по вертикальной оси) (рпс.1 в,е,н). Это говорит о том, что интенсивность флуоресценции /¡/¿123 в клетках после отмывания соотносится с количеством молекул белка Р-170 на мембранах. Таким образом, из описанных данных можно сделать вывод, что интенсивность флуоресценции Лк 123 в клетках после их пребывания в "чистой" среде соответствует уровню устойчивости клеток к селективному агенту и отражает степень проявления функциональной активности Р-170.

Была проверена также возможность регистрации функционирования Р-170 в гетерогенных популяциях. Для этого были приготовлены смеси из чувствительных и резистентных клеток линий т5 и тЭ - 0.5 разного состава. Выявить резистентную популяцию с функционирующим Р-170 удавалось, когда количество резистентных вариантов составляло 10% популяции. По рисунку гистограмм можно было различить популяшш с разным количеством резистентных клеток (в опыте отличие составляло 10%).

Такпм образом, данные первого раздела работы свидетельствуют о достаточно высокой чувствительности метода выявления клеток с функционирующим Р-170 с помощью 7?Л123. Проявление функционирования Р-170 регистрируется и в клетках с минимальным уровнем устойчивости к колхицину, что также говорит о высокой чувствительности метода. Сходные результаты были получены и с помощью красителя Хехст-33258, мишень связывания которого - ДНК клеток.

2. Изучение индукции активности Р-170 цитпостатпиками

Ранее (Chin, et al. 1990) было показано, что в результате воздействия цптостатиков круга МЛУ в клетках грызунов, но не человека, увеличивается количество мРНК гена MDR1. Возможно, это объясняется тем, что в составе генома грызунов содержится три гена семейства MDR, и в результате активации двух из них может возникать фенотип МЛУ. В геноме человека - два гена семейства MDR, гиперэкспрессия одного из них (MDR1) приводит к повышенной продукции Р-170 п приобретению фенотипа МЛУ. В других работах (Bates, et al. 1989; Micklcy, et al. 1989) при воздействии на клетки агентов днффереццировкн было показано, что увеличивается количество мРНК гена MDR1. Однако не было обнаружено проявления активности Р-170 по выведению меченных препаратов. Эти данные согласуются с идеей о том, что, возможно, на начальных этапах развития МЛУ в клетках человека могут работать другие механизмы клеточной защиты от экзогенного воздействия токсических веществ. Аналогичная мысль встречается и в работе Baas, et, al. (1990), в которой изучались механизмы устойчивости клеток опухоли легкого человека низких уровней устойчивости к доксорубицину.

В предыдущем разделе работы было показано, что метод с использованием Родамина достаточно чувствителен для регистрации минимальных проявлений работы Р-170, поэтому имело смысл попытаться зарегистрировать первые пзмепенпя функционирования Р-170 после воздействия на клетки колхицина (СН). Была проверена зависимость воздействия нп-тостатпка на степень активности Р-170 от дозы препарата н времени воздействия.

Выбраны три клеточных линии: мсланома человека - mS, гепатокпрци-нома человека - HepG2 и гепатома крысы - МсА RH 7777. В этих линиях клеток нзначальпо по-разиому проявлялась активность Р-170, что показано с помощью сравнения интенсивности флуоресценции ПН 123 в клетках после 60 мпн. их пребывания в среде без красителя в присутствии вера-памила и без него. Влияния верапамнла на интенсивность флуоресценции /?Л123 в клетках линии mS не наблюдалось. В клетках линии HepG2

наблюдалось слабое воздействие верапамила. В популяции клеток линии МсА RH 7777 была обнаружена большая фракция клеток, интенсивность 7?/г123 в которых увеличивалась в присутствии верапамила. С помощью метода PCR было показано, что в клетках дикого типа меланомы человека не экспрессируется ген MDR1, незначительный уровень экспрессии MDR1 обнаружен в клетках линии Нер G2. Определение проявления функционирования Р-170 с помощью Rh\2Z соответствует этим данным. Таким образом, используемые клеточные линии отличались по функционированию в них Р-170, как показали данные, по влиянию верапамила на интенсивность флуоресценции Rh 123 в клетках. На этих клеточных линиях было исследовано влияние колхицина на функциональную активность Р-170.

Колхицин в различных дозах (10, 20 и 40 нг/мл) добавлялся к клеткам, растущим на твердом субстрате. Время инкубации с СН составляло 3, 24 или 48 часов. Эти интервалы выбраны в соответствии с данными цитируемых работ. Влияние СН на функциональную активность Р-170 оценивалось по изменению интенсивности флуоресценции Л/г123 в клетках относительно необработанных цитостатпком клеток и по влиянию верапамила. В клетках линии меланомы человека влияния СН (20 нг/мл на 24 часа) на интенсивность флуоресценции клеток не наблюдалось. При увеличении дозы цитостатнка в 2 раза было зарегистрировано увеличение количества слабоокрашенных клеток, которых не было в пробе, инкубировавшейся с верапамплом. Таким образом, только при воздействии СН в дозе 40 нг/мл (на 24 часа) было зарегистрировано проявление функционирования Р-170. В клетках гепатомы человека было обнаружено изменение флуоресценции 7?/j123 после воздействия меньшей дозы СН (20 нг/мл СН на 24 часа). Таким образом, и в клетках человеческих линий, по-видимому, индуцируется активность Р-170.

В клетках гепатомы крысы воздействие СН в дозе 10 нг/мл (на 24 часа) заметно усиливало функционирование Р-170: после окрашивания 7í/tl23 и инкубации в среде без красителя в популяции появилось большое количество клеток с низкой интенсивностью флуоресценции, которая в присутствии верапамила восстанавливалась до величины интенсивности флуоресценщш клеток, необработанных СН. При повышении дозы СН (20 нг/мл СН на 24 часа) в популяции появлялась большая фракция клеток, интенсивность флуоресценщш которых отличалась от интенсивности флуоресценции клеток необработанной популяции (рис.2). Более того, на рис.2б можно видеть, что значения интенсивности флуоресценции всей популяции в целом отличаются от таковых для клеток, необработанных

СН. В присутствии вераиампла значения флуоресценции Л/1123 в клетках не различаются (рис.2 а,в). Таким образом, можно заключить, что в клетках гепатомы крысы явно проявляется влияние СН на функционирование в них Р-170. Более того, в крысиных клетках влияние СН (10 иг/мл) на интенсивность флуоресценции ША 23 наблюдалось уже после 3-часовой инкубации. Эти данные свидетельствуют во-первых, о том, что действительно происходит индукция активности Р-170 (или его экспрессии). Во-вторых, проявление усиления функционирования Р-170 за короткое время инкубации говорят о том, что в клетках этой линии воздействие СН более эффективно, чем в клетках человеческих линий. Не исключено, что это связано с начальным уровнем активности Р-170.

Таким образом, данные этого раздела показывают, что влияние цнто-статпка на клетки можно наблюдать на уровне изменения функциональной активности Р-170. Эффективность воздействия колхицина зависела от его дозы ii времени инкубации с клетками, а также от начального уровня функциональной активности Р-170.

3. Разработка метода оценки количества антрациклиноаых антибиотиков, связывающихся с ДНК клеток

В настоящее время не существует метода, позволяющего точно оценивать количество антрацнклнновых аитибиотиков, которые при добавлении к клеткам связываются с мишенью действия - ядерной ДНК. Антраци-клнновые антибиотики являются одним из основных средств лечения в хпмиотерапевтической практике, а их биологическое действие определяется количеством севших на ДНК молекул. Поэтому определение такого параметра, как количество связавшихся с ДНК молекул антрациклннов, позволяет оценить эффективность действия аптибиотпков. Количество антрациклннов, накопленных клеткой, оценивают по уровню интенсивности пх собственной флуоресценции в клетке или используя меченные препараты. Однако аптрацпклпны могут связываться п с цитоплазматическнмн структурами, а не только с ДНК, поэтому методы дают не вполне точную информацию. Квантовый выход флуоресценции антрациклннов снижается при связывании с лпгандом. В связи с этим, оценивая уровень их собственной флуоресценции, трудно различить ситуации, когда в клетку вошло небольшое количество препарата или когда большинство молекул находится в связанном состоянии.

Метод, предложенный в данной работе, основан на эффекте тушения интенсивности флуоресценции красителя Хехст-33258, связанного с ДНК, при пнтеркаляцпи доксорубищша. При насыщении ДНК клеток Хехстом и при добавлении затем к клеткам доксорубпцнна наблюдается снижение

интенсивности флуоресценции Хехста по мере встраивания молекул антибиотика в ПНК. Снижение интенсивности флуоресценции Хехста при связывании с ДНК антибиотика происходит, по-видимому, из-за поглощения пзлучатсльнои энергии молекул красителя молекулами доксорз'бнцп-на, так как спектры флуоресценции Хехста-33258 (при его связывании с ДНК). п-поглощения антибиотика существенно перекрываются.

С помощью модельных экспериментов с ДНК в растворе, используя эффекты изменения квантового выхода флуоресценции доксорубпцнна и комплекса Хехст - ДНК при пнтеркаляцпп доксорубпцнна в ДНК, было показано, каким образом можно сопоставить степень тушенпя флуоресценции Хехста с количеством молекул доксорубпцпна, связавшихся с ДНК клеток. Задача состояла в том, чтобы определить, какая часть от концентрации добавленного в раствор доксорубпцпна связалась с ДНК н вызвала снижение интенсивности флуоресценции Хехста. Для отработки метода попользовались тпмоциты мышеи. После ряда последовательных контрольных экспериментов была получена кривая, отражающая зависимость степени изменения интенсивности флуоресценции Хехста, связанного с ядерной ДНК, от количества доксорубицина, связавшегося с ДНК тимоцптов (рнс.З). Количество доксорубпцпна выражено в мпкромолях. Для того чтобы получить подобную зависимость для любых других клеток, нужно последовательно проделать все этапные эксперименты, которые были проведены для тимоцптов. Необходимая схема опытов описана в разделе 6.2 диссертации.

Уровень связывания доксорубпцнна с ДНК зависит от его общего содержания в клетке, поэтому на эту величину влияет степень активности Р-170. Оценивая уровень падения интенсивности флуоресценции Хехста при добавлении к клеткам доксорубпцнна, было показано, что количество дошедшего до ДНК антибиотика коррелирует с уровнем устойчивости клеток к колхицину. Но в клетке существуют и другие механизмы, препятствующие связыванию антрацпклпнов с мишенью действия. Сравнивая степень функциональной активности Р-170 и долю связанного антибиотика, можно оценить, участвуют ли другие механизмы клетки в защите от цитостатического действия аптрацпклиновых антибиотиков. В данной работе было показано, что, по-видимому, механизмы, отличные от активацпп Р-170 п препятствующие связыванию доксорубпцпна с ДНК, активизируются в клетках мышиного эрптроленкоза £>5 —19, устойчивых к впнбластпну.

4- Исследование функциональной активности Р-170 в клетках крови больных хроническим миелолейкозом (ХМЯ)

В последнем разделе работы метод регистрации функциональной активности Р-170 был применен для нследованпя природных клеточных популяций, в качестве которых были взяты образцы крови больных XMJI. Ранее было показано, что в бластных клетках больных XMJI может быть экспрессирован Р-170 - в них было обнаружено повышенное содержание мРНК гена MDR1 (Herweijer, et al.1990; Weide, et al. 1990). Однако участие именно Р-170 в защите неопластпческих клеток от химиопрепаратов можно подтвердить, лишь непосредственно наблюдая проявление его работы по выведению красителей.

Было исследовано 16 образцов крови больных XMJI, четверо пациентов в момент обследования находились в хронической фазе заболевания (ХФ), остальные 12 - на стадии бластного криза (БК) (из 10 обследованных пациентов двое были обследованы дважды с интервалом в 1 мсс.). Экспрессию Р-170 определяли с помощью антител к Р-170 UIC-2.

Ранее было показано, что стволовые клетки костного мозга {CD34+) экспресспруют Р-170 (Chaudhary, Roninson 1991). Не исключено, что резистентность к химиотерапии больных XMJI может быть среди других причин обусловлена преимущественной пролиферацией в крови вариантов, изначально экспресспрующих Р-170. Поэтому одновременно с экспрессией Р-170 определялся также уровень экспрессии маркерного белка стволовых клеток костного мозга - CD34. Использовались антитела к CD?A - MY10.

Данные по экспрессии Р-170, CD34 и степени проявления функциональной активности Р-170 клетками крови (гранулоцнтами в случае ХФ п бластамп в случае БК) представлены в таблице 1. Указано количество клеток (в %), в которых обнаруживалась экспрессия соответствующих антигенов. Степень функциональной активности Р-170 определяли по влиянию верапамила на интенсивность флуоресценции Rh 123 в клетках, измеренной после 60 mihi, инкубации без красителя. Плюсом отмечены те случаи, когда было обнаружено влияние верапамила. Цитометрпческпй анализ одного из такнх образцов (N5) представлен на рпс.4. Видно, что в популяции присутствует фракция клеток (около 50%), которая обладает слабой интенсивностью флуоресценции (рнс.4а). При увеличении времени инкубации в среде без красителя флуоресценция Rh 123 в клетках еще более уменьшается (рис.46), но в присутствии верапамила слабо-окрашенной фракции не наблюдается. Это свидетельствуя! .о. том, что в 50% клеток образца функционирует Р-170, который выводит Rh 123 из клеток. Иммуногпстохимический анализ, данные которого представлены в виде диаграммы, показывает, что около половины клеток популяции связывают антитела к Р-170. Таким образом, количественные данные

пммуногистохимпческого анализа п данные, полученные с помощью ро-дампнового метола, совпадают. Практически во всех случаях ХФ и БК количество ШС-2+ клеток и клеток, проявляющих функциональную активность Р-170, совпадают. В тех случаях, когда в клетках образца не обнаруживалась экспрессия Р-170, не было зарегистрировано и активности Р-170. Три случая составляют псключенпе и не подходят под это утверждение (N1,6,9). Если не считать, что произошло неспецнфпческое связывание антител, то, по-видимому, Р-170 в этих образцах не проявлял активность по выведению экзогенных веществ.

В табл.1 указан также процент клеток образца, в которых обнаруживалась экспрессия СИЗ4. В трех случаях было обнаружено высокое содержание клеток с Р-170 и С£>34 одновременно (N5,6,7). С клетками пациента N5 была поставлена реакция двойного окрашивания антителами ШС-2 и МУ10. Было показано, что антигены СЮ34 и Р-170 находятся на одних клетках. Таким образом, возможно, что в некоторых случаях спонтанное появление в крови клеток с МЛУ можно объяснить избирательной пролиферацией клеток определенного клона.

ВЫВОДЫ

Результаты работы позволяют сделать следующие выводы:

1. Разработаны методы оценки функциональной активности Р-170 с помощью флуоресцентных красителей Родампн-123 п Хехст-33258. Методы обладают высокой разрешающей способностью: они позволяют выявлять в гетерогенных популяциях малые фракции клеток, обладающих активным Р-170, составляющие не более 10% популяции, различать популяции, отличающиеся по содержанию резистентных клеток, а также регистрировать активность Р-170 б популяциях клеток с минимальным уровнем устойчивости к селективному агенту.

2. Проявление функциональной активности Р-170 зарегистрировано в линиях клеток опухолей человека с начальными уровнями МЛУ: линиях клеток мелапомы тБ/0.02 п гепатомы Нер С'2/0.01 человека. Таким образом, показано, что первые этапы развития МЛУ п в популяциях опухолевых клеток человека могут быть обусловлены повышением функциональной активности Р-170.

3. Воздействие на клетки человека и крысы цптостатика - колхицина приводит к возрастанию скорости выведения Родамина из клеток, обусловленной функциональной активностью Р-170. Степень этого эффекта зависит: а) от дозы колхицина; б) времени воздействия препарата;

в) начального уровня функциональной активности Р-170 в клетках.

4. Разработан метод количественной оценки связывания антрациклино-вых антибиотиков с ДНК клеток. С помощью этого метода показано, что существует зависимость между уровнем устойчивости клеток, обусловленным работой Р-170, и количеством связавшегося с ДНК доксорубнцина.

5. Метод с использованием Родамнна-223 позволяет оценить функциональную активность Р-170 в клетках периферической кровн больных хроническим млелолейкозом. Показано, что в 13 случаях из 1С степень связывания клетками моноклональных антител к Р-170 и проявление d неопластпческих клетках кровн функциональной активности Р-170 совпадает.

Метод позволяет различать образцы с разным проявлением функциональной активности Р-170, выявляются малочисленные фракции клеток с высокоактивным Р-170 и значительные фракции клеток с низкой активностью белка.

Эти данные подчеркивают необходимость сочетания методов пммуно-гнстохпмического анализа ц оценки функциональной активности Р-170 с помощью Родампна-123 при изучении клинического материала.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Доненко Ф.В., Боровкова Н.Б., Егуднна C.B., Кабиева А.О., Крнсь-ко Ш.И., Мороз JT.B. Исследование сравнительного накопления флюоресцентного зонда Хехст-33258 в клетках лейкоза Р-388, чувствительных п устойчивых к доксорубнцину: Бюлл. эксперим.бполог. и мед. 1990, т.СХ, N9, с.310-312.

2. Егуднна C.B., Баранов Е.П., Богуш Т.А., Крпсько Ш.И. Использование флюоресцентного зонда Хехст-33258 для количественного определения связывания антрацпклпновых антибиотиков с ДНК в клетках: Антпб. и химнотерап. 1992, т.37, iV5, с.21-23.

3. Богуш Т.А., Баранов Е.П., Егуднна C.B., Танковнч Н.И. Количественное определение связывания антрацнклиновых антибиотиков с ДНК: Бюлл. эксперпм. биол. и мед. 1992, т.СХШ, N6, C.63G-G37.

4. Egudina S.V., Stromskaya Т.Р., Frolova Е.А., Stavrovskaya A.A. Early steps of the P-glycoprotein expression in cell cultures studied with vital fluoroclirome. FEBS Letters, 1993, Vol.329, No.1,2, p.63-66.

5. Stromskaya T.P., Fillipova N.A., Rybalkina E.Yu., Egudina S.V., Shtil A.A., Eliseenkova A.V., Stavrovskaya A.A. Alteration of melanin

synthesis in human melanoma cclls selected in vitro for multidrug resistance: Exp. Toxic. Pathol. 1994, 4G (in press).

6. Егудппа C.B., Стромская Т.П., Ставровская А.А., Фролова Е.А., Рыбалкина Е.Ю., Баранов Е.П. Применение цптофлуорпмстршг для выявления клеток с множественной лекарственной устойчивостью, опосредованной .трансмембранным Р-гликопротеином: Биологические мембраны. 1995, т.12, jVl, с.73-81( в печати).

Тезисы докладов:

1. Baranov Е.Р., Egudina. S.V. Spectroscopic method of the determination of the tumor sensitiviti and it's resistans to chemoterapy / Abstracts of Soviet-American Symposium, San Francisco, 13-16, March, 1991.

2. Егудина С.В., Баранов Е.П. Мпкрофотометрпческин метод выявления резистентных клеток. - В кн.: Труды конференции "Биология клеток в культуре". - С.-Петербург, 20-22 октября 1992 г.; Цитология, 1992, т.34, т, с. 68.

3. Егудина С.В., Стромская Т.П., Ставровская А.А. Изучение малых изменений активности Р-глпкопротеипа в клетках с множественной лекарственной устойчивостью. - В кн.: Труды конференции по генетике соматических клеток в культуре. - Черноголовка, 22-24.11.93 / Тезисы докладов. - Москва, 1993, с. 50.

4. Egudina S.V., Frolova Е.А., Turkina A.G., Scdyakina N.P., Stromskaya Т.P., Barishnikov A.Y., Stavrovskaya A.A. Detection of the P-glycoprot,cin functional activity in the cclls of patients with chronic myelogenous leukaemia (CML). - 1st International Conference on Reversal of Multidrug Resistance in Cancer. 1-3 Sept. 1994. - In: Anti-cancer drugs. Vol.5, p.56.

5. Stavrovskaya A.A., Stromskaya T.P., Rybalkina E.Yu., Egudina S.V., Filinova E.Yu., Krasilnikov M.A. The connecting of cell signaling system and P-glycoprotein function in multidrug resistant (MDR) Tumor cclls. - In: XVI International Cancer Congress. - New Delhi, India, 1994.

6. Stavrovskaya A.A., Egudina S.V., Eliseenkova A.V., Kakpakova E.S., Abclriashitov R.I., Frolova E.Y., Turkina A.G. Test for P-glycoprotein (P—gp) activity- usful tool for experimental and clinical research. - Abstracts of XXII Meeting JSCBM, 1994, Groningen, Netherlands, p.246.

1G

шИ-

о

а.

ы

. а.

шш

И» 123

Рис.1. Двумерная цитометрия клеток линии меланомы человека т5 и резистентных сублшшй т5-0.2, т£-0.5. По вертикальной оси - значения интенсивности флуоресценции фикоэритрина (РЕ), по горизонтальной оси - ДЛ123. В первом столбце - контрольное окрашивание вторыми антителами против иммуноглобулинов мыши изотипа \gG2a, меченных РЕ. Во втором столбце - результат регистрации флуоресценции РЕ на клетках после реакции преципитации с антителами к Р-170 ШС-2. В третьем столбце - цитометрия клеток, которые перед связыванием с антителами ШС-2 были окрашены ЛЛ123. На диаграмме (к) -клетки тБ-0.5 инкубировались в присутствии верапамила (20 мкг/мл).

ü о н ш ч ü

о

03

н a a) г s

4

2.

Rh 123

Рис.2. Влияние колхицина (СН) на интенсивность флуоресценции Rh 123 в клетках гепатомы крысы линии МсА RH 7777. Время инкубации с CII - 21 часа, а) гистограммы значений интенсивности флуоресценции клеток без предварительной инкубации с СН\ б) после инкубации с 20 нг/мл СН; в) после инкубации с СН пребывание клеток в среде без Rh 123 проводилось в присутствии веранамила (20 мкг/мл) (Ver).

a МсА В Н 77, А 77 Л i

. СН сГ ; i 20 нг/, /Н U | t

В .МсА .Н 77 + Ves IU: г 57 i К А

Рнс.З. Зависимость степени снижения интенсивности флуоресценции Хехста-33258, связанного с ДИК клеток, от количества доксорубицина, связавшегося с ДНК. По оси ординат - интенсивность флуоресценции Хехста в отн. сл.; по осп абсцисс - концентрация доксорубицина на ДНК.

1000

ы о н

0) к

о

Щ

н

о ш г

X с:

о

"гоо^™ Ч^йЬ1' |5ои ■" "|аоо' ¡юоо ИЬ 123

Рис Л. Гистограммы значений интенсивности флуоресценции клеток крови пациента М после окрашивания /Ш23. а) клетки инкубировались без красителя 30 мин.; б) 60 мил.; в) в присутствии 20 мкг/мл всрапамила. 1Га диаграммах -иммунофлуоресцентный анализ клеток крови того же пациента после реакции с антителами к Р-170 - ШС-2. а) контрольное окрашивание вторшш антителами против иммуноглобулинов мыши изотипа 15С2а, меченных РЕ; б) результат непрямой иммунологической реакции с антителами ШС-2. По вертикальной осп -интенсивность флуоресценции РЕ, по горизонтальной оси - канал флуоресценции открыт. Масштаб логарифмический.

Таблица 1.

Экспрессия СБ34 и Р-170 п Быпедение Родампна-123 _клетками крови больных ХМЛ._

Пациент % бластов С034+ Выведение Р-170+

в кровц (%) Шг123 (%)

Хроническая фаза

1.Л.Е.П. 0 8 - 76

2.М.А.В. 0 16 - 0

З.У.Т.А. 7 0 + 0

4.Г.Н.В. 41 3 - 4

Властный крпзпс

5.К.П.А. 78 78 + 50

6.С.П.И. 46 50 - 55

7.К.А.А. а) 44 63 + 53

К.А.А. б) 13 4 + 17

8.Г.Е.Г. 50 0 + 35

9.В.Л.Н. 4 0 - 17

Ю.Ш.Н.И. 17 0 + 16

11.М.А.М. 45 49 + 13

12.Г.В.Б. 22 51 + 10

13.М.М.Б. 90 24 - 6

14.А.Л.Н. а) 43 11 - 4

А.Л.Н. б) 27 13 - 0

Фоломешкина С.В.

Исследование функциональной активности белка множественной лекарственной устойчивости Р-170 с помощью флуоресцентных красителей.

Оригинал-макет подготовлен с помощью системы М?£Х. Редактор М.Л.Фоломешкина

Подписано к печати 14.02.95 г. Формат 60 х 90/16.

Офсетная печать. Печ.л. 1.37 Уч.-изд.л. 1.62 Тираж 50 Заказ 190 Индекс 3649 ЛР №020498 06.04.1992.

Институт физики высоких энергий, 142284, Протвино Московской обл.